Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch và chống oxy hóa của cao quả nhàu trên động vật thực nghiệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhờ có sức đề kháng miễn dịch mà người tồn trước công tác nhân gây bệnh vi sinh vật, hóa chất, vật lý….Sức đề kháng miễn dịch hoạt động hệ thống tế bào có thẩm quyền miễn dịch chất tiết chúng (cytokin) hoạt hóa Sự tồn vẹn hệ thống giúp cho trình đáp ứng miễn dịch thể diễn bình thường Bệnh lý suy giảm miễn dịch hay gọi thiếu hụt miễn dịch nguyên nhân bẩm sinh (nguyên phát) hay mắc phải (thứ phát), hậu thể khơng có giảm khả đáp ứng miễn dịch (dịch thể tế bào) để chống lại yếu tố lạ (kháng nguyên) gây nên.[2, 4, 11] Suy giảm miễn dịch bệnh lý phổ biến, nước phát triển (nơi bệnh nhiễm trùng tình trạng suy dinh dưỡng cịn nhiều) Ở nước phát triển, tình trạng suy giảm miễn dịch xảy người bị đe dọa loại thuốc, hóa chất, yếu tố vật lý phóng xạ, bệnh béo phì, bệnh ung thư….[2, 7, 8, 11, 29] Trước bệnh lý suy giảm miễn dịch chưa quan tâm mức, đến năm gần đại dịch HIV/AIDS kỷ bùng nổ, bệnh ung thư phát triển ngày tăng…gây nên tình trạng suy giảm miễn dịch làm khó khăn cho việc điều trị, người ta nghiên cứu cách hệ thống suy giảm miễn dịch Hơn nhờ tiến khoa học, đặc biệt y sinh học phân tử giúp hiểu rõ chế phân tử bệnh lý suy giảm miễn dịch, để từ có biện pháp điều trị miễn dịch thích hợp hiệu [2, 4, 11, 29] Vì chuyên đề xin trình bày khái quát bệnh lý suy giảm miễn dịch, chế bệnh sinh số bệnh suy giảm miễn dịch mắc phải phổ biến người số phương pháp nghiên cứu gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm, sở để ứng dụng nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch số thuốc Việt Nam mà số cao nhàu Đại cương bệnh lý suy giảm miễn dịch Bệnh lý suy giảm miễn dịch hay gọi thiếu hụt miễn dịch, biểu thể khơng có khả giảm đáp ứng miễn dịch tế bào đáp ứng miễn dịch dịch thể để chống lại nguyên nhân (kháng nguyên) gây bệnh [2, 4, 7] MD dịch thể MD tế bào Vi khuẩn ngoại bào VK nội bào, virus, nấm TB lympho B Tế bào trình diện KN Tế bào Th Kháng thể Receptor tế bào T Tiếp nhân trình diện KN Receptor với cytokine Biệt hoá phát triển TBMD: Tc, NK, ĐTB Ly giải (bổ thể) Ly giải TB bị nhiễm Hình 1: Đáp ứng miễn dịch dịch thể tế bào Dựa vào chế sinh bệnh nhà Miễn dịch - Sinh lý bệnh nước phân làm loại: suy giảm miễn dịch bẩm sinh hay tiên phát (chủ yếu di truyền) suy giảm miễn dịch mắc phải hay thứ phát (thường hậu trình bệnh lý khác) 1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh: Suy giảm miễn dịch bẩm sinh bất thường vật chất di truyền Dựa vào nguồn gốc vị trí tổn thương tế bào miễn dịch người ta phân loại suy giảm miễn dịch sau: TB mầm TB lympho mầm TB mầm dòng hạt Tiền TB mầm dòng hạt Tiền lympho bào Các BC hạt Ưa base Ưa acid Hồng cầu Lympho B NK Lympho T Trung tính Tiểu cầu Kháng thể Th, Ts, Tc, TDTH, cytokine Hình Sơ đồ biệt hóa vị trí tổn thương tế bào miễn dịch (1) Suy giảm miễn dịch từ tế bào gốc chung cho dòng tế bào B T nên gọi suy giảm miễn dịch nặng phối hợp (2) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T gồm loại: tổn thương tế bào T cao rối loạn hoạt hóa tế bào T trưởng thành (3) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B gồm loại: tổn thương tế bào B cao rối loạn q trình biệt hóa tế bào B để sản xuất kháng thể dịch thể - Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng tế bào thực bào (liên quan đến trình diện kháng nguyên) sản xuất bổ thể 1.1.1 Suy giảm miễn dịch nặng phối hợp SCID (Severed combined immuno deficiency): Đây nhóm gồm nhiều bệnh phức tạp có bất thường phát triển biệt hóa tế bào lympho vào giai đoạn sớm để thành tiền tế bào B T Đặc trưng bệnh suy giảm nặng nề số lượng tế bào B T Bệnh lần phát Thụy Sĩ Nguyên nhân thứ nhất: di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X: bệnh xuất trai nhiều gái (tỷ lệ 3:1) Nguyên nhân thứ 2: di truyền lặn, liên kết với nhiễm sắc thể thường, khoảng 1/50.000 trẻ sinh bị SCID [Trích từ 11] Có nhiều thể SCID di truyền nhiễm sắc thể thường với chế phân tử khác nhau: - Týp 1: thiếu enzym thối hóa purin: adenosin desaminase (ADA) gây tích lũy chất deoxyadenosin chất gây ngộ độc lympho bào gốc làm cho tế bào không phân chia Trên giới có khoảng 100 ca bệnh SCID týp Trên lâm sàng người ta điều trị bệnh cách tiêm định kỳ enzym ADA Tuy nhiên enzym ADA phải gắn giá trơ để bền vững trước đưa vào thể - Týp 2: Khơng có lympho bào (alymphocytosis) Nghiên cứu chuột nhắt thấy chế bệnh sinh rối loạn trình tái tổ hợp gen xảy trình biệt hóa tế bào tiền thân lympho bào để trở thành tế bào B T, dẫn đến rối loạn xếp lại gen q trình chín lympho bào B T để đảm bảo tính đa dạng TCR (T cell Receptor) sIg (Surface Immunoglobulin) Trên người chế bệnh sinh chưa hiểu rõ có ý kiến cho bệnh có chế - Ngồi cịn SCID khác như: giảm biểu lộ phân tử MHC lớp II tế bào có thẩm quyền miễn dịch lympho B, đại thực bào…nên bệnh gọi hội chứng tế bào lympho trần trụi, hậu thiếu sót trình diện kháng nguyên giảm biểu lộ phân tử MHC Thể SCID đột biến chuỗi gamma receptor IL-2, lympho T CD3… rối loạn chuyển tín hiệu di truyền bên tế bào nên tế bào lympho T CD3 khơng hoạt hố phân chuyển, làm giảm sản xuất cytokin [11, 19, 21, 29] Điều trị bệnh SCID: - Ghép tủy xương: cách tốt nhất, kết tốt có hịa hợp mơ hịa hợp hệ ABO người cho người nhận Phản ứng thải loại mảnh ghép nguy hiểm, gây tử vong thể nhận mảnh ghép bị suy giảm miễn dịch - Truyền máu nhiều lần, nhiên biện pháp khó trì lâu dài có phản ứng giống thải loại mảnh ghép - Truyền hồng cầu bình thường chứa enzym ADA cho thể bệnh SCID thiếu enzym ADA 1.1.2 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T  Hội chứng Di George Hội chứng chiếm khoảng 20% bệnh lý suy giảm miễn dịch bẩm sinh Nguyên nhân tình trạng bệnh lý phôi: không phát triển túi hầu thứ thứ Các túi hầu chịu trách nhiệm phát triển hình thành tuyến ức tuyến cận giáp vào tuần thứ thứ Ngồi túi hầu cịn chịu trách nhiệm phát triển cung động mạch chủ, mơi, tai vào tuần thứ 12 Vì vậy, gặp hội chứng Di George thể điển hình, thường gặp thể khơng điển hình Bệnh nhi bị giảm sản tuyến ức, suy giảm tuyến cận giáp (thường bị co giật giảm calci huyết), kèm theo triệu chứng dị tật tim, mặt, tai… rối loạn phát triển tuyến ức biểu chủ yếu rối loạn mơi trường biệt hóa tế bào lympho T Hậu số lượng tế bào T bình thường giảm, chức tế bào T giảm giảm biểu lộ TCR/CD3, giảm sản xuất cytokin Dịng tế bào lympho B khơng bị ảnh hưởng nên đáp ứng miễn dịch dịch thể gần bình thường giảm khơng có hỗ trợ Th Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào bị ảnh hưởng nặng nề có khơng có đáp ứng [33, 37, 42, 45, 49] Điều trị: - Ghép tuyến ức phơi có kháng ngun hịa hợp mơ Tiêm truyền tế bào mảnh ghép tuyến ức có đường kíng 1mm thẳng bụng phúc mạc Dùng thuốc biện pháp hữu hiệu tránh phản ứng mảnh ghép chống túc chủ - Tiêm tinh chất tuyến ức thymosin để biệt hóa tế bào gốc thành tế bào T - Điều chỉnh calci huyết, điều trị dị tật tim mặt - Điều trị nhiễm nấm, virus, lao mắc phải  Hội chứng Nezelof: vô sản tuyến ức, không kèm theo vô sản tuyến cận giáp Biểu lâm sàng bệnh thường nhẹ hội chứng Di George: khơng có rối loại calci huyết Do khơng có đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nên trẻ thường bị nhiễm nấm, virus Điều trị có hiệu ghép tuyến ức tiêm tinh chất tuyến ức [2, 11, 29, 51]  Một số suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T khác: - Hội chứng Hong Good: gặp, có thiểu sản tuyến ức tuyến giáp trạng Biểu lâm sàng chủ yếu suy giảm miễn dịch tế bào: giảm số lượng chức tế bào T tế bào B bình thường - Khuyết tật cấu trúc TCR: phức hợp CD3/TCR bị khuyết tật đột biến chuỗi gamma CD3 dẫn đến ảnh hưởng đến số protein chuyển tin làm rối loạn phosphoryl hóa, vận chuyển calci nội bào… - Giảm sản suất IL2, IL4 INF-gamma: đột biến tế bào receptor chúng 1.1.3 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho B Dòng tế bào lympho B chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch dịch thể, nên có rối loạn q trình biệt hố phát triển dòng làm giảm nồng độ giảm chất lượng globulin máu Biểu lâm sàng bệnh nhân bị nhiễm khuẩn tái lại nhiều lần vi khuẩn sinh mủ (các cầu khuẩn Gram +) [2, 4, 18, 22]  Bệnh Bruton: Bệnh Bruton phát năm 1952, gọi thể khơng có gamma globulin máu, di truyền liên kết nhiễm sắc thể giới tính X nhiễm sắc thể thường Bệnh chiếm 70% bệnh nhân suy giảm miễn dịch bẩm sinh Nếu thể bệnh gắn với nhiễm sắc thể X, bệnh thường xảy trẻ em trai, xuất sớm Nếu di truyền nhiễm sắc thể thường bệnh xuất giới, thường giai đoạn muộn Sự biệt hóa tế bào B bị rối loạn giai đoạn sớm tiền tế bào B, bệnh đặc trưng xét nghiệm khơng có lympho bào B máu mơ lympho, hạch bạch huyết nhỏ, khơng có amidan, huyết khơng có loại Ig Phân loại: có týp bệnh Bruton - Týp 1: Suy giảm tế bào B kèm suy giảm toàn Ig: IgA, IgM, IgG, IgE Nguyên nhân thiếu gen mã hóa để tổng hợp Ig - Týp 2: Suy giảm tế bào B kèm suy giảm Ig: IgA, IgG, IgE tăng IgM Nguyên nhân rối loạn gen điều hòa việc tổng hợp, vận chuyển Ig Điều trị: Điều trị bệnh Bruton kháng sinh thường khơng có hiệu Hiện người ta dùng kháng sinh kết hợp với truyền Ig thụ động Các chế phẩm Ig thường dùng chủ yếu chứa IgG (99%) Do IgG có thời gian bán thải dài nên có giá trị phịng số bệnh nhiễm trùng Duy trì nồng độ IgG huyết cao 2g/lít [11] Không dùng IgA để điều trị đưa IgA đường tiêm chúng không đến niêm mạc hệ tiêu hóa, hơ hấp nên khơng có giá trị phịng điều trị bệnh Hơn nữa, thân IgA dễ gây choáng phản vệ nên thiếu IgA khơng có định dùng IgA cho bệnh nhân Bruton [2, 11, 29]  Bệnh suy giảm tế bào B có liên quan đến chuyển đổi isotyp Các tế bào B biệt hóa từ tế bào gốc gan phơi, sau chuyển vào tủy xương Dịng tế bào B biệt hóa suốt đời Trong vi môi trường tủy xương nguyên bào lympho B xếp lại gen mã hóa cho chuỗi nặng muy, chuỗi nhẹ kappa, chuỗi lamda Giai đoạn tiền B có IgM nguyên sinh chất, giai đoạn chưa trưởng thành có IgM bề mặt (mIgM), trưởng thành có IgD IgM Trong giai đoạn phát triển biệt hóa tế bào B, MHC lớp II biểu lộ, sau tế bào B rời tủy xương đến hạch bạch huyết Tại hạch bạch huyết, tế bào B kích thích kháng nguyên chúng biệt hóa để trở thành tương bào tiết kháng thể dịch thể đặc hiệu tế bào B trí nhớ Sự biến đổi tế bào B chủ yếu IgD, biểu lộ gen mã cho chuỗi …, đồng thời biến dị số gen tạo thay đổi vị trí receptor, làm tăng tính receptor với kháng nguyên Suy giảm IgA Là bệnh tương đối phổ biến, cộng đồng người da trắng với tần xuất khoảng 1/700 người di truyền theo NST 18 Loại suy giảm khơng có triệu chứng biểu dễ bị nhiễm khuẩn đường hô hấp đường ruột hay thấy xuất bệnh tự mẫn Xét nghiệm có nồng độ IgA máu thấp (< 50 g/ml) hay khơng có Khoảng nửa bệnh nhân xuất kháng thể chống IgA nên có nguy bị sốc truyền máu hay huyết tương Điều trị biện pháp miễn dịch cần dè dặt phải tiêm γ - globulin Cơ chế bệnh sinh tình trạng suy giảm IgA chưa rõ có lẽ phức tạp Nguyên nhân tổn thương bên tế bào (tế bào lympho B có sIgA khơng chuyển tiếp nữa) hay thiếu hỗ trợ bên (thiếu Th đặc hiệu, thiếu cytokin TGF- β , IL-5) Yếu tố địa giữ vai trò quan trọng định Bệnh nhân hay có haplotyp A1, B8, DR3 có thiếu sót gien mã cho C4, C4a giảm [41, 42, 43, 46, 51] + Suy giảm lớp IgG Một số trường hợp suy giảm IgG thường có kết hợp với suy giảm IgA hay với bệnh điều hoà – giãn mạch Bệnh nhân bị suy giảm IgG khơng có triệu chứng đặc hiệu, bệnh nhân bị nhiễm khuẩn sinh mủ, tái phát nhiều lần, dai dẳng, nặng Nguyên nhân thiếu sót lớp IgG3 hay phối hợp IgG2 IgG4 Nồng độ IgG chung bình thường, số trường hợp có tăng IgM Nếu có kết hợp suy giảm IgA có đột biến điểm gien mã cho glycoprotein 39 nằm NST X [17, 29, 51] Suy giảm miễn dịch thơng thường (CVID = Common variable ImmunoDeficiency) Bệnh cịn có tên vơ γ -globulin huyết muộn (late agamma globulinemia) hay vô γ -globulin huyết mắc phải (acquired agamma globulinemia) Bệnh thường xuất muộn tuổi 20 -30 nam lẫn nữ nên tỷ lệ mắc Xét nghiệm máu thấy có giảm loại IgG, IgA IgM Số lượng tế bào lympho B thay đổi không rõ rệt chức chúng có thay đổi có kết hợp với thay đổi tế bào lympho T Điều trị biện pháp miễn dịch tiêm gamma-globulin, liều lượng tuỳ nồng độ Ig máu mức độ biểu lâm sàng [2, 4, 11, 29, 51] 1.1.4 Suy giảm miễn dịch phối hợp Suy giảm miễn dịch loại này, người ta thấy có thay đổi tế bào lympho T lẫn lympho B kết hợp với tổn thương nhiều quan khác ủ ấm nuôi cấy thêm 20 Sau ni cấy đủ thời gian, tế bào cịn sống thu hoạch, giữ nhiệt độ phòng 30 phút, thêm vào giếng 100μl LDH, 15 phút sau đo hoạt tính enzym máy quang phổ bước sóng 490 nm - Đánh giá: So sánh nhóm chứng dương: tế bào ủ với TNF-α nhóm khơng với TNF-α - Một số phương pháp cải tiến: Maloff Delmendo: đánh giá kết hợp TNF-α với receptor TNF người Dùng tế bào HeLa S3 người, nuôi cấy ủ với TNF-α có gắn Iod phóng xạ (I125) 2.2.3 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho với mitogen (Mitogen induced lymphocyte proliferation) [25] - Nguyên lý: Các tế bào lympho kích thích tăng trình tăng sinh cảm ứng mitogen khác Q trình biệt hóa thể thông qua tăng sinh tổng hợp DNA Định lượng DNA phương pháp đánh dấu phóng xạ +3H-thymidin, nhờ người ta xác định nucleotid (nguyên liệu trình sinh tổng hợp DNA) Thuốc thử thường dùng trước cho súc vật nghiên cứu (có thể tiến hành nhiều loại súc vật) Sau dùng thuốc thử đủ thời gian qui định, lấy máu tổ chức lympho để làm xét nghiệm - Đối tượng chất liệu nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chủng NMRI, cân nặng 18-20 gam, chuột cống chủng Lewis cân nặng 180-200 gam Hồng cầu cừu dùng làm kháng nguyên, dùng chất sau làm mitogen: + Lipopolysaccharide nồng độ 0,1-10 µg/ml + Dextran sulfat nồng độ 7,5 - 30 µg/ml + Phytohaemagglutinin nồng độ 0,12 – 0,5 µg/ml + Concanavallin A nồng độ 0,12 – 0,5 µg/ml Các thuốc thường dùng làm thuốc chuẩn lô súc vật đối chứng dương là: levamisol, cycloporin A, prednisolon, leflunomid - Trên ex vivo: Các súc vật dùng thuốc thử ngày lần ngày liên tục Sau dùng thuốc thử đủ ngày, lấy tổ chức lách, tách lấy tế bào (Hỗn dịch chứa 5x 106 tế bào/ml) Các mitogen đưa vào giếng nuôi cấy Ủ ấm nuôi cấy tế bào điều kiện chuẩn: nhiệt độ 37 oC, khơng khí có % khí CO2, thời gian nuôi cấy 48- 60 Thêm 0,25 µC +3H-thymidin vào giếng nuôi cấy Thu hoạch tế bào dụng cụ lọc thủy tinh chuyên biệt, làm khô định lượng - Đánh giá: số kích thích tăng q trình biệt hóa so sánh lô súc vật nghiên cứu: lô chuẩn đối chứng dương, đối chứng âm, lô chứng sinh học lô dùng thuốc thử 2.2.4 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho T (T cell proliferation) [25] - Nguyên lý: Các tế bào lympho T tăng biệt hóa kích thích bới kháng ngun đặc hiệu Dùng tác nhân khác làm suy giảm số lượng chức tế bào lympho T, sau gián tiếp định lượng tế bào lylpho T phương pháp đánh dấu phóng xạ ( +3Hthymidin) chất tiết đặc hiệu chúng IL-2 phương pháp ELISA - Tiến hành: tế bào lympho máu ngoại vi gồm tế bào B T Dùng kháng CD3 (phân tử CD3 tổ hợp gồm chuỗi peptid có trọng lượng phân tử từ 20-26 kD, phân tử CD3 có mặt tế bào T chín) kháng CD28 để cô lập tế bào T Sau ủ ni cấy tế bào T với kháng nguyên đặc hiệu giếng nuôi cấy tế bào Thêm vào giếng µC +3H-thymidin để gián tiếp định lượng số lượng tế bào lympho T Dùng phương pháp ELISA để định lượng interleukin-2 receptor (IL-2R) - Đánh giá: IL-2 cytokin quan trọng, sản xuất tế bào T h Dưới tác dụng IL-2 tế bào lympho T tăng cường phân chia biệt hóa IL-2R gồm chuỗi peptid (chuỗi α: trọng lượng phân tử 75 kD β: 55 kD) Các tế bào T nghỉ có chuỗi α, khơng cịn chuỗi β Những receptor có tính cao với IL-2có khả cảm ứng tăng trưởng biệt hóa tế bào T Receptor có tính thấp với IL-2 có chuỗi β, chúng khơng hoạt hóa tế bào T Dựa vào đường cong chuẩn nồng độ xác định giếng nuôi cấy, so sánh với lô súc vật dùng thuốc thử lô đối chứng 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá quầng dung huyết in vitro (Plaque forming colony test in vitro) [2, 25] - Nguyên lý: x¸c định tỷ lệ tế bào lympho lách tiết kháng thể kh¸ng hồng cầu cừu (HCC) theo kü tht cđa Cuinningham - Tin hnh: trộn lympho bào lách chuột đà đợc mẫn cảm với kháng nguyên HCC từ tríc víi HCC theo tû lƯ thÝch hỵp kÌm theo có mặt bổ thể buồng đếm gắn kín Khi gặp kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho B đà biệt hoá thành tơng bào tiết kháng thể hoà tan vào môi trờng xung quanh kháng thể kết hợp với kháng nguyên HCC Phức hợp kháng nguyên - kháng thể hoạt hoá bổ thể làm tan HCC xung quanh tế bào B tiết kháng thể, tạo vòng trắng HCC xung quanh tế bào Đây gọi tế bào tạo quầng dung huyết Đếm tế bào lympho tạo quầng dung huyết tổng số 100 tế bào lympho lách dới kính hiển vi độ phóng đại 10 x 40 Từ tính đợc tỷ lệ phần trăm tế bào tạo quầng dung huyết lô thí nghiệm - ỏnh giỏ: Các lympho bào B đợc mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu phân chia biệt hoá nhanh chóng thành tơng bào sản xuất kháng thể Vì vậy, sỳc vt đà đợc mẫn cảm kháng nguyên hồng cầu cừu, sau ủ tế bào lympho B với hồng cầu cừu, tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể, với tác dụng bổ thể làm dung giải hồng cầu cừu xung quanh tế bào lympho tạo thành quầng dung huyết Tỷ lệ tế bào tạo quầng dung huyết đánh giá đợc khả tiết kháng thể đặc hiệu lympho B mà đánh giá đợc thụ thể bề mặt tế bào với C3 bổ thể 2.2.6 Phản ứng bì với kháng nguyên OA [2, 25] - Nguyên lý: Thí nghiệm thường tiến hành chut nht trng, chut cng trng ánh giá miễn dịch qua trung gian tế bào thông qua phản ứng mẫn chậm gan bàn chân chuột với kháng nguyên OA - Tin hnh: trớc đo kết phản ứng mẫn chậm với kháng nguyên OA, tiêm 50 hoc 100 l kháng nguyên OA (liều phát hiện) vào bên gan bàn chân chuột, bên lại tiêm thể tích tơng tự dung dịch BSA Sau 24 tiêm kháng nguyên phát hiện, đo bề dày hai gan bàn chân chuột thớc palmer Lấy hiệu số bề dày phản ứng mẫn chậm chuột với kháng nguyên OA BSA đợc số phản ứng với kháng nguyên OA - ỏnh giỏ: phản ứng mẫn chậm với kháng nguyên OA ỏnh giỏ ỏp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào lympho T đóng vai trị Tại chỗ tiếp xúc với kháng nguyên có tập trung nhiều tế bào lympho đặc biệt lympho bào T Một số phương pháp nghiên cứu khác như: nghiên cứu đánh giá kết hợp receptor interferon (binding to interferon receptors), nghiên cứu sàng lọc chất đối kháng với IL-1 (screening for interleukin-1 antagonists), nghiên cứu ức chế enzym chuyển IL-1β (inhibition of interleukin-1β converting enzym) [25]… 2.2.7 Xác định số lượng nhóm lympho bào T Dùng kỹ thuật miễn dịch hình quang xác định số lượng T CD3, TCD4, TCD8a, TCD8b - Nguyên lý: tế bào lympho T có nhiều loại T h, Tc, Ts, TDTH… loại có chức đặc hiệu đặc trưng dấu ấn miễn dịch riêng (các CD) bề mặt tế bào Ví dụ, CD3: đặc trưng cho tế bào T9 sau hoạt hoá kháng nguyên đặc hiệu, CD4: đặc trưng cho tế bào T hỗ trợ, CD8 đặc trưng cho tế bào T độc (là tế bào có chức quan trọng miễn dịch chống tế bào ung thư virus) - Tiến hành lấy máu tổ chức lympho súc vật bị gây suy giảm miễn dịch tác nhân đặc hiệu (hoá chất, tia xạ…) Đánh giá số lượng nhóm lympho bào T kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp máu ngoại vi tổ chức lympho Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào TCD3, TCD4, TCD8a, TCD8b tổng số 100 tế bào - Đánh giá: tế bào TCD3 tế bào T chín sau mẫn cảm với kháng nguyên đặc hiệu Phân tử CD3 tế bào T chín liên kết trực tiếp với TCR Số lượng tế bào T CD3 tăng tương ứng với khả đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cải thiện Các tế bào TCD4 TCD8 quần thể tế bào gây độc với virus tế bào ung thư Bản thân chúng tiêu diệt trực tiếp tế bào ung thư tế bào nhiễm virus (TCD8) gián tiếp thông qua cytokin chúng tiết IL-2, TNF 2.2.8 Định lượng cytokin IL-2, TNF Nguyên lý: tế bào lympho T sau hoạt hoá kháng nguyên tăng sinh, biệt hoá để trở thành tế bào T mẫn cảm có chức loại bỏ kháng nguyên Một công cụ quan trọng tế bào lympho T mẫn cảm chất tiết cytokin chúng Các cytokin có tác dụng trực tiếp loại bỏ kháng nguyên (TNF với tế bào ung thư) chúng có vai trị khuếch đại dịng thác miễn dịch thơng qua việc kích thích tế bào T hỗ trợ IL-2 Bản chất cytokin protein đặc trưng chuỗi acid amin Dùng kỹ thuật ELISA để xác định nồng độ cytokin dịch tiết tế bào lympho T nuôi cấy - Tiến hành: lấy tổ chức lympho súc vật (thường lách, hạch, tuyến ức) nghiền nhỏ ly tâm, rửa dung dịch đặc hiệu, tách lấy tế bào lympho khoảng 105 tế bào, tế bào nuôi cấy khoảng 48giờ với PHA 3g/ml - Đánh giá: IL-2 cytokin quan trọng bậc có tác dụng tăng sinh biệt hoá lympho bào T, hoạt hoá tế bào T độc, hoạt hố đại thực bào, có vai trị quan trọng miễn dịch chống ung thư chống virus TNF có nhiều nguồn gốc khác từ đại thực bào, tế bào mast, tế bào lympho… nên đặc hiệu so với IL-2, TNF có phạm vi tác dụng rộng có tác dụng gây độc tế bào ung thư tế bào nhiễm virus tăng biểu lộ phân tử MHC lớp I cho tế bào T độc hoạt động 2.3 Các số dùng để đánh giá suy giảm miễn dịch thực nghiệm Các số chung: Trọng lợng quan lympho (lách, tuyến ức, hạch) số lợng bạch cầu máu ngoại vi, tiêu giải phẫu bệnh quan lympho Trọng lợng lách tuyến ức tơng đối = Trọng lợng lách tuyÕn øc ThÓ träng súc vật 2.3.2 Các số ỏnh giỏ ỏp ng dch dch th: ịnh lợng globulin, lớp Ig, kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đà đợc mẫn cảm, số lợng tỷ lệ tế bào lympho B tiết kháng thể đặc hiệu, tế bào tạo hoa hồng mẫn cảm, khả tạo cụm tế bào lympho B nuôi cấy với chất kích thích phân bào 3 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bo: Phản ứng mẫn chậm da thông qua ghép da dị gen, phản ứng bì với kháng nguyên đặc hiệu, số lợng tế bào lympho T, dới nhãm cña lympho T (Th, Ts, Tc, TCD4+, TCD8+ ) máu tổ chức lympho, khả gây độc tế bào lympho Tc, khả tiết lymphokin tế bào lympho T mn cm nh interleukin, interferon, yếu tố hoại tử khối u Tµi liƯu tham kh¶o TiÕng ViƯt Phan SÜ An (1995), "Tơng tác xạ ion với vật chất tác dụng xạ ion hoá", Tài liệu tập huấn Quốc gia an toàn phóng xạ Y tế, Bộ Khoa học Công nghệ môi trờng Bộ Y tÕ phèi hỵp tỉ chøc Vị TriƯu An (1997), Miễn dịch học, Trờng Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Dợc lý (2007), Dợc lý học, Trờng Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh (2007), Sinh lý bệnh miễn dịch,Trờng Đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ môn Y học hạt nhân (2007), Bài giảng Y học hạt nhân, Trờng đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2006), Dợc th quốc gia Việt Nam, Hội đồng Dợc điển Việt Nam Đào Văn Chinh, Nguyễn Quốc Tuấn, Phạm Văn Thức (2002), Miễn dịch học lâm sàng, Nhà xuất Y học Nguyễn Bá Đức (2003), Thực hành xạ trị bệnh ung th, Nhà xuất Y học Nguyễn Thị Vinh Hà, Phạm Huy Quyến, Phan Thị Phi Phi (1994), Về mô hình gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học, Đại học Y Hà Nội, 5, tr 16-17 10 Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dơng(2001), Xét nghiệm sử dụng lâm sàng, Nhà xuất Y học 11 Phan Thị Phi Phi (2007), Một số vấn đề y sinh học cập nhật cho bác sĩ, Nhà xuất Y häc TiÕng Anh: 12 Akiyama M (1995), "Late effects of radiation on the human immune system: an overview of immune response among the atomic-bomb survivors", Int J Radiat Biol., Japan, 68(5), pp 497 508 13 Banks W.A., Farr S.A., Morley J.E (2003), “Entry of blood-borne cytokines in the central neurvous system: effect on cognitive processes”, Neuro immuno modulation, 10(6), pp 319 - 327 14 Bertram G.K (1998), Basic and clinical pharmacology, Karolinska Institutets Bibliotek, pp 917944 15 Birkeland S A (1980), "Influence of irradiation on the capacity of human T and B lymphocytes to from E and EAC rosettes", Transplantation, 29, pp 23 - 24 16 Bourgeois C; Rocha B; Tanchot C (2002), A role for CD40 expression on CD8+ T cells in the generation of CD8+ T cell memory, Science, 297(5589):2060-3 17 Castigli E; Wilson SA; Garibyan L; Rachid R; Bonilla F; Schneider L; Geha RS (2005), TACI is mutant in common variable immunodeficiency and IgA deficiency, Nat Genet, 37(8):829-34 18 Castigli E; Wilson SA; Scott S; Dedeoglu F; Xu S; Lam KP; Bram RJ; Jabara H; Geha RS (2005), TACI and BAFF-R mediate isotype switching in B cells, J Exp Med, 201(1):35-9 19 Chang C.C., Naiki M., Halpern G.M., Gershewin M.E (1993), "Pharmacological regulation of the immune system", J Investig Allergol Clin Immunol, 3, pp 8-18 20 Cosman D (1998), "Colony stimulating factors invivo and invitro", Immunology today 21 Doan T., Melvold R., Waltenbaugh C (2005), Medical Immunology, Lippincott Willams and Wilkins 22 Ferrari S; Plebani A (2002), Cross-talk between CD40 and CD40L: lessons from primary immune deficiencies, Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2(6):489-94 23 Fooksman DR; Gronvall GK; Tang Q; Edidin M (2006), Clustering class I MHC modulates sensitivity of T cell recognition, J Immunol, 176(11):6673-80 24 Gatto D; Martin SW; Bessa J; Pellicioli E; Saudan P; Hinton HJ; Bachmann MF (2007), Regulation of memory antibody levels: the role of persisting antigen versus plasma cell life span, J Immunol, 178(1):67-76 25 Gehard Volgel H (2002), Drug discovery and evaluation, Pharmacological assays, Springer 26 Gong J K., Glomski C A., Bruce A K (1983), "The effects of low dose X-rays on the erythropoietic marrow" Cell Biophys, 5, pp 143 - 162 27 Goodman and gilman’s (2005), The pharmacological basic of therapeutics (11 th edition), pp.14631484 28 Gutierrez T., Berber A (2001), “Safety and efficacy of two courses of OM-85 Bronchovaxom in the prevention of respiratory tract infections in children during 12 months”, Chest Journal, Jun, 119(6), pp 1742 - 1748 29 Hans D Ochs, C I Edvard Smith, Jennifer M Puck (2007), Primary Immuno deficiency Diseases: A Molecular and Genetic Approach, Second Edition, Oxford university press 30 Hendry J H (1985), "The cellular basis of long term marrow injury after irradiation" Radiother Oncol Vol 3, pp 331 - 338 31 Huggins J; Pellegrin T; Felgar RE; Wei C; Brown M; Zheng B; Milner EC; Bernstein SH; Sanz I; Zand MS (2007), CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naive human B cells, Blood, 109(4):1611-9 32 Knoechel B; Lohr J; Zhu S; Wong L; Hu D; Ausubel L; Abbas AK (2006), Functional and molecular comparison of anergic and regulatory T lymphocytes, J Immunol, 176(11):6473-83 33 Krogsgaard M; Li QJ; Sumen C; Huppa JB; Huse M; Davis MM (2005), Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity, Nature, 434(7030):238-43 34 Kuppers R (2003), B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus, Nat Rev Immunol, 3(10):801-12 35 Lieberman J (2003), The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal, Nat Rev Immunol, 3(5):361-70 36 McHeyzer-Williams LJ; McHeyzer-Williams MG (2005), Antigen-specific memory B cell development, Annu Rev Immunol, 23:487-513 37 Mills DM; Cambier JC (2003), B lymphocyte activation during cognate interactions with CD4+ T lymphocytes: molecular dynamics and immunologic consequences, Semin Immunol, 15(6):325-9 38 Niedbala W; Wei XQ; Cai B; Hueber AJ; Leung BP; McInnes IB; Liew FY (2007), IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells, Eur J Immunol.37(11):3021-9 39 Novoselova E G, Safonova M V (1995), Immune functions of spleen lymphocytes of rats subjected to chronic irradiation and antioxidant (ubiquinone Q9) diet Int J Radiat Biol., 67 (4), pp 469 476 40 Ojeda F Flores M (1999), "Radiation induced loss of anti-Ig binding ability of lymphocytes" J Naturforsch, 34, pp 888 - 889 41 Quesenberry P J (1995), Hematopoietic stem cells, progenitor cells and cytokin Inc New York, pp 211 - 228 42 Quezada SA; Jarvinen LZ; Lind EF; Noelle RJ (2004), CD40/CD154 interactions at the interface of tolerance and immunity, Annu Rev Immunol, 22:307-28 43 Richard J., Brian M., June E (2005), “IL-15 has stimulatory activity for the induction of B cell proliferation and differentation”, The American Association of Immunologists, pp 484 - 488 44 Shen J., Bao S., Reeve V (1999), “Modulation of IL-10, IL-12 and IFN- in the epidermis of hairless mice by UVA and UVB radiation”, Invest Dermatol, 113(6), pp 1059 - 1064 45 Shinkai K; Mohrs M; Locksley RM (2002), Helper T cells regulate type-2 innate immunity in vivo, Nature, 420(6917):825-9 46 Tangye SG; Avery DT; Deenick EK; Hodgkin PD (2003), Intrinsic differences in the proliferation of naive and memory human B cells as a mechanism for enhanced secondary immune responses, J Immunol, 170(2):686-94 47 Thomas R., Cupps, Lynne Edgar, Amthony S (2002), “Suppression of human B lymphocyte function by cyclophosphamid”, Journal of immunology, 125 (6) 48 Toftegaard C.L., Knigge U., Kjaer A (2003), “Effect of Interleukin 1 on the HPA axis in H(1)-receptor knockout mice”, Neuroimmunomodulation, 10(6), pp 344 - 350 49 Vigouroux S; Yvon E; Biagi E; Brenner MK (2004), Antigen-induced regulatory T cells, Blood, 104(1):26-33 50 Wang JC; Livingstone AM (2003), Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo, J Immunol, 171(12):6339-43 51 William E (1999), “Fundamental immunology, 4th edition”, Lippincott - Raven Philadelphia, New York 52 William P (2003), “Grannulocyte and granulocyte macrophage colony stimulating factors”, The Lancet, (342), pp 153 - 157 Bộ giáo dục đào tạo Bộ y tế trờng đại học y Hà Nội phạm thị vân anh chuyên đề tiến sỹ SUY GIM MIN DỊCH Ở NGƯỜI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SUY GIẢM MIN DCH THC NGHIM Thuộc đề tài: Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch chống oxy hóa cao nhàu động vật thực nghiệm Hà Nội - 2009 Bộ giáo dục đào tạo Bộ y tế trờng đại học y Hà Nội chuyên đề tiến sü SUY GIẢM MIỄN DỊCH Ở NGƯỜI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SUY GIẢM MIỄN DỊCH THỰC NGHIỆM Thc ®Ị tài: Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch chống oxy hóa cao nhàu động vật thực nghiệm Ngời thực hiện: Phạm Thị Vân anh (NCS khóa 24 - Chuyên ngành Dợc lý) Ngời hớng dẫn khoa häc: PGS TS Phan Thị Thu Anh Hµ Néi - 2009 Các chữ viết tắt CD : Cluter of differentiation DTH : Delayed hypersensitivity Elisa : Enzyme linked immunosorbent assay GM-CSF : Granulocyte monocyte colony stimulating factor ICAM : Intercellular adhesion molucule INF : Interferon Ig : Immunoglobulin IL : Interleukin KTMD : Kích thích miễn dịch LPS : Lipopolysaccharid MHC : Major histocompatibility complex NK : Natural killer TGF : Tumor growth factor Th : Helper T cell TNF : Tumor necrosis factor Ts : Suppessor T cell MỤC LỤC Đại cương bệnh lý suy giảm miễn dịch .2 1.1 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh: 1.1.1 Suy giảm miễn dịch nặng phối hợp SCID 1.1.2 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho T .5 1.1.3 Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng lympho B 1.1.4 Suy giảm miễn dịch phối hợp 1.1.5 Suy giảm bẩm sinh tế bào thực bào bổ thể 12 1.1.6 Kết luận suy giảm miễn dịch bẩm sinh: 15 1.2 Suy giảm miễn dịch mắc phải: .15 1.2.1 Suy giảm miễn dịch ung thư 16 1.2.2 Suy giảm miễn dịch nhiễm HIV/AIDS .22 Các phương pháp gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm 28 Các tác nhân gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm: .28 2.1 Thuốc hóa chất: 29 2 Tác nhân phóng xạ gây suy giảm miễn dịch thực nghiệm: 36 Gây ung thư thực nghiệm: .38 2.1.4 Vi sinh vật: 41 2 Một số mơ hình nghiên cứu 41 2.2.1 Nghiên cứu đánh giá giải phóng cytokin: IL-1alpha, IL-1 beta, IL-6, IL-8 TNF-alpha từ bạch cầu người .41 2.2.2 Nghiên cứu chất đối kháng với yếu tố hoại tử khối u .42 2.2.3 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho với mitogen 43 2.2.4 Nghiên cứu đánh giá tăng sinh tế bào lympho T 44 2.2.5 Nghiên cứu đánh giá quầng dung huyết in vitro 45 2.2.6 Phản ứng bì với kháng nguyên OA 46 2.2.7 Xác định số lượng nhóm lympho bào T 47 2.2.8 Định lượng cytokin IL-2, TNF 48 2.3 Các số dùng để đánh giá suy giảm miễn dịch thực nghiệm .48 Các số chung: 48 2.3.2 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể: 49 3 Các số đánh giá đáp ứng miễn dịch tế bào: 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ... giảm miễn dịch, điều trị nguyên nhân người ta cịn dùng biện pháp kích thích miễn dịch thích hợp Tuy nhiên thuốc kích thích miễn dịch hay tăng cường miễn dịch thường có tác dụng hệ miễn dịch vật. .. trờn nhiu loi sỳc vt Nghiên cứu tác dơng kích thích miễn dịch thuốc thiết phải tiến hành súc vật bị suy giảm miễn dịch súc vật bình thờng ®¸p øng víi c¸c chÊt kích thích miễn dịch Cã nhiều phơng... khơng có tác dụng hệ miễn dịch bình thường Vì vậy, nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch chất (nguồn gốc tự nhiên từ dược liệu tổng hợp), người ta thường gây mơ hình suy giảm miễn dịch thc