Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
6. Ưu nhược điểm của các phương pháp chẩn đoán PGT-M
Một trong những thách thức lớn nhất đối với PGT-M là lượng DNA đầu vào thấp, do đó cần có các kỹ thuật khuếch đại DNA để đảm bảo vật liệu di truyền phục vụ chẩn đoán. Những hạn chế của lượng DNA thấp là có thể gia tăng lỗi khuếch đại DNA (AF - Amplification failure), ngoại nhiễm DNA hoặc hiện tượng mất alen (ADO), trong đó một trong hai alen trong mẫu dị hợp tử được khuếch đại trong khi alen còn lại vẫn không bị phát hiện. Nếu sinh thiết phôi một tế bào thì sẽ khó phân tích hơn so với sinh thiết vài tế bào. Ngày nay hay sử dụng sinh thiết ở giai đoạn phôi nang, sinh thiết 3 - 5 tế bào vào ngày thứ 5 – 6 sau IVF, vì đã được chứng minh rằng ít ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi. Sau đó, sử dụng phản ứng khuếch đại mục tiêu thông qua multiPCR hoặc khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA) để tiến hành các ứng dụng như PCR, mảng đa hình đơn nucleotide (aSNP) hoặc giải trình tự thế hệ mới (NGS). Mỗi phương pháp đều có ưu điểm và hạn chế của nó.
45 Các dấu hiệu STR là các chuỗi DNA ngắn lặp lại song song (dinucleotide là phổ biến nhất), có tính đa hình cao và khá phong phú trong bộ gen của con người (một STR trên 2000 – 10.000 bp). Các chỉ thị STR hữu ích được lấy từ các bài báo đã xuất bản hoặc được chọn lọc từ cơ sở dữ liệu công cộng và thường liên quan đến nhiều alen (độ dị hợp tử cao). Các locus STR được nhắm mục tiêu bằng các mồi có gắn nhãn huỳnh quang và được đồng khuếch đại trong phản ứng PCR. Một chỉ thị STR đầy đủ thông tin sẽ có các kích thước khuếch đại khác nhau cho mỗi trong số bốn alen bố mẹ, cho phép phân biệt tất cả các kiểu gen mà phôi có thể có và phát hiện các vấn đề về ngoại nhiễm, ADO, tái tổ hợp và sai lệch số lượng bản sao.
Nhiều chỉ thị được lựa chọn sẽ làm cho kết quả chẩn đoán trở nên chắc chắn hơn;
phân tích ít nhất hai locus liên kết chặt chẽ với gen và bên cạnh gen sẽ làm giảm nguy cơ chẩn đoán sai do ADO. Ngoài ra, nguy cơ không chẩn đoán được do AF cũng sẽ giảm đi.
SNP array (aSNP) là mảng oligo mật độ cao chứa tới vài triệu đầu dò, cho phép xác định kiểu gen của hàng trăm nghìn SNP được chọn trên tất cả các nhiễm sắc thể trong một phản ứng duy nhất. Các loại aSNP có bán trên thị trường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định kiểu gen SNP của mẫu DNA như phép lai với các mẫu dò đặc hiệu alen SNP hoặc các phản ứng mở rộng bazơ đơn. Một số lượng nhất định SNP đã đặt trước và do đó, vị trí và số lượng SNP trong khu vực quan tâm sẽ được cố định. Các mảng được quét và kiểu gen SNP được gọi dựa trên tổng tín hiệu huỳnh quang và tỷ lệ cường độ lai của hai alen SNP.
Còn trong kỹ thuật NGS, DNA polymerase xúc tác cho sự kết hợp của deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) vào mẫu DNA trong các chu kỳ tổng hợp DNA tuần tự. Tùy thuộc vào nền tảng giải trình tự, mỗi chu kỳ kết hợp nucleotide được theo dõi bởi sự giải phóng tín hiệu huỳnh quang hoặc nồng độ ion hydro. Quy trình này có thể diễn ra trên hàng triệu mảnh/phân tử một cách song song. Điểm chung của kĩ thuật SNP array và NGS là đều cần đầu vào DNA lớn, nên bước WGA là bắt buộc. Thời gian hoàn thành xét nghiệm thay đổi từ 24h cho đến vài ngày, nên phôi sẽ được trữ đông lạnh và cần kế hoạch chuyển phôi cho các chu kì tiếp theo.
46 Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) thể hiện nhiều ưu điểm khi có thể chẩn đoán được nhiều loại đột biến, bên cạnh đó, nhiều công nghệ hiện nay đã rút ngắn thời gian thực hiện xét nghiệm, giúp tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, phương pháp này có giá thành rất cao, gây gánh nặng kinh tế cho gia đình người bệnh, đặc biệt là những gia đình đông thành viên.
Giải trình tự Sanger được coi là “tiêu chuẩn vàng” cho chẩn đoán đột biến, bởi phương pháp này có thể xác định trình tự gen cụ thể với độ chính xác cao. Tuy nhiên, phương pháp này lại có độ nhạy thấp khi chỉ có thể phát hiện đột biến nếu lượng DNA đột biến lớn hơn 20% tổng số lượng vật chất di truyền. Bên cạnh đó, giải trình tự Sanger cũng đòi hỏi quy trình kỹ thuật thực hiện hết sức tỉ mỉ, chính xác ngay từ khâu khuếch đại đoạn gen chứa đột biến: Đoạn mồi thiết kế cho giải trình tự Sanger cần phải có độ đặc hiệu cao, sản phẩm sau khi khuếch đại không có lẫn băng phụ, quy trình thực hiện có nhiều bước cần tiến hành tinh sạch.
Vì những điều trên, việc kết hợp sử dụng phương pháp giải trình tự NGS và giải trình tự theo nguyên lý Sanger giúp việc xác định đột biến chính xác và dễ dàng hơn. Việc kết hợp sử dụng phương pháp phân tích di truyền liên kết đã thể hiện nhiều ưu điểm hơn khi có thể xác định người mang gen bệnh đột biến một cách chính xác và dễ dàng với quy trình kỹ thuật đơn giản và dễ thực hiện. Phương pháp có thể áp dụng trên nhiều loại đột biến, đồng thời tiết kiệm về thời gian lẫn chi phí thực hiện cho gia đình người bệnh. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải tìm được các STR liên kết chặt chẽ với gen gây bệnh, đồng thời chúng phải có tính đa hình cao trong quần thể. Việc chẩn đoán di truyền tiền làm tổ nhờ đó có thể giảm thiểu chi phí, giúp ngày càng có nhiều gia đình tiếp cận được với phương pháp.
47
Bảng 14: Bảng tổng hợp ưu nhược điểm của các phương pháp PGT-M
Phương pháp chẩn đoán trực
tiếp (PCR, Sanger, NGS)
Phương pháp chẩn đoán gián tiếp (STR, SNP)
Phương pháp chẩn đoán mới (SNP array,
NGS)
Ưu điểm
- xác định được trực tiếp đột biến quan tâm.
- có thể phát hiện được những loại đột biến mới.
- kiểm soát được hiện tượng ngoại nhiễm và ADO.
- số chỉ thị càng nhiều thì độ chính xác sẽ càng cao.
- độ chính xác cao.
- rút ngắn thời gian thực hiện kĩ thuật.
Nhược điểm
khó kiểm soát ngoại nhiễm; ADO
- thời gian thiết lập quy trình kéo dài do phải sàng lọc các STR phù hợp cho ca bệnh.
- bộ chỉ thị STR có tính chủng tộc.
- yêu cầu cao về CSVC, TTB để phục vụ phân tích.
- giá thành cao.
Như vậy, sử dụng NGS và Sanger kết hợp phân tích di truyền liên kết như nghiên cứu đã thực hiện sẽ giúp việc xác định đột biến chính xác và dễ dàng hơn, tiết kiệm thời gian lẫn chi phí thực hiện, giúp ngày càng có nhiều gia đình tiếp cận được với phương pháp PGD.
48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận:
1. Kết hợp các kỹ thuật sinh học phân tử NGS, giải trình tự Sanger và phân tích di truyền liên kết STR, nghiên cứu đã phát hiện được hai đột biến trên gen OCA2 là OCA2 c.2344G>A (p.Gly782Arg) và OCA2 c.2323G>A
(p.Gly775Ser).
2. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật cho chẩn đoán di truyền tiền làm tổ bệnh bạch tạng tuýp 2.
3. Tiến hành chẩn đoán di truyền tiền làm tổ thành công cho 06 phôi của một gia đình mang gen đột biến OCA2 gây bệnh bạch tạng tuýp 2; kết quả có
03 phôi bệnh (L1, L3, L5), 02 phôi bình thường (L2, L4) và 01 phôi mang gen bệnh (L6).
Kiến nghị:
1. Từ quy trình phát hiện đột biến OCA2 trên mà nghiên cứu đã đưa ra, với
cách thức tương tự hoàn toàn có thể áp dụng cho các đột biến điểm khác trên gen OCA2 và với các bệnh di truyền đơn gen khác nói chung.
2. Có thể tiến hành chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi cho các cặp vợ chồng mang đột biến gen OCA2 tương tự có nguyện vọng sinh con khoẻ
mạnh, không mang gen bệnh.
49