TỔNG QUAN
Tổng quan về viêm
Viêm là phản ứng bảo vệ không đặc hiệu của mô để loại trừ tác nhân gây viêm và loại bỏ những thành phần của mô bị tổn thương [11]; ngăn cản sự lây lan rộng của tác nhân gây viêm và hồi phục sửa chữa mô tổn thương [3], [91] Viêm là một phản ứng phức tạp của các mô liên kết và tuần hoàn mao mạch ở nơi bị tác động, biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn chức năng [3]
Như vậy, viêm vừa là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng cơ quan… có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [3]
Phản ứng viêm hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể chia thành hai nhóm là nguyên nhân bên ngoài và nguyên nhân bên trong [3]
Nguyên nhân bên ngoài: tác nhân sinh học là nguyên nhân phổ biến nhất Virus, vi khuẩn, ký sinh trùng đơn bào, đa bào hay nấm tác động thông qua các độc tố, các sản phẩm chuyển hóa Tác nhân cơ học: từ sây sát nhẹ tới chấn thương nặng… gây phá hủy tế bào và mô, làm phóng thích ra những chất gây viêm nội sinh Tác nhân vật lý như: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hóa protid tế bào gây tổn thương enzym, tia xạ (UV, tia X) do tạo ra các gốc tự do gây phá hủy một số enzym oxy hóa, gây tổn thương ADN Tác nhân hoá học bao gồm: các acid, kiềm mạnh, các chất hoá học khác (thuốc trừ sâu, các độc tố…) gây hủy hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym chủ yếu
Nguyên nhân bên trong có thể gặp như thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (tắc mạch), phản ứng miễn dịch kháng nguyên – kháng thể (viêm cầu thận, viêm trong hiện tượng Arthus)
Viêm có thể phân loại theo nhiều cách: theo nguyên nhân (viêm nhiễm khuẩn, viêm vô khuẩn), theo vị trí (viêm nông, viêm sâu), theo dịch rỉ viêm (viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ…), theo tính chất (viêm đặc hiệu và viêm không đặc hiệu), theo diễn biến (viêm cấp, viêm mạn) Viêm được phân thành viêm cấp tính hay viêm mạn tính phụ thuộc vào sự tồn tại của tổn thương, những triệu chứng lâm sàng và bản chất của phản ứng viêm được thể hiện ở Bảng 1.1
Bảng 1.1: Viêm cấp và viêm mạn Đặc điểm Viêm cấp Viêm mạn
Ngay lập tức Kéo dài vài phút đến vài ngày Kéo dài nhiều ngày đến nhiều năm Các tế bào chính tham gia
Bạch cầu trung tính Đại thực bào, tế bào lympho
Các chất trung gian hóa học
Serotonin, histamin, PG đặc biệt,
Cytokin tiền viêm: IL-1, IL-12, NF-κB, TNF-α, IFN-γ, LOX,
Nhồi máu, nhiễm khuẩn, độc tố, chấn thương
Bệnh tự miễn, nhiễm virus, nhiễm khuẩn mạn tính, chấn thương kéo dài, viêm cấp dai dẳng Đặc trưng
Sự tiết dịch và các thành phần huyết tương và sự di chuyển của bạch cầu (chủ yếu là bạch cầu trung tính) vào trong các mô ngoại mạch
Sự tích tụ và kích hoạt của các tế bào lympho và đại thực bào, tăng sinh mạch máu, xơ hoá và hoại tử mô
Tiêu viêm Hình thành mủ (áp xe) Hình thành sẹo Tiến triển thành viêm mạn
Xơ hóa Phá hủy mô
1.1.4 Diễn biến cơ bản của phản ứng viêm
Những rối loạn chủ yếu của viêm bao gồm 4 biến đổi đồng thời tồn tại và liên quan chặt chẽ với nhau: (1) rối loạn tuần hoàn; (2) rối loạn chuyển hóa; (3) tổn thương mô và (4) tăng sinh tế bào làm lành vết thương [3]
(1) Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm có 4 hiện tượng chính:
Giai đoạn phản ứng mạch máu:
❖ Rối loạn vận mạch: ngay khi yếu tố gây viêm tác động, tại ổ viêm xảy ra hiện tượng co mạch chớp nhoáng (sớm và rất ngắn) Ngay sau đó là giãn các mạch máu theo thứ tự từ các tiểu động mạch, mao mạch rồi đến tiểu tĩnh mạch gây sung huyết động mạch, sung huyết tĩnh mạch và ứ máu Sự giãn mạch dẫn đến thay đổi cấu trúc vi tuần hoàn, tăng tuần hoàn tại chỗ gây nên các triệu chứng sưng, nóng và đỏ còn đau xuất hiện (muộn hơn) do các chất trung gian và bạch cầu thực bào
❖ Tạo dịch rỉ viêm: phản ứng tuần hoàn quá mạnh gây tăng tính thấm thành mạch cho phép protein huyết tương thoát khỏi mạch, bạch cầu xuyên mạch xuất hiện ở nơi viêm; tạo ra dịch rỉ viêm gồm nước, protein huyết tương, các thành phần hữu hình của máu (chủ yếu là bạch cầu), các chất do rối loạn chuyển hóa và tổn thương mô (chất trung
5 gian hóa học, bradykinin, cytokin, enzym…) Dịch rỉ viêm có tính chất bảo vệ, nhưng nếu lượng quá nhiều sẽ gây chèn ép mô xung quanh gây đau nhức, hoặc hạn chế hoạt động của các cơ quan
Giai đoạn phản ứng tế bào: là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể, trong đó bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xảy ra kế tiếp:
❖ Bạch cầu xuyên mạch: bạch cầu có khả năng tiếp cận, lăn, bám dính nội mô thành mạch sau đó thoát mạch tới ổ viêm là nhờ vai trò của đại thực bào, các chất hóa ứng động bạch cầu, phân tử kết dính trên bạch cầu và tế bào nội mô (như selectin, integrin) Phụ thuộc vào bản chất tác nhân gây viêm, loại viêm mà loại bạch cầu tại ổ viêm cũng khác nhau
❖ Bạch cầu thực bào: bạch cầu tập trung ở ổ viêm, vươn chân giả tới quanh đối tượng thực bào, bọc kín chúng, hình thành hốc thực bào (phagosom) Sau đó lysosom tiến tới hòa màng để tạo ra tiểu thể chung phagolysosom, giải phóng vào đó các chất trong lysosom để tiêu hủy đối tượng theo cơ chế phụ thuộc oxy (nhờ quá trình oxy hóa của NADPH oxydase, myeloperoxydase (MPO) và NO-synthetase) và không phụ thuộc oxy (nhờ các enzym trong lysosom)
(2) Rối loạn chuyển hóa: tại ổ viêm quá trình oxy hóa tăng làm tăng nhu cầu oxy, nhưng sự sung huyết động mạch chưa đáp ứng kịp, dẫn đến pH giảm (khi bắt đầu chuyển sang giai đoạn sung huyết tĩnh mạch), từ đó kéo theo hàng loạt những rồi loạn chuyển hóa của glucid, lipid, protid
(3) Tổn thương mô: bao gồm các tổn thương tiên phát do nguyên nhân ban đầu và tổn thương thứ phát do đáp ứng viêm tạo ra
(4) Tăng sinh tế bào làm lành vết thương: viêm bắt đầu bằng tổn thương và kết thúc bằng quá trình tái tạo Ngay trong giai đoạn đầu đã có sự tăng sinh tế bào, nhưng càng về cuối sự tăng sinh này vượt mức hoại tử khiến ổ viêm được sửa chữa Mô xơ và các mạch máu mới là cơ sở hình thành sẹo thay thế cho mô tổn thương, làm lành vết thương
1.1.5 Các tế bào tham gia phản ứng viêm
Phản ứng viêm liên quan đến một mạng lưới phối hợp chặt chẽ của nhiều loại tế bào, bao gồm:
Bình thường, các tế bào nội mô phủ mặt trong tất cả các huyết quản, giúp duy trì tính lưu động của máu, điều hòa lưu lượng máu, kiểm soát tính thấm thành mạch, làm ngừng dòng tuần hoàn bạch cầu [74] và tạo thành hàng rào đầu tiên giữa các thành phần máu và mô đệm
Một số mô hình dược lý thực nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm
Dựa trên những hiểu biết về nguyên nhân gây viêm, tiến triển của phản ứng viêm, triệu chứng lâm sàng của viêm, người ta tạo ra các mô hình viêm thực nghiệm dùng để nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc Các mô hình này có thể chia thành: mô hình gây viêm cấp, bán cấp và mô hình gây viêm mạn tính
1.2.1 Mô hình đánh giá tác dụng chống viêm cấp
1.2.1.1 Mô hình gây phù bàn chân chuột
Nguyên tắc : tác nhân gây viêm (carrageenan, kaolin, dextran, albumin trứng…) khi được tiêm vào bàn chân chuột sẽ kích thích giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, prostaglandin… gây giãn và tăng tính thấm thành mạch, gây phù bàn chân chuột [38], [41], [42], [72] Các thuốc có khả năng ức chế phù bàn chân chuột được coi là có tác dụng chống viêm
Cơ chế : quá trình viêm cấp sau khi tiêm carragenan tiến triển theo 2 pha Pha đầu
(0-2,5 giờ sau tiêm) liên quan đến việc giải phóng histamin, serotonin, các kinin gây phá hủy các mô xung quanh Pha thứ 2 (2,5-6 giờ sau tiêm) là quá trình enzym COX cảm ứng, sản xuất bradykinin, protease, prostaglandin, lysosom và các gốc tự do, đồng thời có sự xâm nhập và hoạt hóa bạch cầu trung tính [34], [41] Các PG có vai trò chính trong sự tiến triển của phản ứng viêm trong giai đoạn này, khi đó các biểu hiện của viêm và phù xuất hiện rõ nhất, đặc biệt trong 3-5 giờ sau gây viêm [21], [25]
Tiến hành: gây phù bàn chân sau của chuột bằng cách tiêm dưới da tác nhân gây viêm ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột Đo thể tích bàn chân sau tới khớp cổ chân chuột tại các thời điểm trước khi tiêm và sau khi tiêm chất gây viêm 1,3,5,7 và 24 giờ
Thông số đánh giá: mức độ tăng thể tích chân chuột (tỉ lệ phù chân chuột) và tỷ lệ
% giảm phù của lô thử so với lô chứng
Nhận xét: Ưu điểm: mô hình đơn giản, phổ biến nhất, dễ tiến hành, thời gian thực hiện nhanh, thường dùng để sàng lọc các thuốc chống viêm mới
Nhược điểm: kết quả có độ chính xác chưa cao do đo thể tích bàn chân chuột phụ thuộc vào yếu tố chủ quan của nghiên cứu viên thực hiện
1.2.1.2 Mô hình phù tai chuột bằng oxazolon
Nguyên tắc : mô hình gây phù tai chuột bằng oxazolon lần đầu tiên được mô tả bởi
Evans (1971) Đây là mô hình dựa trên phản ứng quá mẫn chậm của cơ thể gây ra bởi oxazolon, làm tăng tế bào lympho T CD8+, làm màng tế bào mast bị phá vỡ, giải phóng ra các chất trung gian hóa học gây phù Việc bôi oxazolon tại chỗ sẽ làm tăng các chất chuyển hóa acid arachidonic như prostaglandin và leukotrien trong mô [41], [42], [72]
Tiến hành : gây phù tai chuột bằng cách bôi vào bên trong tai phải chuột dung dịch oxazolon 2% trong aceton; tai trái giữ nguyên Sau 24 giờ gây viêm, gây mê chuột rồi đục một vòng tròn đường kính 8 mm ở cả hai tai, cân ngay
Thông số đánh giá : sự chênh lệch về trọng lượng là một chỉ số đánh giá phù trong viêm Tính tỷ lệ phần trăm tăng khối lượng của tai phải so với tai trái So sánh tỷ lệ phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng
Nhận xét: Ưu điểm: mô hình đơn giản, dễ thực hiện, thường dùng để đánh giá tác dụng chống viêm tại chỗ của thuốc, phù hợp để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc chống viêm steroid và không steroid
Nhược điểm: thời gian thực hiện dài hơn các mô hình gây viêm cấp khác
1.2.1.3 Mô hình gây tăng tính thấm mạch máu bởi acid acetic
Nguyên tắc: acid acetic kích thích giải phóng các chất trung gian gây viêm như histamin, serotonin, prostaglandin dẫn đến tăng tính thấm thành mạch Kết quả là dịch và protein huyết tương bị thoát ra gây phù [41], [72] Các thuốc có khả năng ức chế tăng tính thấm thành mạch sẽ có tác dụng giảm phù, chống viêm
Tiến hành: tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,2 mL dung dịch xanh Evans trong NaCl
0,9% sau 30 phút cho uống thuốc đối chiếu hoặc mẫu thử Sau 15 phút tiêm dung dịch xanh Evans, tiêm vào màng bụng dung dịch acid acetic/NaCl 0,9% Sau 30 phút tiêm acid acetic, gây mê và rửa khoang phúc mạc chuột bằng dung dịch NaCl 0,9% chứa heparin, ly tâm 3000 vòng trong 10 phút Dịch ly tâm được đo ở bước sóng 610 nm Tính thấm thành mạch được biểu thị bằng lượng xanh Evans thoát mạch vào khoang màng bụng
Thông số đánh giá: tỷ lệ phần trăm tăng lượng xanh Evans vào khoang phúc mạc Nhận xét: Ưu điểm: phù hợp để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của thuốc
Nhược điểm: tiêm acid axetic vào màng bụng có thể gây kích ứng nghiêm trọng
1.2.1.4 Mô hình gây viêm khớp cấp bằng carrageenan
Nguyên tắc: carrageenan là tác nhân gây viêm, khi tiêm carrageenan vào khớp gối chân chuột sẽ khởi động các quá trình viêm cấp, tập trung bạch cầu tại ổ viêm và kích thích giải phóng histamin, serotonin, prostaglandin… gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch dẫn tới phù, đau khớp gối Đỉnh viêm sẽ phát triển khoảng 3-4 giờ sau tiêm carrageenan, gây ra các phản ứng viêm gần giống như cơ chế bệnh sinh của viêm với các triệu chứng điển hình như sưng, nóng, đỏ, đau [10], [41].Thuốc làm giảm các triệu chứng viêm trên lâm sàng và xét nghiệm của chuột được coi là có tác dụng chống viêm
Tiến hành: tiêm carrageenan 2% vào khớp gối chân phải sau chuột Sau 4 giờ tiêm carrageenan tiến hành xử lý mẫu, ghi chép và đánh giá mức độ viêm và đau khớp
- Mức độ sưng vùng khớp gối: chênh lệch đường kính khớp gối trước và sau gây viêm và tỷ lệ phần trăm ức chế sưng vùng khớp gối của lô thử/chứng dương so với lô chứng bệnh
- Điểm mức độ viêm khớp
- Chỉ số huyết học: số lượng bạch cầu
Tổng quan về Andrographolid
1.3.1 Tổng quan sơ lược về Xuyên tâm liên
Xuyên tâm liên có tên khoa học là Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees thuộc họ Ô rô (Acanthaceae), hay còn có tên gọi khác là Công cộng, Hùng bút, Nguyên cộng, Lam khái liên, cây Lá đắng, Khô đảm thảo, Nhất kiến kỷ [13]
Bộ phận dùng của cây là phần trên mặt đất Hình ảnh cây Xuyên tâm liên được thể hiện ở Hình 1.1
Hình 1.1: Hình ảnh cây Xuyên tâm liên 1.3.1.1 Thành phần hóa học
Trong cây Xuyên tâm liên có chứa 2 nhóm hoạt chất chính là diterpen lacton và flavonoid [13], [15]
Diterpen lacton là nhóm hoạt chất đặc trưng và quan trọng nhất quyết định tác dụng của Xuyên tâm liên [13], [33] Trong đó, AG là thành phần diterpen lacton chính, hai diterpen lacton khác có mặt với hàm lượng thấp hơn là 14-deoxy-11,12- dedihydroandrographolid và neoandrographolid Ngoài ra, các diterpen khác cũng đã được phân lập từ Xuyên tâm liên như andrographisid, andrograpanin, 14- deoxyandrographolid…[15]
Các chất flavonoid phân lập được từ Xuyên tâm liên có cấu trúc đặc trưng cho chi
Andrographis, ít gặp ở các cây khác Hầu hết các flavonoid này có đặc điểm chung là gắn oxy ở vị trí C 2’ Một số flavonoid phân lập từ Xuyên tâm liên bao gồm andrographin, panicolin, apigenin 7,4’-di-O-methylether…[15]
Ngoài các nhóm chất trên, trong Xuyên tâm liên còn có β-sitosterol, eugenol, nhựa, đường, tinh bột [15]
1.3.1.2 Công dụng của Xuyên tâm liên trong y học cổ truyền
Theo y học cổ truyền, Xuyên tâm liên có vị rất đắng, tính hàn, quy vào 3 kinh phế, can, tỳ [12], [15], có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu thũng, giảm đau Lá và rễ Xuyên tâm liên được sử dụng làm thuốc y học cổ truyền đã nhiều thập kỷ ở châu Á và châu Âu để điều trị nhiều bệnh khác nhau
Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Xuyên tâm liên được dùng điều trị cảm cúm, sốt, viêm họng, viêm thanh quản, ho cấp tính hoặc mạn tính, mụn nhọt, rắn độc cắn Tại Ấn Độ và nhiều vùng Đông Nam Á, Trung Mỹ, cây dùng trị rắn cắn, sâu bọ cắn, phát ban, sốt… Nước sắc từ Xuyên tâm liên được dùng điều trị rối loạn kinh nguyệt, tăng huyết áp, bệnh gan Xuyên tâm liên cũng là thành phần trong thuốc chữa rụng tóc cổ truyền Ấn Độ và trị áp xe ở Nepal [15]
1.3.1.3 Tác dụng dược lý của Xuyên tâm liên a Tác dụng chống viêm, hạ sốt, giảm đau
Tại Trung Quốc, người ta đã báo cáo rằng cả 3 thành phần diterpen lacton của
Xuyên tâm liên đều có tác dụng chống viêm [52] Liu J., Wang Z T và cộng sự (2007) đã chứng minh neoandrographolid cũng ức chế sản xuất NO và TNF-α trong các đại thực bào do LPS gây ra, góp phần vào hoạt động chống viêm của A paniculata [54]
Sheeja và cộng sự đã nghiên cứu các đặc tính chống viêm của A paniculata in vitro và in vivo; họ phát hiện ra rằng việc sử dụng chiết xuất methanol từ A paniculata đã ngăn ngừa tình trạng viêm do carrageenan sử dụng so với động vật đối chứng [80] Tất cả các phát hiện đều chứng minh rằng A paniculata và các thành phần của nó có đặc tính chống viêm Đã có báo cáo rằng AG liều uống 100 mg/kg và 300 mg/kg, tạo ra tác dụng hạ sốt đáng kể sau 3 giờ dùng thuốc gây sốt do nấm men ở chuột [59] Ngoài ra, liều 180 mg/kg hoặc 360 mg/kg andrographolid cũng được cho là có tác dụng hạ sốt ở người vào ngày thứ ba sau khi dùng thuốc [85] Madav và cộng sự cũng đã báo cáo rằng với liều
300 mg/kg andrographolid dùng bằng đường uống, có tác dụng giảm đau đáng kể đối với cơn quằn quại do acetic gây ra ở chuột và trên thử nghiệm Randall-Selitto ở chuột, nhưng không có bất kỳ tác dụng nào đối với thử nghiệm tấm nóng ở chuột Các tác giả này cũng đã báo cáo rằng tiêm andrographolid 4 mg/kg trong màng bụng cho thấy tác dụng giảm đau, trong khi nghiên cứu trước đây, dùng đường uống 300 mg/kg thì không
Các đường dùng khác nhau giữa các thí nghiệm này có thể góp phần vào sự khác biệt này [59] b Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan
Một số nghiên cứu đã báo cáo hoạt động chống oxy hóa của A paniculata và các thành phần của nó Verma và Vinayak (2008) đã báo cáo rằng chiết xuất nước của A paniculata làm tăng đáng kể hoạt động của các enzyme bảo vệ chống oxy hóa như catalase, superoxid effutase và glutathione-S-transferase và làm giảm hàm lượng glutathion [89]
Hệ thống y học Ấn Độ từ lâu đã sử dụng A paniculata như một chất kích thích gan và tác nhân bảo vệ gan [87] Parthasarathy M., Prince S E.(2023) đã chứng minh việc điều trị bằng A paniculata ở chuột bị nhiễm độc methotrexat có hoạt tính bảo vệ gan thông qua khả năng tăng cường chất chống oxy hóa, bình thường hóa các dấu hiệu men gan, giảm các cytokin tiền viêm (TNF-α và IL-6), cải thiện tình trạng chống viêm (IL-10) và các dấu hiệu apoptotic (caspase-3), đồng thời tăng cường khả năng chống apoptosis [64], [71]
16 c Tác dụng điều hòa miễn dịch
Chiết xuất của Xuyên tâm liên và andrographolid được báo cáo là có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở chuột, được đo bằng chỉ số di chuyển của đại thực bào, khả năng thực bào của E.coli được đánh dấu bạch cầu và sự tăng sinh của tế bào lympho [14], [75] Cơ chế kích thích miễn dịch có liên quan tới hệ thống tế bào miễn dịch trong máu ngoại vi [77] Iruretagoyena và cộng sự đã báo cáo rằng andrographolid đã tăng cường các đặc tính dung nạp của các tế bào đuôi gai chưa trưởng thành (DC) trong bệnh viêm não tủy tự miễn thực nghiệm (EAE) bằng cách ức chế hoạt hóa NF- kappa B ở DC ở chuột [46].Hơn nữa, andrographolid đã được báo cáo là có tác dụng ức chế sản xuất TNF-α và IL-12 trong các đại thực bào được kích thích bởi lipopolysaccharid [76] d Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm và kí sinh trùng sốt rét
Tác dụng kháng virus là một trong những tác dụng nổi bật của Xuyên tâm liên Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng kháng virus sốt xuất huyết (DENV-1), virus herpes loại 1 (HSV-1), virus cúm A, HIV, virus viêm gan B [48] Ngoài ra, hiện nay một vài nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng của Xuyên tâm liên trong điều trị Covid-19 [45] Dịch chiết lá Xuyên tâm liên có hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis và Streptococcus aureus Dịch chiết ete dầu hỏa, axeton, cloroform và methanol từ lá và thân cây Xuyên tâm liên cho thấy tiềm năng kháng khuẩn đáng kể chống lại
Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris và Streptococcus pneumonia Chiết xuất của toàn cây được đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với 12 chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài da (chủng 7 gam dương tính: Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus biểu bì, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis, Micrococcus luteus, Enterococcus faecalis) và các chủng 5 gam âm tính: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonia, Neisseria meningitis, Pseudomonas aeruginosa) [23]…
Radha và cộng sự đã kiểm tra các chất chiết xuất từ ete dầu hỏa, aceton, cloroform và methanol của lá và thân cây Xuyên tâm liên cho thấy tác dụng ức chế sự phát triển nấm Aspergillus flavus (23,67± 0,88mm) Các nghiên cứu tương tự được thực hiện bởi Bobbarala cho thấy Xuyên tâm liên chống lại Alternaria Alternata, Aspergillus flavus,
Bipolaris bicolor, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum, Penicillium expansum, Rhizoctonia solani, Tiarosporella phaseolina và Ustilago maydis Xanthon được phân lập từ rễ cho thấy hoạt động kháng nguyên sinh chống lại Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi và Leishmania Infantum [14]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
Viên hoàn giọt andrographolid được sản xuất bởi công ty TNHH Dược phẩm Việt Hùng Chế phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng cơ sở Thành phần chính của chế phẩm là cao Xuyên tâm liên với hoạt chất chính là andrgrapholid
Quy trình bảo chế viên hoàn giọt andrographolid được thể hiện ở Phụ lục 1
Tiêu chuẩn cơ sở của viên hoàn giọt andrographolid được thể hiện ở Phụ lục 2
2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu và thiết kế liều nghiên cứu a Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Tiến hành cân viên hoàn giọt andrographolid với khối lượng phù hợp Nghiền mịn chế phẩm rồi phân tán trong dung dịch NaCMC 0,5% để thu được hỗn dịch có nồng độ phù hợp sử dụng cho từng nghiên cứu b Thiết kế mẫu liều thử
❖ Liều thử mô hình chống viêm của viên hoàn giọt andrographolid
Liều đánh giá tác dụng chống viêm cấp và chống viêm mạn của viên hoàn giọt andrographolid dựa trên tổng quan y văn [19], [20], [94] và kết quả nghiên cứu sàng lọc trước đó trên 3 mức liều 50 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg Do đó, chúng tôi lựa chọn
AG ở 2 mức liều 50 mg/kg và 100mg/kg để đánh giá tác dụng chống viêm của viên hoàn giọt andrographolid
❖ Liều thử mô hình độc tính bán trường diễn của andrographolid
Liều dùng cho nghiên cứu độc tính bán trường diễn là liều được gợi ý từ liều dùng trên người lớn 50 kg (1800 mg/ngày) Từ mức liều này, quy đổi thành các liều thử tương ứng trên thỏ theo công thức sau:
D: liều dùng trên thỏ (mg/kg)
K: hệ số quy đổi tương đương về liều (thỏ: K= 3) [1], [47], [65]
Do đó, liều thử độc tính bán trường diễn trên thỏ: 108 mg/kg (tương đương mức liều dùng trên người 1800 mg/ngày/người) và 324 mg/kg (tương đương mức liều dùng trên người 5400 mg/ngày/người)
Chuột nhắt trắng, cả 2 giống, chủng Swiss, khỏe mạnh, cân nặng 20-25g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp
Thỏ trắng New Zealand khỏe mạnh, cả 2 giống, khối lượng 2,5-3,0 kg
23 Động vật được nuôi ổn định trong điều kiện đầy đủ thức ăn tiêu chuẩn và nước uống tại phòng chăn nuôi, Trường Đại học Dược Hà Nội 5 ngày trước khi làm nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu; chuột được nuôi bằng thức ăn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, thỏ được nuôi dưỡng bằng thức ăn khô và rau củ
Natri clorid 0,9% (CT TNHH B Braun)
Heparin 5000UI/mL (Trittau, Germany)
Formaldehyd (Xilong Chemical Com., Ltd.)
Dexamethason 0,5mg (CT CPDP Hà Tây), SĐK: VD-20727-14
Bộ hóa chất phân tích huyết học (URIT) đạt tiêu chuẩn phân tích
Kali photphat, Acid clohydric, Natri hydroxid (Germany) đạt tiêu chuẩn phân tích Hexadecyltrimethyl ammoni bromid (HTAB, India, Code: 227161000)
Bộ KIT định lượng các thông số sinh hóa: creatinin, glucose, ASAT, ALAT, cholesterol, total bilirubin (Erba)
Cân phân tích (AND-GR185, Nhật)
Cân kĩ thuật (Precisa-BJ610C, TE 412, Sartorious)
Tủ sấy tĩnh (Memmert, Đức)
Máy ly tâm (HERMLE Z300, Đức)
Máy sinh hóa TC – 3300 Plus (Teco Diagnostics USA)
Máy ELISA (Varioskan LUX - Thermo Fisher Scientific)
Máy phân tích huyết học tự động Autohematology analyser URIT-3000 VET Plus
Nội dung nghiên cứu
Để giải quyết 2 mục tiêu đã đề ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu gồm hai nội dung:
Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống viêm cấp của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây viêm màng phổi bằng carrageenan và đánh giá tác dụng chống viêm mạn của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây u hạt bằng viên bông
Nội dung 2: Đánh giá độc tính tiền lâm sàng của viên hoàn giọt andrographolid gồm xác định độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và xác định độc tính bán trường diễn trên thỏ
Nội dung nghiên cứu chi tiết được thể hiện trong Hình 2.1
Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây viêm màng phổi bằng carrageenan
Tiêm carrageenan vào khoang màng phổi dẫn đến tổn thương phổi, viêm cục bộ và thâm nhiễm bạch cầu đa nhân Phản ứng cấp tính do carrageenan gây ra được đặc trưng bởi sự di chuyển và tích tụ dịch tiết màng phổi; sản xuất các chất trung gian gây viêm, bao gồm cytokin và chemokin, các sản phẩm kích hoạt bổ thể và protease; và sản xuất một lượng lớn các loại oxy phản ứng (ROS): hydro peroxid, superoxid và các gốc hydroxyl [40] Viêm màng phổi gây ra bởi carrageenan ở chuột là một mô hình gây viêm cấp Sự thoát dịch, sự di chuyển bạch cầu và các chỉ số sinh hóa khác liên quan tới phản ứng viêm có thể đo lường dễ dàng trong dịch rỉ viêm [41] Thuốc được coi là có tác dụng chống viêm nếu có tác dụng làm giảm sự di chuyển bạch cầu và các sản phẩm của quá trình tăng tính thấm trong dịch rỉ viêm [31], [34], [35], [41], [90]
Thiết kế thí nghiệm: chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 11 con
Lô 1 (chứng sinh lý): uống dung dịch NaCMC 0,5%
Lô 2 (chứng bệnh): uống dung dịch NaCMC 0,5%
Lô 3 (chứng dương): uống dung dịch NaCMC 0,5% trong 4 ngày đầu và uống dexamethason 0,5 mg/kg ngày thứ 5
Lô 4 (H50): uống hỗn dịch viên hoàn giọt andrographolid liều 50 mg/kg
Lô 5 (H100): uống hỗn dịch viên hoàn giọt andrographolid liều 100 mg/kg
Cho động vật ở các lô 1, 2, 3 uống dung dịch NaCMC 0,5%, lô 4, 5 uống hỗn dịch viên hoàn giọt andrographolid với thể tích 0,1 mL/10g cân nặng hàng ngày trong vòng
4 ngày Ngày thứ 5, trước 1 giờ khi tiêm carrageenan, động vật ở lô 1, 2 uống dung dịch NaCMC 0,5%; lô 3 uống dexamethason 0,5 mg/kg; lô 4, 5 uống mẫu thử, gây viêm màng phổi bằng cách tiêm vào khoang màng phổi 0,1 mL carrageenan 1%, riêng động vật ở lô chứng sinh lý được tiêm dung dịch nước muối sinh lý
Sau khi gây viêm màng phổi 4 giờ, gây mê chuột bằng ether, rửa khoang màng phổi bằng 1 mL nước muối sinh lý chứa 20 UI heparin, thu dịch rửa vào ống nghiệm để làm các xét nghiệm định lượng bạch cầu và hoạt độ MPO
Quy trình nghiên cứu được mô tả trong Hình 2.2:
Hình 2.2: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây viêm màng phổi bằng carrageenan
- Số lượng bạch cầu tổng và thành phần bạch cầu
Quy trình định lượng enzym MPO được tiến hành theo Bradley (1982) [25]: MPO được chiết xuất bằng cách hòa tan dịch rửa màng phổi trong dung dịch 0,5% HTAB trong đệm kali phosphat 50mM, pH=6 (tỉ lệ 1:9) Siêu âm trong nước đá 10 giây rồi ly tâm 40.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C thu được dịch nổi Lấy dịch nổi trộn với đệm phosphate 50mM, pH=6, chứa 0,167 mg/ml O-dianisidine.2HCl và 0.0005% H2O2 (tỉ lệ 1:29) Đo độ hấp phụ ở bước súng 460nm Hoạt độ MPO được tớnh bằng: 1U= 1 àmol
Quy trình tiến hành được mô tả như hình Hình 2.3:
27 Hình 2.3: Quy trình định lượng hoạt độ MPO Hoạt độ MPO được tính theo công thức:
E: Mật độ quang đo được ở bước sóng 460 nm
V: Thể tớch trước pha loóng (àl) ε: Hệ số hấp thụ mol (mM -1 cm -1 ) v: Thể tớch mẫu thử (àl) d: Độ dày giếng (cm)
2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây u hạt bằng viên bông
Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn của viên hoàn giọt andrographolid trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng viên bông [41], [43], [61]
Khi cấy vật lạ (viên bông) không hấp thụ vào cơ thể, cơ thể sẽ phản ứng bằng cách kích hoạt phản ứng viêm được đặc trưng bởi các sự kiện thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân, tăng sinh nguyên bào sợi, hình thành mạch và tiết dịch [61] Các phản ứng tăng sinh nhiều loại tế bào tạo mô bào lưới và nguyên bào sợi bao quanh vật lạ, tạo thành một khối
28 u hạt thực nghiệm Khối lượng ướt của viên bông tương quan với lượng dịch rỉ viêm; khối lượng khô của viên tương quan với sự hình thành mô hạt [24], [61] Quá trình tạo u hạt tương tự với tiến triển của viêm mạn tính Một thuốc có khả năng ức chế sự hình thành u hạt đồng nghĩa thuốc đó có tác dụng chống viêm mạn tính
Thiết kế thí nghiệm: chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 11 con
Lô 1 (lô chứng sinh lý): uống dung môi NaCMC 0,5%
Lô 2 (lô chứng dương): uống prednisolon liều 5 mg/kg cân nặng chuột
Lô 3 (H50): uống viên hoàn andrographolid 50 mg/kg cân nặng chuột
Lô 4 (H100): uống viên hoàn andrographolid 100 mg/kg cân nặng chuột
Chuẩn bị tác nhân gây viêm:
Cắt và tỉa gọn viên bông khối lượng 10 ± 0,5mg
Chuẩn bị dung dịch carragenan 1%: ngâm carrageenan đến khi trương nở hoàn toàn trong dung dịch NaCl 0,9% Sau đó, tẩm viên bông vào dung dịch carrageenan 1%, tiệt trùng và sấy khô ở 60°C đến khối lượng không đổi thu được khối lượng m0 (mg).
Ngày thứ 1, gây mê chuột bằng ether, cạo lông ở lưng và sát trùng bằng ethanol 70% Rạch da lưng chuột, đặt một viên bông đã được tiệt trùng vào dưới da vùng bả vai và khâu lại Cho chuột uống dung môi NaCMC/prednisolon/mẫu thử hàng ngày vào thời điểm nhất định với thể tích 0,1 mL/10g, trong 7 ngày liên tục
Ngày thứ 8, sau khi cho chuột uống thuốc lần cuối 1 giờ, gây mê bằng ether, phẫu thuật bóc tách u hạt, cân u hạt ướt thu được khối lượng m1 (mg) Sau đó sấy khô u hạt ở nhiệt độ 60°C đến khối lượng không đổi (24h) Cân khối lượng u hạt sau khi sấy khô thu được khối lượng m2 (mg)
Quy trình tiến hành được mô tả như Hình 2.4:
Hình 2.4: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống viêm mạn của viên hoàn andrographolid trên mô hình gây u hạt bằng viên bông
Thông số đánh giá: tác dụng ức chế sự tạo u hạt được biểu thị bằng tỷ lệ % giảm khối lượng trung bình các u hạt ở lô thử so với lô chứng
Khối lượng u hạt ướt/khô được tính theo công thức:
Khối lượng u hạt ướt: mư= m1 – m0
Khối lượng u hạt khô: mk = m2 – m0
Phần trăm độ giảm khối lượng u hạt của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng (phần trăm ức chế viêm của lô thử/lô đối chiếu so với lô chứng) biểu thị theo công thức:
𝐼(%) = mc−m mc x 100 Trong đó: mc: khối lượng u hạt trung bình của lô chứng (mg) m: khối lượng u hạt trung bình của lô thử/lô đối chiếu (mg)
2.3.3 Phương pháp đánh giá độc tính cấp
Phương pháp đánh giá độc tính cấp được tiến hành theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế [6] và “Test
No 420: Acute oral toxicity- Fixed dose Procedure” của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế (Organization for Economic Cooperation and Development - OECD) [68] Thử nghiệm được tiến hành qua hai giai đoạn: thử nghiệm thăm dò và thử nghiệm chính thức
Tiến hành trên một số nhóm, 3 động vật thí nghiệm/nhóm, cho uống một số mức liều nhằm xác định khoảng liều cho thử nghiệm chính thức
Sau khi thử nghiệm thăm dò, động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô
10 động vật Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật
Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng, giống cái Chuột được nhịn ăn 3 giờ trước khi thử nghiệm, nước uống theo nhu cầu, kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm Cho các lô chuột uống mẫu thử liều tăng dần với thể tích là 0,2 mL/10g cân nặng Mỗi động vật uống tối đa 3 lần trong vòng 24 giờ, mỗi lần cách nhau ít nhất 2 giờ Sau lần cuối cùng uống mẫu thử 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại Theo dõi các biểu hiện của chuột liên tục trong vòng 4 giờ đầu, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ và theo dõi hằng ngày trong vòng 14 ngày sau khi uống chế phẩm thử lần cuối
Quy trình tiến hành như Hình 2.5:
Hình 2.5: Quy trình đánh giá độc tính cấp của viên hoàn giọt andrographolid
Các thông số đánh giá:
❖ Theo dõi động vật trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc về các thông số sau:
Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ bằng phần mềm Excel 365 và xử lý bằng phần mềm SPSS 27 Kết quả trong nghiên cứu được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình, SE: giá trị sai số chuẩn) Đối với dữ liệu có phân phối chuẩn, sử dụng kiểm định One- way ANOVA để đánh giá sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu, dùng hậu kiểm LSD hay Dunett’s T3 để so sánh từng cặp hai lô Khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p
