Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3. Kết quả giải trình tự Sanger
3.2. Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen chứa đột biến OCA2.2 (OCA2 c.2323G>A.)
Kết quả cho thấy các đột biến điểm xuất hiện ở các mẫu I-1, II-1, L1, L3, L5;
minh hoạ bằng mũi tên trong các hình dưới.
33
Mẫu I-1 Mẫu I-2
Mẫu II-1 Mẫu II-2
Mẫu L1 Mẫu L2
Mẫu L3 Mẫu L4
Mẫu L5 Mẫu L6
Hình 15: Kết quả giải trình tự Sanger xác định đột biến OCA2 c.2323G>A.
34
Kết quả giải trình tự Sanger ở mẫu bố mẹ, hai con gái và 6 mẫu phôi. Vị trí
biến đổi được đánh dấu bằng mũi tên màu đỏ.
Kết quả giải trình tự Sanger xác định đột biến OCA2 c.2323G>A cho thấy
người bố I-1 và người con gái đầu II-1 mang đột biến - phù hợp với kết quả NGS, các mẫu phôi L1, L3, L5 mang đột biến. Đột biến c.2323G>A trên exon 22 gen
OCA2 (NM_000275.3), là nguyên nhân dẫn đến sự thay thế Glycine tại vị trí 775 thành Serine (p.G775S) trên chuỗi polypeptide. Đột biến này là một biến thể hiếm đã biết, được báo cáo trên cơ sở dữ liệu dbSNPs (rs774822330) với tần số 8 × 10-6 trên GnomAD và 9 × 10-6 trên ExAC.
Theo kết quả nghiên cứu đột biến gen OCA2 bằng kỹ thuật PCR và giải trình
tự gen theo nguyên lý Sanger, người bố I-1 là người mang đột biến NM_000275.3:c.2323G>A (NP_000266.2: p.Gly775Ser) thuộc exon 22 của gen
OCA2. Đây là đột biến sai nghĩa, dẫn đến sự thay thế amino acid thứ 775 từ Glycine
thành Serine (p.Gly775Ser). Đây là một biến thể đã biết và được tìm thấy trước đó trong nghiên cứu của Markus và cộng sự thuộc đại học Regensburg, Đức vào năm 2011. Tuy nhiên, Markus cho rằng c.2323G>A (p.G775S) là một biến thể lành tính và không phải là nguyên nhân chính gây nên ảnh hưởng có hại ở người bệnh mà là do biến thể đồng hợp tử c.1113T>C (p.G371=) có liên quan đến sự hình thành điểm cắt nối mới, được dự đoán bởi Splice Sequence Finder Server. Markus và cộng sự giải thích rằng, khi tiến hành phân tích in silico sử dụng SIFT và Polyphen-2 cho kết quả trái ngược nhau, do đó c.2323G>A (p.G775S) không được xem là nguyên nhân gây bệnh [41]. Tuy nhiên, cho đến hiện tại, c.1113T>C (p.G371=) đã được báo cáo là một biến thể lành tính trên cơ sở dữ liệu ClinVar (VCV000193573.7).
Ngoài ra, tại vị trí codon 775 còn tồn tại hai biến đổi khác đã được tìm thấy trước đó ở những người bệnh OCA2 bao gồm c.2323G>C (p.G775R) và c.2324G>A (p.G775D). Năm 2007, Li Hongyi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chẩn đoán di truyền trước sinh bệnh bạch tạng tuýp 2 cho 2 gia đình người Trung Quốc. DNA từ mẫu máu ngoại vi của bố mẹ và DNA thai nhi tách chiết từ dịch ối được sử dụng. Nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR và phân tích trình tự tự động
35 để sàng lọc gen OCA2. Kết quả: Trường hợp 1: Hai đột biến dị hợp tử mới (p.N476D và p.Y827H) ở gen P đã được phát hiện trong proband. Chẩn đoán trước sinh phân tử trên DNA của thai nhi cho thấy N476D. Quá trình mang thai diễn ra bình thường và có kết quả bình thường. Trường hợp 2: Người mẹ và thai nhi đều có một đột biến gen P duy nhất (lần lượt là p.V443I và G775R). Việc mang thai vẫn tiếp tục. Nguyên nhân dẫn tới đột biến p.G775R là do sự thay thế nucletotide
c.2323G>C [42]. Năm 2010, Helene C Johanson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 124 người tham gia là người dân đảo Thái Bình Dương có nguồn gốc Polynesia, trong đó có 12 cá nhân mắc OCA và 112 cá nhân khác là thành viên của gia đình ruột thịt hoặc đại gia đình của họ. Mẫu mẫu ngoại vi hoặc mẫu phết tế bào niêm mạc miệng được thu thập phục vụ nghiên cứu. Các mẫu được tách chiết, tinh sạch, sau đó sử dụng phương pháp PCR và phân tích di truyền qua chỉ thị MC1R qua phản ứng Nested PCR. Kết quả phát hiện đột biến mới c.2324G>A (p.G775D).
Tỷ lệ mắc bệnh ước tính của dạng OCA2 này trong cộng đồng nghiên cứu được cho là một trong những tỷ lệ mắc bệnh bạch tạng cao nhất được ghi nhận là khoảng 1 trên 669 cá nhân. Ngoài ra, họ cũng đã phân tích 4 cá nhân mắc bệnh bạch tạng không liên quan huyết thống nhưng có nguồn gốc Polynesia từ ba cộng đồng riêng biệt khác và nhận thấy họ cũng mang cùng một đột biến OCA2. Nghiên cứu cũng đã phân tích một nhóm bên ngoài bao gồm 4 cá thể không liên quan đến bệnh bạch tạng của tổ tiên Melanesian từ hai cộng đồng riêng biệt, một thổ dân Úc và ba người da trắng Úc và không phát hiện ra đột biến này. Các tác giả đưa ra giả thuyết rằng đột biến này có thể đặc trưng của người Polynesia và nó có nguồn gốc từ một người sáng lập chung [43].
Như vậy, đột biến tại vị trí codon 775 đã được tìm thấy trước đó ở những người bệnh OCA2. Ngoài ra, Glycin ở vị trí codon 775 có tính bảo thủ cao, nằm trong vùng xuyên màng 11 trong tổng số 12 miền trên polypeptide P được mã hóa bởi gen OCA2. Do đó, sự thay thế G775 có thể ức chế sự gấp nếp của protein P và dẫn đến những hậu quả có hại.
36 Phần mềm PolyPhen-2 đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của đột biến này tới cấu trúc và chức năng của protein OCA2. Kết quả cho thấy cấu trúc và chức năng protein OCA2 bị ảnh hưởng cao với điểm tin cậy HumDiv và HumVar đạt giá trị lần lượt là 0,974 và 0,821. Công cụ phân tích đột biến Mutation Taster cũng cho kết quả dự đoán đột biến OCA2 c.2323G>A là đột biến gây bệnh (Disease Causing).
Do vậy, có thể xem xét OCA2 c.2323G>A (p.G775S) như một biến thể “có khả
năng gây bệnh” và cần được chứng minh chức năng trong các nghiên cứu xa hơn.
Hình 16: Dữ liệu phân tích khả năng gây bệnh bạch tạng của đột biến OCA2
c.2323G>A sử dụng phần mềm PolyPhen-2.
Như vậy, thông qua giải trình tự Sanger, nghiên cứu kết luận: Các mẫu chỉ mang đột biến OCA2 c.2344G>A gồm: I-2; II-2 và L6; các mẫu chỉ mang đột biến
OCA2 c.2323G>A là: I-1; mẫu II-1; L1, L3 và L5 mang cả 2 đột biến trên; chỉ có
mẫu L2 và L4 là bình thường, không mang gen đột biến nào.
Bảng 12: Kết quả chẩn đoán đột biến bằng giải trình tự Sanger
Mẫu c.2323G>A c.2344G>A Kết luận
I-1 c.2323G>A/WT WT/WT Mang gen đột biến
I-2 WT/WT c.2344G>A/WT Mang gen đột biến
37 II-1 c.2323G>A/WT c.2344G>A/WT Bị bệnh
II-2 WT/WT c.2344G>A/WT Mang gen đột biến
L1 c.2323G>A/WT c.2344G>A/WT Bị bệnh
L2 WT/WT WT/WT Bình thường
L3 c.2323G>A/WT c.2344G>A/WT Bị bệnh
L4 WT/WT WT/WT Bình thường
L5 c.2323G>A/WT c.2344G>A/WT Bị bệnh
L6 WT/WT c.2344G>A/WT Mang gen đột biến
Các đối tượng trên được kết luận là bị bệnh khi mang cả hai đột biến (trạng thái dị hợp tử phức – Compound heterozygous); người mang alen gây bệnh khi mang một trong hai đột biến trên và người bình thường khi chỉ mang alen WT, không mang alen đột biến.