Thiết lập phương pháp phát hiện đột biến vùng khởi động gen tert và đột biến gen ctnnb1 ứng dụng trong sàng lọc ung thư gan

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN VÙNG KHỞI ĐỘNG GEN TERT VÀ ĐỘT BIẾN GEN CTNNB1 - ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC UNG THƯ GAN PHẠM QUANG TRUNG Ngành Công nghệ sinh học Cán hướng dẫn: TS Ngô Tất Trung - Bệnh viện TWQĐ 108 TS Đỗ Biên Cương - ĐH Bách Khoa Hà Nội HÀ NỘI, 5/2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN VÙNG KHỞI ĐỘNG GEN TERT VÀ ĐỘT BIẾN GEN CTNNB1 - ỨNG DỤNG TRONG SÀNG LỌC UNG THƯ GAN PHẠM QUANG TRUNG Trung.PQ202292M@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Cán hướng dẫn: TS Ngô Tất Trung TS Đỗ Biên Cương Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 5/2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Phạm Quang Trung Đề tài luận văn: Thiết lập phương pháp phát đột biến vùng khởi động gen TERT đột biến gen CTNNB1 - Ứng dụng sàng lọc ung thư gan Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số SV: 20202292M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng với nội dung sau: Yêu cầu chỉnh sửa hội đồng Nội dung chỉnh sửa Chỉnh sửa lỗi tả, lỗi diễn đạt Chỉnh sửa lại in nghiêng tên gen, in ý hoa tên gen tên hoá chất sử dụng, chỉnh sửa lại câu chưa rõ nghĩa phần tổng quan kết Chỉnh sửa lại mục tiêu nghiên cứu Đã chỉnh sửa (trang vii) mục tóm tắt Bổ sung giới thiệu đột biến gen TERT Đã bổ sung (trang 1) CTNNB1 mục đặt vấn đề Bổ sung thích tài liệu tham khảo Đã bổ sung tài liệu tham khảo hình hình mục tổng quan 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.10 Sửa lại phần vật liệu phương pháp Bổ sung thêm nguồn gốc mẫu tế bào chuẩn (trang 15) Bổ sung quy trình tách chiết đánh giá DNA mẫu chuẩn (trang 17) Chuyển chu trình nhiệt dạng chữ (trang 19, 20) Sửa lại tên thích bảng, hình Đã chỉnh sửa tên hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, phần kết bàn luận 3.6, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, bảng 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 Khớp lại nội dung hình 3.3 (trang 24) Sửa lại độ nhạy phương pháp phát Sửa “độ tin cậy” thành “độ lặp lại” đột biến TERT C228T (trang 27) Luận văn tốt nghiệp Yêu cầu chỉnh sửa hội đồng Lí chưa chỉnh sửa Phương pháp tách chiết chuẩn Phương pháp tách chiết sử dụng phương pháp đánh giá cfDNA đề tài kiểm tra sử dụng để tách cfDNA thí nghiệm trước Đối với phương pháp đánh giá không đủ công cụ để đánh giá nên nghiên cứu sử dụng kết điện di để đánh giá nội chuẩn trình tách Ngày tháng năm 2023 Cán hướng dẫn TS Ngô Tất Trung Tác giả luận văn TS Đỗ Biên Cương CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Trần Liên Hà ii Phạm Quang Trung Luận văn tốt nghiệp LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ tên học viên: Phạm Quang Trung Khóa: 2020B Số hiệu học viên: 20202292M Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Ngành: Công nghệ sinh học Đề tài nghiên cứu: Thiết lập phương pháp phát đột biến vùng khởi động gen TERT đột biến gen CTNNB1 - Ứng dụng sàng lọc ung thư gan Nội dung đề tài:  Phát triển phương pháp phát đột biến C228T vùng khởi động gen TERT đột biến gen CTNNB1 máu ngoại vi  Xác định giá trị đột biến TERT C228T đột biến gen CTNNB1 việc sàng lọc ung thư gan Họ tên cán hướng dẫn:  TS Ngô Tất Trung - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108  TS Đỗ Biên Cương - Đại học Bách Khoa Hà Nội Ngày giao nhiệm vụ luận văn: 03/12/2020 Ngày hoàn thành luận văn: 01/04/2023 Ngày tháng năm 20… Trưởng môn (Ký, ghi rõ họ, tên) Cán hướng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) TS Ngô Tất Trung TS Đỗ Biên Cương Học viên hoàn thành nộp khóa luận tốt nghiệp ngày… tháng…năm… Người duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Học viên (Ký, ghi rõ họ, tên) Phạm Quang Trung iii Luận văn tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, tơi xin gửi lịng kính trọng biết ơn chân thành đến thầy TS Ngô Tất Trung thầy TS Đỗ Biên Cương trực tiếp hướng dẫn, khơng dạy tơi kiến thức mà cịn dạy cách làm việc, cách tư duy, đem đến cho hội động lực để phấn đấu đạt Điều giúp tơi trở nên trưởng thành ngày chọn đường đắn Tiếp theo đó, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội vô tâm huyết, đem đến giảng quý báu cho học viên Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, PGS.TS Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi tham gia nghiên cứu thực luận văn Bệnh viện Trung ương Quân đội 108; cảm ơn anh chị làm việc Trung tâm Tư vấn di truyền Sàng lọc ung thư, Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 quan tâm, hướng dẫn từ thao tác nhỏ nhất, giúp tơi có thêm kinh nghiệm hoàn thiện kĩ phịng thí nghiệm Tơi cảm thấy hạnh phúc biết ơn gia đình, người thân ln bên cạnh hỗ trợ tơi để nhìn lại gia đình động lực để tơi bước tiếp vượt qua khó khăn Học viên Phạm Quang Trung iv Luận văn tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực, không chép chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận văn Phạm Quang Trung v Luận văn tốt nghiệp TÓM TẮT Đột biến vùng khởi động gen telomerase reverse transcriptase (TERT) điểm -124 từ điểm bắt đầu phiên mã (C228T) đột biến gen catenin beta1 (CTNNB1) exon có ý nghĩa quan trọng bệnh lý ung thư Các nghiên cứu trước tập trung phân tích đột biến mẫu mơ ung thư, phương pháp xâm lấn, có độ nhạy khơng cao, giá thành xét nghiệm cao Do đó, đề tài thực với mục tiêu: Phát triển phương pháp phát đột biến C228T vùng khởi động gen TERT đột biến gen CTNNB1 máu ngoại vi; Xác định giá trị đột biến TERT C228T đột biến gen CTNNB1 việc sàng lọc ung thư gan Đối với đột biến vùng khởi động gen TERT, thiết kế tối ưu phản ứng PCR lồng kết hợp với đầu dò đặc hiệu tạo thành phương pháp Nested Realtime PCR; đột biến gen CTNNB1, sử dụng phương pháp giải trình tự gen để phát đột biến; Thử nghiệm phương pháp thiết lập thực 288 mẫu máu ngoại vi với ba nhóm bệnh nhân viêm gan, xơ gan ung thư gan Kết quả, thành công việc thiết lập Nested Realtime PCR phát đột biến gen TERT điểm -124 Độ nhạy kỹ thuật đạt 0,1% (tế bào đột biến/tế bào lành), độ đặc hiệu 100% Tỷ lệ số ca mang đột biến gen TERT phát mẫu máu ngoại vi bệnh nhân ung thư gan 26,44% (n = 174) không phát đột biến nhóm bệnh nhân xơ viêm gan mạn Với đột biến gen CTNNB1 exon 3, tỷ lệ phát bệnh nhân ung thư gan 6,32% không thấy đột biến bệnh nhân viêm gan mạn xơ gan Kết phân tích giá trị đột biến kết hợp với phương pháp chẩn đoán ung thư gan cho thấy việc phát đột biến -124 vùng khởi động gen TERT có khả cải thiện việc tiên lượng ung thư gan, có ý nghĩa việc sàng lọc ung thư gan Từ khóa: ung thư biểu mơ tế bào gan, telomerase reverse transcriptase, catenin beta-1, Nested Realtime PCR, giải trỉnh tự Sanger vi Luận văn tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiii ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƯ GAN 1.1.1 Nguyên nhân ung thư gan 1.1.2 Các giai đoạn ung thư gan tỉ lệ sống thêm bệnh nhân 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan 1.1.3.1 Các phương pháp thường quy 1.1.3.2 Phương pháp phát ung thư gan thông qua phân tích đột biến gen DNA lưu hành tự 1.2 GIÁ TRỊ ĐỘT BIẾN VÙNG KHỞI ĐỘNG GEN TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE VÀ ĐỘT BIẾN GEN CATENIN BETA-1 TRONG UNG THƯ GAN 1.2.1 Đột biến vùng khởi động gen Telomerase Reverse Transcriptase 1.2.1.1 Khái niệm, vai trò Telomere, Telomerase 1.2.1.2 Đột biến promoter gen TERT mối liên hệ với ung thư gan 10 1.2.2 Đột biến gen catenin beta-1 11 1.2.2.1 Giới thiệu đường tín hiệu Wnt/β-catenin 11 1.2.2.2 Mối liên hệ đột biến gen CTNNB1 ung thư gan 12 1.2.3 Các phương phát đột biến vùng khởi động gen TERT gen CTNNB1 13 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.2 VẬT LIỆU 15 2.2.1 Hóa chất 15 2.2.2 Thiết bị, máy móc 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Phương pháp tách chiết, định lượng DNA mẫu dòng tế bào 17 vii Luận văn tốt nghiệp 2.3.1.1 Nguyên tắc 17 2.3.1.2 Quy trình 17 2.3.1.3 Đánh giá chất lượng DNA sau tách chiết 17 2.3.2 Phương pháp tách, chiết cfDNA/ctDNA huyết tương 18 2.3.2.1 Nguyên tắc 18 2.3.2.2 Quy trình 18 2.3.3 Phương pháp khuếch đại gen kỹ thuật Nested-PCR kết hợp Realtime PCR xác định đột biến pTERT 18 2.3.3.1 Nguyên tắc 18 2.3.3.2 Quy trình 19 2.3.3.3 Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu 20 2.3.4 Phương pháp xác định đột biến gen CTNNB1 20 2.3.5 Phương pháp định lượng AFP máu 21 2.3.6 Phương pháp xử lý, phân tích số liệu 21 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN PROMOTER GEN TERT VÀ GEN CTNNB1 23 3.1.1 Tối ưu phương pháp Nested Realtime PCR phát đột biến C228T promoter gen TERT 23 3.1.2 Tối ưu phương pháp phát đột biến gen CTNNB1 27 3.2 GIÁ TRỊ CỦA ĐỘT BIẾN C228T CỦA GEN TERT VÀ CÁC ĐỘT BIẾN GEN CTNNB1 ĐỐI VỚI VIỆC SÀNG LỌC UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO GAN 29 3.2.1 Đặc điểm tuối, giới, nồng độ AFP nhóm nghiên cứu 29 3.2.2 Mối liên hệ đột biến C228T pTERT gen CTNNB1 nhóm bệnh gan 30 3.2.2.1 Tần suất đột biến gen TERT gen CTNNB1 bệnh nhân bệnh gan 30 3.2.2.2 Mối liên hệ đột biến TERT C228T đột biến gen CTNNB1 độ tuổi nồng độ AFP 31 3.2.2.3 Khả chẩn đốn xác đột biến pTERT, đột biến gen CTNNB1 AFP chẩn đốn ung thư biểu mơ tế bào gan 32 viii Luận văn tốt nghiệp D32V, ca 98 C>G S33C, ca 104 T>G I35S ca đoạn 105_107 Đối với đột biến C228T pTERT, nhóm nghiên cứu phát 46 bệnh nhân mang đột biến này, chiếm 26,44% Như vậy, nói đột biến gen TERT đột biến gen CTNNB1 có độ đặc hiệu 100% độ nhạy tương ứng 26,44% 6,32% việc chẩn đoán UTG bệnh nhân nhiễm HBV Số liệu tương đồng với phân tích tổng hợp liệu lớn cơng bố trước Cụ thể, dột biến gen TERT, nghiên cứu Francesca Pezzuto cs (2017) phân tích tổng hợp 12 nghiên cứu liệu lớn khác cho thấy đột biến xuất với tần suất cao đáng kể bệnh nhân nhiễm HCV so với bệnh nhân HBV Mặt khác, khu vực châu Á khu vực mang đột biến thấp so với châu Phi châu Âu (28% so với 40%) [50] Điều chứng minh phương pháp thiết lập đáng tin cậy Điều tương tự đột biến gen CTNNB1 kết Maria cs cho thấy đột biến tập trung bệnh nhân nhiễm HCV Ngoài ra, khoảng 9% bệnh nhân UTG HBV châu Á mang đột biến [39] Kết cho thấy đột biến gen CTNNB1 tập trung vị trí từ D32 đến S37 khơng có trường hợp có đột biến T41 S45, điều cho thấy giá trị cao đột biến D32 đến S37 nghiên cứu trước mẫu mô [38] 3.2.2.2 Mối liên hệ đột biến TERT C228T đột biến gen CTNNB1 độ tuổi nồng độ AFP Mối tương quan độ tuổi, nồng độ AFP với kết phát đột biến gen TERT bệnh nhân UTG thể Hình 3.11 B A Hình 3.11 Biểu đồ phân bố độ tuổi (A) nồng độ AFP (B) nhóm bệnh nhân UTG có khơng có đột biến TERT C228T 31 Luận văn tốt nghiệp Có thể thấy yếu tố tuổi không ảnh hưởng đến bệnh nhân có hay khơng đột biến C228T (Hình 3.11) Sự khác biệt độ tuổi nhóm khơng có ý nghĩa thống kê (P = 0,563, Mann-Whitney test) Nồng độ AFP bệnh nhân UTG mang đột biến C228T khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với bệnh nhân khơng mang đột biến (Hình 3.11, P = 0,928, Mann-Whitney test) Như vậy, không phát mối tương quan độ tuổi, nồng độ AFP đột biến TERT C228T A B Hình 3.12 Biểu đồ phân bố độ tuổi (A) nồng độ AFP (B) nhóm bệnh nhân UTG có khơng có đột biến gen CTNNB1 Đối với đột biến CTNNB1, bệnh nhân mang đột biến thường trẻ bệnh nhân khơng mắc đột biến (Hình 3.12) Tuy nhiên khác biệt độ tuổi hai nhóm khơng có ý nghĩa thống kê (P = 0,231, Mann-Whitney test) Nồng độ AFP bệnh nhân UTG mang đột biến CTNNB1 thấp so với bệnh nhân không mang đột biến (Hình 3.12) Tuy vậy, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (P = 0,506, Mann-Whitney test) 3.2.2.3 Khả chẩn đốn xác đột biến pTERT, đột biến gen CTNNB1 AFP chẩn đốn ung thư biểu mơ tế bào gan Hiện nay, độ tuổi bệnh nhân UTG ngày có xu hướng trẻ hóa Nguyên nhân tình trạng lạm dụng rượu bia Việt Nam, đối tượng sử dụng rượu bia không xảy lứa tuổi người trưởng thành mà xuất lứa tuổi trẻ Tình trạng lạm dụng rượu bia kết hợp với yếu tố khác virut viêm gan B, C, yếu tố di truyền dẫn tới tỉ lệ bệnh nhân UTG ngày tăng cao Với tỉ lệ bệnh nhân có nguy mắc UTG gia tăng cao với hậu nghiêm trọng kèm bệnh này, việc tìm dấu ấn sinh học có khả cải thiện phương pháp chẩn đoán UTG giai đoạn sớm vô cần thiết Việc phát nghiên cứu dấu ấn sinh học TERT DNA lưu hành tự mở hội tiên lượng UTG [27, 51] Hơn nữa, phương pháp phát đột biến DNA lưu hành tự mà nghiên cứu thiết lập 32 Luận văn tốt nghiệp phương pháp khơng xâm lấn có tiềm ứng dụng rộng rãi chẩn đoán lâm sàng Để đánh giá khả chẩn đoán UTG việc phát đột biến pTERT định lượng AFP, xây dựng đồ thị đường cong ROC tính diện tích đường cong AUC 33 A B C Hình 3.13 Biểu đồ ROC phối hợp đột biến gene TERT, CTNNB1, AFP chẩn đoán UTG Trong đó: Biểu đồ phân biệt UTG VG (A); B UTG XG (B); UTG (VG+XG) (C) Luận văn tốt nghiệp Bảng 3.6: Giá trị AUC TERT, CTNNB1 AFP phân biệt UTG với XG VG UTG VG UTG XG UTG (XG + VG) AUC AUC AUC p p TERT 0,632 0,632 0,632 CTNNB1 0,532 0,532 0,532 AFP 0,836 0,770 0,796 0,07 0,02 p 0,01 AFP+TERT 0,877 0,826 0,847 AFP+TERT+CTNNB1 0,883 0,838 0,856 Khi đứng riêng rẽ, khả chẩn đoán xác AFP cao đáng kể so với TERT CTNNB1 phân biệt UTG với VG [AUC (AFP) = 0,836, AUC (TERT) = 0,632, AUC (CTNNB1) = 0,532], phân biệt UTG XG [AUC (AFP) = 0,770, AUC (TERT) = 0,632, AUC (CTNNB1) = 0,532], phân biệt với UTG với nhóm XG+VG [AUC (AFP) = 0,796, AUC (TERT) = 0,632, AUC (CTNNB1) = 0,532, Bảng 3.6, Hình 3.13] Tiếp theo đó, chúng tơi phân tích kết hợp AFP TERT xây dựng mơ hình hồi quy nhị phân: Logit (p = UTG) = -0,410 + 20,896 x TERT + 0,002 x AFP; kết hợp AFP, CTNNB1 TERT xây dựng mơ hình hồi quy nhị phân Logit (p = UTG) = -0,486 + 20,804 x TERT + 20,606 x CTNNB1 + 0,002 x AFP Lúc này, khả chẩn đốn tăng từ mức trung bình (AUC 0,7 ~ 0,8) lên mức tốt (AUC 0,8 ~ 0,9) Các kết phân biệt UTG với VG XG đạt mức tốt Cụ thể AUC (TERT+AFP) = 0,877 phân biệt UTG VG (sự khác biệt gần có ý nghĩa thống kê P = 0,07, Hanley-McNeil test), AUC (TERT+AFP) = 0,826 phân biệt UTG XG, AUC (TERT+AFP) = 0,847 UTG nhóm VG+XG (có ý nghĩa thống kê, Bảng 3.6, Hình 3.13) Mặt khác, gen CTNNB1 không làm AUC thay đổi, AUC (TERT+AFP) AUC (TERT+AFP+CTNNB1) thay đổi khơng có ý nghĩa thống kê (P > 0,05, Hanley-McNeil test) Có thể thấy rằng, độ nhạy đặc hiệu đứng riêng rẽ AFP cao TERT mức trung bình Khi kết hợp AFP TERT với cải thiện tốt khả chẩn đốn UTG Ngồi ra, việc bổ sung thêm xét nghiệm gen CTNNB1 trường hợp khơng có ý nghĩa 35 Luận văn tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Thiết lập thành công phương pháp phát đột biến vùng khởi động gen TERT C228T đột biến gen CTNNB1 exon mẫu máu ngoại vi Độ nhạy kỹ thuật gen TERT C228T đạt 0,1% tế bào đột biến độ đặc hiệu 100%; Phương pháp giải trình tự phát đột biến gen CTNNB1 máu ngoại vi có độ đặc hiệu 100% chưa xác định độ nhạy Thử nghiệm 288 mẫu máu bệnh nhân ba nhóm viêm gan (n = 50), xơ gan (n = 64) ung thư gan (n=174) cho thấy: tỷ lệ mang gen đột biến TERT C228T bệnh nhân thư biểu mô tế bào gan 26,44%, khơng có bệnh nhân viêm gan mạn, xơ gan mang đột biến Tỷ lệ mang gen đột biến CTNNB1 6,32% bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan, khơng có bệnh nhân viêm gan mạn, xơ gan mang đột biến Giới hạn đề tài:  Nghiên cứu lấy mẫu cắt ngang  Mới dừng lại phân tích bệnh nhân ung thư gan nhiễm HBV Kiến nghị phát triển đề tài:  Thực phát đột biến ung thư khác  Thực cỡ mẫu lớn đánh giá giá trị hai đột biến với giai đoạn tiến triển ung thư gan 36 Luận văn tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Organization, W.H., Liver, Fact Sheet no 11 The Global Cancer Obvervatory, 2020 Organization, W.H., Liver, Fact Sheet no 704 The Global Cancer Obvervatory, 2021 Kew, M.C., Hepatocellular carcinoma: epidemiology and risk factors Journal of hepatocellular carcinoma 2014 1: p 115-125 Nguyen, V.T., M.G Law, and G.J Dore, An enormous hepatitis B virusrelated liver disease burden projected in Vietnam by 2025 Liver Int, 2008 28(4): p 525-31 Paraskevi A Farazi, R.A.D., Hepatocellular carcinoma pathogenesis: from genes to environment Nature Reviews Cancer, 2006 6: p 674-687 Liu, J and D Fan, Hepatitis B in China Lancet, 2007 369(9573): p 15823 El-Serag, H.B., Hepatocellular carcinoma N Engl J Med, 2011 365(12): p 1118-27 Pons, F., M Varela, and J.M Llovet, Staging systems in hepatocellular carcinoma HPB (Oxford), 2005 7(1): p 35-41 Reig, M., et al., BCLC strategy for prognosis prediction and treatment recommendation: The 2022 update J Hepatol, 2022 76(3): p 681-693 10 Singal, A.G., et al., Hepatocellular Carcinoma Surveillance and Staging, in Hepatocellular Carcinoma: Translational Precision Medicine Approaches, Y Hoshida, Editor 2019: Cham (CH) p 27-51 11 Gomaa, A.I., et al., Diagnosis of hepatocellular carcinoma World Journal of Gastroenterology, 2009 15(11) 12 Daniele, B., et al., α-fetoprotein and ultrasonography screening for hepatocellular carcinoma Gastroenterology, 2004 127(5): p S108-S112 13 Jordi Bruix*, M.S., Josep M Llovet, Michel Beaugrand, Riccardo Lencioni, Andrew K Burroughs, Erik Christensen, Luigi Pagliaro, Massimo Colombo, Juan Rode´s, Clinical Management of Hepatocellular Carcinoma Conclusions of the Barcelona-2000 EASL Conference Journal of Hepatology, 2001 35: p 421-430 14 Tokuhisa, Y., et al., Circulating cell-free DNA as a predictive marker for distant metastasis of hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma Br J Cancer, 2007 97(10): p 1399-403 37 Luận văn tốt nghiệp 15 Diaz, L.A., Jr and A Bardelli, Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA J Clin Oncol, 2014 32(6): p 579-86 16 Joosse, S.A., T.M Gorges, and K Pantel, Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells EMBO Mol Med, 2015 7(1): p 111 17 Dasgupta, A., A.R Lim, and C.M Ghajar, Circulating and disseminated tumor cells: harbingers or initiators of metastasis? Mol Oncol, 2017 11(1): p 40-61 18 Dawson, S.J., et al., Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer N Engl J Med, 2013 368(13): p 1199-209 19 Bettegowda, C., et al., Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies Sci Transl Med, 2014 6(224): p 224ra24 20 Forshew, T., et al., Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA Sci Transl Med, 2012 4(136): p 136ra68 21 Thress, K.S., et al., Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M Nat Med, 2015 21(6): p 560-2 22 Totoki, Y., et al., Trans-ancestry mutational landscape of hepatocellular carcinoma genomes Nat Genet, 2014 46(12): p 1267-73 23 Shimada, S., et al., Comprehensive molecular and immunological characterization of hepatocellular carcinoma EBioMedicine, 2019 40: p 457-470 24 Jhunjhunwala S, J.Z., Stawiski EW, Gnad F, Liu J, Mayba O, Du P, Diao J, Johnson S, Wong KF, Gao Z, Li Y, Wu TD, Kapadia SB, Modrusan Z, French DM, Luk JM, Seshagiri S, Zhang Z., Diverse modes of genomic alteration in hepatocellular carcinoma Genome Biol, 2014 15(8): p 436 25 Leao, R., et al., Mechanisms of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) regulation: clinical impacts in cancer J Biomed Sci, 2018 25(1): p 22 26 Huang FW, H.E., Xu MJ, Kryukov GV, Chin L, Garraway LA, Highly recurrent TERT promoter mutations in human melanoma Science, 2013 339(6122): p 957-9 38 Luận văn tốt nghiệp 27 Nault, J.C., et al., High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions Nat Commun, 2013 4: p 2218 28 Vinagre, J., et al., Frequency of TERT promoter mutations in human cancers Nat Commun, 2013 4: p 2185 29 Nault, J.C., et al., Telomerase reverse transcriptase promoter mutation is an early somatic genetic alteration in the transformation of premalignant nodules in hepatocellular carcinoma on cirrhosis Hepatology, 2014 60(6): p 1983-92 30 Wang, N., et al., TERT promoter mutation as an early genetic event activating telomerase in follicular thyroid adenoma (FTA) and atypical FTA Cancer, 2014 120(19): p 2965-79 31 Huang, D.S., et al., Recurrent TERT promoter mutations identified in a large-scale study of multiple tumour types are associated with increased TERT expression and telomerase activation Eur J Cancer, 2015 51(8): p 969-76 32 Cevik, D., Common telomerase reverse transcriptase promoter mutations in hepatocellular carcinomas from different geographical locations World Journal of Gastroenterology, 2015 21(1): p 311 33 Trung, N.T., et al., Clinical significance of combined circulating TERT promoter mutations and miR-122 expression for screening HBV-related hepatocellular carcinoma Sci Rep, 2020 10(1): p 8181 34 Rao, T.P and M Kuhl, An updated overview on Wnt signaling pathways: a prelude for more Circ Res, 2010 106(12): p 1798-806 35 Kimelman, D and W Xu, beta-catenin destruction complex: insights and questions from a structural perspective Oncogene, 2006 25(57): p 748291 36 Jeong, W.J., E.J Ro, and K.Y Choi, Interaction between Wnt/beta-catenin and RAS-ERK pathways and an anti-cancer strategy via degradations of beta-catenin and RAS by targeting the Wnt/beta-catenin pathway NPJ Precis Oncol, 2018 2(1): p 37 Xu, C., et al., beta-Catenin signaling in hepatocellular carcinoma J Clin Invest, 2022 132(4) 38 Rebouissou S, F.A., Calderaro J, et al., Genotype-phenotype correlation of CTNNB1 mutations reveals different ß-catenin activity associated with liver tumor progression Hepatology, 2016 64(6): p 2047-2061 39 Luận văn tốt nghiệp 39 Tornesello, M.L., et al., Mutations in TP53, CTNNB1 and PIK3CA genes in hepatocellular carcinoma associated with hepatitis B and hepatitis C virus infections Genomics, 2013 102(2): p 74-83 40 Schwaederle, M., et al., Telomerase reverse transcriptase promoter alterations across cancer types as detected by next-generation sequencing: A clinical and molecular analysis of 423 patients Cancer, 2018 124(6): p 1288-1296 41 McEvoy AC, C.L., Pereira MR, et al, Sensitive droplet digital PCR method for detection of TERT promoter mutations in cell free DNA from patients with metastatic melanoma Oncotarget, 2017 8(45): p 78890-78900 42 Pellestor, F and P Paulasova, The peptide nucleic acids (PNAs), powerful tools for molecular genetics and cytogenetics Eur J Hum Genet, 2004 12(9): p 694-700 43 Braasch DA, C.D., Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA Chem Biol., 2001 8(1): p 1-7 44 Anna, S.F.L., J Brian, and McMahon, AASLD PRACTICE GUIDELINES Corrections to AASLD Guidelines on Chronic Hepatitis B: Update 2009 HEPATOLOGY 2009 45 Bacon, B.D., Cirrhosis and its complications Harrison’s principles of internal medicine, 2009 17th edition: p 1971-1980 46 Ferenci, P., et al., World Gastroenterology Organisation Guideline Hepatocellular carcinoma (HCC): a global perspective J Gastrointestin Liver Dis, 2010 19(3): p 311-7 47 Yan, L., et al., Diagnostic value of circulating cell-free DNA levels for hepatocellular carcinoma Int J Infect Dis, 2018 67: p 92-97 48 Alcaide, M., et al., Evaluating the quantity, quality and size distribution of cell-free DNA by multiplex droplet digital PCR Sci Rep, 2020 10(1): p 12564 49 Lee, W.C., Value of alpha-fetoprotein in hepatocellular carcinoma Transl Gastroenterol Hepatol, 2021 6: p 52 50 Pezzuto, F., et al., Frequency and geographic distribution of TERT promoter mutations in primary hepatocellular carcinoma Infect Agent Cancer, 2017 12: p 27 51 Liao W, Y.H., Xu H, et al, Noninvasive detection of tumor-associated mutations from circulating cell-free DNA in hepatocellular carcinoma 40 Luận văn tốt nghiệp patients by targeted deep sequencing Oncotarget, 2016 7(26): p 4048140490 41 Luận văn tốt nghiệp PHỤ LỤC Bảng SPSS: Thông tin bệnh nhân STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới 1 0 7.32 57 41 0 1.44 23 0 2.08 20 42 0 2.13 44 0 1.62 40 43 0 250.03 54 0 2.41 46 44 0 1.75 48 0 3.75 49 45 0 23.07 48 0 0.51 46 0 3.7 51 0 1.25 38 47 0 1.11 43 0 4.54 61 48 0 3.3 59 0 3.82 39 49 0 4.59 50 10 0 4.17 31 50 0 7.39 56 11 0 1.48 51 0 628.35 61 12 0 2.34 52 0 14.31 58 13 0 0.79 53 0 8.1 74 14 0 2.08 42 54 0 1.44 62 15 0 6.52 34 55 0 10.06 57 16 0 1.21 56 0 2.17 61 17 0 4.42 62 57 0 3.05 63 18 0 1.08 55 58 0 8.92 68 19 0 40 59 0 4.34 63 20 0 13.23 60 0 3.18 40 21 0 61 0 12.83 38 22 0 0.71 62 0 2.25 42 23 0 1023.73 63 0 54.1 79 24 0 1.51 64 0 2.2 63 25 0 2.42 60 65 0 7.9 55 26 0 1.48 19 66 0 4.78 41 27 0 101.98 63 67 0 3.13 59 28 0 3.21 46 68 0 12.1 45 29 0 2.37 53 69 0 36.3 73 30 0 496.11 35 70 0 119.41 58 31 0 40 71 0 1.51 32 0 9.62 22 72 0 157.36 61 33 0 2.08 28 73 0 3.13 63 34 0 7.67 72 74 0 1.02 35 0 950.32 73 75 0 23.49 36 0 82.89 33 76 0 9.48 37 0 2.49 32 77 0 40.78 60 38 0 2.84 52 78 0 706.64 53 39 0 1.55 37 79 0 58.08 37 40 0 2.77 36 80 0 3.73 57 42 Luận văn tốt nghiệp STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới 81 0 3.16 65 127 0 321.19 50 82 0 13.77 78 128 0 3000 62 83 0 5.7 82 129 9.51 57 84 0 6.82 53 130 3.09 77 85 0 6.84 45 131 0 35.44 70 86 0 2.86 56 132 470.61 41 87 0 20.6 50 133 0 86605.79 93 88 0 3.57 70 134 0 10.01 63 89 0 1.5 63 135 0 20.03 67 90 0 4.31 49 136 0 12.38 63 91 0 2.92 137 49.61 59 92 0 22.16 61 138 38.41 67 93 0 3.64 55 139 0 21.28 63 94 0 40.69 56 140 13942.59 40 95 0 1.78 65 141 0 15438.79 61 96 0 17.82 75 142 0 13.48 64 97 0 1.61 143 0 12885.29 49 98 0 24.16 59 144 10357.13 49 99 0 48.99 38 145 105.73 57 100 0 101.01 70 146 0 12.16 55 101 0 0.27 67 147 8600.21 63 102 0 7.59 61 148 0 111.53 70 103 0 1.33 60 149 47.73 65 104 0 0.51 36 150 0 99988.57 64 105 0 2.17 151 0 4825.02 81 106 0 3.45 152 0 57.98 67 107 0 6.98 153 0 1933.25 63 108 0 15.19 154 0 2.23 63 109 0 36.71 155 0 1909.5 37 110 0 2.9 156 0 6.1 67 111 0 156.73 157 0 25.03 53 112 0 5.07 158 2008.6 57 113 0 2.99 159 0 3000 65 114 0 7.27 160 4473.33 64 115 52344.6 66 161 185.71 70 116 0 8421.6 43 162 132.69 71 117 0 37.06 56 163 2000 47 118 0 1045.36 60 164 9.08 74 119 268.24 39 165 0 1833.77 43 120 2008.6 61 166 0 50.84 73 121 0 13.16 37 167 0 1.51 64 122 1.68 71 168 0 4381.4 72 123 0 25.2 63 169 7.48 69 124 0 2000 71 170 6.15 54 125 0 234957.8 64 171 5.17 62 126 73.19 57 172 6.16 40 43 Luận văn tốt nghiệp STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới 173 0 2.34 64 219 70.72 63 174 13.85 60 220 5.31 45 175 0 4.02 48 221 0 1706.54 63 176 0 28.34 76 222 889.64 64 177 0 4.76 70 223 0 3000 56 178 0 4.86 63 224 0 7.61 47 179 3160.6 68 225 0 0.68 29 180 2008.6 62 226 0 6.73 55 181 0 432.59 59 227 0.68 39 182 0 55.12 60 228 0 58.01 82 183 0 55.53 70 229 0 0.99 59 184 0 764.49 67 230 0 704.83 55 185 0 19001.62 51 231 0 2008.6 60 186 0 297362.7 61 232 0 2008.6 66 187 5.14 68 233 0 69.37 56 188 0 1.77 68 234 0 16.96 54 189 0 11.97 60 235 0 33.09 62 190 0 242.71 53 236 0 26.95 39 191 2.11 48 237 0 2.57 53 192 10.77 66 238 0 221.45 60 193 1 40.32 60 239 0 2.06 61 194 0 1210 33 240 0 3.21 68 195 139.62 50 241 0 1.63 35 196 0 162332.4 73 242 0 17.28 51 197 0 9.49 67 243 0 4.42 64 198 0 2008.6 61 244 0 3.96 75 199 0 713.22 68 245 11.22 64 200 119.41 58 246 0 80.22 56 201 3000 67 247 0 22150.26 62 202 0 74.68 70 248 0 2008.6 52 203 0 5.87 42 249 0 311.56 73 204 0 3000 48 250 0 2715.31 60 205 0 669.42 72 251 1 10.56 70 206 1 40.04 55 252 0 7796.03 67 207 0 453.92 64 219 70.72 63 208 0 6.23 51 220 5.31 45 209 0 2.06 63 221 0 1706.54 63 210 0 25.39 77 222 889.64 64 211 0 154931.7 60 223 0 3000 56 212 0 1438.29 67 224 0 7.61 47 213 0 51.62 55 225 0 0.68 29 214 0 3000 61 226 0 6.73 55 215 0 1262.27 82 227 0.68 39 216 0 1.79 70 228 0 58.01 82 217 0 5.48 62 229 0 0.99 59 218 0 33708.63 61 230 0 704.83 55 44 Luận văn tốt nghiệp STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới STT Bệnh TERT CTNNB1 AFP Tuổi Giới 253 2483.82 39 271 0 275.01 53 254 0 6.09 82 272 0 2088.46 59 255 634136.8 62 273 0 2.57 80 256 1804.11 66 274 0 245.51 44 257 2999.59 69 275 0 45.73 67 258 43.66 87 276 1 60 259 0 22150.26 62 277 2008.6 62 260 11.22 64 278 826.43 77 261 0 53.71 82 279 0 2088.46 59 262 44.94 73 280 0 245.51 44 263 0 2.2 50 281 0 45.73 67 264 0 2.07 54 282 12.64 55 265 0 109641.7 69 283 0 20.22 62 266 0 80.22 56 284 0 816.99 57 267 0 3.28 60 285 140.2 56 268 0 13.59 50 286 0 3.05 64 269 0 6.3 64 287 0 8147.44 58 270 0 79.97 57 288 0 52.7 67 Ghi chú: Tên đầy đủ Giá trị STT Số thứ tự TERT Đột biến promoter C228T {0, Khơng đột biến; 1, Có đột biến} CTNNB1 Đột biến gen CTNNB1 {0, Không đột biến; 1, Có đột biến} Bệnh {1, VG; 2, XG; 3, UTG} Giới {0, Nam; 1, Nữ} 45