TỔNG QUAN
Tổng quan về ma túy
Theo Tổ chức Liên Hợp Quốc: Ma túy là “Các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ làm thay đổi trạng thái tâm sinh lý của người sử dụng” Theo tổ chức y tế thế giới: Ma túy theo nghĩa rộng nhất là “Mọi thực thể hoá học hoặc là những thực thể hỗn hợp khác với tất cả những cái được đòi hỏi, để duy trì một sức khoẻ bình thường, việc sử dụng những cái đó sẽ làm biến đổi chức năng sinh học và có thể cả cấu trúc của vật” [4]
Theo Luật Phòng, chống ma tuý số 73/2021/QH14 của Việt Nam được Quốc hội thông qua ngày 30/3/2021, có hiệu lực từ ngày 01/01/2022, cũng đưa khái niệm về chất ma túy như sau: Chất ma tuý là các chất gây nghiện, chất hướng thần được quy định trong danh mục chất ma túy do Chính phủ ban hành Chất gây nghiện là chất kích thích hoặc ức chế thần kinh, dễ gây tình trạng nghiện đối với người sử dụng Chất hướng thần là chất kích thích hoặc ức chế thần kinh hoặc gây ảo giác, nếu sử dụng nhiều lần có thể dẫn tới tình trạng nghiện đối với người sử dụng [7]
Dựa trên nguồn gốc, tác dụng trên hệ thần kinh trung ương người ta đưa ra các cách phân loại ma tuý như sau:
1.1.2.1 Phân loại theo nguồn gốc
Ma túy tự nhiên: Đây là các chất ma tuý có sẵn trong tự nhiên, là alcaloid của một số thực vật như cây thuốc phiện (anh túc), cây cần sa (cây gai dầu), cây coca (cocain)…
Ma túy bán tổng hợp: Là các chất ma túy được tổng hợp một phần từ một số loại ma tuý có sẵn trong tự nhiên, có tác dụng mạnh hơn chất ma túy ban đầu Ví dụ: morphin, heroin…
Ma túy tổng hợp: Là nhóm các chất ma túy không có trong tự nhiên Ma túy tổng hợp được tổng hợp nên từ các loại hóa chất (các hóa chất này được gọi là tiền chất) Ví dụ: amphetamin (AMP), 3,4-methylenedioxy methamphetamin (MDMA), ecstasy, ma túy đá [4]
1.1.2.2 Phân loại theo tác động lên thần kinh trung ương
Nhóm gây ức chế hệ thần kinh trung ương: Nhóm này khi sử dụng gây ra trạng thái buồn ngủ, an thần, giảm nhịp tim, ức chế hô hấp Nhóm này gồm thuốc phiện, nguồn gốc thuốc phiện (morphin, heroin, cocain ), các thuốc an thần gây ngủ (seduxen, phenobarbital)
Nhóm gây kích thích thần kinh trung ương: Nhóm này gồm AMP và các dẫn xuất, khi sử dụng gây tăng hoạt động, tăng sinh lực, tăng nhịp tim, tăng hô hấp
Nhóm gây ảo giác: Nhóm này gây thay đổi về nhận thức và môi trường xung quanh, nghe thấy những âm thanh không có thực Bao gồm các loại như lysergic acid diethylamid (LSD), thuốc lắc, cần sa [4]
1.1.3 Một số ma túy và chất chuyển hoá nghiên cứu
1.1.3.1 Heroin (HER) a Công thức hóa học
HER có công thức phân tử là C21H23NO5, khối lượng phân tử là 369,4 g/mol Danh pháp IUPAC của HER là [(4R,4aR,7S,7aR,12bS)-9-acetyloxy-3-methyl-2,4,4a,7,7a, 13-hexahydro-1H-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinolin-7-yl] acetate [30]
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Heroin b Tính chất vật lý
HER có dạng bột kết tinh hoặc tinh thể màu trắng, không mùi, nhiệt độ sôi là
272 – 274 ºC, điểm nóng chảy 173 o C, ít tan trong nước, tan tốt trong cloroform, alcohol, benzen Giá trị logP là 1,58 Giá trị pKa là 7,96 [30] c Cơ chế tác dụng
Khi dùng đường uống/tiêm, HER bị chuyển hóa bước đầu bằng cách khử acetyl để tạo ra các chất chuyển hóa có hoạt tính 6-MAM và morphin, sau đó các chất này sẽ qua hàng rào máu não Do đó dù theo đường dùng nào thì chất chuyển hoá cuối cùng của nó cũng là morphin Morphin là một chất chủ vận của thụ thể à-opioid, morphin kớch hoạt các con đường ức chế của hệ thần kinh trung ương cũng như ức chế các tế bào thần kinh cảm giác của hệ thần kinh ngoại vi, dẫn đến giảm tổng thể sự truyền dẫn cảm giác đau [30] d Chất gốc và quá trình chuyển hoá tạo morphin
HER bị thủy phân nhanh chóng thành 6-MAM, sau đó, được thủy phân thành morphin HER và 6-MAM hòa tan trong lipid hơn morphin và đi vào não dễ dàng hơn HER được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng morphin tự do và liên hợp [30]
1.1.3.2 Cocain (COC) a Công thức hoá học
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Cocain
COC có công thức phân tử là C17H21NO4, khối lượng phân tử là 303,35 g/mol Danh pháp IUPAC của Cocain là Methyl (1R,2R,3S,5S)-3-benzoyloxy-8-methyl-8- azabicyclo[3.2.1]octane-2-carboxylate [26] b Tính chất vật lý
COC có dạng bột kết tinh không màu đến màu trắng hoặc dạng bột màu trắng, nhiệt độ sôi là 187 ºC ở 0,1 mmHg, nhiệt độ nóng chảy 98ºC, độ tan trong nước là 1800 mg/L (ở 22ºC), tan tốt trong cloroform, alcohol, ether, dầu Giá trị logP là 2,3 Giá trị pKa là 8,7 [26] c Cơ chế tác dụng
COC gây tê bằng cách ức chế sự kích thích của các đầu dây thần kinh hoặc bằng cách ngăn chặn sự dẫn truyền ở các dây thần kinh ngoại vi Điều này đạt được bằng cách liên kết thuận nghịch với các kênh natri và làm bất hoạt các kênh natri Dòng natri qua các kênh này cần thiết cho quá trình khử cực của màng tế bào thần kinh và sự lan truyền xung động sau đó dọc theo đường đi của dây thần kinh [26] d Chất gốc và quá trình chuyển hoá tạo benzoylecgonin
Quá trình chuyển hóa COC diễn ra chủ yếu ở gan và có 3 con đường biến đổi sinh học Con đường chính là thủy phân COC bởi các esterase tạo ra ecgonin methyl ester Con đường thứ hai là quá trình thủy phân tạo ra BEN bằng cách khử methyl N-demethyl hóa COC là một con đường thứ ba dẫn đến norcocain Do đó, các chất chuyển hóa của COC là BEN, ecgonin methyl ester và bản thân ecgonin là những chất không hoạt động và norcocain có hoạt tính [26]
1.1.3.3 Codein (COD) a Công thức hóa học
COD có công thức phân tử là C18H21NO3, khối lượng phân tử là 299,4 g/mol Danh pháp IUPAC của Codein là (4R,4aR,7S,7aR,12bS)-9-methoxy-3-methyl- 2,4,4a,7,7a,13-hexahydro-1H-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinolin-7-ol [28]
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Codein b Tính chất vật lý
COD có dạng chất rắn hoặc bột kết tinh màu trắng không màu đến trắng, không mùi, vị đắng Thăng hoa ở 140 o C, nhiệt độ nóng chảy 154 đến 156 o C (sau khi sấy ở
80 o C) Dung dịch nước bão hòa pH=9,8 Ít tan trong nước, tan trong ethanol, benzen, cloroform, toluen Giá trị logP là 1,39 [28] c Cơ chế tác dụng
Tổng quan về phương pháp phân tích dư lượng ma túy và chất chuyển hóa của nó có trong nước thải
nó có trong nước thải
1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu
Trong phân tích các mẫu môi trường như nước thải luôn gặp khó khăn do sự ảnh hưởng của nhiều thành phần tạp chất và nồng độ chất cần phân tích thường rất nhỏ Chính vì vậy, mục tiêu của quá trình xử lý mẫu là làm tăng nồng độ, hàm lượng chất cần phân tích và bên cạnh đó loại bỏ được tối đa lượng tạp chất ảnh hưởng đến kết quả phân tích Hiện nay, có nhiều phương pháp xử lý mẫu được sử dụng bao gồm chiết lỏng- lỏng, chiết pha rắn (SPE), và gần đây nhất là lọc và phân tích trực tiếp
1.2.1.1 Chiết bằng dung môi (Chiết lỏng-lỏng)
Chiết lỏng-lỏng là kỹ thuật được dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang một dung môi thứ hai mà không hòa tan với dung môi thứ nhất Trong chiết xuất các chất từ nền mẫu lỏng như nước thải, dịch sinh học… thường sử dụng các dung môi không hoà tan trong nước như diethyl ether, n-hexan, cloroform để tách và tinh chế các chất phân tích, bên cạnh đó có thể sử dụng một số tác nhân vật lý hỗ trợ như lắc xoáy, khuấy trộn siêu tốc, ly tâm… để tăng hiệu suất chiết Ưu điểm: Kỹ thuật chiết bằng dung môi có ưu điểm là khá đơn giản, dễ thực hiện, có thể làm giàu và tinh chế mẫu, áp dụng rộng rãi
Nhược điểm: Mất thời gian và tốn công sức, khả năng mất chất trong quá trình chiết, sử dụng lượng lớn dung môi gây ảnh hưởng đến môi trường, một số dung môi độc hại có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người làm
Tuy nhiên, phương pháp này vẫn được sử dụng do đây là phương pháp đơn giản, hiệu quả và khá ổn định Để khắc phục những nhược điểm nói trên, các nhà khoa học đã thực hiện nhiều sự thay đổi như giảm thiểu lượng mẫu để sử dụng lượng dung môi thấp hơn, giảm các bước hoặc sử dụng các kỹ thuật chiết tự động
Việc xác định dư lượng của các chất gây nghiện trong môi trường có nhiều khó khăn do đa số các chất cần phân tích có nồng độ rất nhỏ và nền mẫu chứa nhiều thành phần khác nhau Vì vậy hầu hết không thể định lượng được trực tiếp từ mẫu thu thập mà cần phải được chiết tách, xử lý để loại tạp chất, làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích, tránh ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả và thiết bị phân tích Hiện nay, để xử lý các mẫu môi trường như nước thải thường áp dụng kỹ thuật chiết pha rắn [9]
Chiết pha rắn (chiết rắn-lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha rắn, lỏng Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước, dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn Nguyên liệu tạo ra pha rắn trong SPE là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo ra liên kết, ngoài ra còn sử dụng cả tạo pha không liên kết [1], [3]
Chiết pha rắn là kỹ thuật mới khắc phục được các nhược điểm của chiết lỏng-lỏng: lượng dung môi sử dụng ít; có khả năng kết nối GC, LC; khả năng làm giàu mẫu tốt, cơ chế chiết đa dạng phù hợp với nhiều chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn Tuy nhiên có nhược điểm là khó lưu giữ chất phân cực mạnh, khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm nhiều nhưng vẫn còn lớn, giá thành của phương pháp còn cao, khó áp dụng ở quy mô rộng [3]
1.2.1.3 Lọc và phân tích trực tiếp Đối với phương pháp phân tích nền mẫu môi trường như nước thải, bên cạnh việc lựa chọn phương pháp xử lý mẫu để làm sạch và làm giàu mẫu thì phương pháp đơn giản, dễ tiến hành, giảm thời gian phân tích cũng được quan tâm Do đó, ngày nay cùng với kỹ thuật phân tích hiện đại có độ đặc hiệu và độ nhạy cao như GC-MS/MS và LC-MS/MS, cỏc nghiờn cứu gần đõy sử dụng phương phỏp lọc qua màng lọc 0,45 àm và tiêm trực tiếp vào hệ sắc ký Phương pháp lọc và phân tích trực tiếp tuy mẫu không được làm giàu tuy nhiên lại có ưu điểm ít ảnh hưởng đến quá trình chiết tách nên hiệu suất thu được xem như là 100 % Tuy nhiên ở Việt Nam phương pháp lọc và phân tích trực tiếp các chất đối với nền mẫu phức tạp như nước thải chưa được sử dụng rộng rãi do lo ngại ảnh hưởng đến thiết bị phân tích Mặt khác, máy phân tích kết nối đòi hỏi phải là hệ thống thiết bị có độ nhạy rất cao, đắt tiền nên chưa được ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam
Theo nghiên cứu của T.T.T Huế và cộng sự được công bố năm 2022 về phương pháp xác định dư lượng của các chất gây nghiện bằng dịch tễ học nước thải tại Hà Nội đã sử dụng phương pháp lọc, sau đó tiêm trực tiếp vào hệ thống LC-MS/MS có độ nhạy cao là SCIEX 5500+QTRAP (Ontario, Canada) kết nối hệ thống sắc ký lỏng Nexera (Shimadzu, Nhật) với nguồn ESI (+) Phương pháp cho độ nhạy cao và ứng dụng để ước tính lượng sự dụng các chất gây nghiện trong cộng đồng dân cư tại Hà Nội [20]
Sau khi đã chiết các chất gây nghiện ra khỏi nền mẫu, cần phải sử dụng các kỹ thuật phân tích phù hợp để có thể xác định và định lượng được chính xác hàm lượng của chúng Trong số các kỹ thuật phân tích các chất gây nghiện hiện nay, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ là các kỹ thuật phân tích được sử dụng phổ biến nhất a Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng để tách các hợp chất trong hỗn hợp với mục đích định tính, định lượng và tinh chế các thành phần của hỗn hợp dựa vào sự tương tác khác nhau của chất phân tích đối với pha động và pha tĩnh [2]
HPLC có ưu điểm nổi bật so với các quá trình tách thông thường đó là quá trình tách và phát hiện diễn ra đồng thời do có nhiều loại detector để lựa chọn phù hợp với chất phân tích HPLC có nhiều loại detector khác nhau như detector UV-VIS, detector huỳnh quang, detector tán xạ bay hơi, detector khối phổ Tuy nhiên trong phân tích dư lượng chất gây nghiện trong nước thải, các nghiên cứu thường sử dụng dectector khối phổ do có độ đặc hiệu và độ nhạy để phân tích vết b Sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận HPLC và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS) [1], [2]
Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (amu - Atomic mass unit) hoặc bằng dalton 1 amu = 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro [1], [2]
Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao có vai trò phân tách hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với hoạt chất đi vào nguồn ion, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích [1] [2]
Hình 1.6 Sơ đồ khối của máy khối phổ
Tổng quan về phương pháp dịch tễ học dựa trên phân tích nước thải WBE 17 1 Giới thiệu về phương pháp WBE
1.3.1 Giới thiệu về phương pháp WBE
Tiền thân của WBE xuất hiện từ những năm 1970 khi các nhà nghiên cứu môi trường kiểm tra hiệu quả xử lý của các nhà máy xử lý nước thải để ngăn chặn hóa chất xâm nhập vào môi trường Các hóa chất được quan tâm bao gồm những các chất tẩy rửa, dầu gội đầu, xà phòng… Christian Daughton là người đầu tiên đưa ra ý tưởng từ phương pháp phân tích các chất trong nước thải có thể được điều chỉnh để đưa ra bản đồ tiêu thụ các ma tuý trong cộng đồng theo thời gian và không gian Đó chính là nguyên tắc của phương pháp WBE Ông còn cho rằng WBE sẽ tránh được một số vấn đề ảnh hưởng do phương pháp khảo sát, chẳng hạn như chi phí, sự lựa chọn chủ quan, lỗi lấy mẫu, sự chậm trễ trong báo cáo và báo cáo không chính xác [14]
Nguyên tắc của phương pháp Dịch tễ học dựa trên phân tích nước thải (WBE –
Wastewater-Based Epidemiology) là dựa vào nồng độ các chất trong nước thải, lưu lượng xả thải hàng ngày và dân số trong khu vực để ước tính tổng lượng tiêu thụ theo đầu người và sau đó là lượng tiêu thụ của từng chất theo đầu người trong phạm vi khảo sát Lượng tiêu thụ bình quân mỗi ngày của từng chất (ví dụ như thuốc) trong cộng đồng ở khu vực khảo sát được tính theo công thức sau đây:
Lượng tiêu thụ ước tính = F x C DR
Lượng tiêu thụ ước tính được tính theo mg/ngày/người
CDR là dư lượng của thuốc trong nước thải, tính theo đơn vị mg/L
F là lưu lượng nước thải trong vòng 24 giờ, tính theo đơn vị L/ngày
P là dân số của khu vực khảo sát (số người)
CF là hệ số hiệu chỉnh trung bình của chất chỉ điểm sinh học so với chất gốc [35] Phương pháp mới này bao gồm một số bước cho phép ước tính được lượng thuốc sử dụng bởi dân cư sống trong khu vực khảo sát dựa trên hàm lượng dư lượng đã được xác định trong nước thải và sự chuyển hóa của chất gốc trong cơ thể con người Các mẫu nước thải sau khi được lấy từ hiện trường sẽ được phân tích để xác định dư lượng các chất Sau đó, lượng thuốc tiêu thụ trong cộng đồng sẽ được tính toán dựa theo phương trình trên Lượng tiêu thụ bình quân (mg/ngày/1000 người) cho phép đánh giá mức độ sử dụng thuốc trong cộng đồng theo không gian và thời gian, cũng như phản ánh hiệu quả của các chính sách về quản lý thuốc hoặc hóa chất trong cộng đồng Cách tiếp cận này không gây xâm lấn và được thực hiện ở quy mô cộng đồng, vì vậy tôn trọng quyền riêng tư cá nhân và đảm bảo tính khách quan
Nguyên tắc quan trọng của phương pháp WBE là ước tính lại lượng tiêu thụ trong cộng đồng dựa vào Hệ số CF Hệ số này đã được tính toán dựa vào hệ số thải trừ EF của chất chuyển hóa so với chất gốc và tỷ số khối lượng phân tử giữa chất gốc/chất chuyển hóa theo công thức sau đây [35]:
KLPT (Chất gốc) KLPT (Chất chuyển hóa)
Ngày nay các nghiên cứu WBE được mở rộng và chuyên sâu hơn để hiệu chỉnh lại hệ số CF dựa vào thông số độ ổn định của các chất chuyển hóa trong đường ống xả thải
1.3.2 Các nghiên cứu WBE với chất gây nghiện
1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng
Trong các nghiên cứu WBE của các chất nói chung và chất gây nghiện nói riêng, việc ước tính lượng tiêu thụ sẽ thông qua nhiều thông số khác nhau, do đó luôn có một sai số nhất định Một số yếu tố ảnh hưởng chính đến kết quả của phương pháp được trình bày dưới đây a Quy mô dân số
Việc ước tính chính xác quy mô dân số trong khu vực của nhà máy xử lý nước thải rất khó thực hiện do số lượng người thực tế trong một khu vực tại bất kỳ thời điểm nào là không thể có được Do đó, các nghiên cứu vẫn sử dụng số liệu số lượng người những người cư trú trong khu vực mặc dù số liệu này không tính đến sự di chuyển dân số b Hoạt lực và mức liều tiêu chuẩn
Mức liều tiêu chuẩn Đối với thuốc sử dụng trong điều trị thì đều có mức liều tiêu chuẩn Tuy nhiên, liều lượng của các chất gây nghiện sử dụng có thể dao động, những người nghiện sử dụng ma túy bất hợp pháp lâu ngày có thể dung nạp lượng thuốc cao hơn so với người mới nghiện và do đó mỗi người sẽ đóng góp lượng chất chuyển hoá vào dòng nước thải khác nhau sau cùng một liều
Các loại ma tuý khác nhau thì hoạt lực của chúng cũng khác nhau Loại tác dụng mạnh thì chỉ cần một liều nhỏ hơn đã đủ để ảnh hưởng đến cơ thể con người so với loại tác dụng yếu hơn Do đó, nếu sử dụng dữ liệu mức tải hoặc lượng tiêu thụ đầu vào thì có thể không thấy được sự khác biệt Việc ước tính liều lượng tiêu thụ thông qua nước thải sẽ tạo điều kiện cho việc so sánh độ mạnh tương đối của các loại ma túy khác nhau trên các thị trường c Hệ số hiệu chỉnh (CF)
Các yếu tố hiệu chỉnh yêu cầu dữ liệu về tỷ lệ bài tiết (EF%) cho tất cả các chất Mỗi đường dùng khác nhau (tiêm, uống, hít ) thì có thể cho các sản phẩm bài tiết khác nhau, tốc độ bài tiết cũng có thể bị thay đổi Do đó, dẫn đến sự sai lệch kết quả và khoảng dao động CF lớn
Heroin Đối với heroin, có 2 chất chuyển hoá chính là 6-MAM và morphin Trong đó, 6- MAM chiếm tỷ lệ rất thấp, rất khó phát hiện trong khi morphin với % thải trừ là 77,7 (CF=1,67) được phát hiện dễ dàng trong nước thải nên được ưu tiên sử dụng [16] Tuy nhiên khi sử dụng morphin thì sẽ có một số điểm cần chú ý sẽ được trình bày trong phần sau
Cocain Đối với cocain, có 2 chất chỉ điểm được liệt kê là chất gốc COC có % thải trừ là 7,5 (CF) [23] và BEN có % thải trừ là 29 (CF=3,59) [13] Tuy nhiên COC là chất ổn định kém ở điều kiện nhiệt độ từ 2 - 31 °C, trong khi đó BEN khá ổn định ở pH trung tính ở -20 đến 31 °C nên BEN được phát hiện nhiều hơn trong nước thải và thường được dùng để ước tính ngược lại mức độ tiêu thụ của cocain
Codein Đối với codein, có 2 chất chỉ điểm được liệt kê là COD và MOR Trong đó, COD có % thải trừ dưới dạng chất gốc là 30 (CF=3,33), % thải trừ dưới dạng MOR là 6,51 (CF,12) [16]
Morphin Đối với morphin sử dụng trong điều trị, tỷ lệ thải trừ dạng MOR là 77,7% (CF=1,67) d Sự phức tạp do bản thân chất chỉ điểm sinh học
Cocain là trường hợp đơn giản nhất khi áp dụng phương pháp WBE Chất chỉ điểm sinh học của nó là COC (chất gốc) và BEN (chất chuyển hóa) chỉ được tạo thành duy nhất của cơ thể khi bài tiết cocain
Codein cũng khá đơn giản khi chất chỉ điểm sinh học của nó là COD (chất gốc) và MOR (chất chuyển hóa)
Heroin là trường hợp gây khó khăn nhất khi hợp chất gốc (HER) hiếm khi được tìm thấy trong nước tiểu vì nó bị chuyển hóa nhanh chóng Chất chuyển hóa chính của heroin là 6-acetylmorphin và morphin Tính toán lượng tiêu thụ heroin bằng chất chuyển hóa 6-acetylmorphin không chính xác do tỷ lệ thải trừ nhỏ và kém ổn định Tuy nhiên, morphin lại cũng được bài tiết sau khi tiêu thụ thuốc morphin và codein Do đó, việc ước tính lượng tiêu thụ heroin sẽ khả thi nếu có sẵn các dữ liệu liên quan đến tiêu thụ codein e Đổ thuốc bất hợp pháp vào hệ thống cống rãnh
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP ƯỚC TÍNH MỨC ĐỘ TIÊU THỤ MỘT SỐ MA TÚY NHÓM OPIAT
Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu
Các ma túy nghiên cứu: HER, COC
Chất chuyển hóa chính được phân tích trong nước thải: MOR, COD, BEN
Mẫu thử: cách lấy mẫu và bảo quản được tiến hành như sau:
- Vị trí lấy mẫu: nước thải được thu thập ở sông Kim Ngưu, Hà Nội tại vị trí cách đầu vào nhà máy xử lý nước Yên Sở khoảng 500 m
- Thời điểm lấy mẫu: mẫu được lấy hằng này bằng cách lấy mẫu gộp trong 1 giờ
- Dụng cụ lấy mẫu: lấy bằng ca nhựa có nối đầu dây
- Cách lấy mẫu: lấy cách bờ 0,5 m Mẫu được lấy liên tục trong vòng 1 giờ (5 phút lấy 50 ml Gộp mẫu thử Điều chỉnh về pH 2 bằng dung dịch HCl 10%
- Bảo quản: bảo quản ở -20 ºC cho đến khi phân tích
Mẫu nền: mẫu nước thải được lấy từ hộ gia đình không sử dụng chất ma túy hay mẫu nước sinh hoạt
Mẫu tự tạo: mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định
2.1.2 Hoá chất và chất chuẩn
Các chất chuẩn - hóa chất dùng trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1 và Bảng 2.2
Bảng 2.1 Các chất ngoại chuẩn và nội chuẩn STT Tên nội chuẩn, ngoại chuẩn
Hóng cung cấp Nồng độ (àg/mL) Số lụ
STT Hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
2 Amoni acetat Fisher - Mỹ LC - MS
3 Acid formic Fisher - Mỹ LC - MS
2.1.3 Máy móc – trang thiết bị
Các máy móc - trang thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày Bảng 2.3
STT Thiết bị Xuất xứ
1 Cân phân tích Mettler MS 105DU Thuỵ Sỹ
Hệ thống sắc ký lỏng Nexera (Shimadzu) kết nối khối phổ
2 lần LC - MS/MS SCIEX 5500 QTrap (Sciex, Concord,
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và thẩm định các phương pháp định lượng dư lượng một số ma túy trong nước thải bằng LC-MS/MS
BEN-d3, MOR-d3, COD-d3 là nội chuẩn tương ứng của BEN, MOR, COD Các chất này có công thức cấu tạo, tính chất lý hóa tương tự với chất phân tích, chỉ khác nhau về số khối và không có trong tự nhiên nên giảm được các sai số trong quá trình xử lý mẫu, giảm được hiện tượng khử ion
2.2.1.2 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba Tiến hành lựa chọn nguồn ion, thế ion hóa, ion mẹ, điều kiện phân mảnh và các ion con để phân tích được đồng thời các chất nghiên cứu trong hỗn hợp dựa vào tính năng tối ưu hóa (Optimize) của thiết bị Tiến hành khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời các chất nghiên cứu và chuẩn nội
Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn của các chất phân tích và nội chuẩn vào hệ thống khối phổ, không có cột để tối ưu hóa điều kiện khối phổ: Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất
2.2.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký
Qua tham khảo các nghiên cứu đã công bố, lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau:
Pha tĩnh: Cột Kinetex biphenyl (Phenomenex; 50 x 2,1 mm; 1,7 àm) Đõy là cột đặc biệt của C18 do Phenomenex phát triển có ưu điểm tách tốt, có độ chọn lọc cao hơn các cột C18 thông thường
Pha động: Khảo sát hệ pha động gồm 2 kênh:
- Kênh 1: Pha động A là dung dịch amoni acetat 5 mM và acid formic 0,1 % trong nước siêu sạch
- Kênh 2: Pha động B là dung dịch amoni acetat 5 mM và acid formic 0,1 % trong methanol
Chương trình chạy theo gradient với tỷ lệ pha động như sau: Đối với mỗi hệ pha động thay đổi tỷ lệ các thành phần theo chương trình gradient
Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%)
Tốc độ dòng: 0,45 ml/phút
2.2.1.4 Phương pháp lấy mẫu và quy trình xử lý mẫu a Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách
Các chất gây nghiện và các chất chuyển hoá thường có bản chất là các base yếu vì vậy trong các nghiên cứu trước đây các tác giả thường tiến hành acid hóa mẫu thử sau khi thu mẫu đến pH 2 và bảo quản ở -20 °C để tăng độ ổn định của các chất gây nghiện này [9] Khi phân tích, mẫu thử được rã đông ở nhiệt độ phòng Lắc đều Ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C Lọc lớp dịch trong phía trên qua 2 lần giấy lọc băng xanh b Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu thử được lọc qua màng lọc nilong 0,45 àm, sau đú thờm hỗn hợp chuẩn nội với nồng độ 5 ng/ml rồi tiêm vào hệ thống sắc ký
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn làm việc 10 àg/ml: từ dung dịch chuẩn gốc của cỏc chất phõn tớch và nội chuẩn, tiến hành pha cỏc dung dịch chuẩn 10 àg/ml cho mỗi chất trong MeOH
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 àg/ml: lấy 1 ml dung dịch chuẩn làm việc 10 àg/ml của mỗi chất cho vào bình định mức 10 ml và bổ sung MeOH đến vạch
+ Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 100 ppb: lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc 10 àg/ml của mỗi nội chuẩn cho vào bình định mức 100 ml và bổ sung MeOH đến vạch
+ Dóy chuẩn: từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 àg/ml, dung dịch chuẩn nội hỗn hợp
100 ppb pha dãy hỗn hợp các dung dịch chuẩn của 3 chất phân tích với các nồng độ khác nhau với nồng độ từ 0,05 đến 100 ppb, thêm dung dịch chuẩn nội với nồng độ 5 ppb, sử dụng dung môi H2O
Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 4 ºC
Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí của AOAC [10] và 2002/657/EC [17] Bao gồm các tiêu chí: a Độ thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp hê ̣ thống là phép thử nhằ m đánh giá đô ̣ ổn đi ̣nh của toàn hê ̣ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bi ̣
Tiến hành tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất phân tích BEN, MOR, COD nồng độ 1 ppb và chuẩn nội BEN-d3, MOR-d3, COD-d3 nồng độ 5 ppb được pha từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb và nội chuẩn hỗn hợp 100 ppb bằng dung môi H2O vào hệ thống LC - MS/MS Ghi lại các giá tri ̣ thời gian lưu, diê ̣n tích pic Tính tương thích hê ̣ thống được biểu thi ̣ qua đô ̣ lê ̣ch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: RSD về thời gian lưu ≤ 2 % và diện tích pic ≤ 5 % (HealthCare, 2011) b Độ chọn lọc (đặc hiệu) Độ đặc hiệu của phương pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn:
- Mẫu trắng: mẫu nền đã qua quy trình chiết tách
- Mẫu chuẩn: chuẩn hỗn hợp MOR, BEN, COD nồng độ 50 ppb và các nội chuẩn MOR-d3, BEN-d3, COD-d3 nồng độ 5 ppb
- Mẫu trắng thêm chuẩn: mẫu trắng được thêm nồng độ MOR, BEN, COD 50 ppb và các nội chuẩn MOR-d3, BEN-d3, COD-d3 nồng độ 5 ppb
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn cho các pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của các pic trên sắc ký đồ mẫu chuẩn Trong khi đó, mẫu trắng không cho pic ở khoảng thời gian lưu trên Ngoài ra, với phương pháp LC - MS/MS, mỗi chất phân tích cần được xác nhận bằng sự có mặt của hai ion con, đạt yêu cầu về độ đặc hiệu của phương pháp LC - MS/MS với số điểm IP là 4 c Độ tuyến tính (khoảng nồng độ định lượng)
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện phân tích dãy chuẩn hỗn hợp của các chất cần phân tích với 9 nồng độ từ 0,05 ppb đến 100 ppb, nội chuẩn nồng độ 5 ppb Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và tính hệ số tương quan r giữa nồng độ và tỷ lệ giữa diện tích pic của chất phân tích/nội chuẩn
Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính (r) phải đạt theo yêu cầu sau: r ≥ 0,995 d Độ chính xác (độ đúng - độ lặp lại - độ tái lặp) Độ đúng của phương pháp được tiến hành theo quy trình phân tích trên mẫu tự tạo chứa lượng hoạt chất đã biết trước hàm lượng Phân tích các mẫu chứa chất phân tích BEN, MOR, COD tại 3 nồng độ: thấp 1 ppb, trung bình 50 ppb và cao 80 ppb; các nội chuẩn tương ứng ở nồng độ 5 ppb; với mỗi nồng độ tiến hành phân tích 3 mẫu độc lập; tiến hành tương tự vào ngày hôm sau để đánh giá độ tái lặp Thêm chuẩn vào nền mẫu rồi phân tích theo quy trình đã xây dựng Dựa vào đường chuẩn, tỷ lệ đáp ứng của chất phân tích/ nội chuẩn và hệ số chuyển (nếu có) để tính lượng chuẩn tìm lại Tính tỉ lệ chuẩn tìm lại và lượng chuẩn thêm vào để có được độ đúng của phương pháp Tính RSD để xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp Độ đúng, độ lặp lại và độ tái lặp phải đạt yêu cầu của AOAC [10]
Bảng 2.4 Độ thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC STT
Từ 10 - 100 Từ 1 - 10 < 1 Độ thu hồi (%) 80 - 110 60 - 115 40 - 120 Độ lặp lại RSD (%) 15 21 30 Độ tái lặp RSD (%) 22 32 45 e Giới hạn định lượng (LOQ)
Phương pháp ước tính mức độ tiêu thụ một số ma túy nhóm opiat
Sử dụng phương pháp WBE:
Lượng tiêu thụ ước tính = F x C DR
- Lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là BEN để tính toán lượng COC tiêu thụ
- Lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là COD để tính toán lượng COD tiêu thụ
- Lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là MOR để tính toán lượng HER tiêu thụ, tuy nhiên, việc tính toán có phần phức tạp hơn vì MOR còn là chất chuyển hóa của COD và MOR sử dụng trong điều trị Do đó, tính toán HER là khả thi khi biết được lượng COD tiêu thụ và MOR sử dụng trong điều trị [15], [16]
Lượng tiêu thụ HER = MOR HER x F
P x CF HER-MOR MORHER = MORww – MORCOD – MORMOR
MORWW: tổng lượng morphin trong nước thải
MORHER: lượng morphin trong nước thải do heroin chuyển hóa
MORMOR: lượng morphin trong nước thải từ morphin sử dụng trong điều trị MORCOD: lượng morphin trong nước thải do codein chuyển hóa
CFHER-MOR: hệ số hiệu chỉnh của chất chỉ điểm morphin so với chất gốc heroin F: lưu lượng nước thải trong vòng 24 giờ
P: dân sngiờượng nước thải tro
Bảng 2.5 Tỷ lệ thải trừ và hệ số hiệu chỉnh của các chất chỉ điểm sinh học
Tên chất gốc Tên chất chỉ điểm sinh học
(hệ số hiệu chỉnh) HER
- Dư lượng COD trong nước thải bao gồm cả COD sử dụng trong điều trị (các thuốc điều trị ho) và COD lạm dụng trong ma túy Do đó, dựa vào mức tiêu thụ COD không thể đánh giá lượng sử dụng trái phép bằng phương pháp này, chỉ ứng dụng để tính toán lượng HER thông qua chất chuyển hóa của COD là MOR
- MOR sử dụng trong điều trị là rất ít, không tìm thấy dữ liệu Do đó, bỏ qua dư lượng MOR
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn các chất phân tích và chuẩn nội đồng vị có nồng độ 100 ppb vào hệ thống khối phổ, không qua cột với hệ dung môi methanol và nước có chứa acid formic 0,1 % vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và hai ion con để tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Kết quả khảo sát các điều kiện của nguồn ion hóa và điều kiện phân mảnh được thể hiện ở các Bảng 3.1 và Bảng 3.2
Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa
Nguồn ion hoá ESI (+) Điện thế ion hoá (V) 4500
Bảng 3.2 Các điều kiện khối phổ để phân tích các ma túy và nội chuẩn
Tên chất Q1 Ion định lượng Q3 Ion định tính Q3 m/z DP m/z CE CXP m/z CE CXP
Nhận xét: các điều kiện ion hóa và điều kiện phân mảnh ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2 đã xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các chất phân tích nghiên cứu và chất chuẩn nội Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của các chất phân tích và chuẩn nội đều ở dạng [M-H] + có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Chế độ phát hiện là ESI (+) Từ đó, mỗi chất được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định danh Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC - MS/MS của châu Âu với số điểm nhận dạng (IP) là 4
Hình 3.1 thể hiện phổ đồ MS của MOR và MOR-3D Hình 3.2 thể hiện phổ đồ MS/MS của MOR và MOR-3D.
Hình 3.1 Phổ MS của MOR và MOR-3D
+Q1: 50 MCA scans from Sample 4 (Morphine_Fullscan) of Morphine_fullscan.wiff (Turbo Spray IonD Max 1.7e9 cps
+Q1: 40 MCA scans from Sample 1 (Morphine-d3_fullscan) of Morphine-d3_fullscan.wiff (Turbo Spra Max 1.0e9 cps
Hình 3.2 Phổ MS/MS của MOR và MOR-3D
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành pha dung dịch hỗn hợp các chất chuẩn nồng độ 1 ppb và nội chuẩn nồng độ 5 ppb bằng dung môi H2O
Kết quả khảo sát cho thấy: pic của các chất phân tích và các chất chuẩn nội tương ứng cân đối, gọn đẹp Do đó lựa chọn điều kiện sắc ký như trên để phân tích các chất gây nghiện nghiên cứu trong nước thải
Hình 3.3 thể hiện sắc ký đồ của chất phân tích và chất chuẩn nội
+MS2 (286.20) CE (85): 50 MCA scans from Sample 2 (Morphine_Productscan_CE85) of Morphine_Pr Max 3.3e7 cps
+MS2 (289.20) CE (80): 40 MCA scans from Sample 1 (Morphine-d3_productscan) of Morphine-d3_pr Max 4.5e7 cps
Hình 3.3 Sắc ký đồ của các chất phân tích và chất chuẩn nội
3.1.3 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
Từ các kết quả khảo sát, lựa chọn được các điều kiện xử lý mẫu để đồng thời các chất phân tích và chuẩn nội trong nước thải để tiếp tục tiến hành thẩm định: Điều kiện xử lý mẫu:
Mẫu sau khi lấy được acid hóa về pH 2,0 bằng dung dịch acid hydrocloric 1 M, sau đó bảo quản ở -20 °C Sau khi lấy đủ mẫu, rã đông về điều kiện thường, lọc qua màng lọc nilon 0,45 àm Lấy 1 ml dịch lọc cho vào lọ đựng mẫu 2 ml, bảo quản ở -70 °C đến khi phân tích
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05 – 10 ppb mỗi chất và có nồng độ chuẩn nội là 5 ppb Điều kiện phân tích
- Hệ thống sắc ký lỏng Nexera (Shimadzu) kết nối khối phổ SCIEX 5500 QTrap
- Cột: Kinetex biphenyl (Phenomenex; 50 x 2,1 mm; 1,7 àm)
- Tốc độ dòng: 0,45 ml/phút
+ Pha động A là dung dịch amoni acetat 5 mM và acid formic 0,1 % trong nước siêu sạch
+ Pha động B là dung dịch amoni acetat 5 mM và acid formic 0,1 % trong methanol Chương trình chạy theo gradient với tỷ lệ pha động theo bảng sau:
Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%)
Các điều kiện khối phổ như đã trình bày ở Bảng 3.1 và Bảng 3.2
Nồng độ các chất gây nghiện trong mẫu thử được tính toán dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính, tỷ lệ đáp ứng của chất phân tích/ nội chuẩn tương ứng.
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Độ thích hợp hệ thống Độ thích hợp của hệ thống được đánh bằng kết quả tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất phân tích nồng độ 1 ppb và chuẩn nội nồng độ 5 ppb pha bằng dung môi H2O vào hệ thống LC - MS/MS Kết quả phân tích thu được Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC - MS/MS
Tỷ lệ diện tích pic
Nhận xét: Kết quả cho thấy RSD của thời gian lưu rất thấp (
