Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4. Kết quả phân tích di truyền liên kết
Tiến hành điện di mao quản trên máy SeqStudio các STR đã lựa chọn và khuếch đại, căn cứ vào kích thước các đoạn có thể phân tích di truyền liên kết để xác định các alen liên kết với gen gây bệnh.
38
Alen liên kết gen gây bệnh
39
Hình 17: Kết quả điện di mao quản với STR D15S661.
Nhận xét: Các đỉnh tín hiệu của sản phẩm sau điện di mao quản thu được đều rõ ràng. Nồng độ sản phẩm sau PCR của các mẫu vừa phải, phù hợp với giới hạn thang tín hiệu thu được của máy.
Với locus STR D15S661, từ trường hợp bệnh nhân II-1 mang hai alen kích thước 155 bp, ta có thể suy luận người bố I-1 mang một alen liên kết gen gây bệnh kích thước 155 bp, người mẹ I-2 mang một alen liên kết gen gây bệnh kích thước một alen. Các mẫu phôi L1, L3, L5 cũng mang hai alen kích thước 155 bp như mẫu II-1.
Alen liên kết gen gây bệnh
Alen liên kết gen gây bệnh
40
Hình 18: Kết quả điện di mao quản với STR D15S1019.
Màu cam là các alen liên kết gen gây bệnh nhận từ mẹ, màu xanh là alen liên
kết gen gây bệnh nhận từ bố.
Kết quả điện di mao quản D15S1019 xuất hiện nhiều đỉnh tín hiệu thấp, đây là các đỉnh tín hiệu phụ, hay còn gọi là các stutter thường xuất hiện trong phân tích các STR.
Với locus D15S1019, bệnh nhân II-1 có 2 alen kích thước 157 bp và 167 bp, như vậy người mẹ I-2 sẽ mang một alen liên kết gen gây bệnh kích thước 157 bp, người bố I-1 mang một alen liên kết gen gây bệnh kích thước 167 bp. Các mẫu phôi L1, L3, L5 mang hai alen kích thước 157 bp và 167 bp như bệnh nhân II-1.
Một trong những tiêu chí chọn STR là có mức độ dị hợp tử cao. Trong nghiên cứu này, locus D15S661 cho kết quả bệnh nhân II-1 đồng hợp tử, tuy nhiên vẫn có giá trị sử dụng vì cung cấp thêm thông tin chứng minh không xảy ra ADO. Với locus D15S1019, người mẹ I-2 là đồng hợp tử, trường hợp này không xác định được chính xác alen mẹ di truyền cho con có phải alen liên kết gen gây bệnh hay không, nhưng kết hợp với kết quả giải trình tự Sanger thì vẫn có thể phân tích được di truyền liên kết.
Từ kết quả điện di mao quản, nghiên cứu phân tích trên trường hợp bệnh nhân II-1 mắc bệnh bạch tạng để suy luận ra các alen liên kết với đột biến gây bệnh. Căn cứ vào những dữ kiện trên và kết quả giải trình tự Sanger đã thực hiện, nghiên cứu đã xác định được kết quả như bảng 13 dưới đây.
Alen liên kết gen gây bệnh Alen liên kết gen gây bệnh
41
Bảng 13: Kết quả phân tích di truyền liên kết gen OCA2
Phôi L1 Phôi L2 Phôi L3 Phôi L4 Phôi L5 Phôi L6
Kết luận: Bị bệnh
Bình thường
Bị bệnh Bình
thường
Bị bệnh Mang gen
đột biến
Trên mỗi phôi đều có hiện tượng dị hợp tử xảy ra trên ít nhất 1 locus STR, do vậy trên các phôi không xảy ra hiện tượng ADO. Ngoài ra, kết quả này cũng trùng khớp với kết quả giải trình tự Sanger đã thực hiện. Như vậy, kết quả sàng lọc theo phương pháp mà nghiên cứu đã thiết kế là đáng tin cậy. Phôi L2 và phôi L4 là phôi
42 bình thường, không mang alen gây bệnh và có thể sử dụng để tiến hành chuyển phôi.
Việc lựa chọn các chỉ thị phân tử STR có ý nghĩa quan trọng, quyết định việc thực hiện phân tích di truyền liên kết thành công. Do vậy, việc phát hiện người mang gen đột biến OCA2 gây bệnh bạch tạng tuýp 2 bằng phương pháp phân tích di truyền liên kết đã được tiến hành trên cơ sở lựa chọn các chỉ thị STR kỹ lưỡng. Các chỉ thị đa hình sử dụng trên các mẫu nên là các đa hình dị hợp tử và tín hiệu đỉnh điện di mao quản rõ, giúp cho việc nhận diện các alen có thể tiến hành dễ dàng.
Trong quá trình giảm phân ở dòng tế bào mầm, trên mỗi cặp NST kép tương đồng trong lần giảm phân đầu tiên đều có khả năng xảy ra hiện tượng tiếp hợp và trao đổi chéo. Phạm vi tái tổ hợp rộng hay hẹp thay đổi ngẫu nhiên trên toàn bộ NST. Giữa hai gen có khoảng cách càng gần nhau thì khả năng xảy ra trao đổi chéo của chúng càng giảm hay tần số trao đổi chéo càng thấp. Do vậy, khả năng giữa hai gen có khoảng cách gần nhau liên kết chặt chẽ và di truyền cùng với nhau càng cao.
Theo khuyến cáo của ESHRE, khi sử dụng các chỉ thị ngoài gen, nên giữ khoảng cách 1 Mb (1 cM) với biến thể gây bệnh được quan tâm, để giảm nguy cơ chẩn đoán sai do các sự kiện tái tổ hợp (trung bình, các locus cách nhau 1 cM dự kiến sẽ có tỉ lệ tái tổ hợp 1%). Nếu không có chỉ thị phù hợp trong phạm vi 1 Mb, thì các chỉ thị trong vòng 2 Mb có thể chấp nhận được [30]. Dựa trên cơ sở này, các chỉ thị STR đã chọn trong nghiên cứu đều nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 15 với chỉ thị D15S661 nằm trong gen và chỉ thị D15S1019 nằm cách 1.3 Mb về phía đầu mút so với gen OCA2. Với khoảng cách này sẽ làm giảm khả năng trao đổi chéo của các locus STR tương đồng trong quá trình giảm phân ở dòng tế bào mầm. Do vậy, có thể đảm bảo các chỉ thị STR gần như hoàn toàn di truyền cùng với gen đột biến
OCA2 gây bệnh mà nghiên cứu khảo sát.
Nguy cơ chẩn đoán sai do tái tổ hợp cần được xem xét đối với từng chỉ thị và đặc biệt quan trọng trong trường hợp các gen lớn và các gen có điểm nóng tái tổ hợp đã biết. Việc lựa chọn cẩn thận các dấu hiệu liên quan đến biến thể gây bệnh được quan tâm sẽ làm giảm nguy cơ chẩn đoán sai do tái tổ hợp. Việc sử dụng các
43 STR có lặp lại tri-, tetra- hoặc penta-nucleotide là thích hợp hơn, để giảm bất kỳ xung đột gây nhiễu nào do hiện tượng lặp tín hiệu và để cải thiện khả năng phân biệt alen.
Phân tích di truyền liên kết sử dụng STR đã được Hiệp hội Sinh sản và Phôi học châu Âu (ESHRE - European Society of Human Reproduction and Embryology) khuyến cáo trong chẩn đoán di truyền tiền làm tổ các bệnh đơn gen bởi khả năng kiểm soát ngoại nhiễm, giảm thiểu nguy cơ chẩn đoán sai do hiện tượng mất alen (Allen Drop Out - ADO), hiện tượng tái tổ hợp của cặp nhiễm sắc thể tương đồng [30] và đồng thời cũng có thể coi là phương pháp chẩn đoán gián tiếp nhằm kiểm tra lại kết quả giải trình tự Sanger. Trong nghiên cứu này, sử dụng NGS và Sanger đã cho ra kết quả chẩn đoán di truyền tiền làm tổ, tiến hành thêm phân tích di truyền liên kết với hai STR giúp khẳng định kết quả chẩn đoán trên chính xác hơn.