Phát hiện Đột biến trên gen oca2 và Ứng dụng trong chẩn Đoán trước chuyển phôi bệnh bạch tạng type 2

Phát hiện Đột biến trên gen oca2 và Ứng dụng trong chẩn Đoán trước chuyển phôi bệnh bạch tạng type 2 Phát hiện Đột biến trên gen oca2 và Ứng dụng trong chẩn Đoán trước chuyển phôi bệnh bạch tạng type 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN OCA2

VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC CHUYỂN

PHÔI BỆNH BẠCH TẠNG TYPE 2

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN OCA2

VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC CHUYỂN

PHÔI BỆNH BẠCH TẠNG TYPE 2

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Triệu Tiến Sang PGS.TS Đỗ Thị Phúc

HÀ NỘI - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được bảo vệ trước bất kỳ hội đồng nào trước đây

Tác giả

Nguyễn Thị Nhung

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Triệu Tiến Sang – Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y, người đã luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu hoàn thiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đỗ Thị Phúc – Bộ môn Di truyền học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã luôn giúp đỡ, hỗ trợ tôi trên mọi phương diện trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị và các bạn trong Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học, quý thầy cô của Bộ môn Di truyền học và các Phòng chức năng trực thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi có môi trường học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt chương trình học Cao học

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 11 năm 2023

Học viên cao học

Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOANLỜI CẢM ƠNDANH MỤC HÌNHDANH MỤC BẢNGDANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

1.2.2.Các đặc điểm lâm sàng ở người bệnh bạch tạng 4

1.2.3.Đặc điểm lâm sàng bệnh bạch tạng tuýp 2 4

1.2.4.Cơ chế bệnh sinh của bạch tạng 5

1.2.5.Phân loại bệnh bạch tạng 6

1.2.6.Các phương pháp chẩn đoán, sàng lọc bạch tạng 7

1.2.7.Chăm sóc và điều trị người bệnh bạch tạng 8

2 Gen OCA2 9

3 Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho các bệnh đơn gen (PGT-M) 10

4 Tình hình nghiên cứu về chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh bạch tạng124.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

1 Đối tượng nghiên cứu 15

2 Hóa chất 15

3 Thiết bị 16

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

5 Phương pháp nghiên cứu 17

5.1 Tách chiết và bảo quản DNA từ mẫu máu ngoại vi 18

5.2 Kỹ thuật sinh thiết phôi 18

5.3 Kỹ thuật nhân bản toàn bộ hệ gen (Whole Genome Amplification - WGA) 18

5.4 Thiết kế mồi để khuếch đại đột biến đã xác định 19

5.5.4.Phân tích kết quả giải trình tự Sanger 23

5.6 Phân tích di truyền liên kết 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

1 Kết quả giải trình tự NGS 27

2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mang đột biến 29

3 Kết quả giải trình tự Sanger 30

3.1 Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen chứa đột biến OCA2.1 (OCA2 c.2344G>A.) 30

3.2 Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen chứa đột biến OCA2.2 (OCA2 c.2323G>A.) 32

4 Kết quả phân tích di truyền liên kết 37

5 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật chẩn đoán di truyền tiền làm tổ bệnh bạch tạng tuýp 2 43

6 Ưu nhược điểm của các phương pháp chẩn đoán PGT-M 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình minh họa cơ chế tổng hợp melanin và các lỗi trong quá trình sinh tổng

hợp melanin gây ra bởi các tuýp bạch tạng (màu đỏ) [12] 6

Hình 2: Vị trí gen OCA2 trên nhiễm sắc thể số 15 và hình minh họa protein mã hóa, màu đen là vùng xuyên màng [27] 9

Hình 3: Một số loại đột biến trên gen OCA2 [28] 10

Hình 4: Một số trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16

Hình 5: Sơ đồ tóm tắt các bước trong nghiên cứu 17

Hình 6: Thiết kế cặp mồi OCA2.1 khuếch đại exon 23 nhằm xác định biến thể NM_000275.3: c.2344G>A (NP_000266.2: p.Gly782Arg) 19

Hình 7: Thiết kế cặp mồi OCA2.2 khuếch đại toàn bộ exon 22 phát hiện biến thể NM_000275.3: c.2323G>A (NP_000266.2: p.Gly775Ser) 20

Hình 8: Kết quả chạy phản ứng gradient-PCR khuếch đại đột biến OCA2.1 c.2344G>A 20

Hình 9: Kết quả chạy phản ứng gradient-PCR khuếch đại đột biến OCA2.2 c.2323G>A 21

Hình 10: Bản đồ vị trí 2 STR được lựa chọn 24

Hình 11: Kết quả NGS của II-2 29

Hình 12: Phả hệ gia đình đối tượng nghiên cứu 29

Hình 13: Kết quả khuếch đại đoạn gen chứa đột biến OCA2.1 và OCA2.2 30

Hình 14: Kết quả giải trình tự Sanger xác định đột biến OCA2 c.2344G>A 31

Hình 15: Kết quả giải trình tự Sanger xác định đột biến OCA2 c.2323G>A 33

Hình 16: Dữ liệu phân tích khả năng gây bệnh bạch tạng của đột biến OCA2 c.2323G>A sử dụng phần mềm PolyPhen-2 36

Hình 17: Kết quả điện di mao quản với STR D15S661 39

Hình 18: Kết quả điện di mao quản với STR D15S1019 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Một số tuýp bạch tạng đã được nghiên cứu và công bố trên thế giới 7

Bảng 2: Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen đột biến 20

Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen OCA2 21

Bảng 4: Chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen OCA2.1 và OCA2.2 22

Bảng 5: Đặc điểm 2 STR được lựa chọn 24

Bảng 6: Trình tự các cặp mồi sử dụng khuếch đại các STR 25

Bảng 7: Chu trình nhiệt khuếch đại đoạn STR 25

Bảng 8: Thành phần phản ứng biến tính DNA trước khi điện di mao quản 26

Bảng 9: Kết quả NGS của I-1 không phát hiện đột biến 27

Bảng 10: Kết quả NGS của I-2 28

Bảng 11: Kết quả NGS của II-1 28

Bảng 12: Kết quả chẩn đoán đột biến bằng giải trình tự Sanger 36

Bảng 13: Kết quả phân tích di truyền liên kết gen OCA2 41

Bảng 14: Bảng tổng hợp ưu nhược điểm của các phương pháp PGT9-M 47

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribose Nucleic Acid Axit deoxyribose nucleic EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit etylendiamintetraaxetic IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm

L-DOPA Levodopa

MLPA Multiplex ligation dependent

probe amplification

Khuếch đại đa dầu dò phụ thuộc phản ứng ghép nối

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới

OCA Oculocutaneous albinism Bạch tạng mắt da OCA1-8 Oculocutaneous albinism type 1-8 Bạch tạng mắt da loại 1-8 OCA1A Oculocutaneous albinism type 1A Bạch tạng mắt da loại 1A OCA1B Oculocutaneous albinism type 1B Bạch tạng mắt da loại 1B PBS Phosphate Buffered Saline Muối đệm phosphate PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PGD Preimplantation genetic diagnosis Chẩn đoán di truyền tiền làm

tổ PGT-M Preimplantation genetic testing for

monogenic

Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ cho các bệnh đơn gen PVP Polyvinyl Pyrrolidone Polyvinyl Pyrrolidone SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide STR Short Tandem Repeats Các đoạn trình tự lặp lại ngắn

WGA Whole Genome Amplification Khuếch đại toàn hệ gen

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch tạng mắt da (Oculocutaneous albinism - OCA) là một bệnh di truyền hiếm gặp, gây ra bởi đột biến gen lặn trên nhiễm sắc thể thường với đặc trưng là sự rối loạn sinh tổng hợp melanin trong tế bào hắc tố, dẫn đến giảm sắc tố ở tóc, da và mắt Bệnh gây ra do đột biến các gen có vai trò trong quá trình tổng hợp melanin với đặc trưng lâm sàng là sự mất một phần hoặc hoàn toàn sắc tố của da, tóc và luôn đi kèm với các bất thường về mắt gồm rung giật nhãn cầu, giảm thị lực, giảm sắc tố võng mạc… [1] Bệnh bạch tạng có tỷ lệ mắc thay đổi giữa các dân tộc và quần thể, trên toàn thế giới tỷ lệ mắc là 1/17.000 [2] Ở một số vùng quần thể người châu Phi, tần số có thể cao tới 1:1500 [3], [4]

Bệnh bạch tạng hiện nay được phân loại thành 8 tuýp khác nhau gồm: OCA1A

và OCA1B (đột biến trên gen TYR), OCA2 (đột biến trên gen OCA2), OCA3 (đột biến trên gen TYRP1), OCA4 (đột biến trên gen SLC45A2), OCA6 (đột biến trên gen SLC24A5), OCA7 (đột biến trên gen LRMDA) và OCA8 (một phân nhóm mới được phát hiện của bạch tạng, liên quan đến gen DCT) [5], [6] Mỗi tuýp có đặc

điểm đặc trưng lâm sàng khác nhau, trong đó OCA1A là loại nghiêm trọng nhất được đặc trưng bởi thiếu hoàn toàn việc sản xuất melanin trong suốt cuộc đời Các loại OCA khác nhau được gây ra bởi các đột biến gen khác nhau nhưng kiểu hình lâm sàng không phải lúc nào cũng có thể phân biệt được, nên chẩn đoán phân tử trở thành một công cụ hữu ích và cần thiết cho tư vấn di truyền

OCA2 (OMIM 203200) được xếp hạng là tuýp bạch tạng phổ biến thứ hai trên thế giới [7], [8] và chiếm gần 30% các trường hợp bạch tạng [9] Những người mắc bạch tạng tuýp 2 thường có nhiều sắc tố hơn (làn da trắng nhưng không nhợt nhạt như mắc tuýp 1, màu tóc từ vàng nhạt đến vàng hoặc thậm chí là nâu) và thị lực tốt

hơn OCA2 gây ra bởi các đột biến trong gen OCA2 (hay còn gọi là gen P) nằm trên

nhiễm sắc thể số 15 Hiện nay, chưa có phương pháp nào để điều trị bệnh triệt để

Người mắc bệnh chỉ có thể sử dụng các biện pháp bảo vệ nhằm giảm các nguy cơ biến chứng và tổn hại do ánh nắng mặt trời gây ra

Với sự tiến bộ của khoa học hiện nay, phương pháp chẩn đoán di truyền tiền làm tổ được biết đến là phương pháp dự phòng bệnh hiệu quả nhất, bởi có thể chọn được phôi lành ngay từ trước khi cấy phôi vào tử cung của người mẹ Điều này sẽ đem lại ý nghĩa rất lớn đối với những gia đình mang gen gây bệnh đột biến như

OCA2 Đó là cơ sở để thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện đột biến trên gen OCA2 và ứng dụng trong chẩn đoán tiền làm tổ bệnh bạch tạng type 2” Nghiên

cứu này được thực hiện trên một gia đình mang gen đột biến OCA2 gây bệnh bạch tạng tại Việt Nam, có nguyện vọng sinh con khoẻ mạnh, không mang gen bệnh

Mục tiêu nghiên cứu:

- Sử dụng các kĩ thuật sinh học phân tử để phát hiện các đột biến trên gen

OCA2

- Tiến hành hoàn thiện kỹ thuật và ứng dụng trong chẩn đoán di truyền

tiền làm tổ đột biến gen OCA2 để xác định phôi khỏe mạnh không mang

gen bệnh

Chương 1: TỔNG QUAN

1 Bệnh bạch tạng

1.1 Giới thiệu chung về bệnh bạch tạng Bạch tạng được mô tả là một bệnh di truyền hiếm gặp, đặc trưng bởi sự giảm sắc tố ở da, tóc và/hoặc mắt, đồng thời có ảnh hưởng liên quan đến võng mạc và có thể làm thay đổi thị lực của mắt Những bất thường quan trọng ở mắt ở những người bệnh bạch tạng ngoài suy giảm sắc tố được biểu thị một cách rõ ràng thì còn có thể bao gồm các ảnh hưởng như thiểu sản hoàng điểm, giảm sắc tố của tế bào biểu mô sắc tố võng mạc, giảm tế bào hình que cảm thụ ánh sáng (photoreceptor rod cell deficit), hoạt động sai dây thần kinh ở vùng giao thoa thị giác, giảm sắc tố ở mống mắt, có biểu hiện của chứng sợ ánh sáng và rung giật nhãn cầu [6]

Có hai loại bạch tạng chính là bạch tạng da và mắt (oculocutaneous albinism - OCA) và bạch tạng mắt (ocular albinism - OA), được phân loại dựa trên kiểu hình lâm sàng, liên quan đến suy giảm sắc tố ở da, tóc và mắt (OCA), hoặc chỉ ở mắt (OA) Bạch tạng da và mắt (OCA) là một rối loạn di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, bao gồm 8 phân nhóm nhỏ OCA1 – OCA8 [6] Các phân nhóm này được phân biệt bởi đột biến trên các gen khác nhau, tạo ra sản phẩm melanin khiếm khuyết dẫn đến melanin không được tổng hợp hoặc không được phân bố đúng cách trên các mô da

1.2 Dịch tễ học bệnh bạch tạng

1.2.1 Tỷ lệ mắc bệnh

Tỷ lệ mắc bạch tạng được ước tính là 1/17.000 đến 1/20.000 trong quần thể, trong đó chiếm đến 70% là các trường hợp OCA, riêng các trường hợp OA thì tỷ lệ mắc bệnh trên toàn thế giới ước tính khoảng 1/50.000 người Trong 8 phân nhóm của OCA thì OCA2 có tỷ lệ mắc bệnh tương ứng là 1/40.000 Đặc biệt, ở các nước châu Phi gần sa mạc Sahara có tỉ lệ OCA2 tương đối cao so với các quần thể khác,

tỉ lệ mắc bệnh lên đến 1/1.500 – 4.000 người Điều này có thể là kết quả của tình trạng hôn nhân cận huyết phổ biến tại đây [10] Bên cạnh đó, các quần thể người Mỹ gốc Phi (1/10.000) và người Mỹ nói chung (1/36.000) cũng là những quần thể có tỷ lệ OCA2 cao hơn so với các quần thể khác [6]

1.2.2 Các đặc điểm lâm sàng ở người bệnh bạch tạng

Triệu chứng của bạch tạng được nhận biết ở màu da, màu tóc, màu mắt và thị lực Hầu hết những người bệnh bạch tạng có màu tóc trắng và màu da rất sáng Màu da và màu tóc thay đổi trong khoảng từ trắng sang nâu và màu mắt dao động từ màu xanh da trời sáng đến nâu Suy giảm thị lực là một yếu tố chính trong tất cả các dạng của bạch tạng Các vấn đề về thị lực có thể xuất hiện như rung giật nhãn cầu, phân tán sắc tố mống mắt (iris transillumination), thoái hóa điểm vàng, giảm thị lực và giảm khả năng nhìn sâu Ngoài ra, biểu hiện chậm phát triển tâm thần có thể xuất hiện ở một số trường hợp [6] Các dạng bạch tạng khác nhau thì sẽ tồn tại những triệu chứng đặc trưng riêng Trong bạch tạng da và mắt, hiện có 8 phân nhóm chính (OCA1-OCA8) đã được chỉ ra

1.2.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh bạch tạng tuýp 2

Phân nhóm OCA2 có xu hướng nhẹ với biểu hiện sắc tố trên da, tóc và mắt sẫm màu hơn (gần với kiểu hình bình thường hơn) do đa phần sắc tố melanin vẫn được tổng hợp Bệnh nhân OCA tuýp 2 có kiểu hình đa dạng Tóc của những người bị bệnh sẽ chuyển sang màu sẫm dần theo tuổi tác cùng sự xuất hiện của các đốm sắc tố hoặc tàn nhang Bệnh nhân người Châu Phi và người Mỹ gốc Phi có thể có mái tóc màu vàng hoặc màu xám xanh, mống mắt màu lục nhạt Kiểu hình “OCA nâu” đã được mô tả ở quần thể người Châu Phi và người Mỹ gốc Phi với đặc trưng bởi tóc và màu da nâu nhạt, màu mống mắt xám Những người mắc OCA tuýp 2 thường có lượng sắc tố nhiều hơn (làn da trắng nhưng không nhợt nhạt như mắc OCA tuýp 1, màu tóc từ vàng nhạt đến vàng, nâu) và thị lực tốt hơn Tuy vậy, chất lượng cuộc sống và sức khoẻ của người mắc bạch tạng vẫn bị ảnh hưởng nghiêm

trọng bởi các vấn đề liên quan đến suy giảm thị lực và việc phải hạn chế tiếp xúc ánh sáng mặt trời nhằm phòng tránh ung thư da

1.2.4 Cơ chế bệnh sinh của bạch tạng

Tế bào biểu bì tạo hắc tố/ tế bào hắc tố (melanocytes) có nguồn gốc từ các mào thần kinh trong quá trình phát triển phôi thai và được phân phối đến nhiều loại tế bào, bao gồm da, mắt, tóc và tế bào mạch máu ở tai trong Các tế bào hắc tố chiếm khoảng 5% đến 10% lượng tế bào ở lớp đáy biểu bì, và tỷ lệ này là không thay đổi ngay cả ở các bệnh nhân bạch tạng Sự khác biệt giữa bệnh nhân bạch tạng và những người khỏe mạnh là lượng sắc tố melanin được tạo ra từ tế bào hắc tố ít hơn Melanin được biết đến với vai trò quan trọng là bảo vệ cơ thể khỏi tia cực tím (UV) có hại Có hai loại sắc tố melanin chính là eumelanin và pheomelanin, được tổng hợp trong bào quan chuyên biệt của tế bào hắc tố gọi là melanosome Eumelanin làm cho da có màu đen hoặc nâu, đồng thời đóng vai trò bảo vệ da chống lại tác hại của bức xạ cực tím B (UVB) bằng cách hấp thụ và phân tán các tia cũng như ngăn chặn sự thâm nhập của tia cực tím vào cơ thể một cách tự nhiên Pheomelanin chịu trách nhiệm tạo ra các sắc tố có màu vàng, hồng cho đến đỏ tùy theo số lượng của loại sắc tố melanin này [6]

Quá trình tổng hợp melanin được thực hiện thông qua 3 phản ứng, đầu tiên là quá trình oxy hóa L-tyrosine thành L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), tiếp đó là quá trình chuyển đổi L-DOPA thành DOPAquinone và cuối cùng là quá trình chuyển đổi DOPAquinone thành một trong 2 dạng melanin là eumelanin và pheomelanin Trong đó, tyrosinase là enzyme xúc tác giúp thực hiện 2 quá trình chuyển đổi từ L-tyrosine thành L-DOPA đến DOPAquinone Ở giai đoạn 3, hình thành sắc tố melanin, eumelanin được tổng hợp khi không có cysteine hoặc glutathione thông qua phản ứng tự phát hoặc cần sự xúc tác của DOPAchrome tautomerase (DCT/TYRP2) Ngược lại, pheomelanin được sản xuất khi các cysteine cùng tham gia với DOPAquinone Ngoài các phản ứng cần tyrosinase thì tất cả các phản ứng còn lại là tự phát và không cần thêm chất xúc tác nào Ở những người

bệnh bạch tạng, ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp đến hoạt động của tyrosine trong quá trình tổng hợp melanin dẫn đến thiếu hụt sắc tố này được xem là nguồn gốc bệnh lý hay chính là nguyên nhân dẫn đến bệnh [11]

Hình 1: Hình minh họa cơ chế tổng hợp melanin và các lỗi trong quá trình sinh

tổng hợp melanin gây ra bởi các tuýp bạch tạng (màu đỏ) [12]

1.2.5 Phân loại bệnh bạch tạng

Về mặt di truyền bệnh, bạch tạng được phân loại tùy theo các biến thể gen phát hiện ở các gen gây bệnh khác nhau Hiện có 8 phân nhóm OCA (OCA1-OCA8) đã được xác định cho đến nay Ngoại trừ OCA5 chưa xác định được gen

gây bệnh thì đột biến trên các gen bao gồm TYR, OCA2, TYRP1, SLC45A2,

SLC24A5, C10orf11 và DCT được biết đến lần lượt là nguyên nhân dẫn đến các

kiểu hình OCA1, OCA2, OCA3, OCA4, OCA6, OCA7 và OCA8 [13], [14]

Bảng 1: Một số tuýp bạch tạng đã được nghiên cứu và công bố trên thế giới Phân tuýp

bạch tạng OMIM

Gen đột

OCA1A OCA1B

203100 606952

OCA6 113750 SLC24A5 15q21.1 Pháp, Syria, Bỉ và Tây Ban

Nha [20], Trung Quốc [21]

1.2.6 Các phương pháp chẩn đoán, sàng lọc bạch tạng

Chẩn đoán OCA được thực hiện dựa trên các đánh giá lâm sàng liên quan đến giảm sắc tố ở da và tóc bên cạnh các triệu chứng đặc trưng ở mắt Thông thường, các bác sĩ sẽ chú ý đến các biểu hiện giảm sắc tố ở mắt ở trẻ 2 đến 4 tháng tuổi khi nghi ngờ OCA (biểu hiện này ở trẻ sơ sinh không phải là hiếm gặp nên không cần phải chú ý như một đặc điểm nguy cơ ở lứa tuổi này) Các biểu hiện giảm sắc tố da toàn thân kèm theo rung giật nhãn cầu và thính lực bình thường là những điều kiện đủ để nghi ngờ nguy cơ mắc bạch tạng Ngoài ra, các triệu chứng khác có thể đi

kèm như nhiễm trùng tái phát, chảy máu, chậm phát triển trí tuệ cũng được đánh giá để không bỏ sót các hội chứng liên quan của bạch tạng Tuy nhiên, do sự trùng lặp về mặt lâm sàng giữa các kiểu phụ của OCA, chẩn đoán phân tử là cần thiết để xác định gen gây bệnh, giúp phân loại bạch tạng một cách chính xác nhất Cho đến nay, ít nhất 20 gen và locus 4q.24 đã được báo cáo liên quan đến các phân nhóm khác nhau của bạch tạng [24] Các phương pháp chẩn đoán phổ biến hiện nay có thể kể đến như giải trình tự Sanger, MLPA và giải trình tự thế hệ mới (NGS) Giải trình tự Sanger có thể được sử dụng trong các trường hợp đã xác định được gen mục tiêu thông qua các đặc điểm lâm sàng rất đại diện cho một loại phân nhóm của bạch tạng, thường là các kiểu phụ của OCA, được quy định bởi 1 gen duy nhất cho mỗi loại

Trong bạch tạng, chẩn đoán sớm được xem là mục tiêu quan trọng nhất giúp quá trình quản lý bệnh trở nên tối ưu và có hiệu quả Những lợi ích từ chẩn đoán sớm có thể có được như giúp đánh giá và tiên lượng sớm các triệu chứng ở mắt cũng như có thể đảm bảo suy giảm thị lực ở mức tối thiểu nhất; từ đó giúp tối ưu các vấn đề liên quan đến sức khỏe chung của người bệnh cũng như các vấn đề xã hội khác như khả năng học tập, phát triển nhận thức và sự tích cực trong suy nghĩ, tránh mặc cảm, tự ti Chẩn đoán sàng lọc sớm bệnh trên các đối tượng có nguy cơ ngày càng trở nên dễ dàng và chính xác hơn bao giờ hết dựa trên chẩn đoán di truyền ở mức độ phân tử Hơn nữa, chẩn đoán phân tử đặc biệt có ý nghĩa trong tư vấn và chẩn đoán trước sinh cũng như trong chẩn đoán tiền làm tổ, giúp giảm thiểu nguy cơ sinh ra trẻ bị bệnh ở những gia đình có tiền sử

1.2.7 Chăm sóc và điều trị người bệnh bạch tạng

Cũng giống như đa số các bệnh di truyền hiếm gặp khác, hiện chưa có cách chữa khỏi bạch tạng hoàn toàn, việc điều trị hiện nay là điều trị triệu chứng, ngăn ngừa tác hại của ánh nắng mặt trời đến da và tóc của người bệnh, đồng thời thăm khám nhãn khoa định kỳ Người mắc bệnh chỉ có thể sử dụng các biện pháp khắc phục và bảo vệ nhằm giảm các nguy cơ biến chứng và tổn hại do ánh nắng mặt trời

gây ra như đeo kính áp tròng để tăng thị lực, đeo kính râm và mặc quần áo kín có khả năng chống tia UV khi ra ngoài trời

Hình 2: Vị trí gen OCA2 trên nhiễm sắc thể số 15 và hình minh họa protein mã

hóa, màu đen là vùng xuyên màng [27]

Cho đến nay, có đến 152 biến thể của gen OCA2 đã được ghi nhận trong cơ sở

dữ liệu đột biến Clinvar (NCBI) là những biến thể có khả năng gây bệnh và biến thể gây bệnh Chúng bao gồm các loại đột biến thay thế, đột biến chèn, đột biến mất

đoạn, lặp đoạn, đột biến vị trí cắt nối Đột biến trên gen OCA2 có thể gây nên bất

thường về số lượng và chức năng của protein OCA2, dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của bệnh bạch tạng tuýp 2

Hình 3: Một số loại đột biến trên gen OCA2 [28]

Phân nhóm OCA2 (MIM 203200) là kết quả của các biến thể trên gen OCA2 hay còn gọi là gen P Mặc dù chức năng chính xác của protein P vẫn chưa được

hiểu một cách đầy đủ nhưng dường như có liên quan đến quá trình vận chuyển protein đến melanosome, hỗ trợ ổn định phức hợp protein cũng như điều chỉnh pH ổn định trong melanosome và/hoặc xúc tác cho quá trình tổng hợp glutathione (chất ức chế quá trình tạo melanin từ tyrosine, kích thích sự sản sinh pheomelanin) Những người bệnh mang kiểu hình OCA2 sẽ không có loại sắc tố eumelanin (sắc tố có màu nâu hoặc đen), thay vào đó là pheomelanin (sắc tố màu vàng, hồng cho đến đỏ) với lượng sắc tố tăng dần theo độ tuổi [29]

3 Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho các bệnh đơn gen (PGT-M)

Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD – Preimplantation Genetic Diagnosis) là kỹ thuật dùng để xác định các rối loạn về gen di truyền hay bất thường trong bộ nhiễm sắc thể của giao tử hay phôi ở giai đoạn trước khi phôi bám vào nội mạc tử cung để làm tổ PGD được áp dụng cho những cặp vợ chồng mang bệnh có thể di truyền qua thế hệ hoặc những cặp vợ chồng sinh con trước đó có mang bệnh Quá trình chẩn đoán di truyền trước làm tổ bao gồm hai giai đoạn chính là sinh thiết và chẩn đoán di truyền Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho bệnh lý đơn gen (PGT-

M - Preimplantation genetic testing for monogenic disease) là một xét nghiệm di truyền được tiến hành trên mẫu phôi nhằm giảm thiểu nguy cơ mang thai với bất thường di truyền đơn gen ở nhóm bố, mẹ có nguy cơ cao PGT-M có ưu điểm vượt trội hơn so với chẩn đoán trước sinh khi cho phép các cặp vợ chồng mang alen gây bệnh có cơ hội lựa chọn phôi không mang gen bệnh hoặc không bị bệnh để mang thai và sinh em bé không bị bệnh PGT-M là sự kết hợp phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) và kỹ thuật sinh học phân tử để tránh sinh con bị bệnh Thông qua IVF, các gia đình sẽ thu nhận được nhiều phôi; thông qua chẩn đoán phân tử, phôi khỏe mạnh sẽ được xác định để chuyển vào tử cung của người mẹ PGT-M bao gồm 2 phương pháp chẩn đoán là chẩn đoán trực tiếp và chẩn đoán gián tiếp Hiện nay, theo khuyến cáo của Hiệp hội Sinh sản và Phôi thai Châu Âu (ESHRE) năm 2020, PGT-M cần phải được sử dụng đồng thời 2 phương pháp này [30]

Trong chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi, lượng DNA đầu vào là rất ít, rất khó kiểm soát ngoại nhiễm; đồng thời có tỷ lệ mất alen (ADO) rất lớn, lên tới 25%, có thể dẫn tới tình trạng âm tính giả [31] Thực tế, tỉ lệ chẩn đoán sai nếu chỉ dùng đơn độc phương pháp trực tiếp là từ 1-3% và con số này có lẽ còn cao hơn do hạn chế về báo cáo từ các trung tâm IVF [32] Ở Việt Nam, trong một số năm trở lại đây đã áp dụng một kỹ thuật trực tiếp như giải trình tự Sanger và NGS trong xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi Tuy nhiên, cả 2 kỹ thuật này đều xác định trực tiếp các tổn thương gen mà không kiểm soát được hiện tượng ADO và ngoại nhiễm nên kết quả chưa thể tin cậy hoàn toàn Do vậy, phương pháp phân tích gián tiếp hay phân tích di truyền liên kết được đề xuất và mang tính chất bắt buộc, và thậm chí khuyến cáo này đã tồn tại được hàng chục năm [32]

Kỹ thuật gián tiếp hay kĩ thuật phân tích di truyền liên kết là một kĩ thuật sử dụng các chỉ thị phân tử để xác định gián tiếp các haplotype mang đột biến và theo dõi sự di truyền của chúng cho các thế hệ sau Các chỉ thị này có thể là các trình tự lặp ngắn – STR hoặc đa hình đơn - SNP Trong đó các STR được sử dụng rộng rãi hơn do mang tính bảo thủ cao và dễ dàng phân tích phục vụ chẩn đoán Mỗi chỉ thị

có vai trò như một vệ tinh quan sát và đại diện cho sự di truyền của đột biến Do vậy chúng có thể kiểm soát được hiện tượng ngoại nhiễm và ADO Đồng thời số chỉ thị càng nhiều thì độ chính xác của phân tích di truyền liên kết nói riêng và PGT-M nói chung sẽ càng cao

Trong suốt 2 thập kỉ qua, phương pháp PGT-M kết hợp giữa phương pháp chẩn đoán trực tiếp và gián tiếp vẫn là phương thức phổ biến và hiệu quả nhất [33] Mặc dù vậy phương pháp vẫn tồn tại nhược điểm đó là thời gian thiết lập quy trình cho 1 gia đình kéo dài do phải sàng lọc các STR phù hợp cho từng gia đình Tuy nhiên bộ chỉ thị STR lại có tính chủng tộc, do đó để áp dụng vào quần thể người Việt Nam thì cần phải khảo sát được một bộ chỉ thị riêng Hiện nay một số kĩ thuật mới đã được phát triển như SNP-array hay giải trình tự gen thế hệ mới đem lại độ chính xác cao và có khả năng rút ngắn thời gian thực hiện kĩ thuật [33] Tuy nhiên những phương pháp này còn gặp một trở ngại rất lớn là yêu cầu quá cao về cơ sở vật chất để phục vụ phân tích, do vậy chỉ mới bước đầu được thực hiện ở một số cơ sở

Hiện nay, PGT-M được biết đến là phương pháp dự phòng bệnh bạch tạng hiệu quả nhất, bởi có thể chọn được phôi không mang alen gây bệnh ngay từ trước khi cấy phôi vào tử cung của người mẹ, giúp con sinh ra khỏe mạnh, không mang gen bệnh

4 Tình hình nghiên cứu về chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh bạch tạng

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho các bệnh di truyền đơn gen (PGT-M) đã được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1990 trên những bệnh nhân IVF Phôi của họ được sinh thiết lấy ra một hoặc một vài tế bào để thực hiện chẩn đoán [34]

Đến năm 1998, các marker cho phân tích di truyền liên kết, điển hình là các STR (short tandem repeat) trong gen hoặc liên kết chặt chẽ với gen quan tâm được

nghiên cứu và ứng dụng vào chẩn đoán di truyền tiền làm tổ nhằm loại bỏ hoặc giảm thiểu hiện tượng allele drop-out (ADO) và khuếch đại ưu tiên [35]

Trên thế giới chưa có công bố về PGT-M với bệnh bạch tạng tuýp 2 nhưng đã có nhiều nghiên cứu về các phân nhóm bạch tạng khác, chủ yếu là OCA1 Năm 2018, Claudia Yahalom và cộng sự báo cáo tổng kết về mười cặp vợ chồng mang

đột biến gen TYR gây bệnh bạch tạng tuýp 1, đã trải qua tổng cộng 28 chu kỳ

IVF/PGD tại Israel Kết quả, sáu đứa trẻ sinh ra khoẻ mạnh, không mang gen bệnh [36] Tuy nhiên không có chi tiết về kĩ thuật sinh học phân tử đã sử dụng

Năm 2019, Medhat Amer và cộng sự báo cáo về trường hợp một bé trai sơ sinh người Ai Cập khoẻ mạnh, không mang gen bệnh từ một cặp vợ chồng mang

đột biến gen TYR gây bệnh bạch tạng tuýp 1 sau khi thực hiện PGD, sử dụng giải

trình tự gen thế hệ mới (NGS) [37] Cặp vợ chồng thực hiện 2 chu kì IVF, mẫu phôi của họ cũng được sinh thiết vào ngày thứ 5 Các mẫu phôi sinh thiết được đem khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA), tinh sạch bằng Ampure Beads, tạo khuôn và tiến hành giải trình tự NGS trên nền tảng Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific) theo nguyên lý bán dẫn Kết quả cho 2 phôi bình thường, không mang gen bệnh; 2 phôi mang đột biến (N/c.346 C>T và c.346C>T/N) và 2 phôi còn lại khuếch đại không thành công Sau đó một phôi khỏe mạnh được lựa chọn chuyển vào tử cung người mẹ, quá trình mang thai suôn sẻ và một bé trai khỏe mạnh, không mang gen bệnh đã ra đời nhờ kỹ thuật PGT-M bằng NGS Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là không kiểm tra được tình trạng ADO – một tình trạng hay xảy ra trong quá trình WGA các mẫu phôi Do đó có thể dẫn đến những chẩn đoán âm tính giả

Năm 2022, tại Thái Lan, Sirivipa Piyamongkol và cộng sự tiến hành PGD bệnh bạch tạng tuýp 1A bằng phương pháp SNP array kết hợp karyotyping và minisequencing Mẫu phôi sau sinh thiết ngày 5 cũng được đem khuếch đại WGA, sau đó kiểm tra SNP bằng bộ phân tích DNA Illumina HumanKaryomap-12 theo hướng dẫn của nhà sản xuất Ngoài ra còn sử dụng PCR và minisequencing để xác nhận kết quả của aSNP Kết quả phát hiện hai phôi không mang đột biến nào trên

gen TYR từ bố và mẹ, nhưng có bất thường về số lượng nhiễm sắc thể và đã không

được sử dụng để chuyển phôi [38] Sử dụng aSNP cho giá trị chẩn đoán cao khi có thể phân tích liên kết trên nhiều vị trí, kiểm soát ngoại nhiễm và ADO tốt, song giá thành cao là nhược điểm của phương pháp này.Tuy vậy, các báo cáo về việc PGD bệnh bạch tạng mới chỉ ghi nhận trong các trường hợp OCA tuýp 1, chưa có công bố nào về tiến hành PGD OCA tuýp 2

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Các công trình khoa học nghiên cứu về bệnh bạch tạng tại Việt Nam còn hạn chế Năm 2022, Ma Thị Huyền Thương và cộng sự đã giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa trên 7 người bệnh bạch tạng ở Việt Nam Kết quả đã phân loại người bệnh bạch tạng thuộc 3 nhóm: bao gồm 5 người bệnh OCA1 (3 người bệnh OCA1A và 2

người bệnh OCA1B) mang các biến thể trên gen TYR (c.346C>T, c.926insC, c.115T>C và c.559_560ins25); 1 người bệnh OCA2 mang biến thể OCA2

(c.2323G>A và 1 người bệnh mắc hội chứng Hermansky-Pudlak được xác định

mang biến thể HPS1 (c.972delC) Chẩn đoán trước sinh được thực hiện ở lần mang

thai thứ ba trong một gia đình có hai con đầu mắc OCA1A với em bé sinh ra hoàn toàn khỏe mạnh [39]

Trong lĩnh vực di truyền y học, hiện chưa có công bố nào về thực hiện chẩn đoán di truyền tiền làm tổ bệnh bạch tạng ở Việt Nam

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là một gia đình 4 thành viên gồm: bố I-1 (40 tuổi – kiểu hình bình thường, không mang triệu chứng của bạch tạng), mẹ I-2 (31 tuổi - kiểu hình bình thường, không mang triệu chứng của bạch tạng) và hai người con gái trong đó người con gái II-1 (7 tuổi) đã được chẩn đoán mắc OCA, người con gái II-2 (2 tuổi – kiểu hình bình thường, không mang triệu chứng của bạch tạng) Gia đình có nguyện vọng sinh thêm con khỏe mạnh, không mang gen bệnh nên đã tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) thu được 06 phôi

Mẫu máu ngoại vi của 4 thành viên gia đình cùng 06 mẫu sinh thiết phôi ngày 5 (L1-L6) đã được thu thập để phục vụ nghiên cứu

Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Hội đồng Xét duyệt Đạo đức Học viện Quân Y (Số 1068/2019/VMMU-IRB) cùng sự đồng ý tham gia của tất cả các đối tượng

2 Hóa chất

Các hóa chất, máy móc và thiết bị phục vụ cho nghiên cứu này thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y

Các hóa chất sử dụng chính trong nghiên cứu bao gồm: bộ sinh phẩm QIAamp

DNA Blood mini Kit (Qiagen, Đức) sử dụng để tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu,

bộ sinh phẩm REPLI-g® Single Cell Kit (Qiagen, Đức) sử dụng để khuếch đại DNA từ mẫu phôi, sử dụng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems, Mỹ) trong giải trình tự Sanger H2O không chứa nuclease được mua từ hãng Invitrogen; Mastermix 2X (Promega, Mỹ) dùng trong phản ứng PCR; bột agarose và Marker DNA (100bp) dùng để điện di; các mồi khuếch đại STR (Genewiz) Các hóa chất còn lại sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tiêu chuẩn

3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng chính trong nghiên cứu bao gồm: Máy PCR (Eppendoft); Máy đo độ tinh sạch SpectraMax QuickDrop (Molecular Devices); Máy điện di mao quản - SeqStudio Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific); Máy ly tâm miniSpin (Eppendoft); Máy IKA Vortex (Genius 3); Máy spindown (Listekvn); Máy ủ nhiệt có lắc (Eppendoft); Thiết bị điện di (Cleaver Scientific); Máy soi và chụp gel UVP Chemstudio (Analytikjena); Cân điện tử và các phần mềm tin sinh học

(A) Máy PCR

(B) Máy điện di

(C) Máy chụp và soi gel (D) Máy điện di mao quản

Hình 4: Một số trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học và Di truyền y học – Học viện Quân y

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 07/2022 đến tháng 09/2023

5 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp nghiên cứu một ca bệnh (case study) Sơ đồ chi tiết thực hiện nghiên cứu được tóm tắt trong hình 4 dưới đây

Hình 5: Sơ đồ tóm tắt các bước trong nghiên cứu

Mẫu DNA của cả gia đình đã được đem giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) khảo sát đột biến của nhóm gen gây bệnh bạch tạng Kết quả NGS đã cho biết các đột biến của các thành viên trong gia đình là OCA2 c.2344G>A và OCA2 c.2323G>A Tuy nhiên, biến thể OCA2 c.2323 G>A nằm trong vùng gen tín hiệu kém, cần kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger Do đó, nghiên cứu tiến hành thiết kế mồi cho phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa 2 đột biến và giải trình tự Sanger

Xác định đột biến gen OCA2 bằng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS)

với 4 mẫu máu thành viên gia đình

Thiết kế mồi và khuếch đại đoạn gen chứa đột biến đã phát hiện với 4 mẫu máu và

6 mẫu phôi

Giải trình tự Sanger các đoạn gen đột biến đã khuếch đại

Điện di mao quản các STR và phân tích di truyền liên kết

Chẩn đoán đột biến gen OCA2 trên các mẫu phôiThiết kế mồi và khuếch đại các STR đã lựa chọn với 4 mẫu máu và 6 mẫu phôi

nhằm kiểm tra lại các đột biến và chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cho các mẫu phôi của gia đình đã sinh thiết ngày 5 sau khi nhân bản toàn bộ hệ gen Phân tích di truyền liên kết được thực hiện nhằm kiểm tra lại kết quả chẩn đoán và hiện tượng mất alen (Allele Drop-Out - ADO) của các mẫu phôi sau WGA

5.1 Tách chiết và bảo quản DNA từ mẫu máu ngoại vi Mẫu máu ngoại vi của 4 thành viên trong gia đình (2 mL mỗi đối tượng) được thu vào ống lấy máu chứa EDTA K2 tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit

QIAamp DNA Blood mini Kit (Qiagen, Đức) tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Độ tinh sạch và nồng độ DNA sau tách chiết được xác định bằng máy SpectraMax QuickDrop theo hướng dẫn của nhà sản xuất DNA được pha loãng với nước deion để đạt nồng độ khoảng 20 ng/µL, độ tinh sạch A260/280 từ 1.8-2.2, sau đó được bảo quản ở -20°C trước khi tiến hành PCR và giải trình tự Sanger

5.2 Kỹ thuật sinh thiết phôi 6 phôi (L1-L6) của cặp vợ chồng được được nuôi cấy đến ngày thứ năm và tiến hành sinh thiết ở giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5-6 sau thụ tinh) Mỗi phôi sinh thiết từ 3-5 tế bào, đem rửa với dung dịch PBS 1X và 1% PVP trước khi đựng trong các ống PCR 0,2 mL và bảo quản ở -20°C

5.3 Kỹ thuật nhân bản toàn bộ hệ gen (Whole Genome Amplification - WGA)

DNA tách chiết từ các phôi đã sinh thiết được khuếch đại bằng bộ kit

REPLI-g® Single Cell Kit (Qiagen, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất Nồng độ và độ

tinh sạch được đo bằng máy SpectraMax QuickDrop để đảm bảo DNA phôi sau khuếch đại của các tế bào phôi đã đủ tiêu chuẩn để sử dụng Các mẫu DNA sau WGA đem bảo quản ở -20°C

5.4 Thiết kế mồi để khuếch đại đột biến đã xác định Sử dụng phần mềm Primer-BLAST, nghiên cứu thiết kế hai cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen chứa đột biến OCA2 c.2344G>A và OCA2 c.2323G>A Sau đó kiểm tra tính đặc hiệu bằng công cụ Primer-BLAST và các đặc tính mồi bằng phần mềm OligoAnalyzer Sau khi mồi thiết kế đạt yêu cầu sẽ được đặt hàng sản xuất tại công ty Genewiz

Chu trình nhiệt và thành phần phản ứng PCR được tiến hành thực nghiệm để xác định và đưa ra quy trình chuẩn Sau đó tiến hành phản ứng PCR và điện di kiểm tra sản phẩm

Hình 6: Thiết kế cặp mồi OCA2.1 khuếch đại exon 23 nhằm xác định biến thể

NM_000275.3: c.2344G>A (NP_000266.2: p.Gly782Arg)

Hình 7: Thiết kế cặp mồi OCA2.2 khuếch đại toàn bộ exon 22 phát hiện biến

thể NM_000275.3: c.2323G>A (NP_000266.2: p.Gly775Ser)

Như vậy, nghiên cứu đã thiết kế hai cặp mồi để khuếch đại hai đoạn gen chứa đột biến OCA2.1 và OCA2.2 được tổng hợp lại trong bảng 2

Bảng 2: Trình tự các cặp mồi khuếch đại các đoạn gen đột biến

23 OCA2 c.2344G>A

OCA2.1F CACCACAGTCTCTCTACTTGCTAAAAA 274

bp OCA2.1R GAACAGAAGCTTACCACCAAGATGA

22 OCA2 c.2323G>A

bp OCA2.2R TGGATTTTCTAAATTGGTCACAGTATG Với nhiệt độ nóng chảy của các mồi trong khoảng 60,42°C đến 62,29°C, cặp mồi OCA2.1 và OCA2.2 khuếch đại cho toàn bộ exon 23 và exon 22 với kích thước lần lượt là 274bp và 248bp

Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi, phản ứng PCR được thực hiện với dải gradient nhiệt độ gắn mồi từ 52-62°C nhằm xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng mồi

Hình 8: Kết quả chạy phản ứng gradient-PCR khuếch đại đột biến OCA2.1

c.2344G>A

Nhiệt độ gắn mồi (ºC) của từng phản ứng được chú thích như hình

M: Marker 100bp

Hình 9: Kết quả chạy phản ứng gradient-PCR khuếch đại đột biến OCA2.2

Bảng 3: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các đoạn gen OCA2

Bảng 4: Chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen OCA2.1 và OCA2.2

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

Sản phẩm PCR sau khi được kiểm tra bằng điện di sẽ được giải trình tự trên máy SeqStudio Genetic Analyzer bằng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (hãng Thermo Fisher Scientific) theo nguyên lý Sanger để tìm đột biến OCA2 c.2323G>A và OCA2 c.2344G>A trên exon 22 và exon 23 Trình tự nucleotide của mỗi đoạn gen được xác định bằng phần mềm Bioedit Sequence Alignment Editor