(TIỂU LUẬN) phát hiện đột biến gen f8 của bệnh nhân hemophilia a ở việt nam 2 bước đầu xây dựng bản đồ đột biến gen f8 đối với bệnh nhân hemophilia a tại việt nam

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hemophilia hay gọi bệnh rối loạn đông máu Đây bệnh di truyền thiếu hụt hay bất thƣờng chức yếu tố đông máu huyết tƣơng, nhƣ yếu tố VIII, IX hay XI Bệnh đặc trƣng thời gian đông máu kéo dài tăng nguy chảy máu; biểu lâm sàng chủ yếu xuất huyết, xuất huyết tự nhiên sau chấn thƣơng nhẹ Đặc điểm xuất huyết đám máu bầm dƣới da, tụ máu cơ, chảy máu khớp Tỷ lệ mắc nƣớc khác nhƣng tần suất chung khoảng 30100/1.000.000 dân [1] Trên giới có nhiều nghiên cứu bệnh hemophilia dự kiến có khoảng 550.000 ngƣời bị bệnh hemophilia vào năm 2020, Việt Nam có khoảng 6000 bệnh nhân có 30% đƣợc phát điều trị [2] Hemophilia bệnh di truyền lặn liên quan đến giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X Ngƣời mẹ mang gen bệnh có khả truyền bệnh cho 50% trai họ, chủ yếu bệnh nhân nam Có loại hemophilia, giảm yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây hemophilia B bất thƣờng yếu tố XI gây bệnh hemophilia C Trong hemophilia A chiếm 80-85%, hemophilia B chiếm 15-20%, hemophilia C chiếm tỉ lệ ít, phổ biến chủ yếu ngƣời Do Thái với tỉ lệ mắc đồng hợp tử khoảng 1-3‰ ngƣời Do Thái [3] Ở bệnh nhân thể nặng, nồng độ protein yếu tố VIII máu thấp, ≤ 1% so với ngƣời bình thƣờng (nồng độ yếu tố VIII bình thƣờng 200 ng/ml) Việt Nam nƣớc có tỉ lệ mắc bệnh hemophillia A cộng đồng cao Theo nghiên cứu Đỗ Trung Phấn cộng năm 1996 tỷ lệ mắc bệnh khoảng 25 – 60/1.000.000 ngƣời [4], phƣơng pháp điều trị Tieu luan nƣớc ta sử dụng yếu tố VIII máu toàn phần (truyền trực tiếp tách chiết) tốn hiệu không cao, đặc biệt có nguy cao bệnh lây truyền qua đƣờng máu Trên giới, nhà khoa học phân tích gen bệnh nhân hemophilia A nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) đƣợc công bố Các nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác gây kiểu hình đặc trƣng khác Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thƣờng gặp dạng đột biến đảo đoạn exon 22 (chiếm 45-50%), đột biến điểm chiếm đa số bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa nhẹ (chiếm 90-95%) [5] Ở Việt Nam, có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh hemophilia A, chủ yếu nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ lệ mắc bệnh hay nghiên cứu đánh giá hiệu điều trị bệnh chế phẩm thay thế… Chƣa có cơng trình nghiên cứu tồn diện đột biến gen mã hóa yếu tố VIII ngƣời Việt Nam, tạo sở liệu để làm tiền đề cho việc xây dựng đồ gen bệnh nhân hemophilia A Việt Nam Với tiến kỹ thuật sinh học phân tử, nhà khoa học phân tích DNA ngƣời bệnh để xác định xác tổn thƣơng gen gây bệnh hemophilia A, nhƣ kiểm soát bệnh tốt nhờ phát ngƣời phụ nữ mang gen bệnh tƣ vấn di truyền trƣớc hôn nhân, tăng hiệu việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chất lƣợng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Do vậy, đề tài đƣợc thực với hai mục tiêu: Phát đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A Việt Nam Bước đầu xây dựng đồ đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A Việt Nam Tieu luan Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH HEMOPHILIA A Từ thời kỳ cổ đại loài ngƣời biết đến bệnh máu khó đơng, nhiên khơng có tên gọi thức cho Trong văn tự cổ ngƣời Do thái từ kỷ thứ II trƣớc công nguyên miêu tả đứa trẻ chết chảy máu không cầm đƣợc sau cắt bao quy đầu (theo tục lệ ngƣời Do Thái: trẻ em trai sinh đƣợc cắt bao quy đầu) Bác sỹ ngƣời Ả rập- Albucasis miêu tả đứa trẻ bị chết chảy máu vết thƣơng nhỏ Bệnh máu khó đơng đƣợc nhận thấy có tính di truyền hàng trăm năm qua hệ gia đình Vào năm 1880 ngƣời ta phát bệnh máu khó đơng di truyền liên kết với giới tính, nhà khoa học nhận thấy có nam giới mắc bệnh khơng có khả truyền bệnh cho trai, ngƣời mẹ mang gen bệnh truyền cho trai Bệnh hemoliphia cịn đƣợc biết đến nhƣ bệnh hồng gia nữ hoàng Anh Victoria (1838-1901) mang gen bệnh truyền bệnh cho nhiều Hoàng Gia khác [6] Xu hƣớng chảy máu bệnh ƣa chảy máu ban đầu đƣợc cho thành mạch yếu, dễ bị vỡ tổn thƣơng Vào năm 30 kỉ XX, bất thƣờng tiểu cầu đƣợc cho nguyên nhân có khả gây bệnh ƣa chảy máu Năm 1937, Patek Taylor phát họ kiểm sốt khiếm khuyết q trình đơng máu cách thêm chất chiết xuất từ huyết tƣơng, chất đƣợc gọi globulin chống chảy máu Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu Buenos Aires cho thấy máu bệnh nhân hemophilia điều trị triệu chứng rối loạn đông máu bệnh nhân hemophilia khác ngƣợc lại, tình cờ ơng gặp hai bệnh nhân bị thiếu hụt Tieu luan hai protein khác - yếu tố VIII yếu tố IX [7] Những phát cho phép chẩn đốn xác xây dựng sở khoa học cho việc điều trị bệnh rối loạn đông máu di truyền 1.2 BỆNH HỌC BỆNH HEMOPHILIA A 1.2.1 Bệnh hemophilia A Bệnh hemophilia A bệnh rối loạn đông máu di truyền khiếm khuyết gen tổng hợp yếu tố VIII dẫn đến giảm nồng độ hoạt tính yếu tố VIII máu [8] 1.2.1.1 Đại cương đông máu Đông máu trình máu chuyển từ thể lỏng thành thể đặc, chuyển fibrinogen thành fibrin khơng hịa tan Các sợi fibrin trùng hợp với tạo mạng lƣới fibrin giam giữ thành phần máu máu đơng lại Cục máu đơng hình thành có tác dụng bịt kín chỗ tổn thƣơng [9] Bình thƣờng máu mơ có chất gây đông chất chống đông, chất gây đông dạng tiền chất không hoạt động nên máu không đông đƣợc Khi mạch máu bị tổn thƣơng hoạt hóa yếu tố đông máu làm cho máu đông lại 1.2.1.2 Các yếu tố đông máu Hội nghị quốc tế năm 1959 đông máu, quy định tên gọi yếu tố đông máu chữ số La mã Có 12 yếu tố đơng máu: - Yếu tố I: Fibrinogen - Yếu tố II: Prothrombin - Yếu tố III: Prothrombin mô yếu tố mô - Yếu tố IV: Ion canxi - Yếu tố V: Proaccelerin (yếu tố không ổn định) - Yếu tố VII: Proconvectin (yếu tố ổn định) - Yếu tố VIII: Yếu tố chống hemophilia - Yếu tố IX: Yếu tố chống hemophilia B (yếu tố Christmas) Tieu luan - Yếu tố X: Yếu tố Stuart - Yếu tố XI: Yếu tố tiền thromboplastin huyết tƣơng (Yếu tố chống hemophilia C) - Yếu tố XII: Yếu tố Hageman- yếu tố chống hemophilia D (Yếu tố ổn định fibrin) Gần đây, phát hai protein huyết tƣơng đƣợc xếp vào nhóm yếu tố đơng máu huyết tƣơng: - Prekallikrein - Kininogen trọng lƣợng phân tử cao Q trình đơng máu huyết tƣơng kết hợp hai đƣờng đông máu nội sinh đông máu ngoại sinh Các hoạt động enzym chuỗi phản ứng nối tiếp dẫn tới hình thành thrombin chuyển fibrinogen thành fibrin, yếu tố VIII tham gia nhƣ đồng yếu tố Hình 1.1 Sơ đồ đông máu theo đƣờng nội ngoại sinh [10] Tieu luan 1.2.1.3 Chẩn đoán bệnh hemophilia A a/ Chẩn đoán xác định - Tiền sử gia đình có ngƣời mắc bệnh - Triệu chứng lâm sàng: thể khác bệnh nhân, nhƣng triệu chứng chảy máu đặc trƣng bệnh Hội chứng chảy máu xảy vào lúc đẻ, thƣờng xuất trẻ tập đi, lúc trẻ xuất nốt điểm tụ máu Trong thể xuất huyết nhẹ, xuất huyết xảy sữa rụng nhổ Bệnh nặng triệu chứng xuất huyết xuất sớm Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trƣng bầm tím chảy máu thƣờng xuyên tái phát vào khớp, đặc biệt đầu gối, mắt cá chân, hông khuỷu tay gây giới hạn chuyển động khớp Bệnh nhân chảy máu từ 20 – 30 lần/ năm; chảy máu tự phát sau chấn thƣơng nhỏ Tuy nhiên, chảy máu từ vết cắt vết trầy xƣớc đƣợc cầm máu tƣơng đối nhanh chóng Đây nguyên nhân phổ biến bệnh nhân hemophilia A chảy máu đến chết sau chấn thƣơng nhỏ Vấn đề khó khăn bệnh nhân chảy máu nội tạng Chảy máu xảy sau chấn thƣơng tiêm vacxin (Hình 3A) Tổn thƣơng nhẹ thành mạch nhỏ dẫn đến xuất huyết não mơ mềm (Hình 3B, C) dẫn đến biến chứng nghiêm trọng Hình 1.2 Hình ảnh tổn thƣơng bệnh nhân hemophilia A [11] A: Tổn thương bầm tím (h) trẻ tập lẫy dẫn đến nghi ngờ bệnh rối loạn đông máu trẻ tháng tuổi B: Chảy máu vào mô mềm xung quanh mắt trái bệnh nhân tuổi C: Xuất huyết nội tạng (khớp vai khớp háng) bệnh nhân tuổi Tieu luan Điều trị nhanh chóng để chấm dứt chảy máu quan trọng việc bảo tồn khớp, diện máu ổ khớp dễ dẫn đến viêm màng hoạt dịch cấp tính Các trƣờng hợp chảy máu lặp lặp lại nhiều lần ổ khớp vƣợt khả loại bỏ xâm nhập đại thực bào dẫn đến màng hoạt dịch bị phá hủy tiến tới hỏng khớp [11] - Xét nghiệm cận lâm sàng: + Thời gian đông máu kéo dài giờ; chất lƣợng cục máu đơng kém; thời gian Howel kéo dài… + Định lƣợng yếu tố VIII (FVIII) giảm khơng có + Xét nghiệm DNA phát đột biến gen F8 + Yếu tố Von- Willebrand bình thƣờng + Số lƣợng tiểu cầu bình thƣờng b/ Chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII Bình thƣờng nồng độ FVIII ngƣời 200 ng/ml Trƣờng hợp bị bệnh, lƣợng yếu tố VIII giảm dƣới 30% Hemophilia A đƣợc chia làm ba thể: nặng, trung bình nhẹ + Thể nặng: hoạt tính FVIII dƣới 1%, bệnh nhân thƣờng bị chảy máu vài lần tháng + Thể trung bình: hoạt tính FVIII từ 1-5%, bệnh nhân bị chảy máu sau chấn thƣơng nhẹ + Thể nhẹ: hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức bình thƣờng, ngƣời bị chảy máu sau phẫu thuật chấn thƣơng nặng, sau động tác mạnh chơi thể thao [12] c/ Chẩn đoán phân biệt - Bệnh Von-Willebrand:  Bệnh di truyền nhiễm sắc thể thƣờng nên gặp nam nữ  Chủ yếu chảy máu niêm mạc Tieu luan  Thời gian máu chảy kéo dài  Yếu tố VIII: C thấp 30%  Yếu tố vWF: Ag giảm  Ngƣng tập tiểu cầu giảm - Hemophilia mắc phải:  Cơ chế bệnh sinh: thể ngƣời trƣởng thành sinh tự kháng thể gây bất hoạt FVIII  Bệnh gặp độ tuổi trung niên, gặp nam nữ  Biểu xuất huyết da mơ mềm; đái máu, xuất huyết dày-ruột, xuất huyết hậu sản kéo dài; gặp xuất huyết khớp  Xét nghiệm: APTT kéo dài, FVIII thấp 30%, có chất ức chế FVIII theo thời gian; số lƣợng tiểu cầu bình thƣờng - Những rối loạn di truyền khác gây kéo dài APTT: bao gồm giảm yếu tố XI, XII, prekallikrein kininogen trọng lƣợng phân tử cao, phân biệt dựa vào định lƣợng yếu tố VIII, IX - Bệnh lý lƣu hành kháng yếu tố VIII yếu tố IX: số bệnh tự miễn (lupus) APTT kéo dài, nồng độ yếu tố VIII, IX giảm Phân biệt cách trộn huyết tƣơng bệnh nhân với huyết tƣơng ngƣời bình thƣờng, APTT khơng đƣợc cải thiện trƣờng hợp có kháng đơng lƣu hành - Rối loạn đơng máu tăng tiêu thụ yếu tố đông máu: gặp nam nữ, thƣờng biểu rối loạn đông máu số bệnh khác nhƣ nhiễm trùng, chấn thƣơng nặng; giảm yếu tố VIII, yếu tố khác giảm tăng tiêu thụ Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam 1.2.1.4 Điều trị thay FVIII a/ Huyết tương tươi đông lạnh Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh đƣợc chiết tách từ máu tƣơi toàn phần thời gian < tháng kể từ lấy khỏi thể ngƣời cho, sau bảo quản nhiệt độ - 300 C Nồng độ FVIII huyết tƣơng tƣơi đông lạnh vào khoảng 0,6 – 0,8 đơn vị/ml [6] Vì vậy, để truyền cho bệnh nhân hemophilia A thể tích đƣa vào lớn, nguy lây nhiễm bệnh truyền qua đƣờng máu cao [13] b/ Tủa lạnh yếu tố VIII (tủa VIII, cryoprecipitate) Tủa lạnh yếu tố VIII đƣợc điều chế cách làm tan huyết tƣơng tƣơi đông lạnh 40C, ly tâm lấy tủa hòa tan 10- 15 ml huyết tƣơng Tuy nhiên, tủa lạnh FVIII chƣa tinh khiết, nguy lây nhiễm bệnh truyền qua đƣờng máu [14] c/ Yếu tố VIII cô đặc Yếu tố VIII cô đặc đƣợc sản xuất từ huyết tƣơng sau đặc bất hoạt virus, có thời gian bán hủy 12-18 Các sản phẩm hạn chế đƣợc việc lây lan bệnh truyền máu qua đƣờng máu, nhiên chƣa loại trừ đƣợc 100% nguy Sản phẩm FVIII cô đặc dễ bảo quản nhƣng q trình sản xuất địi hỏi phải có trang thiết bị, giá thành sản phẩm cao d/ Yếu tố VIII tái tổ hợp Yếu tố VIII tái tổ hợp đƣợc sản xuất từ kháng thể đơn dịng Sản phẩm có hiệu cao điều trị có hàm lƣợng FVIII cao Điều trị an tồn, khơng có khả lây truyền bệnh qua đƣờng máu Tuy nhiên, sản phẩm có giá thành cao, bảo quản khó khăn (ở -20 0C) nên chế phẩm có sẵn trung tâm hay bệnh viện lớn [15] e/ Liệu pháp điều trị gen Phƣơng pháp điều trị gen đƣợc nghiên cứu thơng qua q trình chuyển đoạn DNA mã hóa đoạn gen FVIII vào thể ngƣời bệnh Điều trị (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam bệnh ƣa chảy máu liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích bệnh đƣợc gây khiếm khuyết gen, điều trị để biến đổi dạng bệnh từ thể nặng thành thể nhẹ bệnh ƣa chảy máu Sử dụng liệu pháp gen kích hoạt lên đến 150% hoạt động FVIII [16] Với nguồn cung cấp liên tục sản phẩm gen, liệu pháp gen chữa khỏi bệnh ƣa chảy máu Hiện nghiên cứu thực nghiệm chuột chó chứng minh thành công sử dụng liệu pháp gen điều trị [17] Các nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng đƣợc tiến hành 1.2.2 Vị trí, cấu trúc, chức gen F8 1.2.2.1 Vị trí cấu trúc gen F8 Gen quy định tổng hợp FVIII nằm vị trí Xq28 NST giới tính X Hình 1.3 Vị trí gen tổng hợp FVIII [18] 1.2.2.2 Chức gen F8 Gen F8 gen lớn thể, có kích thƣớc 186 kb gồm 26 exon 24 exon có kích thƣớc từ 62 bp - 262 bp exon lớn exon 14 (3106 bp) exon 26 (1958 bp) [18], [19] (Hình 1.3) (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Đề tài đƣợc thực sở đề tài cấp Bộ (Quyết định số 101-QĐBYT): “Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A” Đề tài đƣợc tài trợ kinh phí từ ngân sách Sự nghiệp Khoa học cấp Bộ Y tế Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Tạ Thành Văn (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam LỜI CẢM ƠN Lời cho phép tơi xin bày tỏ lịng tri ân sâu sắc tới GS.TS Tạ Thành Văn, Phó hiệu trƣởng, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội ngƣời hƣớng dẫn khoa học, ngƣời Thầy hết lòng giúp đỡ, dìu dắt tơi q trình học tập, nghiên cứu, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, nhƣ tạo điều kiện thuận lợi để giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, ngƣời Thầy định hƣớng, trực tiếp hƣớng dẫn thực nghiên cứu giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nhƣ tạo thuận lợi cho trình thực đề tài hồn thành luận án ngày hơm Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hà, nguyên Phó Hiệu trƣởng Trƣờng Đại học Y Hà Nội, ngƣời Thầy giúp đỡ truyền cho kinh nghiệm quý báu học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc, Trƣởng Bộ mơn Hóa sinh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, Trƣởng khoa Sinh hóa, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện, giúp đỡ trình học tập thực luận án Các Nghiên cứu viên Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trƣờng Đại học Y Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để tơi thực kỹ thuật nghiên cứu hồn thành đề tài Các Thầy, Cô Bộ môn Hóa sinh, Trƣờng Đại học Y Hà Nội dạy dỗ truyền đạt kiến thức quý báu trình học tập nghiên cứu Các Bác sĩ, Y tá Khoa Hemophilia A - Viện Huyết học Truyền máu Trung ƣơng; Khoa Huyết học, Lâm sàng - Bệnh Viện Nhi Trung ƣơng trực tiếp giúp đỡ việc thu thập mẫu nghiên cứu (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Trƣờng Đại học Y Hà Nội - Ban Giám đốc, Phòng ban chức năng, Cán viên chức Khoa Sinh hóa Bệnh viện Phụ sản Hải Phịng tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu - Xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến bệnh nhân hemophilia A giúp đỡ tơi có đƣợc số liệu luận án - Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, động viên tơi nhiều q trình học tập Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, ni dƣỡng tình u thƣơng Cha mẹ tôi, ủng hộ, giúp đỡ, động viên vợ, trai, ngƣời bên tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nộị, ngày tháng 12 năm 2014 Lƣu Vũ Dũng (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam LỜI CAM ĐOAN Tôi Lƣu Vũ Dũng, nghiên cứu sinh khóa 29 Trƣờng Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực dƣới hƣớng dẫn GS.TS Tạ Thành Văn TS Trần Vân Khánh Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác đƣợc công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, đƣợc xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Ngƣời vi t cam đoan LƢU VŨ DŨNG (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A1,A2,A3,B,C1,C2 Các vùng yếu tố VIII bp Base pair CDC The Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt phịng chống bệnh dịch) DNA Deoxyribonucleic acid FVIII Yếu tố VIII HAMSTERS Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (Trang quản lý thông tin bệnh hemophilia A nƣớc Anh) Int1 Intron Int22 Intron 22 I-PCR Inversion PCR LD-PCR Long distance PCR MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification PCR Polymerase Chain Reaction CSGE Conformation Sensitive Gel Electrophoresis DNA Deoxyribonucleic acid DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography F8 Gene quy định yếu tố VIII RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction vWF Yếu tố von Willebrand PEG Polyethylene glycol TBE Tris; acid boric; EDTA APTT Activated Partial Thromboplastin Time Xét nghiệm thời gian Thromboplastin phần hoạt hóa NST Nhiễm sắc thể (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN .3 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH HEMOPHILIA A 1.2 BỆNH HỌC BỆNH HEMOPHILIA A 1.2.1 Bệnh hemophilia A 1.2.2 Vị trí, cấu trúc, chức gen F8 10 1.2.3 Bệnh học phân tử bệnh hemophilia A 14 1.2.4 Mối liên quan kiểu gen kiểu hình 16 1.2.5 Yếu tố ức chế FVIII .19 1.2.6 Di truyền học tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A 21 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN F8 22 1.3.1 Phƣơng pháp phát đột biến đảo đoạn nhiễm sắc thể 23 1.3.2 Phƣơng pháp phát dạng đột biến khác 26 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC .30 1.4.1 Nghiên cứu giới 30 1.4.2 Nghiên cứu Việt Nam .32 1.5 NHỮNG VẤN ĐỀ CÒN TỒN TẠI 34 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.2 DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Dụng cụ 37 2.2.2 Hoá chất .37 2.2.3.Trình tự mồi cho phản ứng PCR 39 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .40 2.3.1 Quy trình lấy mẫu 41 2.3.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 41 2.3.3 Quy trình phát đảo đoạn intron 42 2.3.4 Kĩ thuật PCR khuếch đại exon 48 2.3.5 Kỹ thuật điện di gel agarose 49 2.3.6 Giải trình tự gen 49 2.3.7 Phƣơng pháp phân tích kết 52 2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 52 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .53 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA CÁC ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .53 3.1.1 Đặc điểm tuổi 53 3.1.2 Tỷ lệ bệnh nhân chia theo thể bệnh .54 3.2 KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 54 3.2.1 Tỷ lệ phát đƣợc đột biến 54 3.2.2 Kết phát dạng đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A 55 3.2.3 Đánh giá nguy phát triển chất ức chế yếu tố VIII 70 3.3.LẬP BẢN ĐỒ ĐỘT BIẾN GEN F8 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Ở VIỆT NAM 73 3.3.1 Kết vị trí đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A Việt Nam .73 3.3.2 Tỷ lệ dạng đột biến khác bệnh nhân hemophilia A Việt Nam 75 3.3.3 Tỷ lệ dạng đột biến vùng gen F8 76 3.3.4 Bản đồ đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Việt Nam .76 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Chƣơng 4: BÀN LUẬN 78 4.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 78 4.2.PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN F8 Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA A CỦA VIỆT NAM 82 4.2.1 Tỷ lệ phát đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A 82 4.2.2 Các dạng đột biến gây bệnh hemophilia A Việt Nam 84 4.2.3 Đánh giá nguy hình thành chất ức chế 94 4.3.XÂY DỰNG BẢN ĐỒ ĐỘT BIẾN GEN F8 ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN HEMOPHILIA A TẠI VIỆT NAM .98 4.3.1 Vị trí đột biến gây bệnh hemophilia A 98 4.3.2 Tần suất hay gặp số vị trí đột biến 104 4.3.3 Tỉ lệ phát đột biến exon 104 KẾT LUẬN 107 KIẾN NGHỊ .108 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi đối tƣợng nghiên cứu 53 Bảng 3.2 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân có chất ức chế yếu tố VIII theo dạng đột biến .70 Bảng 3.3 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân có chất ức chế yếu tố VIII theo vùng đột biến gen F8 71 Bảng 3.4 Liên quan dạng đột biến yếu tố ức chế 72 Bảng 3.5 Kết vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A 73 Bảng 4.1 So sánh dạng đột biến với nghiên cứu khác giới 106 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố tỷ lệ bệnh nhân theo thể bệnh .54 Biểu đồ 3.2 Phân bố tỷ lệ phát đột biến theo thể bệnh 55 Biểu đồ 3.3 Các dạng đột biến phát đƣợc bệnh nhân hemophilia A 75 Biểu đồ 3.4 Phân bố tỷ lệ dạng đột biến vùng gen F8 .76 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ đơng máu theo đƣờng nội ngoại sinh .5 Hình 1.2 Hình ảnh tổn thƣơng bệnh nhân hemophilia A Hình 1.3 Vị trí gen tổng hợp FVIII .10 Hình 1.4 Cấu trúc gen protein FVIII .11 Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc phân tử 3-D yếu tố VIII hoàn chỉnh 13 Hình 1.6 Cơ chế hình thành kháng thể kháng FVIII 20 Hình 1.7 Ảnh hƣởng dạng đột biến gen F8 đến nguy phát triển chất ức chế FVIII 21 Hình 1.8 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 24 Hình 1.9 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 26 Hình 2.1 Quy trình xác định đột biến gen F8 bệnh nhân hemophilia A 40 Hình 2.2 Vị trí enzym cắt BclI mồi IU, ID, ED .42 Hình 2.3 Các đoạn DNA đóng vịng sau nối T4 ligate .43 Hình 2.4 Hình ảnh vị trí thiết kế mồi đoạn intron1h1 intron1h2 46 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22 56 Hình 3.2 Hình ảnh giải trình tự đoạn DNA kích thƣớc 487bp (mồi IU-ID) đoạn 559bp (mồi IU-ED) 57 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đảo đoạn intron .57 Hình 3.4 Kết PCR xác định đột biến exon bệnh nhân HA64 58 Hình 3.5 Kết PCR xác định đột biến exon bệnh nhân HA55 58 Hình 3.6 Hình ảnh đột biến đoạn 15 nucleotid bệnh nhân HA46 59 Hình 3.7 Hình ảnh đột biến nucleotid bệnh nhân HA91 60 Hình 3.8 Hình ảnh đột biến bệnh nhân mã số HA90 60 Hình 3.9 Hình ảnh đột biến bệnh nhân HA76 .61 Hình 3.10 Hình ảnh đột biến thêm nucleotid C bệnh nhân HA03 62 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Hình 3.11 Hình ảnh đột biến thêm nucleotid A bệnh nhân HA06 63 Hình 3.12 Hình ảnh đột biến nucleotid bệnh nhân HA01 63 Hình 3.13 Hình ảnh đột biến nucleotid bệnh nhân HA39 .64 Hình 3.14 Hình ảnh đột biến tạo stop codon bệnh nhân HA33 .65 Hình 3.15 Hình ảnh đột biến vị trí nối exon/intron bệnh nhân HA45 .65 Hình 3.16 Hình ảnh Blast phần mềm CLC kiểm tra đột biến vị trí nối exon/intron bệnh nhân HA45 66 Hình 17 Hình ảnh đột biến thay nucleotid tạo SNP bệnh nhân HA26 67 Hình 3.18 Hình ảnh SNP đƣợc công bố 67 Hình 3.19 Hình ảnh đột biến chƣa đƣợc cơng bố bệnh nhân HA96.68 Hình 3.20 Hình ảnh cấu trúc 3D protein F8 phân tích bệnh nhân HA96 69 Hình 3.21 Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Việt Nam 77 Hình 4.1 Cấu trúc vị trí tƣơng tác protein FVIII đông máu .99 (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam Tieu luan (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam (TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam(TIEU.LUAN).phat.hien.dot.bien.gen.f8.cua.benh.nhan.hemophilia.a.o.viet.nam.2.buoc.dau.xay.dung.ban.do.dot.bien.gen.f8.doi.voi.benh.nhan.hemophilia.a.tai.viet.nam