Triển khai và đánh giá tác dụng của cao chiết từ Ích mẫu trong chảy máu âm đạo ở chuột trên mô hình kinh nguyệt như ở người trên chuột nhắt trắng .... Kết quả đánh giá tác dụng của các c
TỔNG QUAN
Tổng quan về bệnh lý rong kinh
1.1.1 Sinh lý học chu kỳ kinh nguyệt
❖ Giai đoạn 1: Giai đoạn tăng sinh hoặc nang trứng
Giai đoạn này xảy ra từ ngày đầu tiên đến ngày 14 của chu kỳ kinh nguyệt (thời gian trung bình là 28 ngày) [63] Cuối chu kỳ trước, progesterone và estrogen giảm đột ngột tạo ra cơ chế điều hoà ngược âm tính, tuyến yên tăng bài tiết FSH và LH dưới sự chỉ huy của GnRH Nồng độ hai hormon này lúc đầu chỉ hơi tăng sau đó tăng dần trong đó FSH tăng trước và LH tăng sau đó vài ngày [4] Dưới tác dụng của FSH và
LH, đặc biệt là FSH, ở buồng trứng có từ 6-12 nang nguyên thủy trưởng thành thành nang Graafian Các nang xung quanh bắt đầu thoái hóa, đó là lúc nang Graafian trở thành nang trưởng thành và bắt đầu quá trình rụng trứng [63] Rụng trứng: Sự rụng trứng luôn xảy ra trước kỳ kinh 14 ngày Vì vậy, với chu kỳ trung bình 28 ngày, sự rụng trứng xảy ra vào ngày thứ 14 Vào cuối giai đoạn tăng sinh, nồng độ estrogen ở mức cao do nang trứng trưởng thành và tăng sản xuất hormone Chỉ trong thời gian này, estrogen tăng cao đã feedback ngược dương tính cho việc tăng sản xuất FSH và
LH Kết quả là nang trưởng thành bị vỡ và tế bào trứng được giải phóng Nồng độ estrogen giảm vào cuối quá trình rụng trứng trong khi đó mức bài tiết progesterone lại bắt đầu tăng dần [4]
Biến đổi ở niêm mạc tử cung: Sau hành kinh, niêm mạc tử cung chỉ còn lại một lớp mỏng của mô đệm và sót lại một ít tế bào biểu mô nằm tại đáy các tuyến Dưới tác dụng của estrogen, các tế bào mô đệm và tế bào biểu mô tăng sinh nhanh chóng Niêm mạc dày dần, các tuyến dài, mạch máu phát triển Ngoài ra, giai đoạn này còn tạo môi trường thuận lợi cho tinh trùng xâm nhập bằng việc tạo các kênh trong cổ tử cung do các tuyến của cổ tử cung bài tiết một lớp dịch nhày kéo thành sợi dọc theo tử cung [4]
❖ Giai đoạn 2: Giai đoạn bài tiết hoặc hoàng thể
Giai đoạn này luôn diễn ra từ ngày 14 đến ngày 28 của chu kỳ [63] Sau khi phóng noãn, tuyến yên vẫn tiếp tục bài tiết FSH và LH Dưới tác dụng của LH, một ít tế bào hạt còn lại ở vỏ nang trứng vỡ được biến đổi nhanh chóng thành hoàng thể Hoàng thể là một cấu trúc được hình thành trong buồng trứng tại vị trí nang trưởng thành vỡ ra để sản xuất progesterone [4]
Biến đổi của niêm mạc tử cung: Trong giai đoạn này estrogen vẫn tiếp tục làm tăng sinh lớp niêm mạc tử cung nhưng tác dụng này yếu hơn nhiều so với progesterone Dưới tác dụng của progesterone, niêm mạc tử cung dày nhanh và bài tiết dịch Các tuyến càng dài ra, cong queo, chứa đầy các chất tiết Các mạch máu phát triển, trở nên xoắn lại và cung cấp máu cho niêm mạc tử cung tăng lên Nội mạc tử cung chuẩn bị bằng cách tăng nguồn cung cấp mạch máu và kích thích tiết nhiều chất nhầy hơn để thích ứng với việc làm tổ của một tế bào mới hình thành phôi Nếu việc thụ thai diễn ra, progesterone tiếp tục được tiết ra, duy trì nội mạc tử cung ở trạng thái thuận lợi cho việc làm tổ Nếu trứng không được thụ tinh làm tổ thì thể vàng sẽ thoái biến, sự giải phóng progesterone từ thể vàng ngừng đột ngột Sự suy giảm progesterone kích thích sự bắt đầu của chu kỳ kinh nguyệt [4]
Hiện tượng kinh nguyệt: Kinh nguyệt được gây ra do sự giảm đột ngột nồng độ hai hormon sinh dục nữ, đặc biệt là progesterone Khi đó, niêm mạc tử cung thoái hóa và bài tiết prostaglandin gây co thắt động mạch nuôi dưỡng lớp niêm mạc gây thiếu máu và do thiếu tác dụng kích thích của hormon nên niêm mạc chức năng bị hoại tử, mạch máu tổn thương và niêm mạc chức năng bị bong ra [4] Nhờ tác dụng co cơ tử cung của prostaglandin mà bị đẩy ra ngoài qua âm đạo là khối mô bong ra cùng với dịch máu gây hiện tượng kinh nguyệt (Được tính từ ngày 0 đến ngày 5 của chu kỳ kinh nguyệt tiếp theo) Máu kinh nguyệt chứa prostaglandin, mảnh vụn mô và lượng tiêu sợi huyết tương đối lớn từ mô nội mạc tử cung Quá trình tiêu sợi huyết sẽ làm tan cục máu đông để máu kinh thường không chứa cục máu đông trừ khi lượng máu chảy nhiều [63]
1.1.2 Sơ lược về chảy máu âm đạo
Chảy máu âm đạo được sử dụng để mô tả bất kỳ hiện tượng chảy máu bất thường nào không liên quan đến kinh nguyệt, bao gồm [34]:
➢ Bất kỳ hiện tượng chảy máu nào xảy ra ngoài chu kỳ kinh nguyệt bình thường ở những người đang có kinh nguyệt;
➢ Chảy máu kinh nguyệt nặng (HMB) hoặc kéo dài bất thường;
➢ Chảy máu trong quá trình mang thai;
➢ Chảy máu ở người sau mãn kinh hoặc trẻ em trước tuổi dậy thì
Chảy máu âm đạo là do chảy máu ở đâu đó trong đường sinh dục, bao gồm âm hộ, âm đạo, cổ tử cung, thân tử cung và phần phụ Nguyên nhân bao gồm chảy máu thứ phát do các bệnh lý phụ khoa (tại tử cung hoặc ngoài tử cung), sản khoa và toàn thân Ở thanh thiếu niên và người lớn, chảy máu âm đạo thường do chảy máu tử cung bất thường (AUB) [34] Chảy máu kinh nguyệt nặng (HMB) là triệu chứng phổ biến nhất của AUB gây giảm chất lượng cuộc sống của phụ nữ về thể chất, xã hội, tình cảm và vật chất [70]
1.1.3.1 Sơ lược về rong kinh
Chảy máu kinh nguyệt nặng (HMB) là thuật ngữ hiện được sử dụng thay cho rong kinh [56] Rong kinh được định nghĩa là tình trạng chảy máu tử cung kéo dài (>7 ngày) hoặc quá nhiều (>80ml/ngày) đều đặn Nguyên nhân phổ biến là rối loạn trục HPG hoặc do rối loạn đông máu, giảm tiểu cầu hoặc rối loạn chức năng tiểu cầu [29]
Rong kinh là nguyên nhân gây phổ biến gây thiếu máu và giảm chất lượng cuộc sống ở phụ nữ Khi chu kỳ kinh nguyệt bất thường có thể phản ánh bệnh lý, vấn đề do điều trị hoặc căng thẳng do vùng dưới đồi gây ra [15]
Rong kinh là tình trạng bệnh lý ảnh hưởng đến phụ nữ trong độ tuổi sinh sản trên toàn cầu Mặc dù các loại thuốc như progesterone và estradiol valerate phần lớn mang lại lợi ích cho bệnh nhân mắc bệnh rong kinh nhưng chúng có liên quan đến các tác dụng phụ bất lợi như buồn nôn, nôn, tăng cân và rối loạn chức năng gan thận Do đó, cần có các chiến lược dùng thuốc mới và an toàn để điều trị rong kinh [64] Tất cả các nước thành viên ở Đông Nam Á, với sự hỗ trợ của WHO đang và đã tăng cường việc sử dụng y học cổ truyền vào việc chăm sóc sức khỏe để điều trị các tình trạng sức khỏe của phụ nữ như bệnh lý rong kinh [23]
Theo thống kê, rong kinh ảnh hưởng đến 30% phụ nữ trong độ tuổi sinh sản 1/5 phụ nữ ở Anh và 1/3 phụ nữ ở Hoa Kỳ bị cắt tử cung trước tuổi 60 và rong kinh là vấn đề chính xuất hiện ở ít nhất 50% đến 70% trên những phụ nữ này [25] Chảy máu kinh nguyệt nhiều là một trong những vấn đề phụ khoa phổ biến nhất, chiếm 18–30% số lần khám phụ khoa và dẫn đến 17,8 ca phẫu thuật trên 10.000 phụ nữ trong độ tuổi sinh sản ở Hoa Kỳ [62] Ở các nước đang phát triển, xuất huyết tử cung bất thường ảnh hưởng tới 5-15% phụ nữ ở độ tuổi sinh sản và có tỷ lệ cao hơn ở phụ nữ ở nhóm tuổi lớn hơn Chảy máu quá mức có thể làm trầm trọng thêm tình trạng thiếu máu và một số trường hợp có thể đe dọa tính mạng nếu không được điều trị [33] Chi phí trực tiếp hàng năm ước tính liên quan đến HMB là 1 tỷ đô la trong khi chi phí gián tiếp có thể lên tới 12 tỷ đô la do ảnh hưởng đến công việc và chất lượng cuộc sống của người phụ nữ [62] Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, hiện nay có đến 90% phụ nữ Việt mắc các bệnh liên quan đến phụ khoa Đáng nói, số ca mắc bệnh phụ khoa mỗi năm tăng 15% - 27% Theo nghiên cứu mô tả hồi cứu được tiến hành dựa trên 108 hồ sơ bệnh án của các bệnh nhân rong kinh rong huyết cơ năng, có độ tuổi từ 10 đến 24 tuổi tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương trong năm 2019 và 2020, độ tuổi vị thành niên chiếm tỉ lệ cao nhất 86,1%, bệnh nhân có lượng hemoglobin dưới 80 g/l chiếm tỉ lệ cao nhất 63,9%, niêm mạc tử cung dưới 5mm: 100% bệnh nhân có thời gian rong kinh 16-30 ngày [7]
HMB là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất của AUB Thuật ngữ này lần đầu tiên được sử dụng trong Guidelines của New Zealand về HMB Nó được xác định rõ ràng trong bối cảnh lâm sàng trên cơ sở khiếu nại của bệnh nhân trong Guidelines của Hoa
FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics – Liên đoàn sản phụ khoa quốc tế) đã tạo ra hệ thống phân loại PALM-COEIN để xác định nguyên nhân gây chảy máu tử cung bất thường (AUB) Nhóm PALM của phân loại bao gồm các nguyên nhân cấu trúc của AUB: Polyp, Adenomyosis (Lạc nội mạc tử cung), Leiomyoma (U xơ tử cung) và Malignancy (Bệnh ác tính và tăng sản) Nhóm COEIN bao gồm các nguyên nhân phi cấu trúc: Coagulopathy (Rối loạn đông máu), Ovulatory disorders (Rối loạn rụng trứng), and Endometrial disorders (Rối loạn chức năng nội mạc tử cung), Iatrogenic causes (Nguyên nhân do điều trị như DCTC; hóa trị liệu; thuốc chống đông máu) và Not classified (Không được phân loại) [56]
Nguyên nhân của HMB có thể bao gồm AUB do polyp (AUB-P), do adenomyosis (AUB-A), do u xơ tử cung (AUB-L), cũng như các nguyên nhân phi cấu trúc như rối loạn rụng trứng (AUB-O); rối loạn đông máu (AUB-C), rối loạn chức năng nội mạc tử cung (AUB-E) Căn nguyên có thể do trong quá trình mang thai như chửa ngoài tử cung, sẩy thai Do rối loạn chảy máu bao gồm bệnh Von Willebrand, bệnh máu khó đông, rối loạn chức năng tiểu cầu, thiếu hụt yếu tố VIII và IX Suy giáp cũng có thể liên quan đến HMB [56]
Hoặc nguyên nhân có thể phân loại như sau [52]:
- Nội tiết: Chảy máu không rụng trứng; Hội chứng buồng chứng đa nang; Bệnh lý tuyến giáp;
- Rối loạn chảy máu: Bệnh Von Willebrand; Rối loạn chức năng tiểu cầu; Giảm tiểu cầu; Thiếu yếu tố đông máu;
- Nhiễm trùng: Bệnh lây truyền qua đường tình dục; Viêm cổ tử cung; Viêm nội mạc tử cung;
- Thai kỳ: Phá thai; Chửa ngoài tử cung; Bệnh nguyên bào nuôi thai kỳ; Chảy máu sau sinh;
- Thuốc: Thuốc chống đông máu; Đặt dụng cụ tử cung; Thuốc tránh thai Depot Medroxyprogesterone;
- Tử cung: Ung thư cơ trơn; Polyp; Lạc nội mạc tử cung; Bệnh lý ác tính;
- Khác: Tổn thương; Dị vật lạ; U nang buồng trứng xuất huyết
1.1.3.4 Cơ chế bệnh sinh rong kinh liên quan tới giảm nồng độ progesterone
Một số mô hình mô phỏng quá trình kinh nguyệt như ở người trên động vật 8 1.3 Tổng quan về dược liệu Ích mẫu
Kinh nguyệt, sự bong ra của nội mạc tử cung kèm theo chảy máu, xảy ra ở một số động vật có vú có nhau thai khi nồng độ progesterone giảm khi không có sự làm tổ của phôi Ở động vật có vú không có kinh nguyệt, sự phá vỡ mô và chảy máu không xảy ra khi nồng độ progesterone giảm Tuy nhiên, ở các loài linh trưởng bậc cao, một số loài dơi và chuột chù voi, sự thoái hóa của hoàng thể và hậu quả là lượng progesterone giảm sẽ gây ra sự phân giải protein của chất nền ngoại bào, tế bào chết và chảy máu [26]
Tử cung của loài gặm nhấm và phụ nữ có chung cấu trúc (lớp biểu mô lòng và tuyến, lớp đệm, lớp cơ nội mạc tử cung) nhưng phụ nữ có chu kỳ kinh nguyệt còn các loài chuột nhắt trong phòng thí nghiệm có chu kỳ “động dục” tương đối ngắn với bốn giai đoạn: tiền động dục, động dục, metetrus và diestrus [42] Do đó, các động vật thí nghiệm thông thường như chuột nhắt hoặc chuột cống không thể được sử dụng để nghiên cứu trực tiếp cơ chế của chu kỳ kinh nguyệt rõ ràng như xảy ra ở người [59]
Về vấn đề này, Finn và Keen (1963) và Finn và Pope (1984) đã xây dựng một mô hình chuột mô phỏng các quá trình giống kinh nguyệt [27], [28] Chuột cái trưởng thành được cắt bỏ buồng trứng, để phục hồi trong 7 ngày để làm cạn kiệt các hormone nội sinh, được thiết lập lịch trình hormone để bắt chước các hormone dao động mà phụ nữ trải qua trong chu kỳ kinh nguyệt (sử dụng estrogen và progesterone) và nội mạc tử cung được kích thích nhân tạo để mô phỏng lại quá trình kinh nguyệt [42] Phương pháp: Những con chuột bị cắt bỏ buồng trứng sau ít nhất 1 tuần sẽ được tiêm hormon theo lịch như sau: Ngày 1 và ngày 2 tiêm 100 ng E2 trong 1 ml dầu lạc mỗi ngày; ngày
3, 4, 5 không tiêm; ngày 6, 7, 8 là 10 ng E2 và 500 pg progesterone (mỗi loại hòa tan trong 5 ml dầu lạc) Sau 4-6 giờ tiêm hormon vào ngày thứ 8 thì tiêm dầu vào tử cung
[28] Sau khi tiêm dầu vào tử cung thì thấy hình thành màng rụng, phá vỡ nội mạc tử cung sau khi ngừng sử dụng progesterone và sửa chữa sau đó [59]
Một mô hình khác được M Brasted và cộng sự thiết kế vào năm 2003, những con chuột bị cắt bỏ buồng trứng sau 7 ngày được tiêm 17β-estradiol và cấy ghép progesterone trước khi tiêm dầu vào lòng tử cung Ngày 0, 1, 2 tiêm dưới da 100 ng E2 trong dầu lạc Ngày 6, 7, 8 cấy phép P dưới da vào lưng mỗi con chuột đồng thời tiêm dưới da 5 ng E2 trong dầu lạc 2 tiếng sau khi tiờm E2 vào ngày 8, tiờm 20 àl dầu mố vào lòng sừng tử cung bên phải, sừng trái làm đối chứng Bộ cấy progesterone được lấy ra 49h sau đó và các con vật bị giết chết vào giữa 0 đến 48h sau đó Sự phá vỡ mô nội mạc tử cung được bắt đầu sau 12-16 giờ và đến 24 giờ, toàn bộ vùng màng rụng nội mạc tử cung bị bong ra Qúa trình tái tạo biểu mô gần như hoàn tất sau 36 giờ và nội mạc tử cung phục hồi hoàn toàn sau 48 giờ Do đó phương pháp này bắt chước nhiều sự kiện trong chu kỳ kinh nguyệt của con người [17]
Năm 2007, X.B Xu, B He và J.D Wang làm giảm nồng độ progesterone trên chuột bằng cách sử dụng Mifepristone đã thành công trong việc mô tả quá trình giống với kinh nguyệt ở chuột Động vật được cắt bỏ buồng trứng và để hồi phục sau 2 tuần Sau đó, chúng được tiêm dưới da hormon vào ngày 1, 2, 3 với 100 ng 17β-estradiol trong dầu Arachis Vào ngày thứ 7, cấy vào lưng chuột 50 ng progesterone và tiêm dưới da 5 ng 17β-estradiol trong dầu arachis Vào ngày 8, 9 cũng tiêm dưới da 5 ng 17β-estradiol trong dầu arachis, trong khi ngày thứ 9 tiêm 20 ml dầu arachis vào lòng sừng tử cung bên trái còn sừng bên phải không tiêm để làm đối chứng Ngày 11 tiêm vào dạ dày Mifepristone (120 mg/kg) [69]
Hạn chế của các mô hình này là việc chuột bị cắt bỏ buồng trứng kết hợp với việc cung cấp hormon nhân tạo sẽ loại trừ mọi tác động tự nhiên của hormon buồng trứng, estrogen và progesterone, là những chất cần thiết để chi phối các chức năng nội mạc tử cung trong chu kỳ kinh nguyệt của con người [59] Thời gian quan sát ngắn (2-
3 ngày sau khi tiêm dầu) không thuận lợi để quan sát, đánh giá tác dụng của mẫu dược liệu Để khắc phục nhược điểm này, Marion Rudolph, 2012 đã đưa ra mô hình sau: Ở những con chuột cái còn nguyên vẹn: Mức progesterone nội sinh tăng lên bằng cách gây ra hiện tượng mang thai giả Sau khi tiêm dầu vào tử cung, những con chuột hình thành lớp màng rụng ở nội mạc tử cung là điều kiện tiên quyết cho quá trình kinh nguyệt Sự sụt giảm tự nhiên của progesterone nội sinh dẫn đến sự phá vỡ tự phát mô nội mạc tử cung sau khi hình thành lớp màng rụng Những thay đổi về hình thái như sự phá vỡ và sửa chữa lớp nội mạc tử cung xảy ra song song ở cùng một sừng tử cung Quan trọng nhất, sự phá vỡ nội mạc tử cung đi kèm với chảy máu âm đạo và chảy ra khỏi mô bị bong ra tương đương với kinh nguyệt của con người Tóm lại, kinh nguyệt của con người có thể bắt chước về mặt chảy máu ra ngoài âm đạo, tái tạo mô ở các loài không có kinh nguyệt tự nhiên như chuột cái còn nguyên vẹn không cắt buồng trứng mà không cần cung cấp hormon ngoại sinh [59]
So với mô hình đã thiết lập, Marion Rudolph, 2012 đã kéo dài thời gian của các quá trình chảy máu: những thay đổi về kích thước và hình thái tử cung xảy ra rất nhanh trong vòng vài giờ sau khi ngừng sử dụng progesterone ở chuột đã cắt bỏ buồng trứng, trong khi các quá trình này diễn ra trong vài ngày trong nghiên cứu của Marion Rudolph, 2012 Việc kéo dài thời gian này sẽ làm tăng tính khả thi của việc phân tích động học hoặc cường độ chảy máu Do đó, những con chuột bị chảy máu quá mức và kéo dài được kỳ vọng sẽ có giá trị trong việc nghiên cứu các con đường phân tử ảnh hưởng đến rối loạn kinh nguyệt như rong kinh [59]
1.3 Tổng quan về dược liệu Ích mẫu
1.3.1 Tên gọi - vị trí phân loại Ích mẫu còn có tên gọi khác là Ích mẫu thảo, Sung úy, Chói đèn Tên khoa học là Leonurus japonicus Houtt là loài điển hình ở Đông Á Thuộc ngành Ngọc Lan
(Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (Lamidae), bộ Hoa môi (Lamiales), họ Bạc Hà (Lamiaceae), chi Leonurus [6], [71], [2]
1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố Đặc điểm thực vật Ích mẫu là một loại cỏ sống 1-2 năm; cao 0,6m đến 1m Thân hình vuông, ít phân nhánh, toàn thân phủ lông nhỏ ngắn Lá mọc đối, lá ở thân có cuống ngắn hơn, phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, trên mỗi thùy có răng cưa thưa, lá trên cùng phần lớn không chia thùy và hầu như không cuống Hoa mọc vòng ở kẽ lá Tràng hoa màu hồng hay tím hồng, xẻ thành 2 môi gần đều nhau Qủa nhỏ, 3 cạnh, vỏ màu xám nâu [6]
Chủ yếu mọc hoang, ven suối, ven sông nơi đất cát Cây ưa nóng và ẩm, đất thịt và đất phù sa Một số nơi đã bắt đầu trồng để làm thuốc Cây phân bố ở nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam, châu Phi, châu Mỹ… Ở nước ta gặp từ Lào Cai, Yên Bái, Hà Giang, Lạng Sơn, Hà Nội, Hà Nam vào tới Lâm Đồng và thành phố Hồ Chí Minh [6]
Hơn 280 chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập từ cây này Tuy nhiên, chỉ một số ít trong số chúng được báo cáo là có hoạt tính sinh học [51]
Alcaloid là thành phần hóa học có hoạt tính chính, có hàm lượng tương đối cao trong L japonicus Có 4 alcaloid được xác định và nghiên cứu: Leonuridine,
Leonurine, Leonurinine, Stachydrine Trong số các alcaloid được phân lập thì Stachydrine là một alcaloid khung pyrrole có hàm lượng cao trong L japonicus
Stachydrine và Leonurine được nghiên cứu rộng rãi nhất [51], [61]
Cấu trúc Leonurine trong L japonicus được thể hiện thông qua hình sau:
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Leonurine
Cấu trúc Stachydrine trong L japonicus được thể hiện thông qua hình sau:
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Stachydrine
Cho đến nay, chỉ có 4 monoterpenoid và 19 sesquiterpenoid được phân lập từ L japonicus Trong số đó, phần lớn là chất tương tự megastigmane Các phân nhóm sesquiterpenoid khác bao gồm chamigrane, bisabolane, cuparane, chromolaevane và eudesmane Trong chi Leonurus đã phân lập hơn 90 diterpenoid Hơn một phần ba trong số này là bis-spirolabdane diterpenoids Những bis-spirolabdanes này có những điểm tương đồng về cấu trúc; sự khác biệt chính là các nhóm thế ở các nguyên tử cacbon C-3, C-6, C-7, C-8 và C-15, cũng như các cấu hình tuyệt đối khác nhau ở các nguyên tử cacbon bất đối, đặc biệt là ở C-13 Cho đến nay, 36 triterpenoid đã được phân lập từ L japonicus [51]
1.3.3.3 Một số thành phần khác
- Steroid: được xác định có mặt trong L japonicus và chiếm một lượng nhỏ (khoảng 6,7 %) bao gồm 11 stigmastanes và 8 ergostanes được chiết xuất và phân lập [51]
- Flavonoid: Leonurus japonicus rất giàu flavonoid, là một loại chất chuyển hóa thứ cấp chính và nồng độ của chúng lớn nhất ở lá và nhỏ nhất ở rễ 5 flavonoid đã được phân lập và mô tả đặc điểm từ L japonicus; chúng bao gồm 10 flavon, 24 flavonol và
1 isoflavon Hầu hết các flavonol là monoglycosid hoặc diglycosid được hình thành bằng cách glycosid hóa glucose (Glc), rhamnose (Rha) và galactose (Gal) [51]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Phần trên mặt đất của cây Ích mẫu được thu hái tại Bắc Giang (tháng 5/2022) và được xác định đúng tên khoa học là Leonurus japonicus Houtt bởi Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Quy trình chiết ethanol 70% và chiết nước từ phần trên mặt đất của cây Ích mẫu được mô tả tóm tắt như sau:
Quy trình chiết cao ethanol 70 % từ Ích mẫu (ký hiệu mẫu là IME): Lá và cành khô của cây Ích mẫu được cắt thành từng đoạn 1 kg dược liệu Ích mẫu được chiết với
10 lít ethanol 70%, trong thời gian 2,5h ở nhiệt độ hồi lưu của dung môi, lọc thu lấy dịch Phần bã được chiết tiếp hai lần nữa với ethanol 70% (8 lít và 8 lít) ở nhiệt độ hồi lưu của dung môi trong khoảng thời gian tương ứng là 2h và 1,5h Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại, cất thu hồi ethanol dưới áp suất giảm, sau đó cô trên bếp cách thủy và cuối cùng là sấy trong tủ sấy chân không thu được 104,14g cao, độ ẩm cao 2,81% Hiệu suất chiết cao đạt 10,41%
Quy trình chiết cao nước từ Ích mẫu (ký hiệu mẫu là IMW): 600 g dược liệu ích mẫu được chiết với 6 lít nước, trong thời gian 2,5h ở nhiệt độ 95 o C, lọc thu lấy dịch Phần bã được chiết tiếp hai lần nữa với nước (4,8 lít và 4,8 lít) ở nhiệt độ 95 o C trong khoảng thời gian tương ứng là 2h và 1,5h Dịch lọc của 3 lần chiết được gộp lại cô cạn bằng bếp cách thủy và sấy trong tủ sấy chân không thu được 76,68g cao, độ ẩm cao 2,86% Hiệu suất chiết cao đạt 12,78%
Cao dược liệu được chiết và đánh giá theo tiêu chuẩn cao chiết Ích mẫu của Dược điển Việt Nam V
Liều sử dụng trên chuột được quy đổi tương đương với liều sử dụng trên người trong dân gian đó là: Cao chiết ethanol Ích mẫu nồng độ 600 mg/kg và 800mg/kg, cao chiết nước nồng độ 800 mg/kg và 1600 mg/kg
Chuột nhắt trắng cả đực và cái 8-10 tuần tuổi (35-40 g), chủng Swiss albino khỏe mạnh đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp Điều kiện phòng thí nghiệm nhiệt độ 25±1°C, độ ẩm 65±5%, chu kỳ sáng và tối là 12/12 (bật đèn từ 7:00 đến 19:00 giờ), thức ăn và nước uống được cung cấp đầy đủ Chuột được nuôi ổn định 5 ngày trước lúc làm thí nghiệm
2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Tên hóa chất Nguồn gốc STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 Acid glacial Merck, Đức 6 Hematoxylin Merck, Đức
Hoa Kỳ 8 Nước cất Việt Nam
4 Đệm PBS Merck, Đức 9 Span 20 Việt Nam
Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu
STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
1 Bút lông để đánh dấu Nhật Bản, Trung Quốc
2 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ
4 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản
6 Máy đo quang phổ UV-VIS Biofuge Fresco, Đức
8 Máy ly tâm Biofuge Fresco, Đức
12 Một số dụng cụ, thiết bị khác
Phương pháp nghiên cứu
Mô hình gây kinh nguyệt như ở người trên chuột nhắt trắng được mô phỏng theo Marion Rudolph, 2012 [59] Thiết kế thí nghiệm được tóm tắt bằng sơ đồ như sau:
Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm
2.2.1 Phương pháp cắt ống dẫn tinh trên chuột nhắt trắng
Quy trình phẫu thuật cắt ống dẫn tinh 2 bên của chuột đực 8-10 tuần tuổi :
- Bước 1: Gây mê chuột bằng pentobarbital với liều 50 mg/kg, tiêm phúc mạc
- Bước 2: Chuột nằm sấp, bôc lộ và sát trùng vùng mổ
- Bước 3: Mổ bộc lộ và cắt ống dẫn tinh Đường mổ gọn dọc theo hai bên cột sống, dài 1cm, cách cột sống 0,5cm, cách gốc đuôi 3cm Qua da, lớp dưới da, lớp cơ, gạt bỏ lớp tổ chức mỡ ta sẽ thấy ống dẫn tinh
- Bước 4: Khâu tổ chức liên kết, cân cơ thành bụng, lưng theo lớp; khâu da và sát trùng tại chỗ bằng dung dịch betadine 10%
- Bước 5: Chuột sau phẫu thuật được đưa vào chuồng ủ ấm và theo dõi sau mổ đến khi động vật tỉnh táo trở lại
Hiệu ứng Whitten được tiến hành theo Whitten WK (1968) [67] đối với chuột đực bị cắt ống dẫn tinh sau 1 tuần và chuột cái 8-10 tuần tuổi khỏe mạnh Hai ngày trước khi giao phối với những con đực đã cắt ống dẫn tinh, đặt những con chuột đực khỏe mạnh phía trên những con chuột cái trong 48 giờ để gây động dục Động dục gây ra bởi Pheromone, thành phần của nước tiểu chuột nhắt đực (hiệu ứng Whitten)
Phương pháp đánh giá: Quan sát trạng thái và độ mở của âm đạo bằng kính lúp để quan sát các dấu hiệu tiền động dục Proestrus: Âm đạo mở, các mô có màu hồng đỏ, ẩm ướt và có nhiều nếp gấp chạy dọc theo chiều dọc của 2 môi âm vật và giai đoạn động dục Estrus: các dấu hiệu tương tự như proestrus nhưng các mô có màu hồng sáng hơn và ít ẩm ướt, các nếp gấp cũng rõ ràng hơn Lựa chọn những con chuột ở giai đoạn Estrus để tiến hành các bước tiếp theo [5], [1]
2.2.3 Triển khai và đánh giá tác dụng của cao chiết từ Ích mẫu trong chảy máu âm đạo ở chuột trên mô hình kinh nguyệt như ở người trên chuột nhắt trắng
2.2.3.1 Triển khai mô hình kinh nguyệt như ở người trên chuột nhắt trắng
Cho chuột cái động dục giao phối qua đêm với chuột đực cắt ống dẫn tinh ở trên, những con chuột cái mang thai giả được chọn dựa trên sự hiện diện của một nút âm đạo Những con chuột cái mang thai giả (Ngày 0) được lựa chọn và chia ngẫu nhiên thành các lô thử nghiệm, mỗi lô có 6-8 con :
- Lô sinh lý: Những con chuột cái động dục không gây mang thai giả, uống nước cất trong suốt quá trình nghiên cứu;
- Lô bệnh lý: Uống nước cất trong suốt quá trình nghiên cứu;
- Lô điều trị IMW 0,8 và 1,6: Uống cao chiết nước từ Ích mẫu liều tương ứng là 0,8 g/kg và 1,6 g/kg;
- Lô điều trị IME 0,6 và 0,8: Uống cao chiết ethanol từ Ích mẫu liều tương ứng là 0,6 g/kg và 0,8 g/kg;
- Lô chứng dương: Uống progesterone liều 0,05 g/kg (Biệt dược: Utrogestan 100 mg)
Quỏ trỡnh hỡnh thành màng rụng được tạo ra bằng cỏch tiờm 100 àl dầu vào tử cung (Sigma-Aldrich, Đức) của những con chuột cái ở các lô trừ lô sinh lý vào ngày thứ 4 của thai kỳ giả Chuột các lô được uống mẫu thử nghiệm hoặc đối chứng dương, hoặc uống nước liên tục trong 12 ngày với thể tích 10 ml/kg thể trọng chuột Ở ngày thứ 12, đánh giá các chỉ số vào thời điểm sau khi uống thuốc 1 giờ
Ghi chú: Chuột các lô được uống thuốc hàng ngày đến lúc kết thúc thí nghiệm Ngày đánh giá các chỉ số vào thời điểm sau khi uống thuốc 1 giờ Thể tích cho uống là 10 ml/kg thể trọng chuột
Chuột được tiến hành đánh giá các thông số như sau:
2.2.3.2 Đánh giá mức độ bong lớp niêm mạc tử cung thông qua số lượng tế bào sừng Đánh giá mức độ tổn thương của niêm mạc tử cung được xác định bằng cách đếm số lượng tế bào sừng [10] Rửa õm đạo với 40 àl PBS 3 àl dịch rửa được nhỏ trên phiến kính, làm khô và nhuộm H&E (hematoxylin và eosin) Tiêu bản được soi dưới kính hiển vi vật kính 20x Đếm số lượng tế bào sừng của mỗi tiêu bản ở 5 vị trí ngẫu nhiên và tính giá trị trung bình
Quy trình nhuộm H&E theo hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh, tế bào học - Bộ Y tế:
• Bước 1: Tẩy parafin trong 3 bể xylen, mỗi bể 5 phút
• Bước 2: Qua 4 bể ethanol: 100º - 95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần
• Bước 3: Rửa nước cất: nhúng 15 lần
• Bước 4: Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3-5 phút hoặc lâu hơn
• Bước 5: Rửa nước chảy: 5-10 phút
• Bước 6: Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng ethanol-acid
• Bước 7: Rửa nước chảy: 1 phút
• Bước 9: Rửa nước chảy: 1 phút
• Bước 10: Biệt hoá trong 2 bể ethanol 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng
• Bước 11: Qua 3 bể xylen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút
2.2.3.3 Định lượng progesterone huyết thanh chuột bằng kỹ thuật ELISA Định lượng theo hướng dẫn của quy trình Kit Progesterone (Thermo Fisher Scientific) theo nguyên tắc cạnh tranh Nồng độ progesterone trong mẫu được tham chiếu trên đường chuẩn Lấy máu đuôi sau 1 giờ uống thuốc thử nghiệm sau đó định lượng nồng độ progesterone trong huyết tương Định lượng vào ngày 12
Quy trình định lượng bằng kit ELISA cạnh tranh progesterone:
• Bước 1: Cho vào các giếng lần lượt các chất theo thứ tự sau:
➢ Giếng mẫu trắng: Đệm pha (75 àl) → Progesterone liờn hợp (25 àl)
➢ Giếng mẫu chuẩn/ thử: Mẫu chuẩn/ thử (50 àl) → Progesterone liờn hợp (25 àl) → Antibody progesterone (25 àl)
• Bước 2: Ủ trong 2h tại nhiệt độ phòng và lắc
• Bước 3: Rửa giếng 4 lần với 300 àL đệm rửa/ lần (1 lần/ 1 phỳt)
• Bước 4: Thờm 100 àL cơ chất là TMB vào mỗi giếng (Trỏnh ỏnh sỏng) Dung dịch cơ chất ban đầu có màu xanh
• Bước 5: Ủ 30 phút tại nhiệt độ phòng và không lắc (Tránh TMB không chạm vào nhôm hoặc kim loại)
• Bước 6: Thờm 50 àL dung dịch dừng phản ứng HCl Trộn nhẹ Dung dịch trong mỗi giếng chuyển từ màu xanh sang vàng
• Bước 7: Đọc kết quả 3 lần trong vòng 10 phút với bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA theo nguyên tắc đo mật độ quang
2.2.3.4 Giải phẫu mô học tử cung chuột
Cân xác định trọng lượng tử cung - buồng trứng và tiến hành đánh giá phân tích mô bệnh học tử cung: Các mẫu mô tử cung được cố định trong formaldehyde 4%, đệm PBS Thực hiện chuyển mẫu, đúc parafin, cắt lát mỏng Sau đó nhuộm bằng hematoxylin (Merck, Đức) và eosin (Sigma-Aldrich, Đức; nhuộm H&E); quan sát hình thái và bề dày tử cung dưới kính hiển vi quang học Mỗi lô tiến hành đánh trên 6 con chuột, 3 lát cắt/ 1 con chuột Kết quả giải phẫu mô học tử cung do bác sĩ Viện 108 đọc kết quả
Kết quả của thí nghiệm đánh giá số lượng tế bào sừng, nồng độ progesterone trong huyết thanh và trọng lượng tử cung - buồng trứng được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích bằng SPSSv20 Với số liệu thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung bình và sai số chuẩn So sánh kết quả giữa các lô bằng kiểm định One – Way ANOVA Với số liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả biểu diễn bởi giá trị trung vị và khoảng tứ phân vị So sánh kết quả giữa các lô bằng kiểm định Kruskal Wallis Sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu đến mức độ bong của niêm mạc tử cung thông qua số lượng tế bào sừng của chuột chảy máu âm đạo
Chảy máu tử cung được kích hoạt bởi sự sụt giảm tự nhiên của progesterone nội sinh [59] Số lượng tế bào sừng tăng lên khi nồng độ progesterone giảm xuống [32] Khi đó nhiều tế bào biểu mô bị sừng hóa mất nhân, có sự bong tróc dần các lớp sừng hóa [10] Do vậy, thử nghiệm này là tiêu chí quan trọng để nghiên cứu chẩn đoán bệnh và đánh giá tác dụng cao chiết từ Ích mẫu có tác dụng điều trị chảy máu âm đạo Số lượng tế bào sừng được tính trung bình của 5 vị trí có số lượng tế bào nhiều nhất trên tiêu bản Kết quả được thể hiện trong hình 3.1:
Hình 3.1 Tác dụng cải thiện tổn thương lớp niêm mạc tử cung của các cao chiết từ Ích mẫu trên mô hình chảy máu âm đạo ở chuột n = 6; ** p < 0,01; *** p < 0,001 so với lô bệnh lý (chuột chảy máu âm đạo và uống nước); Chuột bị chảy máu âm đạo được điều trị bằng cao chiết ethanol từ Ích mẫu (IME, liều 0,6 và 0,8 g/kg), cao chiết nước từ Ích mẫu (IMW, liều 0,8 và 1,6 g/kg) và Utrogestan (0,05 g/kg) liên tục trong 12 ngày
Kết quả hình 3.1 cho thấy số lượng tế bào sừng ở vết phết âm đạo ngày 12 lô bệnh lý cao hơn so với lô sinh lý, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Số lượng tế bào sừng ở lô điều trị bằng các cao chiết ethanol liều 0,6 g/kg và cao chiết nước liều 0,8 g/kg từ Ích mẫu đều có xu hướng thấp hơn lô bệnh lý, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Ở hai mức liều cao hơn của Ích mẫu 0,8 g/kg đối với cao chiết ethanol và 1,6 g/kg đối với cao chiết nước đều có tác dụng giảm mạnh số lượng tế bào sừng của chuột bị chảy máu âm đạo, với lần lượt p < 0,001 và p
< 0,01 Chuột được điều trị bằng Utrogestan (0,05 g/kg) có số lượng tế bào sừng thấp hơn so với lô bệnh lý, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01)
Từ kết quả trên nhận thấy, cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg từ Ích mẫu có tác dụng làm giảm số lượng tế bào sừng ở vết phết âm đạo liên quan đến giảm sự bong tróc lớp niêm mạc tử cung trong mô hình chảy máu âm đạo ở chuột Do đó, chúng tôi sử dụng các mức liều đó để tiếp tục đánh giá tác dụng sâu hơn ở chuột bị chảy máu âm đạo.
Kết quả đánh giá tác dụng của các cao chiết Ích mẫu lên nồng độ progesterone
Progesterone đã được chứng minh có tác dụng rất hiệu quả trong điều trị rong kinh [13] Do đó, định lượng nồng độ progesterone trong huyết thanh là tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả điều trị của các cao chiết từ Ích mẫu Tiến hành định lượng nồng độ progesterone trong huyết thanh ở ngày 12 bằng phương pháp ELISA, nhóm nghiên cứu thu được kết quả như hình 3.2:
Hình 3.2 Tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu trên nồng độ progesterone ngày 12 trong huyết tương của chuột chảy máu âm đạo
(n=6 cá thể/1 lô; ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với lô chứng bệnh lý)
Kết quả hình 3.2 cho thấy ở ngày điều trị thứ 12, nồng độ progesterone ở lô bệnh lý thấp hơn lô sinh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Lô chuột điều trị bằng cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg của Ích mẫu đều có tác dụng phục hồi đáng kể sự sụt giảm nồng độ progesterone huyết thanh ở chuột chảy máu âm đạo đạt ý nghĩa thống kê lần lượt với p < 0,001 và p < 0,01 Lô chuột được điều trị bằng IME 0,8 g/kg có nồng độ progesterone cao hơn đáng kể (p <
0,001) so với lô chuột được điều trị bằng IMW 1,6 g/kg Thuốc đối chứng dương Utrogestan (liều 0,05 g/kg) cũng có tác dụng phục hồi đáng kể sự giảm progesterone gây bởi chảy máu âm đạo chuột nhắt trắng (p < 0,001).
Kết quả đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu lên trọng lượng tử cung- buồng trứng của chuột chảy máu âm đạo
Khi nồng độ progesterone trong huyết thanh giảm đáng kể thì kích thước tử cung tăng lên và to ra rất nhiều [59] Do đó, trọng lượng tử cung - buồng trứng là tiêu chí để đánh giá tác dụng làm tăng nồng độ progesterone của các cao chiết Ích mẫu trong tác dụng điều trị chảy máu âm đạo Vào ngày 12, tiến hành mổ chuột lấy và cân trọng lượng tử cung - buồng trứng nhóm nghiên cứu thu được kết quả như sau:
Hình 3.3 Tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu đến trọng lượng tử cung - buồng trứng ngày 12 trên chuột chảy máu âm đạo (n=6 cá thể/1 lô; ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với lô chứng bệnh lý) Kết quả hình 3.3 cho thấy ở ngày 12 sau khi gây mang thai giả, lô bệnh lý có khối lượng tử cung - buồng trứng tăng rõ lên so với lô sinh lý (p < 0,001) Ở lô chuột chảy máu âm đạo được điều trị cao chiết Ích mẫu ethanol (0,8 g/kg) và nước (1,6 g/kg) cũng như Utrogestan đều có khối lượng tử cung - buồng trứng giảm đáng kể so với lô bệnh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p lần lượt p < 0,001; p < 0,01 và p < 0,01.
Kết quả đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu lên mô học tử cung trên mô hình chuột chảy máu âm đạo
Trong chu kì kinh nguyệt, nồng độ progesterone giảm xuống thì lớp niêm mạc tử cung bong ra [4] Niêm mạc tử cung mỏng là kết quả do bị bong tróc khi chảy máu kéo dài [53] Do đó, để đánh giá tác dụng cải thiện chảy máu âm đạo nhóm nghiên cứu tiến hành đánh gía mô học tử cung ở ngày 12 và thu được kết quả như sau:
Hình 3.4 Tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu trên mô học tử cung chuột chảy máu âm đạo
(Tử cung chuột ngày 12 được phân tích mô học đánh giá hình thái tử cung với độ khuếch đại X 200 lần (A) và đo độ dày tử cung (B); n=6 cá thể/1 lô; ** p < 0,01, *** p < 0,001 so sánh với lô chứng bệnh lý; Mũi tên đen biểu thị độ dày tử cung)
Quan sát hình thái mô học tử cung hình 3.4A cho thấy ở ngày 12, ở lô bệnh lý số lượng tuyến giảm, bong tróc niêm mạc tử cung, xuất hiện sung huyết, xuất huyết Tuy nhiên, lô chuột chảy máu âm đạo sử dụng cao chiết nước Ích mẫu liều 1,6 g/kg số lượng tuyến tăng, có sung huyết nhẹ, không xuất huyết Ở lô chuột chảy máu âm đạo được sử dụng cao chiết ethanol Ích mẫu liều 0,8 g/kg có số lượng tuyến tăng, không còn hiện tượng sung huyết, xuất huyết, niêm mạc khá dày Ở lô chứng dương, số lượng tuyến vừa phải, niêm mạc khá dày, không thấy hiện tượng xuất huyết
Kết quả hình 3.4B cho thấy, bề dày niêm mạc tử cung ở lô bệnh lý thấp hơn lô sinh lý, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01); chuột chảy máu âm đạo được điều trị cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg có bề dày niêm mạc tử cung tăng lên so với lô bệnh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê lần lượt là p < 0,01 và p < 0,001 nhưng vẫn thấp hơn đáng kể so với chuột được điều trị bằng Utrogestan (p < 0,001) Ở lô sử dụng chứng dương, bề dày niêm mạc tử cung tăng nhiều so với lô bệnh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).
BÀN LUẬN
Về việc lựa chọn mô hình gây kinh nguyệt như ở người trên chuột nhắt trắng để nghiên cứu tác dụng Ích mẫu theo hướng progesterone trong chảy máu âm đạo trên mô hình chuột thực nghiệm
để nghiên cứu tác dụng Ích mẫu theo hướng progesterone trong chảy máu âm đạo trên mô hình chuột thực nghiệm
Từ cuối thế kỷ 18, mô hình chuột đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh bởi nhiều ưu điểm trong nghiên cứu [24]:
Về mặt sinh lý, chuột nhắt là sinh vật được hiểu rõ về quá trình sinh sản, chu trình phát triển từ phôi đến trưởng thành Hơn nữa, lứa đẻ nhiều và thời gian thế hệ ngắn, đó là lợi thế để thiết kế thí nghiệm trên các giai đoạn và các bộ phận khác nhau [60]
Về mặt di truyền chúng bảo tồn gần 99% gen của con người Gần 59% nghiên cứu thực nghiệm sử dụng mô hình chuột thí nghiệm để nghiên cứu những tác động đối với sức khỏe con người Mặc dù một số loài động vật có vú lớn hơn có thể mô phỏng tốt hơn các đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình của con người nhưng chúng tốn kém, khó nuôi dưỡng và thực hành [24]
Loài gặm nhấm có kinh nguyệt là chuột gai (Acomys cahirinus), từ đó cung cấp mô hình phi linh trưởng để tiếp cận nghiên cứu sâu hơn về cơ chế bong lớp nội mạc tử cung và rối loạn kinh nguyệt ở người [12] Chuột gai Cairo (chuột gai Ai Cập) có nguồn gốc từ châu Phi và Trung Đông và có một số đặc điểm chung với các loài động vật có vú có kinh nguyệt khác như quá trình rụng trứng tự phát và môi trường nội tiết trong tử cung tương tự như con người [20] Kinh nguyệt còn quan sát ở ở loài dơi Black mastiff (Molossus rufus) và loài dơi ăn quả hoang dã (Rousettus leschenaulti) [57], [72] CJ van der Horst đã viết tới 35 bài báo về sinh sản ở loài chuột chù voi đá phương Đông (Elephantulus myurus jamesoni) do chúng cũng có chu kỳ kinh nguyệt [19] Số lượng động vật có kinh nguyệt hạn chế, bao gồm các loài linh trưởng bậc cao, chuột chù voi và dơi cho nghiên cứu khoa học vẫn là một thách thức [12], [58], [57] Tuy nhiên, việc nuôi dưỡng các loài linh trưởng không phải con người rất tốn kém và những cân nhắc về mặt đạo đức sẽ hạn chế việc sử dụng chúng [21] Do đó, loài dơi, chuột gai Cairo, chuột phù voi không phù hợp với môi trường thí nghiệm Động vật linh trưởng, là loài có quan hệ họ hàng gần nhất với con người, nên chúng là lựa chọn đúng nhất làm mô hình động vật để nghiên cứu chu kì kinh nguyệt và quá trình sinh sản Tuy nhiên, việc sử dụng các mô hình động vật không phải linh trưởng trong nghiên cứu thường được ưu tiên hơn do các cân nhắc về đạo đức, cần số lượng lớn với thuận lợi hơn về không gian, tiền bạc và việc xử lý Chính vì vậy, việc sử dụng mô hình động vật có thể minh họa quá trình sinh sản của con người đồng thời phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm là điều cần thiết, để hiểu rõ hơn về các quá trình sinh lý xảy ra trong chu kì kinh nguyệt, mang lại ánh sáng mới về các cơ chế điều trị các bệnh lý liên quan đến hệ thống sinh sản nữ giới Ở người có chu kỳ kinh nguyệt, thì ở chuột có chu kỳ động dục Cả hai chu kỳ sinh sản đều liên quan đến sự tăng sinh của các tế bào biểu mô và sự rụng trứng, sau đó là sự hình thành thể vàng sản xuất progesterone trong buồng trứng Tuy nhiên, trong chu kỳ kinh nguyệt, các tế bào biểu mô nội mạc tử cung biệt hóa thành các tế bào màng rụng để đáp ứng với mức progesterone tăng nhanh mặc dù không có phôi nang Ngược lại, trong chu kỳ động dục phản ứng màng rụng chỉ xảy ra sau khi thụ thai, ví dụ: ở chuột, nó bắt đầu vào ngày thứ 4 sau khi thụ thai, khi các tế bào biểu mô nội mạc tử cung bao quanh phôi nang Màng rụng cung cấp một mạng lưới mạch máu để trao đổi dinh dưỡng và khí cho phôi đang phát triển nếu quá trình làm tổ xảy ra trước khi nhau thai được hình thành [59], [41] Trong cả chu kỳ kinh nguyệt và chu kỳ động dục, sự vắng mặt của sự làm tổ sẽ gây ra sự thoái hóa của hoàng thể trong buồng trứng và sau đó mức progesterone giảm xuống [59] Việc tiêm dầu vào khoang tử cung của chuột đã kích thích quá trình tạo lớp màng rụng Cuối cùng, sau khi progesterone sụt giảm tự nhiên, các mạch máu bắt đầu co thắt; lớp màng rụng thoái hóa; nội mạc tử cung bị hoại tử do thiếu máu cục bộ; máu và các mảnh vụn nội mạc tử cung chảy ra khỏi âm đạo của chuột, tạo thành máu kinh [46]
Vì những ưu điểm trên, nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình kinh nguyệt như ở người ở chuột nhắt trắng bằng mô hình mang thai giả và tiêm dầu vào ngày thứ 4 của thai kì để đánh giá tác dụng làm tăng nồng độ progesterone của Ích mẫu từ đó làm giảm lượng máu kinh nguyệt để ứng dụng trong điều trị rong kinh.
Về việc lựa chọn cao chiết dược liệu nghiên cứu
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Ích mẫu rất cần thiết trong việc điều trị các rối loạn kinh nguyệt chẳng hạn như rong kinh, chảy máu tử cung và xuất huyết sau sinh [51] Leonurus japonicus là một loại thuốc cổ truyền Trung Quốc được sử dụng rộng rãi để điều trị MDs [64] Kể từ thời nhà Đường (618 SCN – 907 SCN), người ta đã hiểu rõ hơn về hiệu quả của L japonicus và bắt đầu sử dụng loại thuốc thảo dược này để thúc đẩy tuần hoàn máu và điều hòa kinh nguyệt Hơn nữa, các bác sĩ và nhà thảo dược cổ xưa đã nhiều lần nhấn mạnh rằng L japonicus không chỉ là một loại thuốc tuyệt vời để điều trị các bệnh sản khoa mà còn là một loại thuốc quan trọng để điều trị các bệnh phụ khoa Các bệnh liên quan chủ yếu bao gồm chảy máu tử cung, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh, vô kinh và các bệnh kinh nguyệt khác Vì vậy, các nhà khoa học y học ở Trung Quốc cổ đại đã đặt tên cho loại thuốc thảo dược này là
Yi Mu Cao, nghĩa đen là “Thảo dược có lợi cho phụ nữ” Leonurus japonicus được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các loại thảo dược khác trong liệu pháp điều trị các bệnh khác nhau [51]
Các thí nghiệm in-vivo cho thấy rằng điều trị bằng Leonurine hydrochloride, một hợp chất chiết xuất từ Ích mẫu, đã làm giảm thể tích và thời gian chảy máu ở chuột bị sẩy thai (Li và cộng sự, 2011) [44] Theo Liu (2009), Wang và cộng sự (2009), Chu và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng việc sử dụng oxytocin kết hợp với chiết xuất thảo dược L japonicus tốt hơn so với chỉ sử dụng oxytocin hoặc L japonicus trong việc giảm lượng máu xuất huyết ở phụ nữ sinh con qua đường âm đạo hoặc sinh mổ, giảm đau và chống viêm [23] Theo Jin và cộng sự (2004), ngoài tác dụng co tử cung, chiết xuất thảo dược Leonurus japonicus còn được cho là có tác dụng tăng mức progesterone đồng thời làm giảm nồng độ PGE2 [38] Progesterone đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát chảy máu tử cung bất thường Vai trò của nó rất đa dạng bao gồm việc giảm hoặc ngừng chảy máu kinh nguyệt quá nhiều cũng như bảo vệ nội mạc tử cung [36]
Và đặc biệt là, dựa trên đề tài “Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nữ của các cao chiết từ cây Ích mẫu” của nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự Năm
2012, cao chiết nước và ethanol 70% từ Ích mẫu được đánh giá có tác dụng kiểu estrogen trên chuột bị cắt bỏ buồng trứng (chuột bị gây giảm chức năng sinh dục) nhưng chưa có nghiên cứu tác dụng kiểu progesterone của Ích mẫu Những con chuột bị cắt bỏ buồng trứng được cho uống cao chiết ethanol hoặc chiết nước trong 15 ngày đã dành nhiều thời gian hơn trong giai đoạn động dục và cho thấy sự phát triển trọng lượng tử cung Hàm lượng 17β-estradiol trong huyết tương ở chuột bị cắt bỏ buồng trứng sau khi sử dụng cao chiết cao hơn so với nhóm đối chứng không được điều trị Đặc biệt, những con chuột bị cắt bỏ buồng trứng được dùng dịch chiết nước (1,5g/kg), chiết xuất ethanol 45% (1,5g/kg) hoặc chiết xuất ethanol 70% (1,33g/kg), cũng như Progynova ( estradiol valerate) có hàm lượng 17β-estradiol trong huyết tương cao hơn đáng kể so với chuột non đối chứng Nói chung, tác dụng estrogen của chiết xuất Ích mẫu tương đương với Genistein, một loại phytoestrogen điển hình
Nhận thấy những tiềm năng này, chúng tôi lựa chọn cao chiết nước và ethanol 70% từ Ích mẫu (Leonurus japonicus Houtt.) để đánh giá tác dụng theo hướng progesterone trên mô hình chuột chảy máu âm đạo
Về việc lựa chọn liều sử dụng của cao chiết ethanol và nước, alcaloid là hoạt chất chính của Ích mẫu có tác dụng cầm máu, giảm xuất huyết tử cung và điều hòa kinh nguyệt Hàm lượng alcaloid khi chiết với ethanol cao gấp đôi so với chiết với nước, mặt khác mục đích việc chọn liều là tìm liều thấp nhất có tác dụng nên lựa chọn
2 mức liều để đánh giá tác dụng đối với cao chiết ethanol là 0,6 g/kg và 0,8 g/kg; đối với cao chiết nước là 0,8 g/kg và 1,6 g/kg.
Về các kết quả nghiên cứu
Theo mô hình của Marion Rudolph, 2012 thì ngày 9 chuột chảy máu nhiều, progesterone giảm thấp nhất và tự phục hồi vào ngày 12 [59] Tuy nhiên, qua khảo sát ở lô bệnh lý về số lượng tế bào sừng ở vết phết âm đạo từ ngày 6 đến ngày 15, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở ngày 12 số lượng tế bào sừng tăng nhiều nhất, chuột xuất huyết máu ra bên ngoài âm đạo, ngày 15 xảy ra quá trình tự hồi phục Điều này có thể được giải thích do sự khác nhau về chủng chuột của các nghiên cứu Do vậy, nhóm nghiên cứu đánh giá các chỉ số ở ngày 12
4.3.1 Đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu đến mức độ bong của niêm mạc tử cung thông qua số lượng tế bào sừng của chuột chảy máu âm đạo
Kết quả thực nghiệm cho thấy chuột ở lô bệnh lý có số lượng tế bào sừng cao hơn so với lô sinh lý, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Xu và cộng sự [69]
Lô chuột điều trị bằng cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg từ Ích mẫu làm giảm số lượng tế bào sừng so với lô bệnh lý (sự khác biệt có ý nghĩa thống kê) Tuy nhiên, lô chuột được điều trị bằng cao chiết nước liều 0,8 g/kg, cao chiết ethanol liều 0,6 g/kg từ dược liệu Ích mẫu chưa có tác dụng làm giảm rõ số lượng tế bào sừng, có thể giải thích rằng tác dụng cải thiện chảy máu âm đạo phụ thuộc vào liều sử dụng của Ích mẫu
Theo nghiên cứu của Brasted và cộng sự (2003), Xu và cộng sự (2007), người ta quan sát được các tế bào biểu mô phân hủy và bong tróc khỏi nội mạc tử cung khi nồng độ progesterone giảm xuống [17], [69] Thể vàng bị thoái hóa, nồng độ progesterone giảm xuống đột ngột, ở giai đoạn này, sự khởi phát được đặc trưng bởi việc xuất hiện thoái hóa/ hoại tử các tế bào biểu mô và sau đó là hình thành cụm tế bào sừng hóa mất nhân cùng với với giảm chiều dày của biểu mô [10]
Kết quả nghiên cứu này đã củng cố thêm cho tác dụng giảm số lượng tế bào sừng do làm tăng nồng độ progesterone của cao chiết nước và ethanol từ Ích mẫu
4.3.2 Đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu lên nồng độ progesterone trong huyết thanh của chuột chảy máu âm đạo
Kết quả chỉ ra rằng lô bệnh lý có nồng độ progesterone thấp hơn lô sinh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô bệnh lý và lô sinh lý cho thấy đây là mô hình phù hợp để đánh giá tác dụng của cao chiết Ích mẫu Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó của Rudolph và cộng sự (2012) [59] Mặt khác, nồng độ progesterone tăng lên so với lô bệnh lý với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi chuột uống cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg Điều này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Jin và cộng sự (2004) [38]
Trong hai mô hình thí nghiệm được công bố (Finn và Pope, 1984; Brasted và cộng sự, 2003), việc ngừng cung cấp progesterone kéo theo sự phá vỡ mô và chảy máu tử cung [28], [17] Trong một mô hình khác của Cousins và cộng sự (2014), sự phá vỡ nội mạc tử cung xảy ra trong vòng 4 giờ sau khi ngừng sử dụng progesterone, phù hợp với nồng độ progesterone trong huyết thanh giảm 70% và bằng chứng có máu trong vết phết âm đạo [22] Sự gia tăng nồng độ progesterone nội sinh được quan sát ở chuột của thời kỳ mang thai giả so với giai đoạn tiền động dục Sự sụt giảm nồng độ progesterone nội sinh gây chảy máu rõ ràng, có thể nhìn thấy ngoài âm đạo [59] Kiểm tra phết tế bào âm đạo được thực hiện cho thấy xuất huyết nội mạc tử cung xuất hiện ở hầu hết động vật [69]
Do đó, định lượng nồng độ progesterone trong huyết thanh là tiêu chí quan trọng để đánh giá hiệu quả điều trị của cao chiết từ Ích mẫu
Progesterone được sử dụng để điều hòa chảy máu giữa kỳ kinh và giảm chảy máu kinh nguyệt nặng (HMB) ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản hoặc tiền mãn kinh Việc giảm lượng máu mất đi do rong kinh giảm đáng kể khi dùng progesterone [13] Việc sử dụng progesterone và các chất tương tự trong điều trị AUB và rối loạn kinh nguyệt đã được chứng minh rõ ràng Phụ nữ có chu kỳ không rụng trứng được kích thích nội mạc tử cung bằng estrogen mà không cần progesterone để điều hòa và tổ chức nội mạc tử cung Điều này dẫn đến tình trạng chảy máu không đều, nặng hoặc dài hơn 7 ngày dự kiến của chu kỳ kinh nguyệt bình thường [36]
Như vậy, kết quả nghiên cứu này đã bổ sung thêm cho tác dụng làm cải thiện tình trạng chảy máu quá nhiều khi tăng nồng độ progesterone của cao chiết Ích mẫu
4.3.3 Đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu lên trọng lượng tử cung - buồng trứng của chuột chảy máu âm đạo
Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng ở lô bệnh lý, trọng lượng tử cung - buồng trứng tăng lên so với lô sinh lý, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Rudolph và cộng sự (2012) [59]
Nghiên cứu của Xu và cộng sự (2007), Rudolph và cộng sự (2012), sau khi tiêm dầu vào tử cung và nồng độ progesterone giảm xuống, tử cung sau khi tiêm to ra rất nhiều so với lúc chưa tiêm, sau đó giảm dần Sau tiêm tử cung bị kích thích có màu đỏ sẫm ở nhiều mức độ khác nhau Màu sắc của tử cung thay đổi từ hồng sang đỏ sẫm và trở lại màu hồng [69], [59]
Từ những kết quả trên, chúng tôi nhận thấy khi nồng độ progesterone trong huyết thanh giảm đáng kể thì kích thước tử cung tăng lên và to ra rất nhiều
4.3.4 Đánh giá tác dụng của các cao chiết từ Ích mẫu lên mô học tử cung trên mô hình chuột chảy máu âm đạo
Bên cạnh trọng lượng tử cung - buồng trứng tăng lên thì bề dày niêm mạc tử cung mỏng đi cũng là một trong những hệ quả mà bệnh rong kinh gây ra [53] Kết quả thực nghiệm cho thấy bề dày niêm mạc tử cung tăng lên so với lô bệnh lý ở chuột chảy máu âm đạo được dùng cao chiết ethanol liều 0,8 g/kg và cao chiết nước liều 1,6 g/kg với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó của Bailey và cộng sự (2010) [11]
Progesterone được chứng minh liên quan mật thiết tới bề dày niêm mạc tử cung Trong giai đoạn hoàng thể, nội mạc tử cung sẽ tiếp tục dày lên, các tuyến và mạch máu sẽ tiếp tục phát triển dưới tác động của estrogen và progesterone do hoàng thể tiết ra Estrogen kích thích sự phát triển đồng đều của nội mạc tử cung và nhanh chóng ngừng bong ra, trong khi progesterone giúp ổn định nội mạc tử cung [53] Trong nghiên cứu của Bu và cộng sự (2019), Jin và cộng sự (2021) đưa ra xu hướng bề dày nội mạc tử cung tăng lên khi dùng progesterone [18], [39] Glass và Miller quan sát thấy rằng những bệnh nhân bị suy giảm bài tiết trong giai đoạn hoàng thể sẽ phát triển nội mạc tử cung bình thường khi sử dụng progesterone ngoại sinh [31] Bailey và cộng sự (2010) đã nghiên cứu tác dụng của progesterone lâu dài trên việc phát triển chức năng biểu mô và mạch máu tử cung ở động vật thí nghiệm cho thấy điều trị bằng progesterone kéo dài dẫn đến tăng độ dày của nội mạc tử cung [11] Trong chu kì kinh nguyệt, khi nồng độ progesterone đột ngột giảm xuống gây ra hiện tượng hành kinh, bề dày niêm mạc tử cung chỉ còn lại một lớp mỏng của mô đệm và sót lại một ít tế bào biểu mô nằm tại đáy các tuyến Niêm mạc tử cung bị thoái hóa tới 65% chiều dày [4] Kết quả ở trên cũng cho thấy cao chiết từ Ích mẫu có tác dụng làm tăng bề dày, và giảm bong tróc niêm mạc tử cung ở chuột chảy máu âm đạo
4.3.5 Kết quả việc triển khai mô hình chảy máu âm đạo trên chuột nhắt trắng ứng dụng vào điều trị rong kinh ở người
