nguyễn phượng anh nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi và thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao rau má centella asiatica l urban trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình b

Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ ..... Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với khả năn

TỔNG QUAN

Bệnh tự kỷ

1.1.1 Sơ lược bệnh tự kỷ

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một nhóm rối loạn không đồng nhất với đặc điểm chính là suy giảm khả năng phát triển và giao tiếp xã hội, liên quan đến sự hiện diện của các hành vi lặp đi lặp lại và các lợi ích bị hạn chế [9] ASD là trọng tâm nghiên cứu trong những thập kỷ qua, chủ yếu là do sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh này Cụ thể, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có khoảng 16,8 trên 1.000 (một trên 59) trẻ em 8 tuổi được chẩn đoán mắc ASD [10] Mặc dù mối quan tâm về mặt lâm sàng và khoa học đối với ASD ngày càng tăng, nhưng đây vẫn là một nhóm rối loạn chỉ được xác định bằng các biểu hiện lâm sàng mà không xác định được nguyên nhân sinh bệnh [9, 11] Khuyến nghị điều trị ASD, đặc biệt ở trẻ em, là các biện pháp can thiệp về giáo dục và hành vi [12] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy 27–50% số người mắc ASD được điều trị bằng thuốc [13, 14] Tỷ lệ sử dụng thuốc trong ASD tăng theo tuổi và bệnh đi kèm [13] Nếu không biết và xác định rõ nguyên nhân cơ bản, liệu pháp điều trị bằng thuốc cho ASD chủ yếu hướng tới việc kiểm soát các triệu chứng liên quan của ASD, trong khi vẫn chưa có biện pháp can thiệp dược lý dựa trên bằng chứng nào có thể được sử dụng cho các triệu chứng cốt lõi của nhóm rối loạn này [15] Một nhóm hành vi không thích nghi được xác định rõ ràng, bao gồm hung hăng, tự gây thương tích, rập khuôn và cơn giận dữ, thường cần đến liệu pháp điều trị bằng thuốc [9] Những triệu chứng này được thấy ở tới 85% trẻ em mắc ASD [16] và thường là các triệu chứng mục tiêu trong điều trị ASD bằng thuốc [17, 18]

Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ theo DSM – 5

Theo DSM – 5, trẻ có chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ phải thỏa mãn các tiêu chí được quy định trong 5 nhóm A, B, C, D, E [19] Cụ thể như sau:

Nhóm A: Khiếm khuyết về giao tiếp xã hội và tương tác xã hội, Trẻ phải có đủ tất cả 3 tiêu chuẩn dưới đây:

1) Trẻ biểu hiện sự vô cảm, không biết rung động, chia sẻ tình cảm, sở thích của mình với người khác, không thể bắt chuyện, nhập chuyện, và cách đối đáp trong giao tiếp xã hội rất khác thường

2) Trẻ có những khiếm khuyết về sự bày tỏ cử chỉ, hành vi, dùng lời và không dùng lời, qua sự giao tiếp bằng mắt, không thể hiểu và diễn đạt bằng điệu bộ, hoặc bày tỏ cảm xúc trên nét mặt

3) Trẻ gặp nhiều khó khăn trong vấn đề kết bạn và duy trì tình bạn, ngoại trừ cha mẹ và những người chăm sóc khác, không thể thay đổi hành vi theo sự đòi hỏi của mọi

4 người trong những hoàn cảnh khác nhau, thiếu khả năng chơi giả vờ, và không có hứng thú sinh hoạt chung theo nhóm

Nhóm B: Những giới hạn, lặp lại, rập khuôn về hành vi, sở thích và hoạt động Trẻ phải hội đủ tối thiểu 2 trong 4 tiêu chuẩn dưới đây:

1) Trẻ nói lặp lại, hoạt động tay chân hay sử dụng đồ vật theo lối rập khuôn 2) Trẻ khăng khăng muốn giữ nguyên nề nếp, thói quen, thường chống lại sự đổi thay trong môi trường sinh hoạt hằng ngày

3) Trẻ bị cuốn hút vào những sở thích “độc nhất vô nhị”, chẳng hạn thích sưu tầm những chủ đề về thời tiết, lịch trình xe buýt, tạp chí, v.v

4) Phản ứng mạnh hay thiếu phản ứng đối với những tác động thuộc về giác quan

Ví dụ, trẻ không cảm nhận được nhiệt độ lạnh hay nóng, không có cảm giác đau đớn khi ngã té, trầy xước đến chảy máu, nhạy cảm đối với âm thanh, vải sợi, ngửi và sở chạm vật thể nào đó quá mức bình thường, hoặc có những hành vi tự kích thích như quay vòng đồ chơi, mê mẫn nhìn đèn điện, quạt xoay trên trần nhà

Nhóm C: Những khiếm khuyết hay những triệu chứng trên phải biểu hiện lúc trẻ còn nhỏ tuổi (nhưng có thể chưa lộ rõ cho đến khi sự đòi hỏi của xã hội vượt xa so với khả năng hạn chế của trẻ)

Nhóm D: Những triệu chứng nêu trên có ảnh hưởng đối nghịch và hạn chế khả năng sinh hoạt hàng ngày của trẻ

Nhóm E: Những triệu chứng nêu trên không thể giải thích được bởi khuyết tật trí tuệ hay sự chậm phát triển bao quát của trẻ Tự kỷ thường đi đôi với khuyết tật trí tuệ

Trong trường hợp có sự chẩn đoán này, khả năng giao tiếp xã hội của trẻ phải ở dưới mức trung bình so với những trẻ có sự phát triển ngôn ngữ bình thường và đúng theo độ tuổi [19] Ngoài ra, theo DSM-5, trẻ mắc rối loạn phố tự kỷ thường có các vấn đề y khoa như động kinh, rối loạn giấc ngủ, táo bón, rối loạn ăn uống Đồng thời một số đặc điểm liên quan sau đây cũng góp phần trong hỗ trợ chẩn đoán ASD, bao gồm: suy giảm trí tuệ và/ hoặc suy giảm khả năng ngôn ngữ, tự gây thương tích, thanh thiếu niên và người lớn mắc ASD dễ bị lo lắng và trầm cảm, một số cá nhân rối loạn hành vi vận động (hành động chậm và ”đóng băng” giữa hành động) [19]

1.1.2 Phương pháp điều trị Điều trị rối loạn phổ tự kỷ bao gồm hai hướng: dùng thuốc và không dùng thuốc

Với hướng điều trị không dùng thuốc: các phương pháp can thiệp đã được phát triển và nghiên cứu để sử dụng cho trẻ nhỏ Những can thiệp này có thể làm giảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa hóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ Liệu pháp quản lý hành vi cố gắng

5 củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không mong muốn Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) ABA đã được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và phòng khám điều trị Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường [20]

Với hướng điều trị hỗ trợ bằng thuốc hoá dược: các thuốc được sử dụng để làm giảm bớt các triệu chứng như khiểm khuyết trong giao tiếp xã hội, các sở thích hoặc hành vi quá mức, tăng động và rối loạn giấc ngủ Các loại thuốc được thử nghiệm điều trị ASD là thuốc chống loạn thần, thuốc ức chế tái hấp thu serotonin, thuốc chẹn  - giao cảm, naltrexon, lithium, clonidin, hormon tuyến giáp Risperidon và aripiprazol cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh thiếu niên mắc ASD trong nhóm đối chứng thử nghiệm ngẫu nhiên Nhìn chung, việc sử dụng hai thuốc này làm giảm cáu kỉnh, kích động, hung hãn, tự gây thương tích ở đa số trẻ em Cả hai thuốc này là chất chống loạn thần không điển hình, tác động lên thụ thể dopamin và là chất chủ vận từng phần của serotonin Tuy nhiên, thuốc cũng có thể gây ra tác dụng phụ như an thần, tăng cân, tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khoẻ sau này Methylphenidate là một loại thuốc kích thích thân não và vỏ não thông qua cơ chế ức chế tái hấp thu norepinephrine và đã có hiệu quả trong việc điều trị chứng tăng động kèm theo giảm chú ý ở bệnh nhân tự kỷ Các loại thuốc như piracetam (cơ chế kích thích tế bào tái tạo AMPA) đã có tác dụng hữu ích trong điều trị ASD Các loại thuốc khác bao gồm lamotrigin (cơ chế ức chế receptor glutamat), dextromethorphan, amantadin (thuốc đối kháng thụ thể NMDA) cũng có hiệu quả điều trị tự kỷ [21]

Sử dụng dược liệu trong hỗ trợ điều trị ASD: Gần đây, dược liệu là trọng tâm trong nghiên cứu của các nhà khoa học Chúng được thử nghiệm và cho kết quả đầy hứa hẹn trong điều trị một loạt các biến chứng như bệnh lý thần kinh, các vấn đề tim mạch, bệnh tiểu đường Dược liệu ít có tác dụng phụ và có thể làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc hoá dược khác Kết quả sàng lọc sơ bộ dược liệu để điều trị ASD của Viện Dược liệu và nhóm nghiên cứu của Phạm Thị Nguyệt Hằng cho nhiều kết quả đáng hứa hẹn [21, 22]: Rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst), lá Chè đắng (Illex kudingcha C J Tseng.) và vỏ thân rễ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) có tác dụng tốt trên mô hình ruồi giấm tự kỷ của các cao chiết bằng các thử nghiệm hành vi giấm (thử nghiệm bò, trèo, tương tác cộng đồng, hành vi thức/ngủ…) Đáng kể đến là cây Chè đắng (Ilex kudincha C.J Tseng) - một loại thực vật được sử dụng ở Châu Á để điều trị bảo vệ thần kinh và cải thiện nhận thức Nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Nguyệt Hằng (2021), chứng minh cao chiết IK (IKE) giảm thiểu các hành vi cốt lõi trên mô hình Drosophila melanogaster đột biến gen rugose [22]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh tự kỷ

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến nguyên nhân và sinh lý bệnh của ASD trong hai thập kỷ qua, nhưng các nhà nghiên cứu vẫn còn khi nói đến các cơ chế tham gia vào cơ chế bệnh sinh của ASD [9]

Hai trung tâm điều tiết của não chủ yếu điều chỉnh các đặc điểm cốt lõi của ASD thông qua các hình chiếu phong phú của chúng lần lượt là vùng não thất (VTA) và vùng chất đen (SN) [23] Sự tương đồng trong biểu hiện lâm sàng của ASD với các tình trạng tâm thần khác (ví dụ, tâm thần phân liệt) dẫn đến giả thuyết rằng quá trình gây bệnh cơ bản có liên quan đến rối loạn chức năng của hệ thống tín hiệu dopaminergic ở một số vùng não nhất định [24]

Rau má

1.2.1 Tên gọi – vị trí phân loại Ở Việt Nam, Rau má còn có một số tên như lôi công thảo, tinh tuyết, liên tiền thảo Nó cũng được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Tích tuyết thảo (Trung Quốc), Phanok (Lào) Gotu kola (SriLanka Ấn Độ) Pegagan (Indonesia), Takip-kohol (Philippine) hay Bua-bok (Thái Lan) [26, 54]

Rau má có tên khoa học: Centella asiatica (L.) Urban (CA) Ngoài ra, tên khoa học đồng nghĩa của Rau má là Hydrocotyle asiatica L hay Trisanthus cochinchinensis Lour Rau má thuộc họ Hoa tán (Apiaceae)

Hình 1.2 Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban) 1.2.2 Đặc điểm thực vật, phân bố

Rau má là loài cây một năm, thân thảo, mọc bò, có rễ ở các mấu, thân gầy, nhẫn

Lá hình mắt chim, khía tai bèo, rộng 2 - 4cm, cuống dài 2 - 4cm trong những nhánh mang hoa và dài 10 - 12cm trong những nhánh thường Hoa Rau má có màu đỏ hoặc trắng, được bao phủ bởi các lá và 3 - 6 hoa sắp xếp trong cùng 1 mấu Quả nhỏ, hình cấu, có nhiều rãnh dọc, hạt dẹp Lá mầm hình trứng rộng hay hình bầu dục

Rau má mọc hoang tại khắp nơi ở Việt Nam và các nước vùng nhiệt đới như Lào, Campuchia, Indonesia Ấn Độ, [2] Ở Việt Nam, Rau má mọc tự nhiên ở trên các bãi đất hoang ven đường, ven ruộng tại nhiều địa phương suốt từ Bắc vào Nam

Tùy theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch, tỷ lệ hoạt chất trong Rau má có thể có khác biệt [26]

Trong thành phần hóa học của cây Rau má, nhóm saponin hay còn gọi là triterpen được xem là nhóm chất đặc biệt có ý nghĩa nhất, nó bao gồm triterpen acid và triterpen glycosid Triterpen acid chứa acid asiatic, acid brahmic, acid isobrahmic, acid madecassic và acid bentulinic Còn hợp chất triterpen glycosid có chứa asiaticosid, madecassosid, brahmosid, brahminosid và thankunisid Trong đó asiaticosid chiếm hàm lượng nhiều nhất Đây là nhóm những hoạt chất được nghiên cứu khá nhiều trong lĩnh vực y được nhằm phục vụ việc chữa bệnh cho con người trong đó phải kể đến vai trò của asiaticosid và madecassosid

Ngoài ra, trong dịch chiết tổng Rau má có chứa sterol thực vật, flavonoid và các thành phần khác không có hoạt tính dược lý, như là tannin, một số acid (β-chariophylen, trans- β -pharnesen và mamachren D), phytosterol (campesterol, sitosterol, stigmasterol), chất nhầy, nhựa, aminoacid tự do (alanin, serin, aminobutyrat, aspartat, glutamat, lysin và treonin), một thành phần đáng (vallerin), acid béo (acid linoleic, linolnelic, oleic, palmitic và acid stearic) [8]

1.2.4.1 Tác dụng làm lành da và xương

Rau má thúc đẩy lành da và vết thương bằng cách làm tăng hàm lượng collagen và độ dày của biểu mô, Asiaticosid, một thành phần trong Rau má, đã được báo cáo là có hoạt động chữa lành vết thương bằng cách tăng sự hình thành collagen, sự hình thành mạch [8, 55] và tăng độ bền của da mới hình thành [8]

Cao tiêu chuẩn của Rau má được báo cáo điều trị u xương không đau trong thử nghiệm lâm sàng [55]

1.2.4.2 Tác dụng chống viêm

Chất chiết xuất từ dịch chiết Rau má có các hoạt động chống viêm Madecassosid có thể là thành phần hoạt động chính của Rau má chịu trách nhiệm cho việc sử dụng lâm sàng trong viêm khớp dạng thấp và các cơ chế hoạt động cơ bản có thể chủ yếu thông qua việc điều hòa miễn dịch tế bào và tế bào bất thường để bảo vệ khỏi sự phá hủy chung Madecassosid làm giảm bớt các tế bào viêm và tăng sản hoạt dịch cũng như bảo vệ chống lại sự phá hủy khớp [8]

1.2.4.3 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết Rau má cho thấy tác dụng chống ung thư liên quan đến cấu trúc trong nguyên bào sợi phổi của chuột là thông qua cơ chế kích hoạt hệ thống miễn dịch, bằng chứng là sự thay đổi của lympho bào ở nồng độ dịch chiết thấp [8, 55]

1.2.4.4 Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Tác dụng an thần và giải lo âu: tác dụng được đề xuất chủ yếu là do các thành phần brahmoside và brahminosid, giả thuyết cho rằng hoạt động giải lo âu có thể một phần do liên kết các thành phần này với các thụ thể cholecystokinin (CCK B), một nhóm các thụ thể kết hợp protein G liên kết với peptid hoặc gastrin và được cho là có vai trò tiềm năng trong việc điều chế chứng lo âu, sự hấp thụ, trí nhớ và cơn đói ở động vật và con người [8]

Tác dụng chống trầm cảm: một nghiên cứu chỉ ra rằng số triterpen từ Rau má đã làm giảm thời gian bất động và làm giảm sự mất cân bằng nồng độ acid amin giúp xác nhận hoạt động chống trầm cảm của Rau má [56] Một nghiên cứu khác chỉ ra các triterpen Rau má giúp tăng chất dẫn truyền thần kinh monoamin và chất chuyển hóa của chúng ở vỏ não, đồi thị và làm giảm nồng độ corticosteron, tăng hàm lượng 5-HT NE

DA và chất chuyển hóa của chúng 5-HIAA ở đồi thị, MHPG trong não chuột giúp chứng minh thêm sự tham gia của các triterpen Rau má trong việc cải thiện chức năng trực HPA và tăng số lượng các chất dẫn truyền thần kinh monoamin cho khả năng chống trầm cảm của Rau má [8]

Acetylcholinesterase (AChE) thủy phân acetylcholine (ACh) tức là sự phân hủy của nó, do đó ức chế AChE và enzym pseudocholinesteras butyrylcholinesterase (BChE), đã được coi là mục tiêu tiềm năng trong việc phát triển thuốc chống lại AD và bệnh tự kỷ Bốn chất ức chế AChE đã được phê duyệt trong điều trị AD, đó là rivastigmin, tacrin, donepezil và galantamin cũng kích thích các thụ thể cholinergic nicotinic làm tăng giải phóng Ach Các nghiên cứu về những loại thuốc này đã tiết lộ tính hữu ích tiềm năng trong việc điều trị các triệu chứng ASD cốt lõi và kèm theo, đồng thời các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo đã được ủng hộ để chứng minh hiệu quả của chúng về mặt này Theo quan điểm của suy luận kết quả này, dịch chiết cồn của Rau má có tác dụng ức chế nhất định đối với hoạt động của AChE trong ống nghiệm Bằng chứng khác ủng hộ tác dụng tích cực của Rau má ở những người mắc chứng tự kỷ bắt nguồn từ việc phát hiện ra rằng hỗn hợp flavonoid gồm luteolin, quercetin và rutin, tất cả đều có trong Rau má, đã được chứng minh là gây ra nối lại lời nói trong một thử nghiệm với trẻ em tham gia ASD [7].

Ruồi giấm

Drosophila melanogaster là một loài ruồi thuộc chi Ruồi giấm (Drosophila), họ

Ruồi giấm (Drosophilidae), bộ Hai cánh (Diptera), lớp Côn trùng (Insecta) Chúng được biết đến với tên thông dụng là ruồi giấm hay ruồi trái cây (fruit fly) Ruồi giấm được coi là sinh vật có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm hiểu cơ chế gây bệnh ở

14 mức độ phân tử hay các vấn đề sinh học cơ bản từ sinh lý cho đến thần kinh, chuyển hóa

Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vòng đen ngang bụng Con cái trưởng thành dài khoảng 2,5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng hơi tối Con đực dễ dàng phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác biệt ở bụng

1.3.2 Hệ gen của ruồi giấm

Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên

4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính (XX, YY) trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể Sự đơn giản này là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [57]

Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành (Hình 1.3) Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750- 1500 trứng trong suốt vòng đời của nó Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phôi trong vòng 24h Các phôi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùng bậc hai, ấu trùng bậc ba tương ứng với một, hai, ba ngày tuổi) cuối cùng trưởng thành thành một con ruồi giấm trưởng thành Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10 ngày kể từ khi thụ tinh Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi nuôi ở 29 º C khoảng 30-

Hình 1.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [58]

1.3.4 Mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Drosophila melanogaster là một mô hình cực kỳ hữu ích để hiểu các cơ chế phân tử làm cơ sở cho chức năng của các gen liên quan đến ASD trong sự phát triển và chức năng của não (Hình 1.4) Sử dụng động vật chuyển gen, các nghiên cứu về chức năng và hành vi được sử dụng để mang lại những lợi ích dịch mã cần thiết nhằm xác định hoặc làm rõ chức năng của gen ở người [59]

Hình 1.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu cơ chế phân tử của ADS trên mô hình

Theo Gadow và cộng sự, nghiên cứu từ một số nhóm cho thấy sự mất cân bằng dopamine trong các mạch cụ thể của não có thể dẫn đến hành vi liên quan đến ASD Hơn nữa, kích thước tăng lên của các vùng não giàu DA, chẳng hạn như thể vân, có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của chứng rối loạn [59]

Theo đó, đột biến mất chức năng của gen rugose làm giảm khả năng vận động, gây nên bất thường trong cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm Những cá thể trưởng thành mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương tác xã hội [58] Hơn nữa, cơ quan GWAS đang phát triển nhanh chóng cung cấp thông tin chi tiết về sự hiện diện của các thay đổi gen ở bệnh nhân, do đó rất khó giải thích các hậu quả về chức năng và mức độ liên quan của chúng trong ASD Ruồi giấm cho phép phân tích tác động của nhiều biến đổi gen trong các tập hợp tế bào khác nhau, cho phép phân biệt sự đóng góp của sự kết hợp các thay đổi di truyền cùng xảy ra ở bệnh nhân ASD [59]

Theo Hamilton và cộng sự, cách đây vài năm, một đột biến mới ở gen DAT ở người (hDAT-T356M) đã được xác định Đột biến này dẫn đến giảm khả năng tích lũy

DA nội bào do dòng dopamine tăng lên Hậu quả chức năng của đột biến này đã được nghiên cứu ở Drosophila bằng cách biểu hiện hDAT-T356M ở ruồi đột biến DAT null Những động vật này tỏ ra hiếu động hơn so với ruồi biểu hiện gen wt hDAT do nồng độ

DA ngoại bào tăng lên và dòng dopamine bất thường Do đó, sự kết hợp giữa phân tích

Sàng lọc di truyền và hoá học

17 bộ gen của bệnh nhân ASD cùng với việc sử dụng mô hình in vivo dễ thao tác với sự phát triển thần kinh mạnh mẽ và có thể so sánh được, sẽ rất cần thiết để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của những rối loạn này [59]

Năm 2015, nghiên cứu của Wise và cs đã xác định được mối liên quan giữa đột biến gen rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm Nhóm nghiên cứu chứng minh được gen rugose có khả năng tương tác với phức hệ EGFR và North trong nhiều con đường tín hiệu, đóng vai trò trung gian trong quá trình truyền tin giữa các con đường tín hiệu với nhau Theo đó, đột biến mất chức năng của gen rugose làm giảm khả năng vận động gây nên bất thưởng trong cấu trúc và kiểu hình thần kinh của ấu trùng ruồi giấm Những cá thể trưởng thành mang đột biến cũng bị ảnh hưởng đến tập tính, cường độ hoạt động và hành vi tương tác xã hội [58] Do tính đặc tính của ruồi giấm đột biến gen rugose tương đồng với ASD trên bệnh nhân, mô hình ruồi giấm rugose đã được sử dụng làm mô hình tự kỷ thực nghiệm để nghiên cứu đặc điểm cơ chế bệnh sinh cũng như nghiên cứu sàng lọc phát triển thuốc điều trị

Hai chủng ruồi giấm Canton-S và Rugose được sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu (hoặc nguyên vật liệu)

2.1.1.1 Nguồn gốc Đối tượng nghiên cứu là cao Rau má Rau má được thu hái ở Hải Phòng vào tháng 4/2023, được giám định đúng tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urban (ký hiệu là CA) bởi Trung tâm Tài nguyên, Viện Dược liệu Dược liệu thu hái toàn cây được phơi khô, sau đó nghiền thành bột thô để chiết cao phục vụ cho nghiên cứu

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Quy trình chiết cao chiết nước Rau má được tiến hành tại Khoa Chiết xuất, Viện Dược liệu Quy trình chiết xuất được mô tả tóm tắt như sau: Chiết 66 g mẫu trong 2.25

L nước hồi lưu trong 2 h ở 70℃ thu được 13,226 g cao, hàm ẩm 4,65%

2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu

Chủng Rugose là ruồi giấm mang gen rugose bị đột biến với mã số FBst0009801-

CG44835 có đột biến ở vị trí: X:5085759 5254864 được sử dụng làm mô hình bệnh tự kỷ Chủng ruồi giấm hoang dại Canton-S với mã số FBst0064349 được sử dụng làm nhóm chứng sinh lý Cả 2 chủng ruồi giấm được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản và ở điều kiện phòng thí nghiệm nhiệt độ 25 ± 1 o C, độ ẩm 50%, chu kỳ sáng - tối 12 giờ (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ

2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

8 Sữa bột nguyên kem Việt nam

10 Ether Xilong ChemicalCo, Trung quốc

12 Kháng thể nguyên phát kháng Tyrosine hydroxylase ((#AB152) EMD Millipore, Nhật Bản

13 Kháng thể thứ phát gắn chất phát huỳnh quang Alexa 488 ((#A-11008) Invitrogen, Nhật Bản

14 Huyết thanh dê (serum) (#S-1000) Vector Laboratories, Nhật Bản

15 Paraformaldehyd 4% trong PBS (PFA) Sigma-Aldrich, St Louis,

17 Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm

- Dụng cụ, thiết bị: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu

STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc

1 Buồng tam giác và kính Việt Nam

2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung Quốc

3 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ

4 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng

6 Đĩa petri 90 mm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ

7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản

8 Kính hiển vi soi nổi Olympus, Nhật Bản

9 Lò vi sóng Electrolux, Thụy Điển

11 Máy quay phim Canon, Nhật Bản

13 Miếng lót mềm Việt Nam

14 Ống chứa mùi Corning, Mỹ

16 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus, Nhật Bản

17 Một số dụng cụ, thiết bị khác

Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu được mô tả trong hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.2.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu

Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái (1:1) các cặp ruồi bố mẹ chủng rugose để tạo dòng ruồi tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý Chủng ruồi lai tạo được chia thành các nhóm như sau:

- Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản

- Nhóm bệnh lý: Ruồi bố mẹ chủng rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản

Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm Tất cả các ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1°C với chu kì 12 giờ sáng – 12 giờ tối (sáng từ

07 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn sáng từ 9 giờ đến 18 giờ Thành phần cho 500 ml thức ăn ruồi giấm được trình bày ở phần phụ lục

Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu :

- Đối với ấu trùng: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2 - 3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển

21 toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Tiến hành thu ấu trùng giai đoạn thích hợp cho thí nghiệm

- Đối với ruồi trưởng thành: Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu Để ruồi đẻ trứng (2 - 3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ ra khỏi ống thức ăn sang ống mới Với ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu nghiên cứu sẽ không sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Ruồi bố mẹ đã ăn thức ăn chứa mẫu thì sử dụng lặp lại trong 4 - 6 ngày (tức 1 -

2 lần chuyển) Ấu trùng nở và đóng kén trong 6 - 8 ngày, theo dõi ngày nở của kén, thu ruồi nở trong ngày xác định (sai khác 1 ngày) Ruồi nở được chuyển sang ống chứa thức ăn có mẫu nghiên cứu mới Để ruồi ăn thức ăn chứa mẫu 3 ngày Sau đó tiến hành thí nghiệm

- Chia ruồi trưởng thành đã thu được ở trên làm ít nhất 03 lô nghiên cứu:

Lô 1: Nhóm chứng sinh lý sử dụng chủng Canton-S + nuôi trong ống thức ăn chuẩn

Lô 2: Nhóm chứng bệnh lý sử dụng chủng rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn

Lô 3, 4, 5: Nhóm ruồi rugose + nuôi trong ống thức ăn chứa cao CA (cao chiết được hòa tan trong nước, sau đó trộn đều vào thức ăn chuẩn để được 20 ml thức ăn có nồng độ cao là 1, 2 và 4 mg/ml)

Lô 6: Nhóm ruồi rugose + nuôi trong ống thức ăn chứa methylphenidate nồng độ

Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái 1:1 để nhân số lượng ruồi để chuẩn bị chia thành các lô thí nghiệm: Để ruồi đẻ trứng (2 - 3 ngày) trong ống thức ăn, sau đó chuyển toàn bộ ruồi bố mẹ sang ống thức ăn mới Trứng sau khi nở thành ấu trùng bậc 3 từ 3 – 4 ngày sẽ được đem làm các thí nghiệm hoặc nở thành ruồi trưởng thành làm các thí nghiệm tương ứng

2.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Hành vi tương tác cộng đồng là yếu tố quan trọng đánh giá khả năng điều trị bệnh tự kỷ của dược liệu Do đó dựa trên mô hình đánh giá được tiến hành theo mô tả trước đây của tác giả Simon (2012) và Ueoka (2019) [52, 60], chúng tôi tiến hành đánh giá cải thiện tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose được điều trị bằng cao

Hình 2.2 Hình ảnh mô phỏng thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm [43]

Buồng đánh giá có dạng hình tam giác cân bằng nhựa (có chiều dài các cạnh tam giác là 15,2 cm) dày 0,5 cm được đậy chặt bởi 2 tấm kính vuông (có kích thước 18 cm x 18 cm) cho phép ruồi hoạt động trong không gian hai chiều (Hình 2.2) Ruồi mới nở được phân con đực và con cái riêng và chuyển vào các ống có thức ăn cơ bản/ mẫu nghiên cứu với số lượng (40 - 45 con/ ống) và nuôi trong 3 - 4 ngày, tới ngày thí nghiệm ruồi được gây mê và chuyển vào buồng tam giác (thời gian thí nghiệm sau 3 -

4 tiếng bắt đầu chu kì sáng) Sau đó, buồng tam giác được đóng lại bằng 2 phiến kính Để buồng đếm dựng đứng, đợi ruồi tỉnh và tương tác với nhau trong 20 - 30 phút Ghi lại kết quả bằng chụp ảnh Xử lý hình ảnh bằng phần mềm ImageJ

Tiêu chí đánh giá: Khoảng cách của mỗi con ruồi với con ruồi gần nó nhất Thiết kế mô hình thành công khi khoảng cách ở lô bệnh lý lớn hơn lô sinh lý với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê Các lô điều trị có tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ khi khoảng cách của lô mẫu thử nhỏ hơn lô bệnh lý với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê Số lần lặp lại là 6 lần, tổng số ruồi giấm cho mỗi nhóm là 240 con/ nhóm

2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với trí nhớ ngắn hạn trên mô hình ruồi giấm đột biến rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Mô hình đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm là một trong những thử nghiệm được sử dụng để đánh giá khả năng học tập của Drosophila ASD [61, 62] Phương pháp tiến hành:

Chuẩn bị pha thạch: đĩa petri X chứa 1,5% thạch agar và đường sucrose 2M Đĩa petri

Y chứa 1,5 % thạch agar và không có đường

- Lấy 10 àl dung dịch mựi octanol cho vào ống đựng mựi Đặt là mựi OCT

- Pha loóng dung dịch mựi n-amyl acetat với parafin (1:50), lấy 10 àl dịch pha loãng này cho vào các ống mùi còn lại Đặt là mùi AM

- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi

- Chuẩn bị ấu trùng: Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi còn ở dưới thức ăn, rửa sạch thức ăn còn bám trên ấu trùng

- Đặt ống đựng mùi AM (n-amyl acetat) lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút

- Lấy những ấu trùng đã rửa sạch ở trên cho vào đĩa X, cho chúng làm quen với mùi AM và môi trường đĩa X có đường trong thạch trong 5 phút

- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT (mùi còn lại) vào đĩa Y, đậy nắp để yên trong 1 phút

- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y không có đường trong thạch trong 5 phút

- Lặp lại quá trình trên 3 lần

- Đến phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, tiến hành đặt ống mùi vào 3 đĩa test Đặt mùi AM lên 1 bên trên đĩa test (đã kẻ sẵn vạch ở giữa), đặt mùi OCT lên bên còn lại của đĩa test, đậy nắp và để yên trong 1 phút

- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test và tiến hành kiểm tra trong 3 phút

- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên, phía mùi AM và OCT, ghi nhận kết quả

- Quá trình được tiến hành nhiều lần, để hạn chế sai số tiến hành kết hợp mùi

AM với đĩa X, mùi OCT với đĩa Y; lần kế tiếp làm ngược lại với mùi OCT đĩa X và mùi AM đĩa Y

- Các ấu trùng khi cho vào đĩa thạch, được đặt vào khoảng chính giữa đĩa thạch đã kẻ từ trước Thí nghiệm được bố trí như Hình 2.3

Hình 2.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm

X: đĩa thạch argar có đường, Y: đĩa thạch argar không đường

PREF AM =Số ấu trùng bên AM − Số ấu trùng bên OCT

PREF OCT =Số ấu trùng bên OCT − Số ấu trùng bên AM

LI = PREF AM + PREF OCT

2 Trong đó: PREFAM là chỉ số ưu tiên AM

PREFOCT là chỉ số ưu tiên OCT

LI là chỉ số học tập (Learning Index)

LI > 0 cho thấy ấu trùng có khả năng học tập hay ghi nhớ

LI ~0 cho thấy ấu trùng không có khả năng học tập hay ghi nhớ

LI < 0 cho thấy mùi gây khó chịu cho ruồi giấm

Kết quả của thí nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm

2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh của cao CA trên mô hình ruồi giấm

3.1.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với hành vi tương tác cộng đồng trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Tính cộng động là yếu tố thiết yếu cơ bản của động vật có tập tính sống bầy đàn, được tìm thấy phổ biến từ sinh vật nhỏ bé như ruồi giấm cho đến động vật có vú, bao gồm cả con người Suy giảm khả năng hoạt động cộng đồng là yếu tố đầu tiên đặc trưng để nhận biết bệnh lý tự kỷ Do vậy, thử nghiệm này là tiêu chí quan trọng để nghiên cứu chẩn đoán bệnh cũng như sàng lọc cao chiết có tác dụng điều trị tự kỷ Trong thử nghiệm này, hành vi tương tác cộng đồng được đánh giá trên ruồi giấm trưởng thành ở giai đoạn

3 ngày tuổi Ruồi được phân đực cái riêng thành các lô tương ứng với các cao CA Mỗi cao CA được đánh giá trên ba nồng độ 1 mg/ml, 2 mg/ml và 4 mg/ml Thí nghiệm được tiến hành song song với nhóm ruồi hoang dại Canton-S (nhóm chứng sinh lý) Ruồi được chuyển vào các buồng tam giác để cho tự do vận động trong 30 phút, sau đó chụp lại và xác định khoảng cách của mỗi con đến con gần nó nhất Kết quả được thể hiện trong hình 3.1

Hình 3.1 Ảnh hưởng của cao CA (CA) và methylphenidate đối với khả năng tương tác cộng đồng của ruồi rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

A: Hình ảnh ruồi rugose vận động tự do trong buồng tam giác, B: Biểu đồ cột

(n = 150 - 160 ruồi giấm/ nhóm; *** p < 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý,

### p < 0,001 khi so sánh giữa các lô cao CA; ns: không có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô

• Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại

• Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• CA-1, - 2, - 4 (lô thử): ruồi tự kỷ được điều trị bằng cao CA với mức liều 1, 2 và

• MPH: ruồi tự kỷ được điều trị bằng methylphenidate với mức liều 10 g/ml

Kết quả ở hình 3.1 cho thấy ruồi Canton-S, ruồi được điều trị bằng cao CA nồng độ

1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml và methylphenidate có tác dụng cải thiện hành vi tương tác cộng đồng so với lô chứng bệnh lý Khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ruồi giấm của lô chứng sinh lý (Canton-S) gần hơn so với lô chứng bệnh lý (Rugose), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Ruồi giấm đột biến gen rugose sau khi điều trị bằng cao

CA (1, 2 và 4 mg/ml) hoặc methylphenidate (10 g/ml) đã làm giảm đáng kể khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ruồi so với lô chứng bệnh lý, sự khác biệt này đạt ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Trong ba lô điều trị bằng cao CA thì ở mức liều 2 mg/ml có tác dụng cải thiện hành vi tương tác xã hội tốt hơn so với 2 mức liều 1 và 4 mg/ml (khoảng cách giữa 2 cá thể ruồi giấm giảm 22% so với lô chứng bệnh lý, trong khi ở mức liều 1 và 4 mg/ml chỉ giảm 8% và 12,7% so với lô bệnh lý) Lô điều trị CA nồng độ 2 mg/ml có khoảng cách gần nhất giữa 2 cá thể nhỏ hơn đáng kể so với lô CA nồng độ 1 mg/ml với p < 0,001, tuy nhiên khi so với nồng độ 4 mg/ml có sự nhỏ hơn nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với trí nhớ ngắn hạn trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Thử nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi nhằm mục đích đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ của ruồi giấm đột biến gen rugose được điều trị cao CA Thí nghiệm được thực hiện qua giai đoạn luyện tập và giai đoạn kiểm tra Số lần lặp lại là 6 lần, tổng số ruồi giấm khoảng 21 - 24 con/ 1 lần/ 1 lô Mỗi cao chiết được đánh giá trên ba nồng độ 1 mg/ml, 2 mg/ml và 4 mg/ml Kết quả được tính theo chỉ số LI và được thể hiện trong hình 3.2 dưới đây

Hình 3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của cao CA và methylphenidate trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• (n = 21 - 24 Chỉ số học tập LI được biểu diễn bằng biểu đồ box-and-whisker plot, ** p < 0,01; *** p < 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý, ### p < 0,001 khi so sánh giữa các lô cao CA; ns: không có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô so sánh)

• Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại

• Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• CA-1, -2, - 4 (lô thử): ruồi tự kỷ được điều trị bằng cao CA với mức liều 1, 2 và

• MPH: ruồi tự kỷ được điều trị bằng methylphenidate với mức liều 10 g/ml

Kết quả hình 3.2 cho thấy ruồi giấm chủng hoang dại (Canton-S) có điểm học tập LI cao hơn lô chứng bệnh lý (Rugose), khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 Ruồi chuyển gen rugose được điều trị bằng cao CA (1, 2 và 4 mg/ml) cho thấy sự cải thiện với điểm LI cao hơn so với lô chứng bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với giá trị p được chỉ ra trong hình 3.2 Methylphenidate (10 g/ml) được sử dụng làm đối chứng dương trong nghiên cứu này cũng thể hiện tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ ngắn hạn thông qua chỉ số học tập cao hơn so với lô chứng bệnh lý (p < 0,001)

3.1.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Trẻ mắc tự kỷ thưởng đi kèm với những rối loạn về giấc ngủ và thay đổi nhịp sinh học Nghiên cứu tiến hành theo dõi hoạt động thức ngủ của ruồi giấm trưởng thành để đánh giá tác dụng của cao CA đối với triệu chứng của bệnh tự kỷ Ruồi được chia thành 5 lô sau đó được theo dõi nhịp sinh học trong 7 ngày bằng máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikineties có gắn cảm biến kết nối với máy tính, thu được số lần ruồi di chuyển qua đèn laze cảm biến mỗi 30 phút Kết quả biểu diễn bởi giá trị MEAN ± SE

- Trục hoành biểu thị các mốc thời gian trong một ngày

- Trục tung biểu thị cường độ hoạt động của ruồi

Hình 3.3 Kết quả phân tích số lần hoạt động trong 7 ngày của ruồi giấm trưởng thành (n = 30 – 32, * p < 0,05 khi so sánh với lô chứng bệnh lý, ## p < 0,01 khi so sánh giữa các lô cao CA; ns: không có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô so sánh) Chú thích:

• Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại

• Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• CA-1, -2, - 4 (lô thử): ruồi tự kỷ được điều trị bằng cao CA với mức liều 1, 2 và

Từ kết quả trên, tổng số lần hoạt động trong 7 ngày ở lô bệnh lý (Rugose) thấp hơn lô sinh lý (Canton-S) với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Các lô điều trị có tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ khi số lần hoạt động của lô mẫu thử lớn hơn lô bệnh lý Lô điều trị với cao CA nồng độ 2 mg/ml đã giúp tăng tổng số hoạt động so với nhóm bệnh lý khoảng 50% với p < 0,05 Còn cao CA nồng độ 4 mg/ml tuy tăng 24% so với nhóm bệnh lý nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nồng độ 1 mg/ml của cao Rau rau má chưa thể hiện tác dụng cải thiện khả năng hoạt động của ruồi so với lô bệnh lý (p > 0,05) Lô điều trị CA nồng độ 2 mg/ml có số lần hoạt động lớn hơn đáng kể so với lô CA nồng độ 1 mg/ml với p < 0,01, tuy nhiên khi so với nồng độ 4 mg/ml có sự cao hơn nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05

3.1.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao CA đối với khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Cải thiện tốc độ di chuyển là một tiêu chí đánh giá hiệu quả tác dụng của thuốc lên chức năng vận động của ấu trùng ruồi giấm Thử nghiệm được thực hiện bằng cách đo quãng đường di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trong 45 giây, qua đó tính được tốc độ trung bình của ấu trùng ruồi giấm Thử nghiệm được tiến hành lặp lại 8 lần Tổng số ấu trùng ruồi giấm là 4 con/ 1 lần Tốc độ di chuyển của ấu trùng ruồi giấm sẽ được thể hiện trong hình 3.4

Hình 3.4 Ảnh hưởng của cao CA (1, 2 và 4 mg/ml) và methylphenidate đối với tốc độ di chuyển của ấu trùng bậc 3 ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

A: Hình ảnh quãng đường di chuyển của ấu trùng ruồi giấm, B: Biểu đồ cột

** p < 0,01; *** p < 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý n = 30 – 32 ấu trùng/ nhóm thí nghiệm, ns: không có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô so sánh

• Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại

• Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• CA-1, - 2, - 4 (lô thử): ruồi tự kỷ được điều trị bằng cao CA với mức liều 1, 2 và

• MPH: ruồi tự kỷ được điều trị bằng methylphenidate với mức liều 10 g/ml

Kết quả được thể hiện trong hình 3.4 cho thấy lô ấu trùng ruồi giấm sinh lý (Canton-

Đánh giá sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang

CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang

Tyrosine hydroxylase là một enzym đóng vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển L-tyrosine thành L-DOPA, tiền chất của dopamin TH chỉ biểu hiện ở tế bào thần kinh sản sinh dopamin nên được sử dụng làm marker nhận diện cho nhóm tế bào này Số lượng tế bào có chứa tyrosine hydroxylase hiện huỳnh quang là tiêu chí đánh giá cho mức độ biểu hiện sự thay đổi tyrosine hydroxylase có trong não ấu trùng ruồi giấm Mục đích của nghiên cứu là đánh giá được tác động của cao CA lên hệ dopaminergic Kết quả được trình bày bằng hình ảnh và biểu đồ cột được thể hiện giá trị MEAN ± SE

Hình 3.5 Kết quả số lượng tế bào chứa tyrosine hydroxylase có trong não ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

(A): Hình ảnh của tế bào chứa tyrosine hydroxylase có trong não ấu trùng ruồi giấm khi nhìn dưới kính hiển vi huỳnh quang ở vật kính 20X; (B): Biểu đồ số lượng tế bào chứa tyrosine hydroxylase có trong não ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh kiểu hình tự kỷ

* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý; ### p < 0,001 khi so sánh giữa các lô cao CA; ns: không có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô so sánh Chú thích:

• Canton-S (lô chứng sinh lý): ruồi giấm chủng hoang dại

• Rugose (lô chứng bệnh lý): ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

• CA-1,- 2, - 4 (lô thử): ruồi tự kỷ được điều trị bằng cao CA với mức liều 1, 2 và

• MPH: ruồi tự kỷ được điều trị bằng methylphenidate với mức liều 10 g/ml

Từ kết quả hình 3.5, ta thấy được rằng số lượng tế bào chứa tyrosine hydroxylase của lô chứng bệnh lý có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (Canton-

S) với p < 0,05 Lô điều trị với cao CA nồng độ 2 mg/ml và lô sử dụng chứng dương

37 methylphenidate có số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase nhiều hơn khoảng 44% và 52% so với lô chứng bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê lần lượt là p < 0,05 và p < 0,001 Lô điều trị với cao CA nồng độ 4 mg/ml mặc dù có tăng số lượng tế bào chứa tyrosine hydroxylase khoảng 19% so với lô chứng bệnh lý nhưng sự khác biệt chưa đạt được ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Lô điều trị với cao CA nồng độ 1 mg/ml có số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase giảm rõ rệt khoảng 48% so với lô chứng bệnh lý, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 Lô điều trị CA nồng độ 2 mg/ml có số lượng tế bào nhiều hơn đáng kể so với lô CA nồng độ 1 mg/ml với p < 0,001, tuy nhiên khi so với nồng độ 4 mg/ml có sự cao hơn nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

BÀN LUẬN

Về kết quả nghiên cứu

4.2.1 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Khiếm khuyết về hành vi giao tiếp xã hội là một trong những đặc trưng của người mắc ASD Để đánh giá tác dụng cải thiện triệu chứng của cao CA, chúng tôi thực hiện mô hình đánh giá khả năng tương tác cộng đồng trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Nghiên cứu của Simon và cộng sự [69] cho thấy sự khác biệt giới tính không ảnh hưởng đến hành vi tương tác cộng đồng trên ruồi Vì vậy, chúng tôi thống kê dữ liệu trên cả quần thể bao gồm ruồi đực và ruồi cái Tuy nhiên, để giảm ảnh hưởng của tương tác giới tính, ví dụ như giao phối, đến mô hình hành vi, chúng tôi thực hiện thí nghiệm trên từng nhóm ruồi đực và ruồi cái riêng rẽ

Hình ảnh phân bố quần thể ruồi trong không gian và chỉ số khoảng cách đến con ruồi gần nhất trong hình 3.1 cho thấy lô chứng bệnh lý, điều này chứng tỏ mô hình ruồi giấm gây đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ thành công trên cải thiện hành vi tương tác cộng đồng Các cá thể ở nhóm bệnh chứng đứng riêng lẻ và rải rác trong không gian, ít di chuyển thành từng đám giống như ở nhóm ruồi giấm chủng hoang dại Minh chứng cho điều này là khoảng cách gần nhất giữa hai cá thể ở nhóm ruồi đột biến gen rugose cao hơn so với nhóm ruồi giấm chủng hoang dại Kết quả này phù hợp với các kết quả đã được công bố trên thế giới [69], [58], cũng như các công bố của nhóm tác giả Phạm Thị Nguyệt Hằng (2021) [22] và sự khác biệt khoảng cách giữa các cá thể là do tương tác cộng đồng chứ không phải phân bố ngẫu nhiên [69] Ở các lô điều trị cho thấy cao CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml làm giảm khoảng cách ngắn nhất giữa hai cá thể ruồi giấm đột biến gen rugose với sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê p < 0,001

Như vậy, việc sử dụng cao CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml đều có tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng ở ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ Chính vì thế, chúng tôi tiếp tục đánh giá các mô hình tiếp theo trên cao chiết này

4.2.2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Sự thiếu hụt về khả năng học tập và ghi nhớ được ghi nhận ở một số nhóm trẻ em mắc ASD Chúng tôi sử dụng mô hình đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm (Odor – taste learning) nhằm đánh giá hiệu quả tác dụng của cao

CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml lên khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng khả năng ghi nhớ mùi ở lô bệnh lý rugose kém hơn hẳn so với lô chứng sinh lý Canton-S có ý nghĩa thống kê với p < 0,01, cho thấy mô hình phù hợp để đánh giá tác dụng điều trị của mẫu nghiên cứu

Kết quả cao CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml cho thấy tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ với chỉ số học tập ở ba nhóm ruồi này tăng lên so với ruồi tự kỷ (16,4%, 34,8%, và 14,9%) Trong nghiên cứu của tác giả Volder cũng chỉ ra học tập ghi nhớ mùi trên ruồi giấm liên quan trực tiếp tới tế bào Kenyo, hình thành cấu trúc hình thái vùng MB (Mushroom body) thuộc thần kinh trung ương (CNS) của ruồi giấm [70] Điều này gợi ý cho đích tác dụng của cao CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml trên cấu trúc của MB thuộc hệ thần kinh trung ương, tuy nhiên vẫn cần nghiên cứu sâu hơn để khẳng định chính xác Theo kết quả hình 3.2 cho thấy, lô điều trị bệnh bằng cao CA ở nồng độ 2, 4 mg/ml có tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ tốt hơn so với nồng độ 1 mg/ml (p < 0,05) và nồng độ 2 mg/ml có xu hướng tác dụng cải thiện khả năng ghi nhớ cao hơn nồng độ 4 mg/ml do chỉ số học tập LI cao nhất với 34,8%

4.2.3 Đánh giá tác dụng của cao CA đối với nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Sự thay đổi trong nhịp sinh học thường được báo cáo ở các trẻ mang kiểu hình bệnh tự kỷ [39, 71] Nghiên cứu trên mô hình D melanogaster, theo dõi nhịp sinh học thường được tiến hành trên ruồi đực thay vì ruồi cái vì hoạt động đẻ trứng sẽ ảnh hưởng đến việc đo lường hoạt động vận động thực sự của chúng [72]

Từ kết quả đã cho thấy sự thay đổi trong cường độ hoạt động của ruồi giấm Ruồi tự kỷ có xu hướng giảm hoạt động trong ngày Ruồi bình thường có xu hướng tăng động tại nhiều thời điểm trong ngày Xét trên trẻ tự kỷ cũng cho thấy kết quả tương đồng khi mà tổng thời gian ngủ của trẻ tự kỷ nhiều hơn so với trẻ bình thường trong các nghiên

Ngoài ra, kết quả xác định nhịp sinh học cũng cho thấy ruồi hoạt động chủ yếu vào hai thời điểm trong ngày tương ứng với hai đỉnh cường độ tín hiệu cao nhất là đỉnh hoạt động ban ngày (morning peak) với khoảng thời gian từ 8h – 10h sáng và đỉnh hoạt động ban đêm (evening peak) – tương ứng với thời gian từ 20h – 21h Theo đó, nhịp thức - ngủ của ruồi giấm điều trị bằng cao CA cũng bị thay đổi khi so sánh với ruồi giấm ở nhóm chứng Theo kết quả hình 3.3, ruồi giấm đột biến gen rugose được sử dụng cao

CA nồng độ 2 mg/ml đã giúp tăng tổng số hoạt động so với nhóm bệnh lý khoảng 50% (p < 0,05) Cao CA nồng độ 4 mg/ml tuy tăng 24% so với nhóm bệnh lý nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nồng độ 1 mg/ml của cao CA làm giảm tổng số lần hoạt động so với lô bệnh lý với p > 0,05 Điều này chứng tỏ lô điều trị bằng cao CA ở nồng độ 2 mg/ml có tác dụng tốt hơn cao CA 1 mg/ml khi có số lần hoạt động cao hơn đáng kể (p < 0,001)

4.2.4 Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động của cao CA trên ấu trùng ruồi giấm đột biến rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

Trong khi các đặc điểm nổi bật nhất của ASD liên quan đến suy giảm giao tiếp xã hội và tương tác, bằng chứng cho thấy trẻ mắc ASD cũng có một loạt các khiếm khuyết về vận động [9] Sự cải thiện tốc độ di chuyển là một tiêu chí nhằm đánh giá hiệu quả tác dụng của dược liệu lên chức năng vận động của ruồi giấm

Kết quả hình 3.4 chỉ ra rằng ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ có tốc độ bò chậm hơn so với ruồi giấm chủng hoang dại Ngoài ra, quan sát trong quá trình thực nghiệm cho thấy ruồi giấm mang gen đột biến có xu hướng di chuyển cuộn tròn, ít tuyến tính so với đường đi của nhóm ruồi sinh lý Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó của Wise và cộng sự [58] Sự khác biệt giữa lô chứng sinh lý và lô chứng bệnh lý cho thấy đây là mô hình phù hợp để đánh giá tác dụng của cao CA

Cao CA ở nồng độ 1, 2 và 4 mg/ml cho thấy tốc độ vận động cải thiện hơn so với lô chứng bệnh (khoảng 47%, 36% và 41%) với p < 0,001 Từ đó, cao CA có tác động làm cải thiện hành vi vận động trên mô hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ

4.2.5 Đánh giá sự thay đổi số lượng tế bào biểu hiện tyrosine hydroxylase của cao

CA trên ruồi giấm đột biến gen rugose mang kiểu hình bệnh tự kỷ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang

Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một nhóm các rối loạn được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng giao tiếp xã hội và các hành vi lặp đi lặp lại và rập khuôn Có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rối loạn phổ tự kỷ có liên quan đến rối loạn chức năng dopaminergic