15 Khoa học Y Dược / Dược học 64(5) 5 2022 Đặt vấn đề Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder ASD, gọi tắt là tự kỷ) là rối loạn phát triển thần kinh, đặc trưng bởi những khiếm khuyết về giao tiế[.]
Khoa học Y - Dược / Dược học DOI: 10.31276/VJST.64(5).15-19 Cao chiết Rau đắng biển (Bacopa monnieri) cải thiện hành vi tự kỷ theo chế liên quan đến protein PTEN mơ hình chuột thực nghiệm gây muối natri valproat Phạm Thị Nguyệt Hằng1*, Phạm Anh Tùng2, Trần Nguyên Hồng1, Lê Thị Xoan1, Nguyễn Thị Lập2, Nguyễn Thị Hiền3 Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội Trường Cao đẳng Y tế Hà Đông Ngày nhận 22/6/2021; ngày chuyển phản biện 25/6/2021; ngày nhận phản biện 7/7/2021; ngày chấp nhận đăng 12/7/2021 Tóm tắt: Nghiên cứu tiền đề tác giả chứng minh tác dụng cải thiện khiếm khuyết hành vi cao chiết Rau đắng biển (BME) mơ hình chuột tự kỷ gây muối natri valproat (VPA) Nghiên cứu tập trung tìm hiểu thêm tác dụng cải thiện số hành vi thần kinh chế hóa sinh BME Chuột nhắt trắng mang thai 12-13 ngày chia thành lô sinh lý lô bệnh lý (tiêm phúc mạc nước muối sinh lý VPA với liều 500 mg/kg) Lô sinh lý lô bệnh lý lơ chuột có mẹ tiêm nước muối sinh lý tiêm VPA uống nước cất suốt trình nghiên cứu Lơ điều trị gồm chuột có mẹ tiêm VPA chuột mẹ sau sinh uống BME nước cất 13 ngày tuổi Từ 14 ngày tuổi, chuột rối loạn tự kỷ trực tiếp uống BME (50 mg/kg) nước cất suốt q trình thí nghiệm Các thử nghiệm hành vi (tự chải chuốt giao tiếp xã hội) đánh giá vào ngày tuổi thứ 20 30 Vào ngày tuổi thứ 40, não chuột tách để đánh giá mức độ biểu protein PTEN kỹ thuật Western blot Kết cho thấy, BME liều 50 mg/kg có tác dụng cải thiện tự chải chuốt lại thiếu hụt hành vi tương tác xã hội chuột tự kỷ 20 30 ngày tuổi; đồng thời có tác dụng phục hồi giảm mức độ biểu protein PTEN vỏ não chuột tự kỷ Những kết chứng minh, BME có tác dụng cải thiện số hành vi cốt lõi bệnh tự kỷ thông qua liên quan đến phục hồi giảm mức độ biểu protein PTEN vỏ não chuột tự kỷ thực nghiệm Từ khóa: hành vi lặp lại, lo âu, muối natri valproat, rau đắng biển, tương tác cộng đồng, tự kỷ Chỉ số phân loại: 3.4 Đặt vấn đề Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder - ASD, gọi tắt tự kỷ) rối loạn phát triển thần kinh, đặc trưng khiếm khuyết giao tiếp tương tác xã hội, đồng thời kèm theo mẫu hình hành vi, sở thích rập khn, giới hạn Đặc biệt, rối loạn thường xuất đối tượng nhạy cảm trẻ nhỏ với tỷ lệ mắc theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) 1/270 trẻ vào năm 2021 [1] Ở Việt Nam, số lượng trẻ chẩn đoán mắc tự kỷ tăng lên theo năm việc thay đổi tiêu chuẩn chẩn đoán yếu tố nguy ngày nhiều Vào năm 2017, tỷ lệ mắc tự kỷ Việt Nam 0,752% [2] Do đó, ASD ngày quan tâm nghiên cứu sâu nguyên nhân, chẩn đoán điều trị Rối loạn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Các thuốc dùng cho trường hợp chẩn đoán ASD chủ yếu thuốc điều trị triệu chứng cho rối loạn kèm hỗ trợ cho can thiệp chức Các thuốc chủ yếu thuộc nhóm chống loạn thần khơng điển hình có nhiều tác dụng không mong muốn biến cố bất lợi hiệu mang lại [3] Các liệu pháp chủ yếu dựa trị liệu giáo dục hành vi, vừa tốn công sức gia đình, nhân viên y tế, vừa tốn nhiều chi phí Vì vậy, ASD nhận nhiều quan tâm, hỗ trợ từ cộng đồng Cây Rau đắng biển, hay gọi ruột gà, rau sam trắng, rau sam đắng, ba kích, loại leo mọc nơi ẩm ướt nhiều ánh sáng Rau đắng biển phân bố khắp vùng * đồng trung du miền Bắc miền Nam Loài sử dụng từ lâu để điều trị nhiều bệnh, đặc biệt bệnh có liên quan đến thần kinh Trong văn tự cổ Ấn Độ, Rau đắng biển ghi nhận có tác dụng tăng hiểu biết, học tập trí nhớ Trong y học đại, nhiều nghiên cứu tiến hành để chứng minh tác dụng loài thảo dược Nghiên cứu trước chứng minh rằng, BME có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ chế tác dụng liên quan đến khả bảo vệ, kích thích tăng sinh tế bào thần kinh mơ hình thiếu máu não cục mơ hình cắt bỏ thùy khứu giác chuột nhắt [4, 5] Trên mơ hình chuột tự kỷ thực nghiệm gây VPA, chúng tơi chứng minh BME có tác dụng cải thiện khiếm khuyết hành vi BME [6] Tuy nhiên nghiên cứu này, chuột tự kỷ điều trị BME ngày tuổi thứ 21 mà qua sữa mẹ từ sinh Thêm vào đó, nhóm nghiên cứu chưa đánh giá chế phân tử tác dụng BME mơ hình tự kỷ thực nghiệm Chính vậy, để tìm hiểu thêm tác dụng chế tác dụng BME bệnh ASD cần thiết Mục tiêu nghiên cứu nhằm tiến hành đánh giá tác dụng cải thiện số hành vi thần kinh BME mơ hình chuột nhắt trắng tự kỷ gây VPA thông qua thử nghiệm đánh giá tương tác xã hội hành vi lặp lại Từ đó, bước đầu tìm hiểu chế hóa sinh BME thông qua đánh giá thay đổi mức độ biểu protein đặc trưng cho ASD mô hình chuột nhắt trắng tự kỷ gây VPA sử dụng kỹ thuật Western blot Tác giả liên hệ: Email: nguyethangpt@nimm.org.vn 64(5) 5.2022 15 Khoa học Y - Dược / Dược học Bacopa monnieri extract ameliorates core autistic behavioural deficits of sodium valproate-induced autism spectrum disorder in mice, and its mechanism of action related to PTEN protein gộp lại lọc qua giấy lọc Dịch chiết thu hồi ethanol áp suất giảm bốc nước Dịch đặc sau chiết lần với n-butanol Pha butanol rửa lại với nước thu hồi dung môi áp suất giảm Cao sấy tủ sấy chân không 50°C để thu BME có hàm ẩm 4,5% Hiệu suất chiết 8,3% BME sau phân tích sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Kết thu cao chứa 21,8% bacoside A 11,0% bacopaside I [4] Thi Nguyet Hang Pham , Anh Tung Pham , Nguyen Hong Tran , Thi Xoan Le1, Thi Lap Nguyen2, Thi Hien Nguyen3 Chuột nhắt trắng mang thai chủng Swisss albino Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột mẹ ni ổn định chuồng riêng, điều kiện phịng thí nghiệm nhiệt độ 25±1°C, độ ẩm 65±5%, chu kỳ sáng tối 12/12 (bật đèn từ 7:00 đến 19:00 giờ), thức ăn nước uống cung cấp đầy đủ Chuột sau sinh đánh dấu nuôi chuột mẹ 21 ngày đầu, sau tách mẹ Sau tách mẹ, chuột ni theo nhóm (4-6 con/ chuồng) Tất thử nghiệm hành vi tiến hành pha sáng từ 9:00 đến 18:00 Chuột 40 ngày tuổi tách lấy não để làm Western blot 1* Department of Pharmacology and Biochemistry, National Institute of Medicinal Materials Hanoi University of Pharmacy Ha Dong Medical College Received 22 June 2021; accepted 12 July 2021 Abstract: Our previous study demonstrated the effect of Bacopa monnieri extract (BME) on behavioural deficits in sodium valproate (VPA)induced autism spectrum disorder in mice The present study aims to further investigate the effect of BME on neurobehaviors of autism spectrum disorder (ASD) in mice and the biochemical mechanism(s) involved Female pregnant mice were divided into control and VPA treated groups at 12-13 days of gestation (saline/ sodium valproate 500 mg/kg respectively, i.p.) Control group pups of saline-treated mothers received distilled water The VPAtreated mothers received either distilled water or BME (50 mg/ kg, p.o.) after birth until 13 days later Then, from postnatal day 14, ASD pups were orally treated with BME (50 mg/kg)/distilled water for the duration of the study Behavioural deficits (repetitive behaviour and social behaviour deficit) were measured by a selfgrooming test and a three-chamber test on postnatal days 20 and 30 On postnatal day 40, the cerebral cortex of pups was isolated for evaluation of the expression level of PTEN protein using the Western blot method The results showed that BME (50 mg/ kg, p.o.) significantly improved repetitive behaviour and social behaviour deficits in ASD mice on postnatal day 20 and 30, and also increased PTEN protein expression level in the brain of ASD mice These results demonstrated that BME ameliorates core behaviours of autism and concurrently restores decreases in PTEN protein expression in the cerebral cortex of valproate-treated mice Động vật thí nghiệm Phương pháp gây mơ hình chuột tự kỷ thực nghiệm VPA Áp dụng mơ hình gây tự kỷ thực nghiệm chuột nhắt trắng VPA [6] Chuột mang thai 12-13 ngày, tiêm phúc mạc VPA liều 500 mg/kg thể trọng Chuột mẹ chia lô (2 chuột mẹ/lô): lô (lô chứng sinh lý): chuột mẹ khỏe mạnh cho uống nước cất vòng 13 ngày đầu sau sinh; lô (lô chứng bệnh lý, ký hiệu VPA): chuột mẹ tiêm VPA cho uống nước cất vòng 13 ngày đầu sau sinh; lô (lô điều trị, ký hiệu VPA-BME 50): chuột mẹ tiêm VPA cho uống BME liều 50 mg/kg thể trọng vòng 13 ngày đầu sau sinh Chuột sau sinh chia lô (9-11 con/lô) tương ứng với chuột mẹ: lô (lô chứng sinh, chuột con): chuột mẹ khỏe mạnh cho uống nước cất từ 14 ngày tuổi đến kết thúc q trình thí nghiệm; lô (lô chứng bệnh lý, VPA, 11 chuột con): chuột mẹ tiêm VPA cho uống nước cất từ 14 ngày tuổi đến kết thúc q trình thí nghiệm; lơ (lơ điều trị, VPABME 50, 11 chuột con): chuột mẹ tiêm VPA cho uống BME liều 50 mg/kg thể trọng từ 14 ngày tuổi đến kết thúc q trình thí nghiệm Q trình nghiên cứu mơ tả hình Keywords: anxiety, ASD, Bacopa monnieri, self-repetitive behaviour, social interaction, sodium valproate Classification number: 3.4 Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị BME Mẫu Rau đắng biển thu thập Thanh Hóa (2019) giám định Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu BME chuẩn bị nghiên cứu trước Viện Dược liệu [4] Phần mặt đất dược liệu Rau đắng biển sấy khơ 50°C, sau cắt nhỏ nghiền đến kích thước thích hợp Bột dược liệu chiết cách thuỷ 85°C lần ethanol 50% Dịch chiết ethanol 64(5) 5.2022 Hình Quy trình thí nghiệm BME-50: BME liều 50 mg/kg Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện hành vi lặp lại thử nghiệm tự chải chuốt (self-grooming assay) Thử nghiệm tiến hành theo nghiên cứu Silverman cs (2010) [7] Thử nghiệm dựa tập tính tự chải chuốt nhằm 16 Khoa học Y - Dược / Dược học trì vệ sinh trình sinh lý quan trọng khác điều chỉnh nhiệt độ, giao tiếp xã hội kích thích lồi gặm nhấm Hành vi quan sát thấy thường xuyên động vật gặm nhấm bình thường, mang tính lặp lại Chuột 20 ngày tuổi cho uống nước muối sinh lý BME liều 50 mg/kg 30 phút trước tiến hành thử nghiệm Chuột đặt vào buồng thí nghiệm cách âm, cường độ ánh sáng lux, buồng có camera Chuột tự khám phá buồng 10 phút Tất hoạt động chuột 10 phút camera ghi lại Sau 10 phút, chuột đưa buồng vệ sinh ethanol 70% trước tiến hành thử nghiệm với chuột khác Sau đó, tổng thời gian chuột chải chuốt (gãi đầu, tai lơng) phân tích mù nghiên cứu viên cách độc lập Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện suy giảm tương tác cộng đồng thử nghiệm giao tiếp xã hội (social interaction test) Thử nghiệm tiến hành theo nghiên cứu Nadler cs (2004) [8] Thử nghiệm dựa đặc điểm thích dành nhiều thời gian với lồi tìm hiểu thứ thứ quen thuộc lồi gặm nhấm Thử nghiệm gồm có pha làm quen kiểm tra Chuột 30 ngày tuổi cho uống nước BME (50 mg/kg) trước tiến hành thử nghiệm Thử nghiệm cần hệ thống gồm có buồng, buồng hai bên có chứa hộp lưới giữa, có phiến nhựa để ngăn buồng cần Cường độ ánh sáng buồng 7-8 lux Chuột đặt nhẹ nhàng vào buồng Trong pha làm quen, chuột tự di chuyển khám phá buồng phút Sau đó, chuột lại đưa buồng phút buồng ngăn cách với buồng lại nhựa Trong pha kiểm tra, chuột khác giới khối lượng đưa vào hai hộp lưới Con chuột giới đặt hộp lưới chuột ni riêng biệt với nhóm chuột thí nghiệm Các nhựa ngăn đưa chuột nghiên cứu lại tự khám phá buồng 10 phút Toàn hoạt động chuột máy quay phim ghi lại Thời gian chuột vào buồng tiếp xúc với hộp lưới lưu lại để phân tích phần mềm ANY-maze, Stoeling, Mỹ Phương pháp đánh giá thay đổi biểu protein PTEN vùng vỏ não kỹ thuật Western blot dung dịch đệm Tris chứa 0,1% Tween 20 (TBS-T) nhiệt độ phòng Màng ủ với kháng thể đơn dòng chuột kháng protein PTEN (1:500, sc-7974, Santa Cruz Biotechology, INC., Mỹ), kháng thể đơn dòng thỏ kháng β-actin (1:6000, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Mỹ) 4°C qua đêm Sau rửa TBS-T, màng ủ với kháng thể thứ cấp IgG kháng thỏ chuột liên kết với HRP (DakoCytomation EnVision+System-HRP Labeled Polymer) (Dako Cytomation, Inc., Carpinteria, CA, Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phức hệ miễn dịch nhận biết phương pháp phát quang hóa học tăng cường (GE Healthcare Amersham™ ECL Prime Western Blotting Detection Reagent) (GE Healthcare, Mỹ) chụp lại máy ImageQuant LAS500 (GE Healthcare, Mỹ) Định lượng băng có phản ứng miễn dịch phân tích phần mềm ImageJ 1.50i (Wayne Rasband, NIH, Mỹ) Màng tái sử dụng đệm Restore™ Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific, Mỹ) Xử lý số liệu Số liệu xử lý thống kê phần mềm SPSS 20.0 Số liệu biểu diễn giá trị trung bình (MEAN) ± sai số chuẩn (SEM) Dữ liệu thử nghiệm tự chải chuốt Western blot phân tích one-way analysis of variance (ANOVA), theo sau hậu kiểm (Dunnett 2-sided t test) Dữ liệu thử nghiệm buồng phân tích Student’s Pair T test Sự khác biệt mẫu đạt ý nghĩa thống kê giá trị p