BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẶNG VĂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI VÀ CHÔNG OXY HÓA CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum (Thunb ) Makino) TRÊN MÔ HÌNH RUỒI[.]
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - ĐẶNG VĂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI VÀ CHƠNG OXY HĨA CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN MANG BỆNH PARKINSON KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - ĐẶNG VĂN CƯỜNG Mã sinh viên: 1701066 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN HÀNH VI VÀ CHƠNG OXY HĨA CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ GIẢO CỒ LAM (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM CHUN GEN MANG BỆNH PARKINSON KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hưởng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng TS Hà Vân Oanh Nơi thực hiện: Viện Dược liệu Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô người trực tiếp hướng dẫn em q trình nghiên cứu khoa học khoa, ln bên cạnh động viên cổ vũ hỗ trợ em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Hà Vân Oanh, môn Dược học cổ truyền - trường Đại học Dược Hà Nội Cô cho em hội nghiên cứu khoa học môi trường chuyên nghiệp, đưa lời khuyên quý báu giúp đỡ em suốt trình thực khoá luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Đinh Thị Minh, anh Nguyễn Văn Hiệp anh chị khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược Liệu giúp đờ, hướng dẫn kỹ thuật tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian em tham gia nghiên cứu thực nghiệm khoa Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đà bên cạnh động viên, chỗ dựa vũng em gặp khó khăn học tập sống Do thời gian làm thực nghiệm kiến thức thân có hạn, khóa luận cịn có nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2022 Sinh viên Đặng Văn Cường MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, sơ ĐỊ, ĐÒ THỊ ĐẶT VẤN ĐÈ CHƯƠNG TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu: Giảo cổ lam (Gynostemmapentaphyllum (Thunb.) Makino) 1.1.1 Tên gọi - vị trí phân loại .2 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.1.5 Một số nghiên cứu tác dụng dược lý Giảo cô lam bệnh Parkinsonô 1.2 Tổng quan bệnh Parkinson 1.2.1 Sơ lược lịch sử hình thành bệnh Parkinson 1.2.2 Dịch tễ học 1.2.3 Nguyên nhân yêu tô nguy 1.2.4 Vai trị stress oxy hóa bệnh Parkinson 1.2.5 Biểu lâm sàng bệnh Parkinson 10 1.2.6 Điều trị 11 1.2.7 Một số mơ hình nghiên cứu gây bệnh Parkinson động vật 12 1.3 Tổng quan ruồi giấm 13 1.3.1 Hệ gen ruồi giấm 13 1.3.2 Chu kỳ vòng đời 14 1.3.3 Hệ thống biểu gen GAL4/UAS ứng dụng nghiên cứu mô hình ruồi giấm chuyển gen 14 1.3.4 Mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1 ỉ Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Dòng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu 17 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Quy trình chuẩn bị ruồi giấm phục vụ nghiên cứu 19 2.2.2 Đảnh giả tác dụng cao chiết ethanol từ Giảo cổ lam (GCL) mơ hình ruồi giấm chuyến gen mang bệnh Parkinson thử nghiệm hành vỉ 21 2.2.3 Đảnh giá tác dụng chống oxy hóa cao chiết ethanol từ Giảo cồ lam (GCL) mơ hình ruồi giấm chuyến gen mang bệnh Parkinson 27 2.2.4 Phân tích kết thống kê 30 CHƯƠNG KẾT QUÃ NGHIÊN cứu 31 3.1 Đánh giá tác dụng cao chiết ethanol tù’ giảo cố lam (GCL) mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson thử nghiệm hành vi 31 3.1.1 Kết đánh giá khả vận động (bò trườn) ấu trùng ruồi giấm 31 3.1.2 Kết đánh giá khả vận động (leo trèo) ruồi giấm trưởng thành 32 3.1.3 Kết đánh giá khả ghi nhớ (mùi) ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm 34 3.1.4 Kết đánh giá khả sống sót ruồi giấm trưởng thành 35 3.2 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa cao chiết ethanol từ Giảo cố lam (GCL) mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson 36 3.2.1 Kết đánh giả hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol từ GCL 36 3.2.2 Kết đảnh giá khả loại bỏ gốc DPPH thử nghiệm ex vivo đầu ruồi giấm 37 3.2.3 Kết định lượng nồng độ MDA (Malondialehyd) thử nghiệm ex vivo đầu ruồi giấm 38 CHƯƠNG BÀN LUẬN 39 4.1 mơ hình nghiên cún 39 4.1.1 việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm nghiên cứu bệnh Parkinson 39 4.1.2 việc lựa chọn cao chiết dược liệu nghiên cứu 40 4.1.3 can lựa chọn mức liều nghiên cứu 40 4.2 kết nghiên cứu 40 4.2 ỉ Đảnh giá tác dụng cải thiện khả nẫng vận động ấu trùng ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 40 4.2.2 Đảnh giá tác dụng cải thiện khả vận động ruồi giấm trưởng thành chuyên gen SNCA mang bệnh Parkinson 41 4.2.3 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn ấu trùng ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 42 4.2.4 Đảnh giá tác dụng cải thiện khả nẫng sống sót ruồi giấm trưởng thành chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson 42 4.2.5 Đảnh giả tác dụng chống oxy hóa in vitro cao chiết ethanol từ Giảo cổ lam 43 4.2.6 Đảnh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo đầu ruồi giấm chuyến gen SNCA mang bệnh Parkinson 43 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 45 TÃI LIỆU TÀI KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẲT Viết tắt Viết đầy đủ theo Tiếng Anh Viết đầy đủ theo Tiếng Việt DBS Deep brain stimulation Kích thích não sâu DPPH 2,2-Diphenyl-1 -picrylhydrazyl 2,2-Diphenyl-1 -picrylhydrazyl EOPD Early-onset Parkinson disease Bệnh Parkinson khởi phát sớm Giảo cổ lam GCL LID Levodopa-induced dyskinesia Rối loạn vận động Levodopa LOPD Late-onset Parkinson disease Bệnh Parkinson khởi phát muộn MeOH Methanol Methanol -meth yl-4-phenyl-1,2,3,6- -methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine tetrahydropyridin MS Motor Symptom Triệu chứng vận động NMJ Neuromuscular junction Cấu trúc thằn kinh NMS Non-Motor Symptom Triệu chứng không vận động PD Parkinson’s disease Bệnh Parkinson ROS Reactive oxygen species Các gốc oxy hóa dạng hoạt động SNCA Synuclein Alpha Gen alpha synuclein SNpc Substantia nigra pars compacta Vùng đặc chất đen ƯAS Upstream activating sequence Trình tự hoạt hóa ngược dịng MPTP DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các mơ hình PD động vật sử dụng chất hóa học can thiệp gen 13 Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 19 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, so ĐỒ, ĐỊ THỊ Hình 1.1 Một số hình ảnh GCL {Gynostemma pentaphylỉum (Thunb.) Makino) Hình 1.2 Cấu trúc khung dammaran Hình 1.3 Cấu trúc saponin GCL {Gynostemma pentaphyllum) Hình 1.4 Chu kỳ vịng đời ruồi giấm 15 Hình 1.5 Hệ thống GAL4/ƯAS mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang 16 bệnh Parkinson ĩ Hình 2.1 So đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả vận động ấu trùng ruồi giấm 22 Hình 2.3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả vận động cũa ruồi giấm truởng 24 thành Hình 2.4 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm 25 Hình 2.5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả sống sót ruồi giấm truởng 27 thành Hình 2.6 Phản ứng DPPH chất chống oxy hóa 28 Hình 2.7 Phản ứng MDA TBA 31 Hình 3.1 Kết đánh giá khả bò (trườn) ấu trùng ruồigiấm bậc 32 Hình 3.2 Kết đánh giá khả leo trèo ruồi giấmtrưởng thànhở 34 thời điểm 3, 7, 14 21 ngày tuổi Hình 3.3 Kết đánh giá khả ghi nhớ mùi ấu trùng ruồi giấm bậc 35 Hình 3.4 Biểu đồ đánh giá tuổi thọ ruồi giấm trưởng thành 36 Hình 3.5 Khả loại bỏ gốc tự DPPH cao chiết thanol từ Giảo cổ lam 37 Hình 3.6 Khả loại bỏ gốc tự DPPH đầu ruồi giấm lô nghiên 38 cứu Hình 3.7 Nồng độ MDA dịch đồng thể đầu ruồi lô nghiên cứu 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Parkinson (Parkinson’s disease - PD) nhừng bệnh thối hóa thần kinh phố biến phức tạp người đặc trưng triệu chứng như: run, cứng, di chuyên chậm chạp chứng khác rối loạn nhận thức, hành vi, giấc ngủ PD có xu hướng ngày phố biến mà chi phí y tế cho nhóm bệnh nhân tăng theo [66] Hiện chưa có thuốc chữa khỏi PD, thuốc có tác dụng giảm triệu chứng làm chậm tiến triển bệnh Ớ Việt Nam, có nhiều bệnh nhân Parkinson nghiên cứu chủ yếu khía cạnh bệnh học lâm sàng Cùng với già hóa dân số, tỷ lệ mắc PD tăng lên đáng kế, điều làm gia tăng tính cấp bách việc nghiên cứu tìm thuốc điều trị hiệu bệnh [7] Giảo cô lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) thuốc quý đưa vào sách đỏ quốc gia Ớ Việt Nam tìm thấy Lào Cai, Lạng Sơn, Hịa Bình Thừa Thiên - Huế Từ xưa, Giảo cổ lam dân gian sử dụng nhiều để bồi bổ sức khoẻ, chống lão hóa, trị đái tháo đường Các hoạt tính sinh học chủ yếu Giảo cổ lam chứng minh giới bao gồm chống oxy hóa, hạ đường huyết, bảo vệ hệ thần kinh trung ương, trì sức khỏe tim mạch Thành phần hóa học chủ yếu Giảo cổ lam cơng bố ngồi gypenosid (saponin Giảo cổ lam) cịn có hợp chất tự nhiên flavonoid, steroid, polysaccharid [65] Trong Giảo cồ lam có số lượng nhiều loại saponin có khung dammaran loài thực vật đà nghiên cứu Các nghiên cứu giới cho thấy cao chiết từ Giảo cổ lam gypenosid có lợi ích lâu dài việc làm chậm tiến triển bệnh Parkinson ngăn ngừa thối hóa hệ thần kinh trung ương [56] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý Giảo cố lam bệnh Parkinson hệ thần kinh trung ương Vì lí đó, thực đề tài “Nghiên cứu tác dụng cải thiện hành vi chống oxy hóa cao chiết ethanol tù’ Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) mơ hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson” với mục tiêu cụ thể sau: - Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi thần kinh cao chiết ethanol từ Giảo cố lam mơ hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa (in vitro ex vivo) cao chiết ethanol từ Giảo cổ lam mơ hình ruồi giấm chuyến gen SNCA mang bệnh Parkinson 3.2.3 Kết định lượng nồng độ MDA (Malondialehyd) thử nghiệm ex vivo đầu ruồi giấm MDA (Malondialdehyd) sản phẩm sinh q trình peroxy hóa lipid mà thành, hàm lượng MDA lô sử dụng cao chiết chứng tỏ q trình peroxy hóa lipid đầu ruồi giấm giảm Kết đánh giá thông qua hàm lượng MDA dịch đồng thể đầu ruồi So sánh nồng độ MDA lơ Kết thể Hình 3.7 Hình 3.7 Nồng độ MDA dịch đồng thể đầu ruồi lô nghiên cứu h=3, 20 đầu ruồi/lô/1 lần thử nghiệm One-Way ANOVA với **/>