Đánh giá tác dụng và sơ bộ cơ chế tác dụng của cao chiết ethanol từ thạch tùng đuôi ngựa (huperzia phlegmaria (l ) rothm ) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mang kiểu hình bệnh parkinson khóa luận tốt nghiệp dƣợc sĩ

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ SƠ BỘ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ THẠCH TÙNG ĐUÔI NGỰA (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG KIỂU HÌNH BỆNH PARKINSON KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN Mã sinh viên: 1801794 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ SƠ BỘ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ THẠCH TÙNG ĐUÔI NGỰA (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG KIỂU HÌNH BỆNH PARKINSON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Chử Thị Thanh Huyền ThS Đinh Thị Minh Nơi thực hiện: Viện Dƣợc liệu HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy giáo cô giáo dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm học tập trường Tiếp đến, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Đinh Thị Minh, làm việc khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu Cơ người trực tiếp hướng dẫn, tận tình truyền đạt, bảo cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp đỡ em suốt quãng thời gian em thực khóa luận Sự định hướng tâm huyết cô động lực lớn lao để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô! Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Chử Thị Thanh Huyền, khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, giúp đỡ, quan tâm sát cho em lời khuyên quý báu trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn cô! Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh Nguyễn Văn Hiệp anh chị khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu giúp đỡ, hướng dẫn kỹ thuật tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian em tham gia nghiên cứu thực nghiệm khoa Em xin cảm ơn bạn bè đồng hành em suốt năm tháng học tập trường Xin cảm ơn bạn thực khóa luận khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu ln gắn bó, động viên, giúp đỡ, sẻ chia suốt quãng đường vừa qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tất người thân gia đình em, người ln u thương, ủng hộ để em có ngày hơm Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân cịn hạn chế, nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 06 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Hải Yến MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu: Thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.) 1.1.1 Tên gọi – vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.1.5 Nghiên cứu tác dụng dược lý Thạch tùng đuôi ngựa số triệu chứng liên quan đến bệnh Parkinson 1.2 Tổng quan bệnh Parkinson 1.2.1 Sơ lược lịch sử hình thành bệnh Parkinson 1.2.2 Dịch tễ học 1.2.3 Nguyên nhân yếu tố nguy 1.2.4 Vai trị stress oxy hóa bệnh Parkinson 1.2.5 Chất dẫn truyền thần kinh dopamin protein α - synuclein 10 1.2.6 Biểu lâm sàng bệnh Parkinson 11 1.2.7 Điều trị bệnh Parkinson 12 1.2.8 Một số mơ hình nghiên cứu gây bệnh Parkinson động vật 13 1.3 Tổng quan ruồi giấm 15 1.3.1 Hệ gen ruồi giấm 15 1.3.2 Chu kỳ vòng đời 15 1.3.3 Ứng dụng mơ hình ruồi giấm nghiên cứu 16 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu 20 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Quy trình chuẩn bị ruồi phục vụ nghiên cứu 22 2.2.2 Thử nghiệm đánh giá khả vận động (bò trườn) ấu trùng ruồi giấm (Crawling assay) 24 2.2.4 Thử nghiệm đánh giá khả ghi nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm (Odor-taste Learning) 26 2.2.5 Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm (Activity assay) 28 2.2.6 Thử nghiệm đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành (Viability assay) 29 2.2.7 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa thử nghiệm ex vivo dịch đồng thể đầu ruồi giấm 29 2.2.8 Đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não ấu trùng ruồi giấm 31 2.3 Phân tích kết thống kê 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 33 3.1.1 Kết đánh giá khả vận động (bò trườn) ấu trùng ruồi giấm (Crawling assay) 33 3.1.2 Kết đánh giá khả ghi nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm (Odor-taste Learning) 34 3.1.3 Kết đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm (Activity assay) 35 3.2 Đánh giá tác dụng cải thiện khả sống sót cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 36 3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 37 3.4 Đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 38 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 41 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 41 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm mang bệnh Parkinson 41 4.1.2 Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu 41 4.1.3 Về việc lựa chọn mức liều sử dụng nghiên cứu 42 4.2 Về kết nghiên cứu 42 4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 42 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện khả sống sót cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 44 4.2.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 44 4.2.4 Đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase dsRNA Double strand RNA ARN sợi đôi IC50 Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối đa nửa MAO-B Monoamine Oxidase – B Enzym mã hóa gen MAOB MDA Malondialdehyde Malondialdehyd 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine tetrahydropyridin MS Motor Symptom Triệu chứng vận động NF- κB Nuclear factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NMDA N-Methyl-D-Aspartate N-Methyl-D-Aspartat NMS Non-Motor Symptom Triệu chứng không vận động OGD Oxygen – glucose deprivation Sự thiếu hụt oxy-glucose PBS Phosphate-buffered saline Đệm phosphat PD Parkinson’s disease Bệnh Parkinson PFA Paraformaldehyde Paraformaldehyd RNAi RNA-interference Giao thoa ARN RNS Reactive nitrogen species Các loại nitro phản ứng ROS Reactive oxygen species Các loại oxy phản ứng SNCA Synuclein Alpha Gen alpha synuclein TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric TH Tyrosine hydroxylase Tyrosin hydroxylase MPTP TTĐN UAS Thạch tùng ngựa Upstream activating sequence Trình tự hoạt hóa ngược dịng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các mơ hình PD động vật sử dụng chất hóa học can thiệp gen [1] 14 Bảng Hóa chất thuốc thử sử dụng nghiên cứu 20 Bảng Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng Thành phần 500 ml thức ăn cho ruồi giấm 23 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1 Cây Thạch tùng đuôi ngựa Huperzia phlegmaria (L.) Rothm [8] Hình Cấu trúc hóa học khung alcaloid lớp lycopodin Hình Cấu trúc hóa học khung alcaloid lớp lycodin Hình Cấu trúc hóa học khung alcaloid lớp Fawcettimin Hình Cơng thức cấu tạo Huperzin A Hình Chu kỳ vòng đời ruồi giấm 16 Hình Sơ đồ cụm tế bào thần kinh sản sinh dopamin não ruồi giấm [29] 17 Hình Sử dụng hệ thống GAL4/UAS tạo mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 19 Hình Thiết kế nghiên cứu 22 Hình 2 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả vận động ấu trùng ruồi giấm 25 Hình Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả ghi nhớ mùi ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm bậc 27 Hình Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 28 Hình Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả sống sót ruồi giấm giai đoạn trưởng thành 29 Hình Phản ứng MDA TBA 30 Hình Kết đánh giá khả vận động ấu trùng ruồi giấm bậc 33 Hình Kết đánh giá khả ghi nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm 35 Hình 3 Kết phân tích tổng số lần vận động ngày ruồi giấm 36 Hình Biểu đồ đánh giá tuổi thọ ruồi giấm trưởng thành 37 Hình Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ TTĐN mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 38 Hình Kết đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin cao chiết TTĐN ấu trùng ruồi giấm bậc chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 39 Hình Hình ảnh chụp tế bào thần kinh sản sinh dopamin não ruồi sau nhuộm lô thí nghiệm 39 SNCA Nồng độ MDA (nmol/ml) 2.5 * ** * TTÐN2 TTÐN4 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ELAV-GFP ELAV-SNCA (mg/ml) Hình Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ TTĐN mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson (Thí nghiệm tiến hành lặp lại lần, 40 đầu ruồi/ lô/ 1lần thử nghiệm test Mann Whitney U, với * p < 0,05; ** p < 0,01) Chú thích: - ELAV-GFP: lơ sinh lý - ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson - TTĐN2, TTĐN4: lô dùng mẫu thử tác dụng: ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson điều trị cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml Kết Hình 3.5 cho thấy nồng độ MDA định lượng đầu ruồi giấm lô bệnh lý cao so với lô sinh lý; nồng độ MDA định lượng đầu ruồi giấm lô bệnh lý cao so với lô ruồi bị bệnh sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml 3.4 Đánh giá tác dụng cải thiện số lƣợng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson Đặc điểm bệnh lý thần kinh chủ yếu PD thối hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamin vùng chất đen dẫn đến giảm lượng chất dẫn truyền thần kinh dopamin não, gây nên triệu chứng đặc trưng thần kinh vận động Thí nghiệm tiến hành nhằm xác định số lượng tế bào sản sinh dopamin não ấu trùng ruồi giấm phương pháp nhuộm huỳnh quang so sánh lô sinh 38 lý (ELAV-GFP), bệnh lý (ELAV-SNCA), bệnh lý có dùng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml Kết thể Hình 3.6 Hình 3.7 SNCA 40 Số lƣợng tế bào *** *** *** TTÐN2 TTÐN4 30 20 10 ELAV-GFP ELAV-SNCA (mg/ml) Hình Kết đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin cao chiết TTĐN ấu trùng ruồi giấm bậc chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson (n=8-14, One-Way ANOVA test với *** p < 0,001 so sánh với lô bệnh lý (ELAVSNCA)) Hình Hình ảnh chụp tế bào thần kinh sản sinh dopamin não ruồi sau nhuộm lơ thí nghiệm 39 Chú thích: - ELAV-GFP: lơ sinh lý - ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson - TTĐN2, TTĐN4: lô dùng mẫu thử tác dụng: ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson điều trị cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa nồng độ tương ứng mg/ml mg/ml Kết Hình 3.6 Hình 3.7 cho thấy, số lượng tế bào sản sinh dopamin lô bệnh lý giảm so với lô sinh lý Lô ấu trùng ruồi giấm chuyển gen SNCA sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml có số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin tăng so với lô bệnh lý 40 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về mơ hình nghiên cứu 4.1.1 Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm mang bệnh Parkinson Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) sử dụng làm sinh vật thí nghiệm nghiên cứu di truyền học từ đầu năm 1900 Với ưu điểm phù hợp cho nghiên cứu, ruồi giấm sử dụng để gây mơ hình bệnh nhằm mục đích tìm thuốc [72] Về mặt đạo đức nghiên cứu, ruồi giấm động vật bậc thấp nên hạn chế vấn đề đạo đức việc sử dụng động vật làm mơ hình thí nghiệm nghiên cứu y sinh học thử nghiệm động vật bậc cao chuột, chó, thỏ, khỉ… Về mặt kinh tế, ruồi giấm có kích thước nhỏ nên khơng địi hỏi diện tích mơi trường sống lớn hay lượng thức ăn nhiều Ngoài ra, ruồi giấm đẻ hàng trăm trứng suốt đời nó, phơi tạo thành vịng 24 sau trứng thụ tinh khoảng 8-10 ngày để phát triển thành ruồi trưởng thành nên tạo quần thể ruồi giấm lớn khoảng thời gian ngắn, giúp tiết kiệm chi phí Về mặt di truyền, ruồi giấm có kích thước nhỏ, có cặp NST, dễ dàng thực thao tác, phân tích, sàng lọc di truyền Bộ gen ruồi giấm giải mã hoàn chỉnh vào năm 2000 với khoảng 17000 gen có khoảng 75% gen gây bệnh người tìm thấy có ruồi giấm Drosophila melanogaster sử dụng nhiều chất dẫn truyền thần kinh giống động vật có vú bao gồm GABA, glutamat, acetylcholin số monoamin tương tự bao gồm dopamin, serotonin histamin [25].Vì vậy, ruồi giấm xem mơ hình động vật thí nghiệm lý tưởng để nghiên cứu bệnh người Với ưu điểm thuận tiện sử dụng thí nghiệm, chúng tơi định lựa chọn mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson để đánh giá tác dụng cao chiết ethanol từ TTĐN bệnh Parkinson 4.1.2 Về việc lựa chọn dược liệu nghiên cứu Thạch tùng ngựa có tên khoa học đầy đủ Huperzia phlegmaria (L.) Rothm., thuộc chi Huperzia Bernh Ở số nước giới, loài Huperzia phlegmaria số loài thuộc họ Lycopodiaceae biết đến thảo dược tiềm để điều trị bệnh não Alzheimer, tâm thần phân liệt, Parkinson Nhiều hoạt chất phân lập từ loài thể hoạt tính kháng 41 acetylcholinesterase hỗ trợ thần kinh như: huperphlegmines A, huperphlegmines B [58], huperzin A… Trong đó, huperzin A có tác dụng bảo vệ thần kinh giảm thối hóa tế bào thần kinh [32] Với tiềm này, chọn TTĐN để đánh giá tác dụng cao chiết ethanol từ TTĐN mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang kiểu hình bệnh Parkinson 4.1.3 Về việc lựa chọn mức liều sử dụng nghiên cứu Dựa vào kết sàng lọc số lượng lớn mẫu ruồi giấm thuộc dự án First, Ngân hàng giới tài trợ (2017-2019), PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, Viện Dược liệu làm chủ nhiệm việc tiến hành sàng lọc dải nồng độ 1, 2, 4, 6, 10 mg/ml, dựa vào tỷ lệ sống sót ruồi trưởng thành cải thiện hành vi với mức liều Chúng nhận thấy nồng độ mg/ml mg/ml phù hợp để sử dụng nghiên cứu 4.2 Về kết nghiên cứu 4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson 4.2.1.1 Kết đánh giá khả vận động (bò trườn) ấu trùng ruồi giấm Kết thực nghiệm cho thấy ấu trùng ruồi giấm lơ bệnh lý (ELAV-SNCA) có khả vận động giảm so với lô sinh lý (ELAV-GFP), biểu qua việc giảm tốc độ di chuyển (p < 0,001) Không suy giảm khả vận động, ấu trùng ruồi giấm lơ bệnh lý cịn di chuyển theo quỹ đạo không xác định Trong đó, ấu trùng ruồi giấm lơ sinh lý bò hướng xác định, quỹ đạo di chuyển theo xu hướng đường thẳng Kết thực nghiệm phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Trọng Tuệ cộng năm 2021 [17] Nghiên cứu việc biểu protein alpha-synuclein não làm suy giảm rối loạn vận động ấu trùng ruồi giấm Hơn nghiên cứu Ryabova cộng (2014) [73] chứng minh ruồi giấm chuyển gen SNCA biểu protein alpha-synuclein gây rối loạn chức khớp thần kinh (synap) thông qua phân tích cấu trúc thần kinh NMJ nhóm số ấu trùng ruồi giấm bậc giảm số lượng diện tích nút thần kinh Tốc độ di chuyển lô bệnh lý thấp so với lô sinh lý với khác biệt có ý nghĩa thống kê (giá trị p < 0,001) cho thấy mơ hình phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết TTĐN Sử dụng cao chiết TTĐN làm cải thiện tốc độ di chuyển ấu trùng ruồi giấm, cụ thể việc dùng cao chiết Thạch tùng đuôi ngựa mg/ml mg/ml nhóm ruồi bệnh lý làm tăng tốc độ di chuyển trung bình, với khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (với giá trị p < 0,01) 42 Trong bệnh Parkinson, tế bào thần kinh trung gian dopamin bị thối hóa, dẫn đến suy giảm dopamin não Dopamin có liên quan đến việc điều chỉnh chuyển động, tâm trạng, động lực, người mắc bệnh Parkinson có suy giảm đặc trưng chức [35] Sử dụng cao chiết Thạch tùng đuôi ngựa nồng độ mg/ml cải thiện khả vận động ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson Do đó, cao chiết TTĐN tác động lên việc giảm thối hóa tế bào thần kinh dopamin, nhiên cần nghiên cứu sâu để khẳng định xác 4.2.1.2 Kết đánh giá khả ghi nhớ (mùi) ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm Kết thực nghiệm cho thấy, khả ghi nhớ (mùi) ngắn hạn lô bệnh lý (ELAV-SNCA) so với lô sinh lý (ELAV-GFP) Kết tương đồng với nghiên cứu tác giả Zhao cộng năm 2015 [90] Chỉ số học tập LI lô sinh lý cao lơ bệnh lý với khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) cho thấy mơ hình hoàn toàn phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết TTĐN việc cải thiện hành vi học tập – ghi nhớ ấu trùng ruồi giấm Sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml cho thấy tác dụng cải thiện khả ghi nhớ ấu trùng ruồi giấm Chỉ số học tập LI nhóm ruồi chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml tăng lên so với nhóm ruồi bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,05 Tuy nhiên nhóm ruồi chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml có số học tập cao so với lô bệnh lý khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với giá trị p > 0,05 Điều giải thích khả ghi nhớ ruồi giấm chuyển gen SNCA phụ thuộc vào liều TTĐN Theo nghiên cứu tác giả Yy cộng năm 2011 [88] việc biểu mức α-synuclein ruồi giấm gây tế bào thần kinh dopamin ảnh hưởng đến hiệu suất học tập trí nhớ ruồi giấm TTĐN nồng độ mg/ml cải thiện khả ghi nhớ ấu trùng ruồi giấm Kết tiếp tục bổ sung thêm giả thiết cao chiết TTĐN tác động lên việc giảm thối hóa tế bào thần kinh dopamin 4.2.1.3 Kết đánh giá nhịp sinh học ruồi giấm Rối loạn giấc ngủ triệu chứng không vận động người mắc bệnh Parkinson Kết thực nghiệm cho thấy số lần di chuyển qua chùm tia hồng ngoại ruồi lô bệnh lý (ELAV-SNCA) thấp so với lô ruồi sinh lý (ELAVGFP) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Balija cộng năm 2011 [30], nghiên cứu sử dụng mơ hình PD ruồi giấm thơng qua đột biến αsynuclein cho thấy biểu mục tiêu đột biến α-synuclein không tái triệu chứng vận động giống PD mà triệu chứng không vận động 43 giấc ngủ bất thường Số lần di chuyển qua chùm tia hồng ngoại lô sinh lý cao lô bệnh lý với khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) cho thấy mơ hình hồn tồn phù hợp để đánh giá tác dụng cao chiết TTĐN việc cải thiện số lần vận động ngày ruồi giấm Sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml có xu hướng làm tăng số lần vận động ruồi ngày so với lô bệnh lý, nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với giá trị p > 0,05 Chứng tỏ, cao chiết TTĐN chưa tác động lên việc cải thiện số lần vận động ngày ruồi giấm chuyển gen SNCA 4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện khả sống sót cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson Kết thực nghiệm cho thấy thời gian sống sót trung bình ruồi giấm nhóm bệnh lý (ELAV-SNCA) thấp so với nhóm sinh lý (ELAV-GFP) Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Trọng Tuệ cộng năm 2021 [17], cho thấy việc biểu protein alpha-synuclein não làm suy giảm tuổi thọ trung bình ruồi giấm Tuổi thọ trung bình lơ sinh lý cao lơ bệnh lý với khác biệt có ý nghĩa thống kê (giá trị p < 0,001) cho thấy mơ hình phù hợp để đánh giá tác dụng cải thiện khả sống sót cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa Sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml không làm thay đổi tuổi thọ trung bình ruồi Qua cho thấy, cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml chưa tác động lên việc cải thiện khả sống sót ruồi giấm chuyển gen SNCA 4.2.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson Kết thực nghiệm cho thấy hàm lượng MDA dịch đồng thể đầu ruồi nhóm bệnh lý (ELAV-SNCA) cao so với nhóm sinh lý (ELAV-GFP), khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,05 Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Siddique cộng năm 2019 [77] Kết cho thấy có gia tăng q trình peroxy hóa lipid não ruồi giấm chuyển gen SNCA để tạo mơ hình ruồi mang bệnh Parkinson Nồng độ MDA định lượng đầu ruồi giấm lô ruồi mang bệnh dùng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml thấp so với lô bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p p < 0,01 p < 0,05 Từ cho thấy cao chiết 44 ethanol từ TTĐN hai nồng độ mg/ml có tác dụng cải thiện tình trạng stress oxy hóa thơng qua ức chế q trình peroxy hóa lipid Trong thể ln có cân việc sản sinh chất oxy hóa loại bỏ chúng chất chống oxy hóa Khi cân đi, gốc tự sản sinh vượt khả chống oxy hóa thể, dẫn đến tình trạng stress oxy hóa Hậu phân tử ADN, protein, lipid bị cơng gốc tự Peroxy hóa lipid q trình phân tử lipid bị oxy hóa gốc tự do, có liên quan đến q trình lão hóa bệnh Parkinson, tạo sản phẩm MDA gây độc cho tế bào [56] Cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml cho thấy khả ức chế q trình peroxy hóa lipid thể việc làm giảm nồng độ MDA lô ruồi chuyển gen SNCA 4.2.4 Đánh giá tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson Sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml mg/ml có tác dụng cải thiện khả vận động, khả ghi nhớ mùi, khả ức chế q trình peroxy hóa lipid ấu trùng ruồi giấm Hơn nữa, thối hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamin gây nên triệu chứng đặc trưng thần kinh vận động nên tiếp tục tiến hành đánh giá tác dụng cải thiện tế bào sản sinh dopamin não ruồi giấm Kết thực nghiệm cho thấy số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin lô bệnh lý (ELAVSNCA) giảm so với lô sinh lý (ELAV-GFP), khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,001 Ruồi giấm chuyển gen SNCA sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ mg/ml có số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin tăng so với lơ bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p < 0,001 Do đó, cao chiết TTĐN có khả làm giảm thối hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamin giai đoạn ấu trùng Dopamin chất dẫn truyền thần kinh có liềm đen, nồng độ thấp làm giảm dẫn truyền xung thần kinh não khơng thể truyền tín hiệu theo cách thích hợp Do đó, có kết nối não phận thể khác Mất dopamin dẫn đến kiểm sốt chuyển động thể có liên quan đến bệnh Parkinson [74] Việc sử dụng cao chiết ethanol từ TTĐN giúp cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson Khi số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin tăng lên đồng nghĩa với việc chất dẫn truyền thần kinh dopamin tăng lên Điều góp phần cải thiện khả vận động ấu trùng ruồi giấm, phù hợp với kết đánh giá khả vận động, khả ghi nhớ mùi, khả ức chế trình peroxy hóa lipid ấu trùng ruồi giấm cho thấy sơ chế tác dụng cao chiết TTĐN tác động lên hệ thần kinh làm tăng số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Việc sử dụng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson có tiềm cải thiện số triệu chứng có liên quan đến bệnh hiệu phụ thuộc vào nồng độ sử dụng Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi, cải thiện khả sống sót cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson - Ở hai nồng độ mg/ml mg/ml cao chiết ethanol từ TTĐN có tác dụng cải thiện khả vận động ấu trùng ruồi giấm bậc thông qua thử nghiệm bị trườn - Ngồi ra, nồng độ mg/ml cao chiết ethanol từ TTĐN có tác dụng cải thiện khả học tập ấu trùng ruồi giấm bậc thông qua thử nghiệm đánh giá khả ghi nhớ mùi Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo cao chiết ethanol từ Thạch tùng ngựa mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson - Ở hai nồng độ mg/ml mg/ml cao chiết ethanol từ TTĐN có tác dụng cải thiện tình trạng stress oxy hóa thơng qua ức chế q trình peroxy hóa lipid Mục tiêu 3: Đánh giá sơ chế tác dụng cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin não cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson - Ở hai nồng độ mg/ml mg/ml cao chiết ethanol từ TTĐN làm giảm thối hóa tế bào thần kinh sản sinh dopamin giai đoạn ấu trùng thông qua tăng số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamin Đề xuất - Đánh giá thay đổi cấu trúc thần kinh (neuromuscular junction – NMJ) ấu trùng ruồi giấm bậc chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson trước sau sử dụng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa - Đánh giá biểu protein α-synuclein não ruồi giấm kỹ thuật Western blotting (gen SNCA mã hóa cho protein α-synuclein) trước sau sử dụng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa - Triển khai đánh giá tác dụng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa mô hình chuột PD thực nghiệm 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 10 11 12 13 14 15 16 17 Nguyễn Xn Bắc (2019), Tổng quan mơ hình gây bệnh Parkinson động vật, Nghiên cứu Dược & Thông tin thuốc, pp 16-22 Đồng Thị Biển (2020), Rối loạn dáng thăng bệnh Parkinson, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Bộ Y tế (2018), Dược thư Quốc Gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 889 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 808-813 Nguyễn Ngọc Chương (2020), Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase số loài họ thạch tùng, Luận án tiến sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh Lê Đức Hinh (2001), Bệnh Parkinson, Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hồi cộng (2018), Các hợp chất alcaloid terpenoid phân lập từ thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.) Nguyễn Thị Hoài cộng (2018), Nghiên cứu đặc điểm thực vật Thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.), Tạp chí Dược học, p 41 Đỗ Mạnh Hưng (2021), Bệnh Parkinson: Một số đặc điểm bệnh lý, di truyền chế sinh bệnh, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, pp 411-432 Đồn Thị Hường cộng (2018), "Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro độc tính cấp Thạch tùng ngựa Việt Nam", Tạp chí Y học Việt Nam, 468, pp 20-23 Đoàn Thị Hường cộng (2021), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng theo hướng điều trị bệnh Alzheimer lồi Thạch tùng ngựa (Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.), Luận án Tiến sĩ, Viện Dược Liệu, Hà Nội Phan Kế Lộc (2001), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội, 951-953 Trần Tín Nghĩa (2022), Xác định đột biến gen SNCA gen PARK7 bệnh nhân Parkinson, Tạp chí Y học Việt Nam, 514(1), pp 239-243 Nguyễn Thị Kiều Oanh (2022), Xác định đột biến gen GBA bệnh nhân Parkinson, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Tuệ Tĩnh (2003), Tuyển tập 3033 thuốc đông y, Y học sức khỏe, 1041 Nguyễn Trọng Tuệ, Tạ Ngọc Khánh Trần Quốc Đạt (2021), Rối loạn khả vận động mơ hình ruồi giấm biểu Protein Alpha-Synuclein gây bệnh Parkinson, Tạp chí Nghiên cứu Y học, pp 28-36 Tiếng Anh 18 Andrea, H B and Norbert, P (1993), "Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes", development, 118(2), pp 401-415 19 Armstrong, M J and Okun, M S (2020), "Diagnosis and Treatment of Parkinson Disease: A Review", JAMA, 323(6), pp 548-560 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Balestrino, R and Schapira, A H V (2020), "Parkinson disease", European journal of neurology, 27(1), pp 27-42 Bock, M A and Tanner, C M (2022), "The epidemiology of cognitive function in Parkinson's disease", Progress in Brain Research, 269(1), pp 3-37 Brown, D R (2005), "ORGINAL ARTICLE Neurodegeneration and oxidative stress: prion disease results from loss of antioxidant defence", Folia Neuropathologica, 43(4), pp 229-243 Candan, N and Tuzmen, N (2008), "Very rapid quantification of malondialdehyde (MDA) in rat brain exposed to lead, aluminium and phenolic antioxidants by high-performance liquid chromatography-fluorescence detection", Neurotoxicology, 29(4), pp 708-713 Chiu, J C., et al (2010), "Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila", JoVE (Journal of Visualized Experiments)(43), p e2157 Daewoo, L., Hailing, S., and Diane, K O (2003), "GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons", Journal of Neuroscience, 23(11), pp 4625-4634 Damar, U, et al (2016), "Huperzine A as a neuroprotective and antiepileptic drug: a review of preclinical research", Expert review of neurotherapeutics, 16(6), pp 671-680 Ellemann, L (1990), "Appendix to plants used by the Saraguros", Botanisk Institut Aarhus Universitet Aarhus, 1, pp 1-46 Frank, H (2010), "Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration", CNS & Neurological Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 9(4), pp 504-523 Friggi‐Grelin, Florence, et al (2003), "Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase", Journal of neurobiology, 54(4), pp 618-627 Gajula Balija, M B., et al (2011), "Pre-fibrillar α-synuclein mutants cause Parkinson's disease-like non-motor symptoms in Drosophila", PLoS One, 6(9), p e24701 Gao, X., et al (2009), "Huperzine A protects isolated rat brain mitochondria against β-amyloid peptide", Free Radical Biology and Medicine, 46(11), pp 1454-1462 Geoffrey, C A, Ian, S W, and J, B (1989), Dictionary of alkaloids, Chapman and Hall Gerber, B., Biernacki, R., and Thum, J (2013), "Odor–taste learning assays in Drosophila larvae", Cold Spring Harbor Protocols, 2013(3), p pdb prot071639 Hastings, T G (2009), "The role of dopamine oxidation in mitochondrial dysfunction: implications for Parkinson’s disease", Journal of bioenergetics and biomembranes, 41(6), pp 469-472 Höglinger, G U., et al (2004), "Dopamine depletion impairs precursor cell proliferation in Parkinson disease", Nature neuroscience, 7(7), pp 726-735 Hwang, O (2013), "Role of oxidative stress in Parkinson's disease", Exp Neurobiol, 22(1), pp 11-7 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 Inubushi, Y and Harayama, T (1982), "ALKALOID CONSTITUENTS OF LYCOPODIUM-PHLEGMARIA L", YAKUGAKU ZASSHI-JOURNAL OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, 102(5), pp 434-439 INUBUSHI, Y., et al (1971), "Isolation and structure of phlegmanol F", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 19(12), pp 2640-2642 Jahromi, S R., et al (2020), "SNCA E46K transgenic Drosophila Model of Parkinson’s Disease Confirmed the Causative Role of Oxidative Stress", bioRxiv, p 2020.02 28.969501 Jakes, R., Spillantini, M G., and Goedert, M (1994), "Identification of two distinct synucleins from human brain", FEBS Lett, 345(1), pp 27-32 Jayaraj, Richard L., et al (2019), "Lycopodium Attenuates Loss of Dopaminergic Neurons by Suppressing Oxidative Stress and Neuroinflammation in a Rat Model of Parkinson’s Disease", Molecules, 24(11), p 2182 Joseph, B D (2002), "GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife", genesis, 34(1‐2), pp 1-15 Joseph, J (2008), "Parkinson’s disease: clinical features and diagnosis", Journal of neurology, neurosurgery & psychiatry, 79(4), pp 368-376 Kalia, S K., Sankar, T., and Lozano, A M (2013), "Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders", Curr Opin Neurol, 26(4), pp 374-80 Kirik, Deniz, et al (2002), "Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of α-synuclein in the nigrostriatal system", Journal of Neuroscience, 22(7), pp 2780-2791 Kwon, D K., et al (2022), "Levodopa-Induced Dyskinesia in Parkinson's Disease: Pathogenesis and Emerging Treatment Strategies", Cells, 11(23) Lavedan, C., et al (1998), "Identification, localization and characterization of the human γ-synuclein gene", Human genetics, 103, pp 106-112 Lees, A J., Hardy, J., and Revesz, T (2009), "Parkinson's disease", Lancet, 373(9680), pp 2055-66 Lotharius, Julie and Brundin, Patrik (2002), "Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein", Nature Reviews Neuroscience, 3(12), pp 932-942 Ma, X and Gang, D R (2004), "The lycopodium alkaloids", Natural product reports, 21(6), pp 752-772 Ma, X., et al (2006), "A survey of potential huperzine A natural resources in China: the Huperziaceae", Journal of ethnopharmacology, 104(1-2), pp 54-67 Ma, X., et al (2007), "Huperzine A from Huperzia species—An ethnopharmacolgical review", Journal of ethnopharmacology, 113(1), pp 1534 Manjunath, M, et al (2017), "Experience of pallidal deep brain stimulation in dystonia at a tertiary care centre in India: An initial experience", Neurology India, 65(6), p 1322 Mao, Zhengmei and Davis, Ronald L (2009), "Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity", Frontiers in neural circuits, p Meiser, J., Weindl, D., and Hiller, K (2013), "Complexity of dopamine metabolism", Cell Communication and Signaling, 11(1), p 34 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 Mena, S., Ortega, A., and Estrela, J M (2009), "Oxidative stress in environmental-induced carcinogenesis", Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 674(1-2), pp 36-44 Migliore, L and Coppedè, F (2009), "Environmental-induced oxidative stress in neurodegenerative disorders and aging", Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 674(1-2), pp 73-84 Muñoz, P., et al (2012), "Dopamine Oxidation and Autophagy", Parkinson’s Disease, 2012, p 920953 Murata, H., Barnhill, L M., and Bronstein, J M (2022), "Air pollution and the risk of Parkinson's disease: A review", Movement Disorders, 37(5), pp 894904 Nair, V., et al (1986), "The chemistry of lipid peroxidation metabolites: crosslinking reactions of malondialdehyde", Lipids, 21(1), pp 6-10 Nemani, V M., et al (2010), "Increased expression of alpha-synuclein reduces neurotransmitter release by inhibiting synaptic vesicle reclustering after endocytosis", Neuron, 65(1), pp 66-79 Nguyen, Hoai Thi, et al (2018), "Huperphlegmines A and B, two novel Lycopodium alkaloids with an unprecedented skeleton from Huperzia phlegmaria, and their acetylcholinesterase inhibitory activities", Fitoterapia, 129, pp 267-271 Nichols, C D., Becnel, J., and Pandey, U B (2012), "Methods to assay Drosophila behavior", J Vis Exp(61) Nilsu, T., et al (2018), "Three Lycopodium alkaloids from Thai club mosses", Phytochemistry, 156, pp 83-88 Ohkawa, H., Ohishi, N., and Yagi, K (1979), "Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction", Analytical biochemistry, 95(2), pp 351-358 Perveen, F.K (2018), Drosophila melanogaster: Model for Recent Advances in Genetics and Therapeutics, IntechOpen Pham-Huy, L A., He, H., and Pham-Huy, C (2008), "Free radicals, antioxidants in disease and health", Int J Biomed Sci, 4(2), pp 89-96 Piper, M D and Partridge, L (2016), "Protocols to study aging in Drosophila", Drosophila: Methods and Protocols, pp 291-302 Rao, S S., Hofmann, L A., and Shakil, A (2006), "Parkinson's disease: diagnosis and treatment", American family physician, 74(12), pp 2046-2054 Rouffiac, R (1963), The alkaloids of Lycopods and more particularly Lycopodium phlegmaria L, Annales pharmaceutiques francaises, pp 685-698 Ruan, Q., et al (2013), "The anti-inflamm-aging and hepatoprotective effects of huperzine A in D-galactose-treated rats", Mechanisms of ageing and development, 134(3-4), pp 89-97 Rubin, G M (1988), "Drosophila melanogaster as an experimental organism", Science, 240(4858), pp 1453-1459 Ryabova, E., et al (2014), "Overexpression of human SNCA gene in Drosophila motor neurons causes morphological and functional abnormalities in larval neuromuscular junction", Visnyk of the Lviv University Saad, L., et al (2021), "Dopamine in Parkinson's disease", Clinica Chimica Acta, 522, pp 114-126 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 Schuepbach, W M., et al (2013), "Neurostimulation for Parkinson's disease with early motor complications", N Engl J Med, 368(7), pp 610-22 Shi, H., Li, Z Y., and Guo, Y W (2005), "A new serratane-type triterpene from Lycopodium phlegmaria", Natural Product Research, 19(8), pp 777-781 Siddique, Y H., Naz, F., and Rashid, M (2019), "Effect of Majun Baladur on life span, climbing ability, oxidative stress and dopaminergic neurons in the transgenic Drosophila model of Parkinson's disease", Heliyon, 5(4), p e01483 Tataroglu, O and Emery, P (2014), "Studying circadian rhythms in Drosophila melanogaster", Methods, 68(1), pp 140-150 Thu, Dang Kim, et al (2020), "The use of Huperzia species for the treatment of Alzheimer’s disease", Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology, 31(3) Tysnes, OB and Storstein, A (2017), "Epidemiology of Parkinson’s disease", Journal of neural transmission, 124, pp 901-905 Udai, B P and Charles, D N (2011), "Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery", Pharmacological reviews, 63(2), pp 411-436 Wang, Z F and Tang, X C (2007), "Huperzine A protects C6 rat glioma cells against oxygen–glucose deprivation-induced injury", FEBS letters, 581(4), pp 596-602 Waxman, E A and Giasson, B I (2009), "Molecular mechanisms of αsynuclein neurodegeneration", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 1792(7), pp 616-624 Wittayalai, S., et al (2012), "Lycophlegmariols A–D: Cytotoxic serratene triterpenoids from the club moss Lycopodium phlegmaria L", Phytochemistry, 76, pp 117-123 Xiao, X Q., et al (2000), "Protective effects of huperzine A on β-amyloid25– 35 induced oxidative injury in rat pheochromocytoma cells", Neuroscience letters, 286(3), pp 155-158 Xiao, X Q., Yang, J W., and Tang, X C (1999), "Huperzine A protects rat pheochromocytoma cells against hydrogen peroxide-induced injury", Neuroscience letters, 275(2), pp 73-76 Yang, Y., et al (2016), "Chemical constituents of plants from the genus Phlegmariurus", Chemistry & Biodiversity, 13(3), pp 269-274 Yy, S., et al (2011), "Rotenone induces more serious learning and memory impairment than α-synuclein A30P does in Drosophila", Journal of Shanghai University (English Edition), 15(3), pp 229-234 Zhang, Hai Yan and Tang, Xi Can (2006), "Neuroprotective effects of huperzine A: new therapeutic targets for neurodegenerative disease", Trends in pharmacological sciences, 27(12), pp 619-625 Zhao, X., et al (2015), "Role of α‑synuclein in cognitive dysfunction: Studies in Drosophila melanogaster", Molecular medicine reports, 12(2), pp 26832688 PHỤ LỤC Phụ lục Phương trình hồi quy tuyến tính chất chuẩn MDA 1.0 y = 0,0258x + 0,0215 Độ hấp thụ 0.8 R2 = 0,9994 0.6 0.4 0.2 0.0 10 15 20 25 Hàm lƣợng MDA (nmol/ml) 30 35