nguyễn phượng anh nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi và thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao rau má centella asiatica l urban trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình b

Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ ..... Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với khả năn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯỢNG ANH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI VÀ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG TẾ

BÀO BIỂU HIỆN TYROSINE HYDROXYLASE CỦA CAO RAU MÁ

(CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN) TRÊN

MÔ HÌNH RUỒI GIẤM ĐỘT BIẾN GEN

RUGOSE MANG KIỂU HÌNH BỆNH TỰ KỶ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯỢNG ANH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI VÀ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG TẾ

BÀO BIỂU HIỆN TYROSINE HYDROXYLASE CỦA CAO RAU MÁ

(CENTELLA ASIATICA (L.) URBAN) TRÊN

MÔ HÌNH RUỒI GIẤM ĐỘT BIẾN GEN

RUGOSE MANG KIỂU HÌNH BỆNH TỰ KỶ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HOÁ SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Lập

PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

HÀ NỘI 2024

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS Nguyễn Thị Lập là giáo viên hướng dẫn

đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hết lòng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Nguyễn Văn Hiệp, DS Lều Khánh Duy

cùng các anh chị nghiên cứu viên của Khoa Dược lý Sinh hoá - Viện Dược liệu, các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa sinh Dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ cũng như tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo cùng cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học và các phòng ban

khác trong trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là ThS Chu Lê Mai đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sĩ đúng thời hạn Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn bên tôi, ủng hộ tôi và là chỗ dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2024 Học viên cao học

Nguyễn Phượng Anh

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh tự kỷ 6

1.1.4 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ 9

1.3.4 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 15

Phần 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu (hoặc nguyên vật liệu) 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu 18

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu 20

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 21

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với trí nhớ ngắn hạn trên mô hình ruồi

giấm đột biến rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 22

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 24

2.2.6 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 25

2.2.7 Đánh giá sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang 27

Phần 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh của cao CA trên mô hình ruồi giấm mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi 29

3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 29

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với trí nhớ ngắn hạn trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 30

3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 32

3.1.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 34

3.2 Đánh giá sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang 35

Phần 4 BÀN LUẬN 38

4.1 Về mô hình nghiên cứu 38

4.1.1.Về việc lựa chọn mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 38

4.1.2 Về căn cứ lựa chọn mức liều của cao chiết dược liệu nghiên cứu 39

4.1.3 Vài nét về chứng dương 39

4.2 Về kết quả nghiên cứu 40

4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 40

4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 41

4.2.3 Đánh giá tác dụng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 41

4.2.4 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động của cao CA trên ấu trùng ruồi

giấm đột biến rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ 42

4.2.5 Đánh giá sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

Kết luận 45

Kiến nghị 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Viết tắt (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt) Viết đầy đủ

decarboxylase

L-aromatic amino acid decarboxylase

9 ALDH Aldehyd dehydrogenase Aldehyd dehydrogenase

methylisoxazole-4-propionic

α-amino-3-hydroxy-5-acid

Acid 5-methylisoxazole-4-

α-amino-3-hydroxy-propionic

12 ASD Autism spectrum disorders Rối loạn phổ tự kỷ

enzyme

Enzym butyrylcholinesterase

14 CA Centella Asiatica (L.) Urban Rau má

monophosphate

Adenosin monophosphat

vòng

18 COMT Catechol-O-methyl transferase Catechol-O-methyl

transferase

21 DOPAC 3,4-dihydroxyphenylacetic acid Axit

23 L-Dopa L-dihydroxyphenylalanine L-dihydroxyphenylalanine

26 NMDA N-methyl –D-aspartate N-methyl –D-aspartate

dismutases

32 UBE3A Ubiquitin-protein ligase E3A Ubiquitin-protein ligase

E3A

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí và chức năng của thụ thể D2 và D3 6

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu 18

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tổng hợp và chuyển hoá của Dopamin (DA) 8

Hình 1.2 Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban 11

Hình 1.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm 14 Hình 1.4 Sơ đồ thể hiện dòng chảy nghiên cứu cơ chế phân tử của ADS sử dụng Drosophila 15 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 19 Hình 2.2 Hình ảnh mô phỏng thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm 21

Hình 2.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm 23

Hình 2.4 Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor 24 Hình 2.5 Hình ảnh mô phỏng thử nghiệm và kết quả xử lý bằng phần mềm Image- J để

đánh giá khả năng vận động bằng hành vi bò trên ấu trùng ruồi giấm…… 25

Hình 3.1 Ảnh hưởng của cao CA (CA) và methylphenidate đối với khả năng tương tác

cộng đồng của ruồi rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ ……… 28

Hình 3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của cao CA và methylphenidate trên mô

hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ ……….…30

Hình 3.3 Kết quả phân tích số lần hoạt động trong 7 ngày của ruồi giấm trưởng thành……… 32 Hình 3.4 Ảnh hưởng của cao CA (1, 2 và 4 mg/ml) và methylphenidate đối với tốc độ

di chuyển của ấu trùng bậc 3 ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự

kỷ……….……… ……… 33 Hình 3.5 Kết quả số lượng tế bào chứa tyrosine hydroxylase có trong não ấu trùng ruồi

giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ……… ……… 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một rối loạn về phát triển thần kinh ở trẻ em được giả thuyết do nhiều nguyên nhân khác nhau ASD được đặc trưng bởi các triệu chứng phát triển thần kinh bao gồm sự thiếu hụt trong tương tác xã hội, giao tiếp các hành vi ám ảnh/rập khuôn và các chuyển động lặp đi lặp lại Ngoài ra, những người bị ASD có một số bệnh đi kèm, bao gồm rối loạn lo âu, trầm cảm, suy giảm nhận thức, động kinh, và bất thường chức năng vận động Tỷ lệ người ASD trên toàn thế giới (hơn 1% vào năm 2013) đã tăng lên đáng kể kể từ năm 2000 Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ASD ở trẻ 18–39 tháng tuổi được ước tính là 0,75% và đang tăng lên

Các nguyên nhân cơ bản của ASD bao gồm di truyền và các biến dị biểu sinh [4] và các yếu tố môi trường Khiếm khuyết trong hệ thống dopaminergic của thần kinh trung ương gây ra một số triệu chứng ASD liên quan đến hành vi giao tiếp cộng đồng Các loại thuốc điều chỉnh tín hiệu dopamine có tác dụng có lợi trong một số bệnh nhân ASD [5] Chẳng hạn như risperidone, clozapine, haloperidol và methylphenidate, đã mang lại tác dụng có lợi ở bệnh nhân ASD [6] Tuy nhiên, giả thuyết về mối liên quan giữa hệ dopamine và ASD hiện còn nhiều tranh cãi

Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu tăng cao, trong đó việc sử dụng các sản phẩm hỗ trợ và điều trị cho các bệnh thần kinh là không ngoại lệ Nghiên cứu tại Khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã chứng minh một số dược liệu như Chè đắng, Rau đắng biển và Ngũ gia bì hương có tác dụng cải thiện hành vi thần kinh trên mô hình ruồi giấm tự kỷ là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn

Rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban (CA), được sử dụng phổ

biến là rau ăn hàng ngày, và là dược liệu thuốc rất quen thuộc, mọc tự nhiên khắp nơi ở Việt Nam và một số nước Châu Á [1, 2] Trong hệ thống y học Hindu truyền thống của Ấn Độ (Ayurveda), Rau má là một trong những thảo dược chính giúp hồi sinh các dây thần kinh và tế bào não [35] Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy Rau má có nhiều tác dụng trên hệ thần kinh như bệnh Parkinson, Alzheimer [3, 7, 8]

Nhận thấy tiềm năng của dược liệu Rau má – loài cây rất sẵn về nguyên liệu và chưa có nghiên cứu nào đã công bố về tác dụng điều trị tự kỷ Chính vì vậy, để tìm hiểu thêm về tác dụng của cao Rau má, mở ra triển vọng mới trong phòng ngừa và điều trị ASD, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi và thay đổi số

lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao Rau má (Centella asiatica (L.) Urban) trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ” với mục

tiêu cụ thể sau:

- Đánh giá được tác dụng cải thiện hành vi của cao Rau má trên mô hình ruồi

giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

- Đánh giá được sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của

cao Rau má trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh

tự kỷ

Phần 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh tự kỷ

1.1.1 Sơ lược bệnh tự kỷ

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một nhóm rối loạn không đồng nhất với đặc điểm chính là suy giảm khả năng phát triển và giao tiếp xã hội, liên quan đến sự hiện diện của các hành vi lặp đi lặp lại và các lợi ích bị hạn chế [9] ASD là trọng tâm nghiên cứu trong những thập kỷ qua, chủ yếu là do sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh này Cụ thể, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có khoảng 16,8 trên 1.000 (một trên 59) trẻ em 8 tuổi được chẩn đoán mắc ASD [10] Mặc dù mối quan tâm về mặt lâm sàng và khoa học đối với ASD ngày càng tăng, nhưng đây vẫn là một nhóm rối loạn chỉ được xác định bằng các biểu hiện lâm sàng mà không xác định được nguyên nhân sinh bệnh [9, 11] Khuyến nghị điều trị ASD, đặc biệt ở trẻ em, là các biện pháp can thiệp về giáo dục và hành vi [12] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy 27–50% số người mắc ASD được điều trị bằng thuốc [13, 14] Tỷ lệ sử dụng thuốc trong ASD tăng theo tuổi và bệnh đi kèm [13] Nếu không biết và xác định rõ nguyên nhân cơ bản, liệu pháp điều trị bằng thuốc cho ASD chủ yếu hướng tới việc kiểm soát các triệu chứng liên quan của ASD, trong khi vẫn chưa có biện pháp can thiệp dược lý dựa trên bằng chứng nào có thể được sử dụng cho các triệu chứng cốt lõi của nhóm rối loạn này [15] Một nhóm hành vi không thích nghi được xác định rõ ràng, bao gồm hung hăng, tự gây thương tích, rập khuôn và cơn giận dữ, thường cần đến liệu pháp điều trị bằng thuốc [9] Những triệu chứng này được thấy ở tới 85% trẻ em mắc ASD [16] và thường là các triệu chứng mục tiêu trong điều trị ASD bằng thuốc [17, 18]

Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ theo DSM – 5

Theo DSM – 5, trẻ có chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ phải thỏa mãn các tiêu chí được quy định trong 5 nhóm A, B, C, D, E [19] Cụ thể như sau:

Nhóm A: Khiếm khuyết về giao tiếp xã hội và tương tác xã hội, Trẻ phải có đủ tất cả 3 tiêu chuẩn dưới đây:

1) Trẻ biểu hiện sự vô cảm, không biết rung động, chia sẻ tình cảm, sở thích của mình với người khác, không thể bắt chuyện, nhập chuyện, và cách đối đáp trong giao tiếp xã hội rất khác thường

2) Trẻ có những khiếm khuyết về sự bày tỏ cử chỉ, hành vi, dùng lời và không dùng lời, qua sự giao tiếp bằng mắt, không thể hiểu và diễn đạt bằng điệu bộ, hoặc bày tỏ cảm xúc trên nét mặt

3) Trẻ gặp nhiều khó khăn trong vấn đề kết bạn và duy trì tình bạn, ngoại trừ cha mẹ và những người chăm sóc khác, không thể thay đổi hành vi theo sự đòi hỏi của mọi

người trong những hoàn cảnh khác nhau, thiếu khả năng chơi giả vờ, và không có hứng thú sinh hoạt chung theo nhóm

Nhóm B: Những giới hạn, lặp lại, rập khuôn về hành vi, sở thích và hoạt động Trẻ phải hội đủ tối thiểu 2 trong 4 tiêu chuẩn dưới đây:

1) Trẻ nói lặp lại, hoạt động tay chân hay sử dụng đồ vật theo lối rập khuôn 2) Trẻ khăng khăng muốn giữ nguyên nề nếp, thói quen, thường chống lại sự đổi thay trong môi trường sinh hoạt hằng ngày

3) Trẻ bị cuốn hút vào những sở thích “độc nhất vô nhị”, chẳng hạn thích sưu tầm những chủ đề về thời tiết, lịch trình xe buýt, tạp chí, v.v

4) Phản ứng mạnh hay thiếu phản ứng đối với những tác động thuộc về giác quan Ví dụ, trẻ không cảm nhận được nhiệt độ lạnh hay nóng, không có cảm giác đau đớn khi ngã té, trầy xước đến chảy máu, nhạy cảm đối với âm thanh, vải sợi, ngửi và sở chạm vật thể nào đó quá mức bình thường, hoặc có những hành vi tự kích thích như quay vòng đồ chơi, mê mẫn nhìn đèn điện, quạt xoay trên trần nhà

Nhóm C: Những khiếm khuyết hay những triệu chứng trên phải biểu hiện lúc trẻ còn nhỏ tuổi (nhưng có thể chưa lộ rõ cho đến khi sự đòi hỏi của xã hội vượt xa so với khả năng hạn chế của trẻ)

Nhóm D: Những triệu chứng nêu trên có ảnh hưởng đối nghịch và hạn chế khả năng sinh hoạt hàng ngày của trẻ

Nhóm E: Những triệu chứng nêu trên không thể giải thích được bởi khuyết tật trí tuệ hay sự chậm phát triển bao quát của trẻ Tự kỷ thường đi đôi với khuyết tật trí tuệ

Trong trường hợp có sự chẩn đoán này, khả năng giao tiếp xã hội của trẻ phải ở dưới mức trung bình so với những trẻ có sự phát triển ngôn ngữ bình thường và đúng theo độ tuổi [19] Ngoài ra, theo DSM-5, trẻ mắc rối loạn phố tự kỷ thường có các vấn đề y khoa như động kinh, rối loạn giấc ngủ, táo bón, rối loạn ăn uống Đồng thời một số đặc điểm liên quan sau đây cũng góp phần trong hỗ trợ chẩn đoán ASD, bao gồm: suy giảm trí tuệ và/ hoặc suy giảm khả năng ngôn ngữ, tự gây thương tích, thanh thiếu niên và người lớn mắc ASD dễ bị lo lắng và trầm cảm, một số cá nhân rối loạn hành vi vận

động (hành động chậm và ”đóng băng” giữa hành động) [19]

1.1.2 Phương pháp điều trị

Điều trị rối loạn phổ tự kỷ bao gồm hai hướng: dùng thuốc và không dùng thuốc

Với hướng điều trị không dùng thuốc: các phương pháp can thiệp đã được phát

triển và nghiên cứu để sử dụng cho trẻ nhỏ Những can thiệp này có thể làm giảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa hóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ Liệu pháp quản lý hành vi cố gắng

củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không mong muốn Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) ABA đã được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và phòng khám điều trị Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường [20]

Với hướng điều trị hỗ trợ bằng thuốc hoá dược: các thuốc được sử dụng để làm

giảm bớt các triệu chứng như khiểm khuyết trong giao tiếp xã hội, các sở thích hoặc hành vi quá mức, tăng động và rối loạn giấc ngủ Các loại thuốc được thử nghiệm điều trị ASD là thuốc chống loạn thần, thuốc ức chế tái hấp thu serotonin, thuốc chẹn  - giao cảm, naltrexon, lithium, clonidin, hormon tuyến giáp Risperidon và aripiprazol cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD trong nhóm đối chứng thử nghiệm ngẫu nhiên Nhìn chung, việc sử dụng hai thuốc này làm giảm cáu kỉnh, kích động, hung hãn, tự gây thương tích ở đa số trẻ em Cả hai thuốc này là chất chống loạn thần không điển hình, tác động lên thụ thể dopamin và là chất chủ vận từng phần của serotonin Tuy nhiên, thuốc cũng có thể gây ra tác dụng phụ như an thần, tăng cân, tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khoẻ sau này Methylphenidate là một loại thuốc kích thích thân não và vỏ não thông qua cơ chế ức chế tái hấp thu norepinephrine và đã có hiệu quả trong việc điều trị chứng tăng động kèm theo giảm chú ý ở bệnh nhân tự kỷ Các loại thuốc như piracetam (cơ chế kích thích tế bào tái tạo AMPA) đã có tác dụng hữu ích trong điều trị ASD Các loại thuốc khác bao gồm lamotrigin (cơ chế ức chế receptor glutamat), dextromethorphan, amantadin (thuốc đối kháng thụ thể NMDA) cũng có hiệu quả điều trị tự kỷ [21]

Sử dụng dược liệu trong hỗ trợ điều trị ASD: Gần đây, dược liệu là trọng tâm

trong nghiên cứu của các nhà khoa học Chúng được thử nghiệm và cho kết quả đầy hứa hẹn trong điều trị một loạt các biến chứng như bệnh lý thần kinh, các vấn đề tim mạch, bệnh tiểu đường Dược liệu ít có tác dụng phụ và có thể làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc hoá dược khác Kết quả sàng lọc sơ bộ dược liệu để điều trị ASD của Viện Dược liệu và nhóm nghiên cứu của Phạm Thị Nguyệt Hằng cho nhiều kết quả đáng hứa hẹn [21, 22]: Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst), lá Chè đắng (Illex kudingcha C J Tseng.) và vỏ thân rễ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) có tác dụng tốt trên mô hình ruồi giấm tự kỷ của các cao chiết bằng các thử nghiệm hành vi giấm (thử nghiệm bò, trèo, tương tác cộng đồng, hành vi

thức/ngủ…) Đáng kể đến là cây Chè đắng (Ilex kudincha C.J Tseng) - một loại thực vật

được sử dụng ở Châu Á để điều trị bảo vệ thần kinh và cải thiện nhận thức Nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Nguyệt Hằng (2021), chứng minh cao chiết IK (IKE) giảm thiểu

các hành vi cốt lõi trên mô hình Drosophila melanogaster đột biến gen rugose [22]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh tự kỷ

Dopamin

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến nguyên nhân và sinh lý bệnh của ASD trong hai thập kỷ qua, nhưng các nhà nghiên cứu vẫn còn khi nói đến các cơ chế tham gia vào cơ chế bệnh sinh của ASD [9]

Hai trung tâm điều tiết của não chủ yếu điều chỉnh các đặc điểm cốt lõi của ASD thông qua các hình chiếu phong phú của chúng lần lượt là vùng não thất (VTA) và vùng chất đen (SN) [23] Sự tương đồng trong biểu hiện lâm sàng của ASD với các tình trạng tâm thần khác (ví dụ, tâm thần phân liệt) dẫn đến giả thuyết rằng quá trình gây bệnh cơ bản có liên quan đến rối loạn chức năng của hệ thống tín hiệu dopaminergic ở một số vùng não nhất định [24]

Hệ thống dopamin (DA) là hệ thống điều chỉnh quan trọng đối với hoạt động vận động, động lực, sự chú ý và xử lý phần thưởng [25, 26] Các dự báo Dopaminergic có nguồn gốc từ vùng chất đen và vùng não thất kết thúc ở thể vân, nơi chúng có chức năng điều chỉnh hoạt động đang diễn ra và chức năng vận động cổng cũng như ảnh hưởng đến tín hiệu vỏ não [27, 28] Với vai trò không thể thiếu của hệ thống dẫn truyền thần kinh này trong các chức năng quan trọng của não, khi sự rối loạn điều hòa của hệ thống dopaminergic có liên quan đến một số rối loạn tâm thần kinh như rối loạn phổ tự kỷ (ASD) [29, 30] Vì nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng các đặc điểm của ASD có thể là do hoặc bị trầm trọng hơn do tín hiệu DA bất thường [31, 32], nghiên cứu về rối loạn chức năng dopaminergic vì nó liên quan đến chứng rối loạn này là cực kỳ quan trọng Chất vận chuyển dopamine (DAT), một protein màng trước synap được tìm thấy ở các đầu cuối dopaminergic, điều chỉnh tính sẵn có về mặt thời gian và không gian của DA [33] bằng cách nhanh chóng loại bỏ DA được giải phóng khỏi khớp thần kinh Do

đó, khi các biến thể di truyền trong gen DAT có liên quan đến một số rối loạn tâm thần

kinh như ASD [30, 34] Những thay đổi trong sự phát triển của thể vân, vùng não được làm giàu bằng các hình chiếu DA và biểu hiện DAT, có liên quan đến các hành vi lặp đi lặp lại trong bệnh tự kỷ Sự gián đoạn trong quá trình xử lý phần thưởng xã hội ở thể vân [35] cũng đã được tìm thấy ở những người mắc ASD, và sự suy giảm khả năng dự đoán và mã hóa dự đoán đã được đề xuất là yếu tố nguyên nhân trong biểu hiện lâm sàng của ASD [36] Kết hợp lại với nhau, bằng chứng này cho thấy rối loạn chức năng DAT dẫn đến tín hiệu dopaminergic bị thay đổi có thể hỗ trợ nhiều khía cạnh của các hành vi bị thay đổi liên quan đến rối loạn tâm thần kinh, như ASD

Thụ thể D2 (D2R) và thụ thể D3 (D3R) thuộc về thụ thể dopamine loại 2 (DRD2, DRD3 và DRD4) Cơ chế hoạt động của chúng được biểu hiện thông qua việc ức chế

sản xuất cAMP bằng cách ghép với protein G [37]

Các thụ thể tiền synap trong hệ limbic (vân bụng bao gồm cả nhân accumbens), đồi thị, hồi hải mã, vỏ não, nhân putamen [39, 40]

ghép với protein G và ghép âm với adenylyl cyclas (AC) [37]

Chức năng

Các khía cạnh về chức năng và hành vi vận động, xử lý ngôn ngữ, nhận thức, kiểm soát bài tiết prolactin và bài tiết alpha MSH từ tuyến yên, chức năng hệ tim mạch [41, 36]

Các khía cạnh của chức năng vận động, nhận thức, xử lý cảm xúc, tương tác xã hội [42, 43]

D2R có chức năng điều chỉnh sự giải phóng DA, đồng thời với tư cách là chất dị thể, chúng cũng điều chỉnh sự giải phóng chất dẫn truyền thần kinh từ các tế bào thần kinh sau khớp thần kinh

Một nghiên cứu gần đây đã được thực hiện trên hạch nền (BG) sau khi chết của những người mắc ASD so với những người đối chứng về kiểu hình thần kinh [44] Các hạch nền (BG) rất quan trọng trong việc lựa chọn hành động, thói quen học được, trình tự hành động và hành vi lặp đi lặp lại [44] Nghiên cứu cho thấy sự gia tăng đáng kể về mRNA của D2R trong các tế bào thần kinh gai trung bình (MSN) của nhân đuôi và nhân bèo ở những người mắc ASD, cho thấy con đường BG gián tiếp Con đường BG gián tiếp cho phép thực hiện một hành động được chọn theo cách trực tiếp, bằng cách ức chế các hành động vận động cạnh tranh Do đó, sự xáo trộn của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng vận động, khuôn mẫu và các hành vi lặp đi lặp lại khác ở những người mắc ASD [44] Bên cạnh việc chuyển sang các biểu hiện lâm sàng của ASD, các tác giả của nghiên cứu còn chỉ ra thực tế là BG cũng có liên quan đến việc kiểm soát nhận thức trong quá trình xử lý ngôn ngữ, do đó cho thấy mối liên hệ có thể có giữa sự thay đổi DR2 và suy giảm ngôn ngữ ở ASD [44]

Ngoài ra, điều quan trọng cần lưu ý là các thụ thể D2 ở vỏ não trước trán PFC hỗ trợ chuyển đổi linh hoạt nhanh chóng giữa các biểu diễn, có nghĩa là D2R có vai trò quan trọng trong tính linh hoạt nhận thức [45] Do đó, chức năng này của D2R có thể bị

suy giảm do triệu chứng ASD điển hình là khăng khăng đòi hỏi sự giống nhau

Thụ thể D3 đóng vai trò quan trọng trong nhận thức và học tập [42] Nguyên tắc cơ bản là chất chủ vận D3R làm giảm nhận thức, trong khi chất đối kháng D3 cải thiện chức năng nhận thức [42] D3R hơn D2R, có liên quan đến tương tác xã hội và đóng một vai trò quan trọng trong hành vi xã hội, với chất chủ vận D3R làm giảm các biểu hiện tương tác xã hội ở động vật [42, 46] Vai trò của thụ thể D3 trong hoạt động vận động đã được khám phá trong các nghiên cứu với chất chủ vận D3, cho thấy phản ứng hai pha sau khi sử dụng chúng - giảm vận động ở liều thấp và tăng vận động ở liều cao hơn [17] Do đó, bên cạnh các yếu tố làm suy giảm chức năng xã hội, thụ thể D3 cũng có thể quan trọng đối với hành vi lặp đi lặp lại trong ASD Những hành động và khuôn mẫu cứng nhắc, lặp đi lặp lại đang ảnh hưởng rất lớn đến những người mắc ASD Một nghiên cứu được thực hiện vào năm 2009 cho thấy phần cụ thể của hành vi lặp đi lặp lại - sự nhấn mạnh vào sự giống nhau (bắt nguồn từ Phỏng vấn Chẩn đoán Tự kỷ (ADI-R)) có liên quan đến tính đa hình của gen thụ thể D3 (DRD3) trong ASD [47] Nó cũng được chứng minh là có liên quan đến ASD trong một nghiên cứu sau đó [48]

Tyrosine hydroxylase (TH)

Tyrosin là tiền chất của dopamin Tyrosin được chuyển thành dihydroxyphenylalanine (L-Dopa) nhờ tyrosin hydroxylase Sau đó, L-Dopa nhanh chóng chuyển thành DA bởi L-aromatic amino acid decarboxylas (AADC), một loại enzym tương tự như tạo 5-HT (serotonin) từ L-5-hydrotrytophan [26, 49]

L-Hình 1.1 Tổng hợp và chuyển hóa của Dopamin (DA) MAO: monoamine oxidas; COMT: Catechol-O-methyl transferas; ALDH:

aldehyd dehydrogenas; DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylacetic acid.[26]

Tyrosine hydroxylase (TH) được biểu hiện chủ yếu ở các vùng não cụ thể và ở tủy thượng thận TH là enzym chủ chốt để tổng hợp dopamin [25] Các chất chuyển hóa xuôi dòng này của con đường thoái hóa catecholamin là những chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong việc điều hòa sự phối hợp vận động và chu kỳ đánh thức giấc ngủ cũng như trong các chức năng hành vi, nội tiết và nội tạng [41]

Gen quy định tyrosine hydroxylase của người nằm trên cánh ngắn NST số 11 Sự giảm hoạt tính của tyrosine hydroxylase và đột biến gen quy định protein tyrosine hydroxylase cũng được tìm thấy ở một số bệnh nhân mắc bệnh di truyền về rối loạn thần kinh vận động liên quan đến L-Dopa [50] Một số bằng chứng cho thấy sự suy giảm chức năng của tyrosine hydroxylase khi bị đột biến (haploinsufficiency) có thể tăng khả năng gây các hội chứng suy giảm thần kinh vận động Những nghiên cứu trên động vật cho thấy hoạt tính của enzym tyrosine hydroxylase giảm theo độ tuổi Các nhà khoa học nhận thấy có sự tăng đáng kể (59%) nhóm carbonyl của enzym tyrosine hydroxylase trong SNc của chuột 24 tháng tuổi so với chuột 4-12 tháng tuổi Điều này cho thấy lượng TH bị oxi hóa bởi các tác nhân ROS cao hơn ở những chuột già [51]

1.1.4 Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ

Trong thập kỷ qua, nhiều tiến bộ sâu rộng đã đạt được trong chẩn đoán phân tử ASD và xác định được các gen liên quan đến ASD Để tìm hiểu đặc tính chức năng của các gen này, xác định các dấu ấn sinh học mới cho ASD và nghiên cứu bệnh lý phân tử, một số mô hình động vật bao gồm linh trưởng, chuột và ruồi giấm đã được sử dụng

Nghiên cứu ASD trên chuột, nhìn chung có 2 loại mô hình chính là mô hình di truyền và mô hình không di truyền Các mô hình di truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm các gen tương đồng của chuột với các gen có liên quan

tới ASD ở người như FMR1, NBEA, UBE3A, Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 cho thấy sự thiếu hụt tương tác xã hội, sự hiếu động và suy giảm nhận thức, tương đồng với các triệu chứng tự kỷ ở người NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức

năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học tập không gian và trí nhớ ở chuột Chuột được gây im

lặng (knockout) gen UBE3A cũng cho thấy các tương tác xã hội bị suy giảm, hành vi lặp

đi lặp lại…[52]

Bên cạnh đó, các mô hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Các mô hình động vật không di truyền của ASD được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hóa học như axit valproic (VPA), thalidomid và ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA khi mang thai làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở trẻ em VPA là thuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các rủi ro liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ Bệnh tự kỷ do VPA có khả năng gây ra bởi các khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ thống limbic và thân não để gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap Mô hình này có thể đại diện tốt hơn cho nhiều trường hợp tự kỷ vô căn có nguồn gốc môi trường/ biểu sinh hơn so với các mô hình đột biến gen mang đột biến trong các gen liên quan đến tự kỷ [53]

Trong các năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mô hình để mô phỏng bệnh lý rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh ruồi giấm Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm tự kỷ trên thế

giới như: gen dABCA13, rugose, dUBE3A, dFMR1,… [52]

Trong đề tài cấp cơ sở 2019, Khoa Dược lý – sinh hoá Viện Dược Liệu đã tiến hành đánh giá sàng lọc dược liệu có tác dụng điều trị tự kỷ sử dụng mô hình ruồi giấm

đột biến gen rugose [52] Chủng ruồi giấm đột biến gen này đều do GS Yamaguchi cung cấp

1.2 Rau má 1.2.1 Tên gọi – vị trí phân loại

Ở Việt Nam, Rau má còn có một số tên như lôi công thảo, tinh tuyết, liên tiền thảo Nó cũng được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Tích tuyết thảo (Trung Quốc), Phanok (Lào) Gotu kola (SriLanka Ấn Độ) Pegagan (Indonesia), Takip-kohol (Philippine) hay Bua-bok (Thái Lan) [26, 54]

Rau má có tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urban (CA) Ngoài ra, tên khoa học đồng nghĩa của Rau má là Hydrocotyle asiatica L hay Trisanthus cochinchinensis

Lour Rau má thuộc họ Hoa tán (Apiaceae)

Hình 1.2 Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban)

1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố

Rau má là loài cây một năm, thân thảo, mọc bò, có rễ ở các mấu, thân gầy, nhẫn Lá hình mắt chim, khía tai bèo, rộng 2 - 4cm, cuống dài 2 - 4cm trong những nhánh mang hoa và dài 10 - 12cm trong những nhánh thường Hoa Rau má có màu đỏ hoặc trắng, được bao phủ bởi các lá và 3 - 6 hoa sắp xếp trong cùng 1 mấu Quả nhỏ, hình cấu, có nhiều rãnh dọc, hạt dẹp Lá mầm hình trứng rộng hay hình bầu dục

Rau má mọc hoang tại khắp nơi ở Việt Nam và các nước vùng nhiệt đới như Lào, Campuchia, Indonesia Ấn Độ, [2] Ở Việt Nam, Rau má mọc tự nhiên ở trên các bãi đất hoang ven đường, ven ruộng tại nhiều địa phương suốt từ Bắc vào Nam

1.2.3 Thành phần hoá học

Tùy theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch, tỷ lệ hoạt chất trong Rau má có thể có khác biệt [26]

Trong thành phần hóa học của cây Rau má, nhóm saponin hay còn gọi là triterpen được xem là nhóm chất đặc biệt có ý nghĩa nhất, nó bao gồm triterpen acid và triterpen glycosid Triterpen acid chứa acid asiatic, acid brahmic, acid isobrahmic, acid madecassic và acid bentulinic Còn hợp chất triterpen glycosid có chứa asiaticosid, madecassosid, brahmosid, brahminosid và thankunisid Trong đó asiaticosid chiếm hàm lượng nhiều nhất Đây là nhóm những hoạt chất được nghiên cứu khá nhiều trong lĩnh vực y được nhằm phục vụ việc chữa bệnh cho con người trong đó phải kể đến vai trò của asiaticosid và madecassosid

Ngoài ra, trong dịch chiết tổng Rau má có chứa sterol thực vật, flavonoid và các thành phần khác không có hoạt tính dược lý, như là tannin, một số acid (β-chariophylen, trans- β -pharnesen và mamachren D), phytosterol (campesterol, sitosterol, stigmasterol), chất nhầy, nhựa, aminoacid tự do (alanin, serin, aminobutyrat, aspartat, glutamat, lysin và treonin), một thành phần đáng (vallerin), acid béo (acid linoleic, linolnelic, oleic, palmitic và acid stearic) [8]

1.2.4 Tác dụng dược lý

1.2.4.1 Tác dụng làm lành da và xương

Rau má thúc đẩy lành da và vết thương bằng cách làm tăng hàm lượng collagen và độ dày của biểu mô, Asiaticosid, một thành phần trong Rau má, đã được báo cáo là có hoạt động chữa lành vết thương bằng cách tăng sự hình thành collagen, sự hình thành mạch [8, 55] và tăng độ bền của da mới hình thành [8]

Cao tiêu chuẩn của Rau má được báo cáo điều trị u xương không đau trong thử nghiệm lâm sàng [55]

1.2.4.2 Tác dụng chống viêm

Chất chiết xuất từ dịch chiết Rau má có các hoạt động chống viêm Madecassosid có thể là thành phần hoạt động chính của Rau má chịu trách nhiệm cho việc sử dụng lâm sàng trong viêm khớp dạng thấp và các cơ chế hoạt động cơ bản có thể chủ yếu thông qua việc điều hòa miễn dịch tế bào và tế bào bất thường để bảo vệ khỏi sự phá hủy chung Madecassosid làm giảm bớt các tế bào viêm và tăng sản hoạt dịch cũng như bảo vệ chống lại sự phá hủy khớp [8]

1.2.4.3 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết Rau má cho thấy tác dụng chống ung thư liên quan đến cấu trúc trong nguyên bào sợi phổi của chuột là thông qua cơ chế kích hoạt hệ thống miễn dịch, bằng chứng là sự thay đổi của lympho bào ở nồng độ dịch chiết thấp [8, 55]

1.2.4.4 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Tác dụng an thần và giải lo âu: tác dụng được đề xuất chủ yếu là do các thành phần brahmoside và brahminosid, giả thuyết cho rằng hoạt động giải lo âu có thể một phần do liên kết các thành phần này với các thụ thể cholecystokinin (CCK B), một nhóm các thụ thể kết hợp protein G liên kết với peptid hoặc gastrin và được cho là có vai trò tiềm năng trong việc điều chế chứng lo âu, sự hấp thụ, trí nhớ và cơn đói ở động vật và con người [8]

Tác dụng chống trầm cảm: một nghiên cứu chỉ ra rằng số triterpen từ Rau má đã làm giảm thời gian bất động và làm giảm sự mất cân bằng nồng độ acid amin giúp xác nhận hoạt động chống trầm cảm của Rau má [56] Một nghiên cứu khác chỉ ra các triterpen Rau má giúp tăng chất dẫn truyền thần kinh monoamin và chất chuyển hóa của chúng ở vỏ não, đồi thị và làm giảm nồng độ corticosteron, tăng hàm lượng 5-HT NE DA và chất chuyển hóa của chúng 5-HIAA ở đồi thị, MHPG trong não chuột giúp chứng minh thêm sự tham gia của các triterpen Rau má trong việc cải thiện chức năng trực HPA và tăng số lượng các chất dẫn truyền thần kinh monoamin cho khả năng chống trầm cảm của Rau má [8]

Acetylcholinesterase (AChE) thủy phân acetylcholine (ACh) tức là sự phân hủy của nó, do đó ức chế AChE và enzym pseudocholinesteras butyrylcholinesterase (BChE), đã được coi là mục tiêu tiềm năng trong việc phát triển thuốc chống lại AD và bệnh tự kỷ Bốn chất ức chế AChE đã được phê duyệt trong điều trị AD, đó là rivastigmin, tacrin, donepezil và galantamin cũng kích thích các thụ thể cholinergic nicotinic làm tăng giải phóng Ach Các nghiên cứu về những loại thuốc này đã tiết lộ tính hữu ích tiềm năng trong việc điều trị các triệu chứng ASD cốt lõi và kèm theo, đồng thời các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo đã được ủng hộ để chứng minh hiệu quả của chúng về mặt này Theo quan điểm của suy luận kết quả này, dịch chiết cồn của Rau má có tác dụng ức chế nhất định đối với hoạt động của AChE trong ống nghiệm Bằng chứng khác ủng hộ tác dụng tích cực của Rau má ở những người mắc chứng tự kỷ bắt nguồn từ việc phát hiện ra rằng hỗn hợp flavonoid gồm luteolin, quercetin và rutin, tất cả đều có trong Rau má, đã được chứng minh là gây ra nối lại lời nói trong một thử nghiệm với trẻ em tham gia ASD [7]

1.3 Ruồi giấm

Drosophila melanogaster là một loài ruồi thuộc chi Ruồi giấm (Drosophila), họ

Ruồi giấm (Drosophilidae), bộ Hai cánh (Diptera), lớp Côn trùng (Insecta) Chúng được

biết đến với tên thông dụng là ruồi giấm hay ruồi trái cây (fruit fly) Ruồi giấm được coi là sinh vật có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở

mức độ phân tử hay các vấn đề sinh học cơ bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hóa

1.3.1 Đặc điểm

Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành dài khoảng 2,5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng hơi tối Con đực dễ dàng phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở bụng

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính (XX, YY) trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [57]

1.3.3 Chu kỳ vòng đời

Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành (Hình 1.3) Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750- 1500 trứng trong suốt vòng đời của nó Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùng bậc hai, ấu trùng bậc ba tương ứng với một, hai, ba ngày tuổi) cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi thụ tinh Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29ºC khoảng 30-40 ngày [57]

Hình 1.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [58]

1.3.4 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Drosophila melanogaster là một mô hình cực kỳ hữu ích để hiểu các cơ chế phân

tử làm cơ sở cho chức năng của các gen liên quan đến ASD trong sự phát triển và chức năng của não (Hình 1.4) Sử dụng động vật chuyển gen, các nghiên cứu về chức năng và hành vi được sử dụng để mang lại những lợi ích dịch mã cần thiết nhằm xác định hoặc làm rõ chức năng của gen ở người [59]

Hình 1.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu cơ chế phân tử của ADS trên mô hình

Drosophila melanogaster [59]

Theo Gadow và cộng sự, nghiên cứu từ một số nhóm cho thấy sự mất cân bằng dopamine trong các mạch cụ thể của não có thể dẫn đến hành vi liên quan đến ASD Hơn nữa, kích thước tăng lên của các vùng não giàu DA, chẳng hạn như thể vân, có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của chứng rối loạn [59]

Theo đó, đột biến mất chức năng của gen rugose làm giảm khả năng vận động,

gây nên bất thường trong cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm Những cá thể trưởng thành mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương tác xã hội [58] Hơn nữa, cơ quan GWAS đang phát triển nhanh chóng cung cấp thông tin chi tiết về sự hiện diện của các thay đổi gen ở bệnh nhân, do đó rất khó giải thích các hậu quả về chức năng và mức độ liên quan của chúng trong ASD Ruồi giấm cho phép phân tích tác động của nhiều biến đổi gen trong các tập hợp tế bào khác nhau, cho phép phân biệt sự đóng góp của sự kết hợp các thay đổi di truyền cùng xảy ra ở bệnh nhân ASD [59]

Theo Hamilton và cộng sự, cách đây vài năm, một đột biến mới ở gen DAT ở

người (hDAT-T356M) đã được xác định Đột biến này dẫn đến giảm khả năng tích lũy DA nội bào do dòng dopamine tăng lên Hậu quả chức năng của đột biến này đã được

nghiên cứu ở Drosophila bằng cách biểu hiện hDAT-T356M ở ruồi đột biến DAT null Những động vật này tỏ ra hiếu động hơn so với ruồi biểu hiện gen wt hDAT do nồng độ

DA ngoại bào tăng lên và dòng dopamine bất thường Do đó, sự kết hợp giữa phân tích

Sàng lọc di truyền và hoá học

bộ gen của bệnh nhân ASD cùng với việc sử dụng mô hình in vivo dễ thao tác với sự phát triển thần kinh mạnh mẽ và có thể so sánh được, sẽ rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của những rối loạn này [59]

Năm 2015, nghiên cứu của Wise và cs đã xác định được mối liên quan giữa đột

biến gen rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm Nhóm nghiên cứu chứng minh được gen rugose có khả năng

tương tác với phức hệ EGFR và North trong nhiều con đường tín hiệu, đóng vai trò trung gian trong quá trình truyền tin giữa các con đường tín hiệu với nhau Theo đó, đột biến

mất chức năng của gen rugose làm giảm khả năng vận động gây nên bất thưởng trong

cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm Những cá thể trưởng thành mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương tác xã

hội [58] Do tính đặc tính của ruồi giấm đột biến gen rugose tương đồng với ASD trên bệnh nhân, mô hình ruồi giấm rugose đã được sử dụng làm mô hình tự kỷ thực nghiệm

để nghiên cứu đặc điểm cơ chế bệnh sinh cũng như nghiên cứu sàng lọc phát triển thuốc điều trị

Hai chủng ruồi giấm Canton-S và Rugose được sử dụng trong nghiên cứu này

được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản

Phần 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu (hoặc nguyên vật liệu)

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Nguồn gốc

Đối tượng nghiên cứu là cao Rau má Rau má được thu hái ở Hải Phòng vào

tháng 4/2023, được giám định đúng tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban (ký

hiệu là CA) bởi Trung tâm Tài nguyên, Viện Dược liệu Dược liệu thu hái toàn cây được phơi khô, sau đó nghiền thành bột thô để chiết cao phục vụ cho nghiên cứu

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Quy trình chiết cao chiết nước Rau má được tiến hành tại Khoa Chiết xuất, Viện Dược liệu Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như sau: Chiết 66 g mẫu trong 2.25 L nước hồi lưu trong 2 h ở 70℃ thu được 13,226 g cao, hàm ẩm 4,65%

2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu

Chủng Rugose là ruồi giấm mang gen rugose bị đột biến với mã số

FBst0009801-CG44835 có đột biến ở vị trí: X:5085759 5254864 được sử dụng làm mô hình bệnh tự

kỷ Chủng ruồi giấm hoang dại Canton-S với mã số FBst0064349 được sử dụng làm

nhóm chứng sinh lý Cả 2 chủng ruồi giấm được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản và ở điều kiện phòng thí nghiệm nhiệt độ 25 ± 1oC, độ ẩm 50%, chu kỳ sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

10 Ether Xilong ChemicalCo, Trung quốc

13 Kháng thể thứ phát gắn chất phát huỳnh

4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng

Việt Nam

16 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus, Nhật Bản 17 Một số dụng cụ, thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu được mô tả trong hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.2.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu

Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái (1:1) các cặp ruồi bố mẹ chủng rugose để tạo dòng ruồi tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý Chủng ruồi lai tạo

được chia thành các nhóm như sau:

- Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi

trường thức ăn cơ bản

- Nhóm bệnh lý: Ruồi bố mẹ chủng rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi

trường thức ăn cơ bản Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm Tất cả các ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1°C với chu kì 12 giờ sáng – 12 giờ tối (sáng từ 07 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng từ 9 giờ đến 18 giờ Thành phần cho 500 ml thức ăn ruồi giấm được trình bày ở phần phụ lục

Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu :

- Đối với ấu trùng: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2 - 3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển

toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Tiến hành thu ấu trùng giai đoạn thích hợp cho thí nghiệm

- Đối với ruồi trưởng thành: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2 - 3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Với ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu nghiên cứu sẽ không sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu thì sử dụng lặp lại trong 4 - 6 ngày (tức 1 - 2 lần chuyển) Ấu trùng nở và đóng kén trong 6 - 8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu ruồi nở trong ngày xác định (sai khác 1 ngày) Ruồi nở được chuyển sang ống chứa thức ăn có mẫu nghiên cứu mới Để ruồi ăn thức ăn chứa mẫu 3 ngày Sau đó tiến hành thí nghiệm

Chia lô thí nghiệm:

- Chia ruồi trưởng thành đã thu được ở trên làm ít nhất 03 lô nghiên cứu:

Lô 1: Nhóm chứng sinh lý sử dụng chủng Canton-S + nuôi trong ống thức ăn

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên

mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Hành vi tương tác cộng đồng là yếu tố quan trọng đánh giá khả năng điều trị bệnh tự kỷ của dược liệu Do đó dựa trên mô hình đánh giá được tiến hành theo mô tả trước đây của tác giả Simon (2012) và Ueoka (2019) [52, 60], chúng tôi tiến hành đánh giá

cải thiện tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose được điều trị bằng cao

CA