Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu và khảo sát các thành phần có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5 của nọc bò cạp Heterometrus laoticus

Thông thường, sau khi bị bò cạp chích, vị trí lân cận sẽ đau tê cứng trong vài ngày, sau đó sẽ trở lại bình thường [32].Nọc bò cạp H.laoticus thường không độc, nhưng gây ra sự sưng phù,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYÊN THỊ THANH THẢO

Chuyên ngành : Công Nghệ Hóa Hoc

Mã số : 605275

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 12 năm 2013

TRƯỜNG DAI HOC BACH KHOA - ĐHQG - HCMCán bộ hướng dẫn khoa học : TSKH HOÀNG NGỌC ANHCán bộ chấm nhận xét1 : TS TRAN KHÁNH DUYCán bộ chấm nhận xét2 : TS TRAN THỊ KIỂU ANH

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại Học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày 25 thang 12 năm 2013.

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận van thạc sĩ gồm:

1 PGS TS PHAN THANH SƠN NAM

TS HUỲNH KHÁNH DUYTS TRAN THỊ KIEU ANH - 6s sE+E£E+E+EEeEsEsEeesesereesedTSKH HOÀNG NGỌC ANH - c1 EsEskeksereresedTS TONG THÀNH DANH

On TS G2 bd

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA KY THUẬT HÓA HỌC

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYÊN THỊ THANH THẢO MSHV: 12050167

Ngày, thang, năm sinh: 10/08/1988 Nơi sinh: Quang Ngãi

Chuyên ngành: Tổng hợp hữu cơ Mã số : I TÊN DE TÀI: “Nghiên cứu và khảo sát các thành phần có hoạt tính chống

đồng máu từ phan đoạn 5 của noc bò cạp Heterometrus laoticus.”

Il NHIEM VỤ VA NOI DUNG:

— Nuôi và thu noc bo cạp Heterometrus laoticus.

— Phân tích noc bò cap bang phương pháp sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G-50.— Phân tích phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha trên cột

oO uu O u ye u

ư u ua y a e Lu ntnghiộp y ư cth c hiện t i phũng V t liệu Y sinh - Viện Khoah c V t

liệu Ứng dụng wis ư ngdnc aTiế ùKhoah c Hoang Ng c Anh

ộo u ,emxin gởi lời Ơ ộn:~ B Me o ộukiộn vộ kinh tộ Ong viờn tinh th n cho em th c hiện

Em xin chõn thànhc o o ế th y cụ gi ngd y au ih uo Dih c Bỏch Khoa Thành ph Hồ Chớ Minh u — p kiến thức cho em trong su t

khúa h c.

đằCu Icựng em xinc ở tat c cỏc anh ch ,b e ờ nh Jntr em hoàn thành t tlu y

Trong quỏ trỡnh tỡm hiểu nguồn kiến thức bao la, cú những sai sút khụng mongmu n, kớnh mong cỏc th y cụ tronghộ ụng b o vệ lu thụng c ư ng

d n thờm cho em Em xin chõn thànhhc oMot! n nữa em xin chõn thànhc o cỏc th y cụ, cỏc b n luụnvui khỏe, thành cụng trong cụng việc và cuộc s ng.

Thanh ph Hồ Chớ Minh, 12 2013

Nguyễn Th Thanh Th o

TIENG VIETNhững nghiên cứu trước đây về tác động chống đông máu của noc bò capHeterometrus laoticus An Giang, trong 5 phần đoạn đã được tach ra băng sắc ký lọcgel, người ta đã xác định được 3 phân đoạn có tác động chống đông mau, đó là cácphân đoạn 2, 4 và 5 Nhiệm vụ của luận văn này là phân lập các phân đoạn thứ cấptừ phân đoạn 5 bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp đảo pha, khảo sát tác động củachúng lên quá trình đông — chảy máu và xác định khối lượng phân tử của chúng

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã xác định trong 24 phân đoạn thứ cấp

đã tách ra từ phân đoạn 5, có 6 phân đoạn tác động lên quá trình đông — chảy máu

là: 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 5.22 Sáu phân đoạn nay đã được làm sạch lại băngsắc ký để thu được các toxin sạch, các toxin này đã được xác định khối lượng phântử bang phương pháp khối pho Khối lượng phân tử của 6 toxin này là 1091,1 Da,

444 2 Da, 418,0 Da, 1505,6 Da, 165,0 Da, 831,3 Da.

TIENG ANH

The crude venom of the An Giang Heterometrus laoticus scorpion, wasseparated into 5 fractions by gel filtration chromatography Among them, there were3 fractions affecting the blood coagulation process as practions 2, 4 and 5, this havebeen shown in previous studies The thesis focused to separate sub-fractions fromfraction 5 by reversed phase — high performance liquid chromatography, researchanticoagulant effect of sub-fractions of fraction 5 in Swiss albino male mice anddetermine their molecular weight.

The fraction 5 was separated into 24 sub-fractions The anticoagulant testshowed that sub-fractions 5.5, 5.10, 5.11, 5.16, 5.19, 522 have anticogulation effect.By reversed phase — high performance liquid chromatography, these sub-fractionswere purified to get the purified toxins and we determined molecular weight ofthese toxins The molecular weight of six toxins were 1091,1 Da, 444,2 Da, 418,0Da, 1505,6 Da, 165,0 Da, 831,3 Da.

Tôi xin cam đoan:(1) Luận van này là san phầm nghiên cứu cua tôi.Gi) — Sô liệu trong luận văn là trung thực.

(ii) Tôi xin chịu trách nhiệm vê nghiên cứu của mình.

Học viên

Nguyễn Thị Thanh Thảo

1.1.2 Hinh thái và đặc tính sinh học S1 1111111111111 xe 51.1.2.1 Hình thái học - - c5 E22 E3 E1 15111121515 112111111111 11111111 cxe 51.1.2.2 Đặc tính sinh hỌC - << 330 000002209010110130 111111110 111111 0 1n vờ 6I.I.2.3 Tập tính sinh học - - << G c9 00v 7

1.1.2.4 Sinh sản và phát triỂn ¿5-5256 22S2SE2ESE E23 EEEEEEEEEErkrrrrkrkrreee 71.2 NOC BO CẠTP << sư g0 g0 o0 se 81.2.1 Giới thiệu về độc tính của noc bò OF 0 81.2.2 Thanh phan hóa học và dược lý của nọc bò Cạp - -cssssseeesss S1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VA UNG DUNG NOC BO CAP TREN THEGIỚI VA O VIET NA ÌM 5° < sư g0 cư 90x u02 seese 91.3.1 Tinh hình nghiên cứu trên thé giới ccccccccscseseseseesssessesesessesesesseseeeesesen 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ĂĂ SH re 131.3.3 Cac ứng dung từ NOC DO CAP - Ăn ng ke 14

1.4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HOA TAN BANG PHƯƠNG PHAP SOI0 ôÔỎ 15

1.4.1 Phương pháp B1uref HH vn 161.4.2 Phương pháp LOWFV cọ vn 161.4.3 Phương pháp BradfOrd - + 19999001 ng kg 16

1.5 SAC KY LOC GEL PHAN TICH THÀNH PHAN NOC BO CẠP 17

[.5.I Khi niỆm - G00 kh 17

1.5.3 Một số thông số vật lý của sắc ký lọc gel :- 2 + 5s+s+ccszesrsce¿ 181.5.4 Pha tĩnh của sắc ký lọc gel cccscscsscssssssessssesessesesessesesessescsscsesesssssesseecseseees 18

1.5.6 Dung môi và tốc độ dòng Chay cececccccescssssessesesessesesessesesessssssesssseesessseeeees 191.5.7 Ung dụng của sắc ky lọc gel cceccsccssssssessssssessesssessesesessescsscscsesesssseescseecseees 191.6 PHƯƠNG PHAP DONG KKHÔ 5- 555 scssscsssessesssssseessssesses 19

1.6.1 Khái niệm - 6-52 SE S23 323 11 1 1521111211311 15 1111110111101 11 1 1x 19

1.6.2 Nguyên tac của phương pháp đông khô - ¿2 - 5 c2 2+s+s+£zcze: 201.6.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô - ¿2-5-5 2 2 2+<+£+£z£cszeceee 201.7 PHƯƠNG PHAP SAC KÝ LONG CAO ÁP (HPL,C) . 20

mm ‹ 8 nnDnD 20

1.7.2 Các bộ phận chính của máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 21

1.7.2.1 Bình chứa dung mồi giải Ly CỘ( - << 1 ng 211.7.2.2 Máy DOM occcccccccccccessssessssessssecsssessssessssessssessssessssessssessssessssessssessssesseseees 21

2.1 NUÔI VÀ THU NOC BO CAP TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 26

2.[.I Nuôi bò Cạp cọ TH nọ re 262.1.2 Thu và bao quản nọc bò Cap - -c SH ke 26

2.1.2.1 Dụng cụ và thiẾt bị, 5-5-6 c1 1E 1 1 1115151111111 11 1101111111 re 262.1.2.2 Phương pháp tiến hành - - 2 256 E+E+E£E£E£E£E2ESEEEEEErEeerrerersred 27

PHUONG PHAP LOWRY ccccsssssssssssssosssssssssscsssssssecscsssssecscscsssssessssescocsssesecaees 272.2.1 Nguyén tắc thực hiện -¿- + 2 22123 E5 E1 1212115111111 1111.511, 272.2.2 Tiến hành - + S652 1S E1 1 111513111111 111511 111111151101 11101 11011110 Le 282.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất ¿c5 + 2262123 E5 5 121212151311 21 111111 exce 282.2.2.2 Lập đồ thị chuẩn - ¿c3 3 1 151515151513 11 1111111111111 282.2.2.3 Xác định hàm lượng protein có trong mẫu NOC bò cạp - 292.3 TÁCH PROTEIN TRONG NOC BO CAP H.LAOTICUS BANG SAC KYLOC GEL TREN GEL SEPADEX G-50 5 ° 5° s52 csessessesessessesesse 292.3.1 Nguyên tắc thực hiện ¿6E S2 E21 1 E5 E1 1212115112111 111111511, 292.3.2 Tiến hành - + S652 1S E1 1 111515151111 11511 111111151111 111105 11011110 Le 292.3.2.1 Dụng cụ và hóa chất ¿6-6 S2 S121 3 15 5 1E12121511 1521111111 ecxre 29

2.3.2.2 Thực nghiỆm 00000300100 00 và 30

2.3.2.3 Thu và đông khô mẫẫu - - - + EE2E2E2E2ESE E28 3E vzvrrrerrred 322.4 TÁCH CAC PHAN DOAN THỨ CAP CUA PHAN DOAN 5 BANG SACKÝ LONG CAO AP DAO PHA (RP-HPL,C) -5- 5 5° 55s se ssessesesse 332.4.1 Dụng cụ và hóa chất - + c1 S113 1 1511111111113 1101111111111 1y 33

2.4.2 Thực nghiỆm - - GG G9999 000 00 nọ ch 34

2.5 KHAO SÁT TAC DONG CUA CAC PHAN DOAN THU CAP CUAPHAN DOAN 5 LEN QUA TRÌNH DONG - CHAY MÁU 352.5.1 Hóa chất và dụng CỤ - 5-5251 1 E1 1 1 15131111 111113 1111111111111 352.5.2 Đối tượng thử nghiệm ¿-¿- - + 2S SE2E*ESEEEEEEE 3E 1211111121511 cxe, 352.5.3 Thuốc thử nghiệm - +52 E1 E11 1 1511111111113 1151111111111 Xe 362.5.4 Tiến hành thử nghiệm ¿- - SE E+ESE*E+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEkrkrrrred 362.5.5 Phân tích kết quả thống kê ¿+ 52 2252 SE+E+EEE£EvEEEEEvEerrrerrerered 372.6 LAM SẠCH CAC PHAN DOAN CÓ HOẠT TÍNH TÁC ĐỘNG LENQUA TRÌNH ĐÔNG - CHAY MAU BANG SAC KY LỎNG CAO ÁP (RP-HPLC) VÀ XÁC ĐỊNH KHOI LƯỢNG PHAN TỬ 5 ° << << 37Ch ong 3: KET QUA VA BAN LUẬN - <5 <sssssesssscsessssesese 393.1 KET QUA CUA VIỆC THU NOC BO CẠP 2 5 scss<ssesse 39

3.1.2 Lượng noc thu được trong thời gian nUỒI - «+ + ss<e+++sse+s 39

3.2 HAM LƯỢNG PROTEIN TRONG NOC BO CẠP -. <e- 423.2.1 Đỗ thị đường Chua ec cccccscsesesescscsssscscsescssssssescscssssesesssessssseseeseens 42

3.2.2 Hàm lượng protein trong nọc bò Cạp s c9 ke 43

3.3 KET QUÁ CHẠY SẮC KY LOC GEL VÀ ĐÔNG KHÔ 443.4 KET QUÁ CHẠY SAC KY LONG CAO ÁP DAO PHA (RP-HPLC)CUA PHAN DOAN 677 463.5 KET QUA KHAO SÁT TÁC ĐỘNG CUA CAC PHAN DOAN THU CAPCUA PHAN DOAN 5 LEN QUA TRÌNH ĐÔNG - CHAY MÁU 463.5.1 Anh hưởng của phân đoạn thứ cấp 5.1 lên thời gian chảy máu va đông

CAC PHAN DOAN CÓ HOAT TÍNH TAC DONG LEN QUÁ TRÌNH DONG~ CHAY 000 ÔỎ 753.6.1 Phan đoạn thứ cấp 5.5 vciccccccscccsscsssssscscssssssssescscsssssscscssssssssesesesssssseesseens 763.6.2 Phân đoạn thứ cấp 5.10 c.ccccccccccccsssscscscscscssssescsssssssscscssssssssesssssssssseeeseens 773.6.3 Phân đoạn thứ cấp 5.11 - ¿+ + + 2E +E£k+E£EEEEEEESEEEEEEEEEEEEEEEErErkrkrree 783.6.4 Phân đoạn thứ cấp 5.16 ¿-¿- + + + 2E +E+E+E#EEEEEEEEEE 5 EEEE1111 11x xe, 703.6.5 Phân đoạn thứ cấp 5.lÔ ¿-¿++++ SE SE£E9E5 1112111511511 11 1111.151 x xe 803.6.6 Phân đoạn thứ cấp 5 22 -¿-¿-:-++++ S21 +E E915 1112311111511 11 1111111511 81

3.6.7 Nhận XÉ( -L-L- c3 1511111111 11115 11111151111 111111 111111111101 11g11 82

Ch ong 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 2 5-2 5s 2 se Sssesseses 834.1 KET LUẬN °° 5° 5% SG << << 9 9959 9 0 2x xe sex 834.2 KIÊN NGHỊ, << << 99599929 3 9x9 se 84BÀI BAO ĐÃ ĐĂNG

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BmKAPi_ : Peptide Buthus Martensii Karsch Api

HPLC : Sắc ký lỏng cao áp

IpTxi : Imperatoxin inhibitorPLA2s : Enzyme phospholipase

RP-HPLC : Sac ký long cao áp đảo pha

SVAP : Peptide scorpion venom active polypeptideTFA : Trifluoroacetic acid

TSKH : Tiến sĩ Khoa học

UV : Ultraviolet

Bảng 1.1:Bảng 2.1:Bang 3.1:Bang 3.2:Bang 3.3:Bang 3.4:Bang 3.5:Bang 3.6:Bang 3.7:Bang 3.8:Bang 3.9:Bang 3.10:Bang 3.11:Bang 3.12:Bang 3.13:Bang 3.14:Bang 3.15:Bang 3.16:Bang 3.17:Bang 3.18:Bang 3.19:Bang 3.20:Bang 3.21:Bang 3.22:Bang 3.23:Bang 3.24:

Trang

Các loại cột sắc ký long cao áp dùng trong các kỹ thuật sắc ký 22

Lập đồ thị đường chuẩn nông (6 (005 0) 0) 1) - <S S9 re, 28Khối lượng noc bò cạp H.laoficws thu đưỢC 7< << s+s 40Mật độ quang AOD 59 của các nồng độ protein chuẩn - 42

Hàm lượng protein trong nọc bồ Cạp - - - - -cS S1 n k, 43Khối lượng 5 phân đoạn sau khi chạy lọc gøeÏL - << «<< ««<<+++ 45Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.1 và lô chứng 47

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.1 và lô chứng 47

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.2 và lô chứng 46

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.2 và lô chứng 46

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.3 và lô chứng 49

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.3 và lô chứng 49

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.4 và lô chứng 50

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.4 và lô chứng 50

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.5 và lô chứng 51

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.5 và lô chứng 51

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.6 và lô chứng 52

Thời gian đông máu của phan đoạn thứ cấp 5.6 và lô chứng 52

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.7 và lô chứng 53

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.7 và lô chứng 53

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.8 và lô chứng 34

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.8 và lô chứng 54

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.9 và lô chứng 55

Thời gian đông máu của phan đoạn thứ cấp 5.9 và lô chứng 55

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.10 và lô chứng 56

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.10 và lô chứng 56

Bảng 3.26:Bảng 3.27:Bảng 3.28:Bảng 3.29:Bảng 3.30:Bảng 3.31:Bảng 3.32:Bảng 3.33:Bảng 3.34:Bảng 3.35:Bảng 3.36:Bảng 3.37:Bảng 3.38:Bảng 3.39:Bảng 3.40:Bang 3.41:Bang 3.42:Bang 3.43:Bang 3.44:Bang 3.45:Bang 3.46:Bang 3.47:Bang 3.48:Bang 3.49:Bang 3.50:Bang 3.51:Bang 3.52:

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.11 và lô chứng 57

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.12 và lô chứng 58

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.12 và lô chứng 58

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.13 và lô chứng 59

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.13 và lô chứng 59

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.14 và lô chứng 60

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.14 và lô chứng 60

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.15 và lô chứng 61

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.15 và lô chứng 61

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.16 và lô chứng 62

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.16 và lô chứng 62

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.17 và lô chứng 63

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.17 và lô chứng 63

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.18 và lô chứng 64

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.18 và lô chứng 64

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.19 và lô chứng 65

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.19 và lô chứng 65

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.20 và lô chứng 66

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.20 và lô chứng 66

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.21 và lô chứng 67

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.21 và lô chứng 67

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.22 và lô chứng 68

Thời gian đông máu của phan đoạn thứ cấp 5.22 và lô chứng 68

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.23 và lô chứng 69

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.23 và lô chứng 69

Thời gian chảy máu của phân đoạn thứ cấp 5.24 và lô chứng 70

Thời gian đông máu của phân đoạn thứ cấp 5.24 và lô chứng 70Bảng 3.53: Thời gian chảy máu của các phân đoạn thứ cấp có hoạt tính và lô

Bảng 3.55: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời

gian chảy mau và thời gian đông máu <5 + 119993 1 993 1 ren 74

Bang 3.56: Khối lượng phân tử của các toxin thu được -. - + 2 s2 <<: 32

TrangHình 1.1: Bò cap đen Heterometrus ÍAOfÏCHS «<< c c3 331111 1 EEEESEeeeeeeeeerse 5

Hình 1.2: Sự phát triển của bò cạp H.s/0iHIiƒ€F 5s Set tt Errkerererrrkd 6Hình 1.3: Cấu trúc toxin của noc bd 20011777 10Hình 1.4: Tach các phân tử bằng phương pháp sắc ký lọc gel -5: 17Hình 1.5: Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ¿5-5-5252 tvEvEckekererkrrrrerree 21Hình 2.1: Thu noc bò cạp bằng phương pháp kích điện -25- 5+: 27Hình 2.2: Hệ thống chạy sắc ký lọc gel phân tách protein của noc bò cạp 32

Hình 2.3: Máy đông khô hãng Thermo - - 55c c1 1133911133 11 1 re 33Hình 3.1: Noc thu từ bò cạp H,ÍđOfCHS c1 111111 111111 111111111 111g re 39

Hình 3.2: D6 thị đường chuẩn nồng độ protein - 2 2555252 cs+c+cscsccee 43Hình 3.3: Sắc ký đỗ của noc bò cạp H.ÏđØfiCWS s25cSccc+cEsEeErkeksrsrerrkrsee 44Hình 3.4: Sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) trên cột SDB - C18 của phân

Hình 3.5: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời

QIAN CHAY MAU 0 a 73

Hình 3.6: Tác động của phân đoạn thứ cấp có hoạt tính so với lô chứng lên thời

5081001500008 e 73

Hình 3.7: Sắc ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5.5 - - + 2 2 22s+x+e+£srzrsrereee 76Hình 3.8: Sắc ký đỗ của toxin 5.5 .- c5: 5c tt E2 S321 1515111111 11212 1111111 76Hình 3.9: Sac ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5 | Ũ - - + 2 2 2+s+s+£+£s£zszsceee 77Hình 3.10: Sắc ký đỗ của toxin 5 LŨ 2 ¿:- 2222 123 1515111111 115111 1111k cxe, 77Hình 3.11: Sắc ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5 l - 2 2s s+s+s+£e£z£szszseẻ 78Hình 3.12: Sắc ký đỗ của toxin 5 Í.] ¿¿: + 252 E2E£E+ESEEEEEEESEEErkrkrkrkrree 78Hình 3.13: Sắc ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5.16 - + 2 +2 +s+s+£+£z£z£szszeeẻ 79Hình 3.14: Sắc ký đỗ của toxin 5.LÓ . ¿ ¿6 5252 E23 ESE2E E21 E121 11k rree 79Hình 3.15: Sắc ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5.19 cccccccccsssessssssessessseseeeseseesesen 80

Hình 3.17: Sắc ký đỗ của phân đoạn thứ cấp 5.22 -. + + 2+2 +s+s+s+£z£z£s+sccee 81Hình 3.18: Sắc ký đỗ của toxin 5.22.3 voicccccccsccsccscssssssessscssssssessssssssesessessssssseseseens 81

oieVới xu hướng phát trién của ngành dược, các hop chat thiên nhiên có hoạt tínhsinh học từ cây cỏ, động vật, và đặc biệt là nọc từ các con vật như răn, bò cạp,ong đã và dang được nghiên cứu dùng làm thuốc dé chữa bệnh.

Trai qua hơn 1000 năm, bò cạp đã được sử dụng rất rộng rãi trong ngành dượcvà là một vị thuộc quý của các bài thuốc cô truyền đối với nhiều quốc gia trên thếgiới Theo kinh nghiệm dân gian, bò cạp thường được dùng nguyên con (toàn yết),hoặc phần đuôi (yết vì) để trị động kinh ở trẻ em, uốn ván, bán thân bat toại, quai bị,méo miệng dưới dạng thuốc bột hoặc làm viên uống [1, 2] Cùng với sự tiễn bộkhoa học, đã có những nghiên cứu trên thế giới về nọc bò cạp và đã xác định cóhoạt tính về thần kinh [3] Tuy nhiên, việc nghiên cứu nọc bò cạp ở Việt Nam mớichỉ bắt đầu

Trong nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide toxin, có tác động lên cácreceptor và các kênh Ion của màng tế bào bị kích thích, đã và đang được các nhàkhoa học nghiên cứu và khảo sát để điều chế ra các loại thuốc chữa bệnh như:Parkinson, bệnh cao huyết ap, ung thu, Alzheimer [3,4,5,6,7,8], Bên cạnh đó, đãcó rat nhiều nghiên cứu trên thế giới về hoạt tinh tác động lên quá trình đông — chảy

máu của noc độc các loài bò cạp như Tityus Discrepans, Buthus Martensii Karsch[8],

Ngày nay, những van dé về đột quy, mat máu, chậm đông máu, thiéu máu nãođang là van dé được rất nhiễu nhà khoa học trên thế giới quan tâm, trong đó có cảViệt Nam Số lượng bệnh nhân chết về nhồi máu cơ tim, đột quy hơn khoảng 10000bệnh nhân, đây là một con số khá cao Và nguyên nhân chính là do tình trạng rỗi

loạn đông máu gây nền.

Để có thể đóng góp một nguồn nguyên liệu mới cho ngành dược dùng làmthuốc chữa bệnh, và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo; nhóm nghiên cứuchúng tôi đã tiễn hành các nghiên cứu về noc bò cạp Heterometrus laoticus Qua đềtài “Nghiên cứu và khảo sát các thành phân có hoạt tính chống đông máu từ

mới vê noc bò cap Heterometrus laoticus, chúng tôi hi vọng sẽ mang đên cơ sở chonhững nghiên cứu tiêp theo về việc ứng dung cua noc bò cạp được rộng rãi hon.

TÔNG QUAN

I1 GIỚI THIỆU VE BO CAPBò cạp là loài động vật chân khớp đã có từ lâu đời trên thế giới Trải qua hơn450 triệu năm tiến hóa, hình dạng của bò cạp không thay đổi nhiều [9, 10] Bêncạnh việc nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính đa dạng loài, phương diện sinh thái,các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu các thành phan cua noc độc bò cạp Hướngnghiên cứu nay dang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học vi nocbò cạp chứa nhiều thành phan có hoạt tính sinh học

1.1.1 Phân bố địa lýBò cạp có thể gặp ở mọi miền địa lý trên thế giới, thường xuất hiện ở nhữngvùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Bò cạp sống trong rừng, sa mạc, trong hang và vàiloài còn được tìm thay dưới các tang đá ở những núi có độ cao 5000 m [11]

Có khoảng 2000 loài bò cạp, thuộc 20 họ khác nhau, phân bồ rộng rãi nhất tạinhững vùng phía nam của vĩ tuyến 45 Bắc (ngoại trừ New Zealand và Nam cực) Vídụ như: giống Androctonus, Leiurus: phân bỗ chủ yếu ở Châu A, Bắc Phi, TrungĐông [12, 13]; giống Tityus phân bố ở Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazil, Venezuela,Columbia và Argentina) [14]; giống Centruroides phân bố ở Trung Mỹ [15]; giốngHeterometrus phân bỗ ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam A (Campuchia,Lào, Thái Lan, Việt Nam), cũng như Ấn Độ, Sri Lanka, Nepal và Trung Quốc (Tây

Tạng) [16, 17].

Ở Việt Nam, bò cap phân bố khắp nơi trong nước từ đồng bang đến miễn núitrong những khu rừng âm ướt và hải đảo Có bốn họ thuộc bộ bò cạp: Buthidae,

Scorpionidae, họ Chaerilidae và họ Pseudochactidae Trong đó, họ Buthidae và

Scorpionidae chiếm nhiều nhất [18] Chúng phân bố ở các vùng khác nhau [18, 19,

20, 21,22, 23):Ho Buthidae:

~ Lychas mucronatus Fabricius: phân bỗ ở các tỉnh miền Trung và miền Nam,phát triển mạnh về số lượng cá thể ở Đồng Phú (Bình Phước)

~ Isometrus basilicus karch: phan bố ở các tinh Nghệ An, Quảng Tri, BìnhĐịnh, Khánh Hoà (Trường Sa) Bình Phước (Đồng Phú).

— Isometrus sp: phân bỗ ở Nghệ An (Vinh).— Isometrus deharvengi sp: phân bỗ ở Hòn Chồng, Kiên Giang

~ V thienduongensis Lourenco & Pham, 2012.

Va trong năm 2013, vừa phat hiện loài bọ cạp mới ở miền núi phía bắc Việt

Nam có tên có tên khoa học Euscorpiops cavernicola Lourenco & Phạm Loài bò

cạp mới này thuộc họ Euscorpiidae, phân bố ở hang Hua Ma, xã Quảng Khê (huyệnBa Bẻ, tỉnh Bắc Kạn) [24]

Trong nghiên cứu này, đối tượng chúng tôi để cập đến là loài bò cạp đenHeterometrus laoticus phân bỗ ở An Giang Đây là loại bò cạp den hay bò cạp rừng,chúng hầu hết được tìm thấy ở vùng có than bùn ở Lào, vùng Nam Bộ của Việt

Nam và ở Thái Lan Cơ thể có màu đen hoặc xanh đen, chiều dài trung bình khoảng

Bên cạnh sự biến đổi về màu sac, kích thước cũng tăng dan qua các lần lộtxác Ví dụ: loài Heterometrus spinifer có chiều dài cơ thé qua các tháng tuổi như

sau: thang |: 12 15 mm, tháng 2: 32 40 mm, tháng 3: 44 51 mm, tháng 4: 56 62 mm, tháng 5: 69 - 75 mm, tháng 6: 82 - 90 mm Trong phòng thí nghiệm, ở dang

-trưởng thành loài này có chiều dài từ 95 -110 mm, trong tự nhiên có thể dài 125 mm

[18].

"

-„ oS MR x⁄; ¿ at VN ee> “Hetérometnis tongimanus: jaysL

(Nguồn Internet)Hình 1.2: Sự phát triển của bò cạp H.spinifer

1.1.2.2 Đặc tính sinh học

Toàn thân bò cạp được bao bọc bởi một lớp giáp băng chất sừng, ở một số chỗcó lông làm cơ quan cân bằng Một lớp phủ ngoài giáp trong suốt, khi có tia tửngoại sẽ chuyên thành màu xanh lục huỳnh quang [2] Thân bò cạp có tất cả khoảng18 đốt, chia làm hai phan: phan đầu ngực (đốt thân trước) và phan bụng (vùng thânsau), phần bụng này gồm cả bụng trước và đuôi [2]

Phần đầu ngực có 7 đốt, đốt đầu có 2 mắt giữa và 6 mắt bên, đốt 2 có câu túcvà miệng, đốt 3 có chân xúc giác (càng), 4 đốt còn lại mỗi đốt có một cặp chân.Phần bụng trước có 8 đốt, hai đốt đầu tiên chứa cơ quan sinh dục và nắp sinh dục

(chỉ còn dâu vết trong quá trình tiên hóa), đôt kê là cơ quan cảm giác — lược pectine,

các đốt còn lại bao gdm 4 đôi túi hô hấp mở ra ngoài là 4 đôi lỗ thở trong túi cónhiều tâm kitin xếp song song, bên trong có khe dé máu di chuyền trao đôi khí CO;và O; với không khí [2] Phần đuôi hep lai gồm 5 đốt, hậu môn của bò cap năm ởđốt cuối cùng, đồng thời tại đốt này chứa tuyến độc và mũi tiêm noc độc [2, 18].

1.1.2.3 Tap tính sinh học

Tuổi thọ của bd cạp phụ thuộc vào loài, cá thé, thức ăn, chuyển hóa và bệnhtật Bò cạp có thể sống từ 4 - 25 năm (loài Hadrurus arizonensis thọ 25 năm); trongthiên nhiên, loài Hadogenes sông được 25 - 30 năm [2, 18] Môi trường sống cónhiệt độ cao và phạm vi hoạt động kiếm ăn rộng giúp gia tăng sự trưởng thành, tuynhiên sẽ làm giảm tuổi thọ của loài [27] Bò cạp thích sống tại những vùng nhiệt độthay đối từ 68 đến 99 độ F (20 - 37°C) giới hạn chịu dựng khoảng 14 - 45°C [27,

28].

Bò cạp là loài động vật sống về đêm, ban ngày hay đào hang tìm noi trú anmát mẻ (dưới hoặc trong kẽ các tảng đá, các thần g6 muc, ), ban đêm ra ngoài sănmôi Bò cạp thường sợ ánh sáng và các loài chim, than lăn, những thú có túi và

chuột [27].

Bò cạp là động vật ăn thịt, thức ăn của chúng rất đa dang, từ các loài côn trùngvà những động vật thân khớp nhỏ như: nhện, rudi, dán, bướm, cào cào, châu chau,kiến, rết tới những con chuột nhắt mới sinh [29] Đầu tiên chúng dùng càng dé batmôi, tùy vào lượng noc độc và kích cỡ càng mà bò cạp sẽ chích độc hay dùng càngép con môi Cách này có thé làm tê liệt, thậm chí giết chết con môi dé sau đó bọ cạpcó thé ăn [27, 30] Bò cạp có một kiểu ăn duy nhất là sử dụng chân kim (là nhữngvuốt nhỏ từ miệng) dé nghiền mỗi, và chỉ có thé tiêu hóa thức ăn ở dang lỏng, tất cảchat ran (lông, bộ xương ngoài, của con môi) đều bị chúng bỏ lại [2, 30]

Bò cạp khá là nhút nhát và vô hại với con người, chúng chỉ phun nọc khi bắtmôi hoặc tự vệ Trong một số trường hợp nguy hiểm, bò cạp thường bỏ chạy tìmcách an mình hoặc là đứng yên [2]

1.1.2.4 Sinh sản và phát triển

Bò cạp sinh sản theo phương thức hữu tính, có con đực và con cái riêng biệt,ngoại trừ vài loài có cách sinh sản v6 tính Bò cạp Heterometrus thường sinh sản

Bo cap con sinh ra sẽ được mang trên lung me trong một thời gian ít nhất làmột kỳ lột xác Trước kỳ lột xác đầu tiên, bò cạp con không thể sống sót nếu khôngphụ thuộc vào mẹ chúng Sau 5 — 7 lần lột xác, bò cạp mới trưởng thành và rấtgiống bố mẹ của mình Lớp vỏ mới sau mỗi kỳ lột xác rất mềm, nhưng sau đó sẽcứng dan theo tiến trình keratin hóa [2, 11].

1.2 NỌC BÒ CẠP1.2.1 Giới thiệu về độc tinh của noc bò cap

Tất cả các loài bò cạp được nghiên cứu đến nay đều có nọc độc Nọc độc củatat cả các loài bò cạp đều có độc làm hủy than kinh, ngoài trừ loài Hemiscorpiuslepturus có noc độc hoại tế bào Bò cạp dùng noc của mình dé giết hay làm tê liệtcon mồi trước khi ăn thịt [31] Noc bồ cạp có độc tố đối với động vật, côn trùng và

các loài giáp xác.

Với hơn 1500 loài bò cạp trên toàn thế giới thi phan lớn là vô hại đối với conngười, chỉ khoảng 20 - 25 loài được xem là nguy hiểm Một số bò cạp có nọc độcmạnh và nguy hiểm như họ Buthidae (Leiurus quinquestriatus), chi Parabuthus,Tityus, Centruroides va Androctonus Nọc độc của các loài bò cap có thể gây đau,sưng phông, tê liệt, hay bị cảm giác khó chịu kèm theo các phản ứng toàn thân nhưnôn mửa, bắp thịt co tê, mắt mờ, chảy nước bọt, khó nuốt, tinh thần bất 6n và có thédẫn đến tử vong [31] Nhưng thật ra, lượng noc cua một con bò cạp không du đểgiết chết một cơ thé trưởng thành khỏe mạnh, chỉ có một số trường hợp dị ứng vớibò cạp mới có thể gây tử vong nhanh Thông thường, sau khi bị bò cạp chích, vị trí

lân cận sẽ đau tê cứng trong vài ngày, sau đó sẽ trở lại bình thường [32].Nọc bò cạp H.laoticus thường không độc, nhưng gây ra sự sưng phù, đau va

vùng bị chích có màu đỏ khoảng vài giờ đến nhiều ngày [16, 17].1.2.2 Thanh phan hóa hoc va dược lý của noc bò cap

Nọc bò cạp là nguồn giàu các chất có hoạt tính sinh học, là một hỗn hợp gom

cac polypeptide, mucoprotein, mucopolysaccharid, lipid, enzyme, nucleotide, cacamin sinh học, glycosaminoglycan, hemotoxin, một lượng nhỏ hyaluronidase,

phospholipase, những chat có khối lượng phân tử tương đối thấp như serotonin,

histamin, các chất ức chế protease, và các thành phân chưa biết [33, 34] Trongđó, quan trọng nhất là các độc tố thần kinh, những polypeptide toxin tác động lêncác receptor và các kênh ion cua tế bào thần kinh [3, 4 9, 26, 34] Các nghiên cứucho đến nay đã xác định được khoảng 250 độc tố thần kinh từ nọc bò cạp [35] Bêncạnh các độc tô thần kinh, trong noc độc bò cạp còn có những polypeptide, các

enzyme phospholipase tác động lên quá trình đông - chảy máu [8].

1.3 TINH HÌNH NGHIÊN CỨU VA UNG DUNG NOC BO CAP TRENTHE GIOI VA O VIET NAM

1.3.1 Tinh hình nghiên cứu trên thé giớiCác nghiên cứu trên thé giới đã xác định trong thành phan noc bò cạp có rấtnhiều các chất có hoạt tính sinh học tác động lên trên hệ thống thần kinh và quá

trình đông — chảy máu.

Độc tố than kinhTrong các thành phần có hoạt tính sinh học trong nọc bò cạp, các polypeptide -neurotoxin là thành phần được nghiên cứu nhiều nhất, chúng tác động lên cácreceptor và các kênh Ion của các màng tế bào bị kích thích [3, 4, 26] Phụ thuộc vào

tác động của các toxin với các kênh ion, phân chia làm 4 loại toxin tác động với các

kênh ion: kênh Na”, kênh K*, kênh Cl’, kênh Ca’* [36].Các toxin tác động lên kênh Na” thường là một chuỗi polypeptide được cautao từ 60 — 76 gốc acid amin và cau trúc của chúng được 6n định bởi bốn cầu

disulfide [33, 36, 37, 38] Các toxin tác động lên kênh K” là những polypeptide

ngan, duoc cau tạo từ khoảng 31 — 39 sốc acid amin liên kết với ba hoặc bốn cầudisulfide |4, 39] Các toxin này liên kết với bề mặt ngoài tế bao và can trở sự dichuyển qua màng tế bào của kênh K* [39] Các toxin tác động lên kênh CaTM* đãđược xác định gồm hai peptide, các peptide này làm thay đổi sự liên kết củaryanodine với kênh Ca** [40] Trong số đó, có một toxin được xác định là peptidecó cấu tao từ 33 amino acid làm tăng sự liên kết với ryanodine, va toxin con lại làheterodimer peptide cấu tao từ 104 và 27 amino acid có vai trò làm ức chế sự liênkết với ryanodine [40] Chlorotoxin, độc tố cực độc tác động lên kênh Cl là peptidecầu tạo từ 36 sốc acid amine với bốn cau disulfide [41]

Trong khi cầu trúc bậc một của các độc tố noc bd cạp khác nhau thì cầu trúckhông gian của chúng khá giống nhau Trừ cau trúc không gian của các độc tố tácđộng lên kênh CaTM* là chưa biết, phần lớn các peptide độc tố bd cạp đều cấu tạo bởimột alpha-spiral và ba hay bốn nhánh của cấu trúc beta (cấu trúc beta được taothành bởi các chuỗi peptide đối song song) và được 6n định bởi các cau disulfide

[36, 39].

Hình 1.3: Cấu trúc toxin của nọc bò cạpA Cấu trúc toxin dài

B Câu trúc toxin ngắnẢnh hưởng lên quá trình đông — chảy máuTrong tất cả các nghiên cứu về nọc độc, nọc rắn là đối tượng đã được quantâm nghiên cứu nhiều nhất, và đã phân lập được các thành phan có hoạt tính chốngđông máu và gây xuất huyết từ loại nọc này như: protease, metalloproteinase, C-type lectin, disintegrin và những phospholipase [8] Các thành phan này gây rồi loạntiêu cầu và ảnh hưởng lên quá trình đông máu như: quá trình hình thành phức hợpprothrombinase, quá trình fibrinogen dạng hòa tan chuyển thành fibrin không hòa

tan, quá trình hình thành mạng lưới fibrin [42, 43].

Bên cạnh nọc răn, trong nọc bò cạp của các loài: Buthidae, Caraboctonidae,Iuridae, Ischnuridae, Scorpionidae, Vejovidae, cũng có nhiều peptide và proteincó hoạt tính chong đông mau [8] Nọc độc cua loài Parabuthus transvaalicus,

Parabuthus imperator kéo dài thời gian đông mau từ 2,3 — 2,5 so với thời gian đông

máu của mẫu chứng, đối với một số loài khác chỉ từ 0,8 -2,0 lần [44] Nọc độc củabò cạp Buthus tamulus cũng gây rỗi loạn đông máu nội mạch lan tỏa, và được thửnghiệm in vitro ở liều gây chết đã làm thay đối cơ chế đông máu của thỏ khi tiêmtĩnh mạch |45] Gần đây, các nghiên cứu về nọc độc của loài bò cạp Tityusđiscrepans, cho thay với ham lượng noc cao khi tiêm vào mau sẽ làm tăng mức độnghiêm trọng của các triệu chứng ngộ độc như thay đổi thời gian thrombolpastin(PTT) và thời gian prothrombin (PT), gia tăng nồng độ các cytokine, amylase và

glucose [46].

Các enzyme phospholipase (PLA2s) chống đông máu được phân chia làm 3nhóm khác nhau về hiệu quả ức chế quá trình chéng đông máu: nhóm A là nhữngPLA2s có tác động chống đông máu mạnh, nhóm B là những PLA2s chỉ có tácđộng chống đông máu ở nồng độ cao, và nhóm C là những PLA2s có tác độngchống đông máu ở biên hay không có tác động [47] Những PLA2s được phân lậptừ bò cạp được xếp vào giữa nhóm B và nhóm C [8] Trong số 12 PLA2s được phân

lập từ các loài bò cạp như: Anuroctonus phaiodactylus, Pandinus imperator,Opisthacanthus cayaporum, Hadrurus gertschi, có enzyme Imperatoxin inhibitor

(IpT xi) của P.imperator và Phaiodactyliphin của A.phaiodactylus đã được công bốlàm trì hoãn thời gian đông máu đối với những cơ thể sống có số lượng tiểu cầuthấp và lượng huyết tương cao [48, 49]

Imperatoxin inhibitor (IpTxi) và Phaiodactylipin là hai peptide được phan lậptừ noc độc của loài bò cap P.imperator, đã được xác định làm trì hoãn thời gian

đông máu trên cơ thể sống |49] IpTxi với khối lượng phân tử 14314 Da vàPhaiodactylipin với khối lượng phân tử 19172 Da So sánh hoạt tính ảnh hưởng lên

quá trình đông máu của hai peptide này đã xác định được IpTxi có hiệu quả hơn sovới Phaiodactylipin [49].

Bên cạnh những protein có khối lượng phan tử cao (trên 30 kDa) và nhữngPLA2s có khối lượng phân tử trong khoảng 14 — 16 kDa, trong noc độc của bò cạpcũng có những peptide có khối lượng phân tử nhỏ có hoạt tính chồng đông máu [8]

Các nghiên cứu trên noc độc của loài Buthus Martensii Karsch cũng đã chỉ ra có

tác động chong đông máu, nghiên cứu này được thực hiện trên cả hai phương pháp

in vivo va in vitro [50] Qua đó đã phân lập và đặt tên cho peptide vừa tìm được làpeptide scorpion venom active polypeptide (SVAP), peptide này ảnh hưởng lên qua

trình tao cục máu đông và lam thay đôi Thromboxane Ba và 6-keto-protaglandin Fj,

[50] Dựa trên peptide này, các nha khoa học đã nhan bản thành công một peptidemới và đặt tên là peptide Buthus Martensii Karsch APi (BmKAPI) [51] BmKAPi

được mã hóa từ peptide cầu tạo gom 89 amino acid và năm cau disulfide [51] Cócau tạo khác so với các peptide có trong noc độc bò cạp nên cau trúc ba chiều củaBmKAPi có thé cũng sẽ khác Nghiên cứu trình tự acid amin của BmKAPi đã xácđịnh hoạt tính chống đông máu của BmKAPi thấp hơn so với một số peptide chốngđông máu được phân lập từ giun móc, ong mật [51] Gần đây, nhà khoa học Brazónvà các đồng nghiệp của mình đã đưa ra một peptide ức chế plasmin, có khối lượngphân tử khoảng 6000 Da, có hoạt tính chống tiêu sợi huyết tương có tên gọi làdiscreplasminin, được phân lập từ loài bò cạp Tityus discrepans va đang tiếp tụcnghiên cứu các thành phân có hoạt tính từ nọc của loài này [52, 53]

Nghiên cứu về bò cạp H.laoticusNhững nghiên cứu về loài bò cạp H.laoticus không nhiều Từ noc độc của loàinày, người ta đã phân lập được hai toxin Toxin đầu tiên được phân lập là

Heteroscorpine-1 (HS-1) thuộc ho Scorpine từ noc bò cạp H./aoficus ở Thái Lan có

khối lượng phân tử là 8293 Da với 6 gốc cysteine [54] Toxin này đã được xác địnhcó độc tính đối với côn trùng và có tính kháng khuẩn, kháng nắm [54] Toxin thứhai đã được tách từ noc độc của bò cạp H laoticus băng phương pháp sac ký lỏngcao áp, và đã xác định là polypeptide HelaTx1 có khối lượng phân tử là 2763 Davới 4 sốc cysteine [55] HelaTx1 tác động có hiệu qua đối với kênh K,1.1 và K,1.6với nồng độ thấp (K,1.1 ECso = 9,9 + 1,6 „M), tuy nhiên lại không làm thay đối sựhoạt động của các kênh K” này [55] HelaTx1 1a peptide đầu tiên đã được phân lập

từ noc bò cạp H.laoticus có tác động lên kênh « - KTx5 [55].

Đó là những nghiên cứu về độc tố thần kinh của noc bò cạp H.laoticus, cònđộc tố ảnh hưởng lên quá trình đông — chảy máu, đang trên quá trình phân lập và

xác định các loại toxin này Đây là hướng nghiên cứu có ứng dụng trong y học caocủa loài bò cạp H.laoficus.

1.3.2 Tinh hình nghiên cứu 6 Việt Nam

Ở Việt Nam, từ xa xưa, cha ông ta đã sử dụng bò cạp trong y học cô truyền vớitên gọi là toàn yết — dùng nguyên con, hay yết vĩ — dùng phan đuôi có túi noc đểđiều trị các chứng bệnh có liên quan đến hệ thần kinh như động kinh, co giật, liệtbán thân bat toại, méo miệng, [1, 2] Ngoài ra, bò cạp còn được ngâm trong cônđược dùng để làm thuốc xoa bóp chữa đau cơ, xương và nhức mỏi mang lại hiệu

quả cao [26].

Tại Việt Nam, một số loài bò cạp đã được nghiên cứu tính chất và thành phân

như: Lychas mucronatus, Heterometrus laoticus Tu noc bò cạp nâu L.mucronatus,nhóm nghiên cứu của TSKH Hoang Ngoc Anh, đã tách được một glycoprotein có

hoạt tính lectin và các toxin ngăn có khối lượng phân tử trong khoảng 3,5 — 5,0 kDacó tác động lên myelin than kinh [23, 39] Một trong những độc tố thần kinh này đãxác định được cấu trúc bậc một một phần của một độc tố và xác định cẫu trúc toànphan của một độc tố khác, kết quả nay đã đăng ký ở ngân hàng dữ liệu của protein[23] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu này đã xác định độc tính cấp và tác động kháng

viêm giảm đau cua noc bò cạp nâu L.mucronatus [56].

Đối với nọc bò cạp đen, H.laoticus, nhóm nghiên cứu này đã khảo sát thànhphần protein và dược tính của nó Xác định được loại nọc này chứa các thành phânđộc với động vật và độc với côn trùng, noc toàn phan có tác động kháng viêm, giảmđau [56, 57, 58] Đã xác định được khối lượng phân tử của 2 toxin ngắn có độc tính

với côn trùng là 317,974 Da và 832,600 Da [59] Và mới đây, từ noc bò cạp

H.Laoticus nhóm nghiên cứu nay đã tach và xác định được cầu trúc một toxin.Toxin này được đặt tên là Hetlaxin [60] Hetlaxin có khối lượng phân tử là 3669,2với 8 gốc cysteine hình thành nên 4 cầu disulfide Đây là toxin tác động lên kênhK,1.3 với nồng độ nanomol (ECs = 0.48 + 0,01 „M) đầu tiên được phân lập từ noc

từ noc bò cap H.laoficus băng sắc ký lọc gel Qua đó, người ta đã xác định 3 phân

đoạn có tác động đông — chảy mau, đó là: phân đoạn 2, phân đoạn 4 và phân đoạn 5

[62] Dựa trên cơ sở này, chúng tôi chọn nghiên cứu sâu hơn về tác động chốngđông máu của các phân đoạn thứ cấp từ phân đoạn 5, phân đoạn có tác động lên quá

trình đông — chảy máu.

1.3.3 Cac ứng dụng từ noc bo cạp

Tuy nọc bò cạp là độc, nhưng trong thành phần nọc bò cạp có chứa các chất có

hoạt tính sinh học, các protein đặc hiệu, chỉ với hàm lượng nhỏ nhưng đã gây tác

động lên cơ thể sống [55, 60] Chính vì điều nay đã hấp dẫn các nhà khoa hoc

nghiên cứu khảo sát và đưa nọc bò cạp vào ứng dụng trong y học.

Hiện nay trên co sở các toxin đã nghiên cứu được từ noc bò cạp người ta đã

ứng dụng để tạo ra nhiều loại thuốc chữa các bệnh hiểm nghèo Tt các toxin tacđộng lên kênh K”, các nha khoa học đã thử nghiệm san xuất ra các loại thuốc điềutri các bệnh thần kinh như: Azheimer, Parkinson, [4, 7, 39] Margatoxin tách từ

noc bò cạp Centruroides margaritatus đã được hãng Merck (Đức) đăng kí bản

quyền như thuốc dé điều trị bệnh tự miễn dịch hoặc ngăn cản sự đào thải trong quátrình cây ghép các cơ quan [63, 64]

Vào năm 1991, ông DeBin - nhà độc chất học đã chứng minh trong nọc bò cạpchứa chất chlorotoxin cực độc có tác động ức chế kênh vận chuyển clo qua màng tếbào [6, 65, 66] Giáo sư đã tiêm chất độc này vào chuột và quan sát hiện tượng biếnđối điện thé màng tế bao Điện thé mang tăng lên, từ -90 mV đến -20 mV và kéo dàitrong khoảng 6 giây, điều nay được giải thích là do sự ức chế kênh CI’ gây ra và có

ý nghĩa lam sang lớn [41, 66] Dựa trên co sở này, đã có những nghiên cứu phân lập

chlorotoxin từ noc bò cạp Leiurus quinquestritus va đã được sử dụng để điều trị

bệnh ung thư não [66].

Từ nọc bò cạp xanh Rhppalurus junceus, các nhà khoa học Cuba đã bào chế rathuốc điều trị ung thư Vidatox, có tính kháng tế bào ung thư và kháng viêm cao [7].Dưới tác động của chất này, khối u không phát triển được do bi ngăn chặn sự nuôidưỡng từ mạch máu và đưa đến các chất gây miễn dịch tại khối u Điều này đã mở

ra hi vọng mới cho các bệnh nhân ung thư [5, 7].

Sự thay đối cau trúc bậc một của toxin bd cạp có thé sử dụng để chế tạo ranhững loại thuốc mới với những hoạt tính riêng Như nghiên cứu cau trúc củacharybdotoxin đã mở ra khả năng sản xuất những protein nhỏ nhưng ổn định có

những hoạt tính mới trong y dược [9].

Ngoài chức năng ngăn ngừa và điều trị ung thu, thi noc độc bò cạp còn có tínhkháng khuẩn và kháng nắm [59], nên cũng có thể dùng làm thuốc trị các bệnh do vikhuẩn và nắm gây nên; dùng trong chế phẩm thuốc hạ sốt, chỗng viêm và giảm đau[9, 56, 67, 68] Với các neurotoxin chứa các hoạt tính dược lý va một SỐ protein, đã

được nghiên cứu và khảo sát, chứng minh nọc bò cạp có tác động kháng viêm [67],giảm dau [68, 69].

Bên cạnh tác động gây độc thần kinh đã được nghiên cứu và khảo sát thì tácđộng gây rối loạn đông máu của nọc bò cạp cũng đã mở ra nhiều triển vọng mới yhọc để điều trị tình trạng rối loại đông mau gây ra các bệnh có tỷ lệ tử vong cao [8]

Các nhà khoa học đã xác định được những protein, enzyme phospholipase có tác

động lên quá trình đông — chảy máu và đang tiếp tục nghiên cứu để đưa vào ứng

Có rất nhiều phương pháp xác định khác nhau phụ thuộc vào đối tượng khảosát và tùy theo chiều hướng khảo sát loại chất đạm nào sẽ lựa chọn phương phápthích hợp như: phương pháp li tâm siêu tốc, phương pháp đo độ hấp thụ của dung

dịch protein ở vùng tia tử ngoại, hoặc dựa vào các phản ứng so màu đặc trưng

(Lowry, Biure, ) hay có thé xác định băng phương pháp gián tiếp Kjeldahl thông

qua xác định N-protein [70].

Trong luận văn này, sử dụng phương pháp so màu Lowry để xác định hàm

lượng protein hòa tan trong nước của noc bò cạp đen H.laoficus.

1.4.1 Phương pháp Biuret

Các hợp chất Hữu cơ nói chung, peptide va protein nói riêng chứa từ hai liênkết peptide (-CO-NH-) trở lên đều có khả năng tạo phức chất có màu tím đỏ đến tímxanh với CuSO, trong môi trường kiểm mạnh Phức chất này có độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 540 nm [70].

Cường độ mau tỉ lệ với số lượng liên kết peptide (-CO-NH-); nghĩa là tỷ lệ vớihàm lượng của lượng protein [71] Do vậy, dựa vào máy quang phổ dé suy ra hàmlượng protein của một hợp chat bat kỳ

Phương pháp này dé dàng thực hiện và cho kết quả 6n định đối với các loạiprotein khác nhau Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp Biuret là có độ nhạykém, và các mẫu nghiên cứu có khối lượng protein tương đối lớn (> vai mg/mL)

[70].1.4.2 Phuong pháp Lowry

Tương tự như phương pháp Biuret, xác định hàm lượng protein dựa vào cường

độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphovolphramat tại bướcsóng 750 nm (bước sóng có độ hấp thu cực dai) [70]

Phương pháp nay sử dụng phối hợp phản ứng Biuret (tác động lên liên kếtpeptide) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc Tyrozin,

Tryptophan) tạo ra phức màu xanh đặc trưng.

Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy tương đối cao, có thể xác định mẫu

chứa hàm lượng khoảng vài chục pg protein; nhưng bi ảnh hưởng mạnh bởi(NH4)2SOq4 (> 15%), glycine (> 0,5%), và mercaptan [70, 71, 72|.

1.4.3 Phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford dựa trên sự thay đổi bước sóng hap thu cực đại củathuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein trong môi trườngacid [71] Bước sóng thay đổi từ 465 nm (của thuốc nhuộm) lên 595 nm (của phứcchất liên kết với protein) [71]

Phương pháp xác định này có độ nhạy cao (cho phép phát hiện tới vài chục pg

protein/mL), dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian (màu xuất hiện sau 2 phút và 6nđịnh trong 1 giờ); trong dung dich mẫu nếu có Triton X-100, sodium dodecyl

sulfate sẽ gây nhiễu kết quả [70].1.5 SẮC KÝ LOC GEL PHAN TÍCH THÀNH PHAN NOC BO CAP

1.5.1 Khái niệm

Sắc kí lọc gel (sắc kí rây phân tử) là phương pháp tách dựa trên sự khác nhauvề kích thước phân tử của các chất Một số vật liệu rắn xốp có khả năng tạo ra bộkhung gel hay rây phân tử khi gặp dung môi tách Pha tĩnh trong sắc kí lọc gel làdung môi trong các lỗ của hạt gel, còn pha động chính là dung môi chạy qua [73].Khi dung dịch cần phân tích đi qua bộ khung gel hay rây phân tử do có kích thước

phân tử khác nhau nên sẽ có khả năng khác nhau khi qua gel.

khe hở của các hạt gel và theo pha động đi ra khỏi cột sớm hơn với thời gian lưu

thấp [73] Ngược lại, các cau tử nhỏ hơn có thé thông qua các 16 rỗng đi sâu vào bêntrong các hạt gel, bị lưu giữ tạm thời trong các lỗ rỗng này và đi ra khỏi cột chậmhơn với thời gian lưu dài Như vậy trong sắc kí lọc gel, các cau tử trong dung dich

phân tích sẽ được phân tách theo thứ tự giảm dân về kích thước phân tử [73].1.5.3 Một số thông số vật lý của sắc ký lọc gel

Giới hạn tách (exclution limit): là khối lượng của phân tử nhỏ nhất không

chui vào bên trong hạt gel [74].

“Phạm vi tách (fractionatinon range): là khoảng giới hạn mà gel dễ dàngphân tách chat được [74]

“Độ ngậm nước (water ragain): là lượng nước ma | gam bột gel khô hút

nước, không tính đến lượng nước bao quanh hat [75].Thể tích nền (bed volume): là thé tích cuối cùng khi 1 gam gel khô hap thu

khi trương nở trong nước [7Š].

~ Hạt gel (gel particle): hạt gel hình cầu có nhiễu lỗ.Kích thước hạt được xác định băng đường kính hạt (bead diameter) tính theopm Hạt có kích thước lớn (100 — 300 pm) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưngkhả năng phân tach hop chất thấp Ngược lại, những hat mịn (10 — 40 pm) có khanăng phân tách hợp chất tốt nhưng tốc độ dong thap Thường lựa chon hat gel cókích thước 50 — 150 um dé nhdi cột sắc ký, vì cho tốc độ dòng chảy trung bình vàkha năng tách tương đối tốt [73, 75]

- Thể tích rửa (elution volume): là thé tích đệm cần thiết làm pha động dé đưachất cân tách ra khỏi cột [75]

Thể tích trong (void volume): là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel

trong cột [75].

1.5.4 Pha tĩnh của sắc ký lọc gelViệc tách trong sắc ký lọc gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạngkhông gian ba chiều Hạt gel phải có kích cỡ giống nhau có tinh tro về mặt hóa học,bên vé mặt cơ học, các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất Các hạtgel có dạng hình cau, hạt gel có kích thước càng nhỏ càng tốt vì như thé đảm bảo

dong chảy [73, 75].Cỡ hạt gel thường được sử dụng là 10 — 40 pm hay 20 — 80 pm Hạt nhỏ hơn

cho kết quả tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện dài hon [74] Các loại gel phố biếnnhất hiện nay như dextran, polyacryamit, polyvinyacetate, polystyrol hoặc các rây

phân tử vô cơ như zeolit tổng hợp, thủy tinh xốp, silicagel [73] Việc chọn gel, yêu cầu quan trọng nhất là phải chọn gel có khả năng tách đượccác chất có kích thước phân tử hoặc khối lượng phân tử trong vùng chúng ta cần, dođó phải hết sức can thận chọn kích thước của gel (nếu can, phải tiễn hành thí

nghiệm thăm dò trước) [73, 75|.1.5.5 Chon cot

Với từng loại mục dich phan lập loại hợp chất mà chọn cột phù hợp Dé táchnhóm chất chỉ cần cột dài hơn 50 em, tỉ lệ chiều dài cột so với đường kính ở khoảng5 — 10 lần, và thé tích lớp nền gap 4 — 20 lần thé tích của mẫu [73, 75]

Đối với quá trình tách các phân đoạn thì cần cột dai hơn 100 em va tỉ lệ chiềudài lớp nên so với tỉ lệ đường kính là 25 - 100 lần hoặc lớn hơn và thể tích lớp nềngap 25 — 100 lần thé tích mẫu [72, 75]

1.5.6 Dung môi và tốc độ dòng chảyLựa chọn dung mồi phụ thuộc vào tính tan của hỗn hợp tách; dung mỗi có thể

là nước, toluene, chloroform

Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảytự do Đối với gel có kích thước lỗ nhỏ thì tốc độ khoảng 8 — 12 mL/cm? mặt cắtngang (15 — 25 mL/h), đối với gel lỗ lớn thì 2 — 5 mL/cm? (5 — 10 mL/h) [74] Dòngchảy có thể chảy theo cách chảy tự do hoặc dùng bơm nén tùy vào loại gel sử dụng

~ Lam sạch các phân tử sinh hoc [74].

16 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.6.1 Khái niệm

Đông khô là phương pháp sấy thăng hoa đệm ở nhiệt độ và áp suất thấp Là

phương pháp được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, dược phẩm dé làmkhô các sản phẩm sinh học như: enzyme, protein, tế bào mà không ảnh hưởngđến những tính chất và hoạt tính của sản phẩm [73, 75].

Cách đông khô mẫu: đông lạnh nhanh mẫu nhờ dung dịch nito lỏng hoặc CO,tinh thé; và làm khô ở điều kiện lạnh trong chân không [75]

1.6.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khôNguyên tac của phương pháp đông khô là loại đệm ra khỏi nguyên liệu bằngcách chuyền mẫu đông khô từ trạng thái ran sang trạng thái khí, mà không qua giaiđoạn lỏng trong điều kiện hút chân không ở nhiệt độ thấp Quá trình được thực hiệnở nhiệt độ và áp suất thấp nên nguyên liệu không bị hỏng hay biến tính [73, 75].1.6.3 Uu điểm của phương pháp đông khô

Sau khi mẫu đem đi sấy thăng hoa thì tính chất lý, hóa, sinh của nguyên liệukhông thay đổi [75]:

Duy trì tạo hương, vi và các chất dễ bị phân hủy như vitamin, protein.Mau sac và hình dang của mẫu được giữ nguyên

Kéo dài thời gian sử dụng nhờ vào nguyên liệu có độ âm thấp.17 PHƯƠNG PHÁP SAC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

1.7.1 Khai niệm

Sac ky lỏng cao áp gọi tat là HPLC (High Performance LiquidChromatography) là phương pháp tách chất hoạt động theo nguyên tac của sắc kynhưng được hoàn thiện ở mức độ cao [73] Khác với phương pháp sắc ký cô điển,sắc ký lỏng cao áp đạt hiệu quả phân tách cao nhờ sử dụng các chất nhôi cột có kíchthước rất nhỏ (5 đến 10 pm)

Phương pháp này còn có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khácnhư: hoạt động ở áp suất cao, tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy nhanh, dễ thu hồimẫu [73]

Máy HPLC là một hệ thống gồm nhiều thiết bị được lắp ráp với nhau thànhmột khối hay nhiều khối riêng biệt ráp lại [73] Bơm cao áp và detector là hai bộphận quan trọng nhất của hệ thống máy HPLC.

1.7.2.1 Bình chứa dung môi giải ly cột

Bình chứa dung môi được làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh, luôn cómột nap đậy dé bảo vệ dung môi tránh bị bụi ban [73] Hệ dung môi dùng để giải lycột chứa trong những bình này Một hệ thong của may HPLC thường có 4 bình

dung mồi.1.7.2.2 Máy bơm

Hệ thống dùng bơm đặc biệt tương ứng với áp suất cao lên đến 7000 psi (48.3Mpa) để bơm một dung môi (còn gọi là pha động) đi qua lớp pha tĩnh trong cột vớivận tốc không đổi (khoảng 0,5 — 4,0 mL/phút) [73]

1.7.2.3 Cột sắc kýCột sắc ký dùng trong máy HPLC được làm băng thép không gỉ, có đườngkính trong từ 2,1 — 4,6 mm, chiều dài từ 10 — 25 em Bên trong cột được nhồi thật

chặt bởi các hạt nhỏ thật min [73 |.

Bảng 1.1: Các loại cột sắc ký lỏng cao áp dùng trong các kỹ thuật sắc ký [73]STT Loại cột Tính chất của hợp chất có thể phân tích

— Khôi lượng phân tử nhỏ (< 2000)

Cột pha thường, đảo |~ Không mang điện tích.

Ị pha, pha tạo nối ~ Có tính phân cực hoặc không có.

- Có thé hòa tan trong dung môi hữu cơ hay nước.— Khối lượng phân tử nhỏ (< 2000)

2 Cột trao đổi ion — Phân tử có mang điện tích

— Hoa tan được trong nước.

— Khôi lượng phân tử nhỏ hay lớn.3 Cột sắc ký gel — Không có mang điện tích

— Có thé hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.Các loại nguyên liệu dùng dé nhdi cột sắc ký HPLC là những hạt có kíchthước siêu nhỏ (microporous particle) với kích thước, hình dạng và độ rỗng khácnhau [73] Các loại nguyên liệu như: silica (loại được sử dụng nhiều nhất), alumin,Zirconium, nguyên liệu trao đôi ion [73],

1.7.2.4 Bộ phận tiêm mẫu vào máyCho mẫu vảo pha động là một vấn đề kỹ thuật của máy HPLC, vì khi đó hệthong dang ở áp suất cao [73] Bộ phận tiêm mẫu có cấu tạo đặc biệt giúp địnhhướng dòng chảy của pha động đưa mẫu vào cột sắc ký

1.7.2.5 Detector

Trong hệ thống HPLC, loại đầu đò thường được sử dụng nhiều nhất là đầu dohấp thu tia tử ngoại UV, vì loại detector này không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứngtuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất [73, 75] Đầu dò UV hoạt độngdựa trên sự hấp thy tia tử ngoại của cau tử trong mẫu phân tích mà dung môi phântích không có sự xuất hiện của cau tử nay [73, 75]

1.7.3 Dung môi dùng trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC)Hệ thống HPLC thường sử dụng hỗn hợp hai loại dung môi, đôi khi cũng cónhững quá trình phân tách sử dụng hệ bốn dung môi