Vẫn còn thiếu các nghiên cứu đánh giá sự phù hợp của các quy định này với điều kiện tại Việt Nam, cũng như thực trạng mối nguy đối với sức khỏe do phơi nhiễm độc tố vi nấm từ thực phẩm,
TỔNG QUAN
T ỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ VI NẤM
1.1.1 Giới thiệu chung về độc tố vi nấm Độc tố vi nấm là các chất hóa học có độc tính được sinh ra trong tự nhiên bởi một số chủng vi nấm có khả năng sinh độc tố Thuật ngữ độc tố vi nấm (mycotoxin) bắt nguồn từ thuật ngữ “mykes” trong tiếng Hy lạp có nghĩa là vi nấm và thuật ngữ “toxicum” trong tiếng La tinh có nghĩa là chất độc Độc tố vi nấm là các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có độc tính do một số loài vi nấm tổng hợp trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào trong các điều kiện xác định Các độc tố này có thể gây bệnh hoặc gây tử vong cho người và động vật Sự sinh trưởng và phát triển của nó phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái Thuật ngữ mycotoxin thường được áp dụng hạn chế cho các độc tố vi nấm ngoại bào có độc tính đối với động vật máu nóng [5]
Các độc tố vi nấm thường phát triển trên các loại ngũ cốc (ngô, gạo, đậu…) và các loại hạt có dầu (lạc, đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng…), do đó làm ô nhiễm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Thực vật với tư cách là cá thể sống, có thể làm thay đổi cấu trúc hóa học của các độc tố vi nấm như một phần của quá trình bảo vệ chúng chống lại những hợp chất hóa học không do sinh vật ấy tạo ra, khi vào cơ thể nếu không được chuyển hóa và thải trừ sẽ gây rối loạn các quá trình sinh lý-sinh hóa của cơ thể, tạo ra các gốc tự do hoạt động và gây oxy hóa phân tử trong đó có ADN từ đó gây biến đổi và gây bệnh cho cơ thể [15]
Các độc tố vi nấm bị thay đổi cấu trúc hóa học này được gọi chung là các độc tố vi nấm ngụy trang/mang mặt nạ - masked mycotoxin và khó bị phát hiện bởi các phương pháp phân tích thông thường do tính chất hóa học đã thay đổi nhiều so với hợp chất mẹ Các thuật ngữ “ngụy trang” (masked), “ẩn (hidden), “liên hợp” (conjured) và liên kết (bound) được sử dụng không thống nhất trong nhiều tài liệu khác nhau, nhưng thuật ngữ
“ngụy trang” (masked) được sử dụng phổ biến nhất Thuật ngữ này được Gareis nêu ra đầu tiên nhằm mục đích phân biệt các chất là mục tiêu trong quá trình phân tích thông thường với các chất, mặc dù không phải là chất phân tích mục tiêu, nhưng có thể góp phần vào tổng hàm lượng độc tố vi nấm Năm 2014, Hội đồng về các chất gây ô nhiễm trong chuỗi thực phẩm (CONTAM) của Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã định nghĩa độc tố vi nấm biến thể (modified độc tố vi nấm) (thường được gọi là “ngụy trang”) là các chất chuyển hóa của độc tố vi nấm tự do được hình thành trong thực vật hoặc nấm, ví dụ: bằng cách liên hợp với các hợp chất phân cực [31] Theo một số nghiên cứu trên thế giới [12], [15], [17], các chất chuyển hóa của độc tố vi nấm bị thủy phân trong quá trình chế biến thực phẩm hoặc trong đại tràng của động vật có vú sẽ trở thành các độc tố vi nấm ban đầu, gây độc cho con người và động vật Hình 1.1 là cấu trúc một số chất chuyển hóa của độc tố vi nấm đã được định danh và xác định cấu trúc, tuy nhiên
3 một số khác vẫn còn là ẩn số (masked fumonisin) [15]
Hình 1.1 Một số chất chuyển hóa của độc tố vi nấm được làm sáng tỏ về cấu trúc Đặc biệt, các chất chuyển hóa của độc tố vi nấm này chủ yếu được tạo ra bởi thực vật thông qua biến đổi enzym liên quan đến quá trình giải độc (chất chuyển hóa giai đoạn II) và có liên quan đến cơ chế đề kháng của thực vật để chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh Ngoài ra, các biến đổi hóa học của độc tố vi nấm cũng có thể xảy ra trong quá trình chế biến và lên men thực phẩm [16]
Các chất chuyển hóa thực vật đã được xác định cho đến nay chủ yếu là của zearalenon (ZEN) và deoxynivalenol (DON) Đặc biệt, zearalenon-14-glucosid (ZEN- 14G) và deoxynivalenol-3-glucosid (D3G), 15-acetyldeoxynivalenol (15ADON) và 3- acetyldeoxynivalenol (3ADON) đã được chứng minh là thường xuyên được phát hiện trong các loại ngũ cốc bị nhiễm vi nấm tự nhiên như lúa mì, lúa mạch và ngô [16] Theo thống kê [28], DON và các chất chuyển hóa của nó được phát hiện nhiều nhất so với các độc tố vi nấm khác Người ta đã chỉ ra rằng lúa mì tạo ra D3G từ DON để khử độc tố của nấm Fusarium graminearum Do đó, nguy cơ từ DON và các chất chuyển hóa của DON là đáng kể và cần có các nghiên cứu cụ thể
1.1.2 Nguồn gốc, sự hình thành DON
Các loại nấm tạo ra độc tố vi nấm nhiễm vào thực vật khi nấm hoại sinh ở các sản phẩm thực vật sau thu hoạch Chỉ có một số ít loài nấm là tiết ra độc tố vi nấm còn hầu hết các loại nấm còn lại tiết ra một loạt các chất chuyển hóa độc hại khác Các chi nấm quan trọng nhất tạo ra độc tố vi nấm được tìm thấy trong các sản phẩm thực phẩm là Aspergillus, Fusarium, Alternaria và Penicillium Theo Thrane, U [29], các loại nấm Fusarium ưa thích điều kiện ẩm ướt, tức là hoạt độ nước (hay độ ẩm tương đối – aw) cao
4 hơn 0,86 và phát triển tốt ở nhiệt độ từ khoảng 0 o C đến 37 o C, một số loài Fusarium có thể hình thành DON trong thực phẩm và môi trường phát triển của chúng (liên quan đến thực phẩm) được trình bày ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Các loài Fusarium có thể hình thành DON trong thực phẩm và môi trường phát triển của chúng
Loài Fusarium Môi trường sống Các điều kiện khác
Chủ yếu ở vùng ôn đới
Trong ngũ cốc, khoai tây, táo, củ cải đường
Nhiệt độ: 0-31 o C tối đa 35 o C aw nhỏ nhất là 0,87 ở 25 o C, trong điều kiện hiếu khí
Trong ngũ cốc và cỏ aw nhỏ nhất là 0,90 ở 25 o C pH nhỏ nhất là 2,4 ở 30 o C pH lớn nhất là 10,2 ở dưới 37 o C Quá trình chế biến thực phẩm cũng có thể làm thay đổi độc tố vi nấm về mặt hóa học, tuy nhiên hầu hết các hợp chất sinh ra trong quá trình chế biến thực phẩm ít độc hơn so với tiền chất của chúng Các vi sinh vật được sử dụng trong quá trình lên men cũng có thể biến đổi độc tố vi nấm thành các chất chuyển hóa khác, nhưng không được phát hiện bằng các phương pháp phân tích thông thường Các chất chuyển hóa này sinh ra từ các hoạt động enzym của vi sinh vật nuôi cấy được sử dụng để lên men, chẳng hạn như trong sản xuất rượu, bia, xúc xích lên men hoặc dưa chua trộn [15]
Có bốn nguồn chính mà từ đó các chất chuyển hóa của độc tố vi nấm có thể bắt nguồn đó là: nấm, thực vật, quá trình chế biến thực phẩm và từ động vật có vú Nguồn gốc của chúng và mức độ ô nhiễm tối đa đo được trong các loại thực phẩm khác nhau của DON và các chất chuyển hóa được đưa ra trong bảng 1.2 [12]
Bảng 1.2 Một số chất chuyển hóa của DON
Nguồn gốc Chất chuyển hóa của DON Nguyên nhân hình thành
Nấm 3ADON Ngũ cốc bị nhiễm nấm
15ADON Ngô nhiễm nấm Fusarium
Thực vật D3G Từ lúa mì, ngô, lúa mạch, bia
Thực phẩm chế biến Không có chất chuyển hóa Động vật có vú D3G Nước tiểu
Ronald Maul và các cộng sự [25] đã thực hiện một nghiên cứu liên quan đến sự nảy mầm của lúa mạch được xử lý DON và ghi nhận sự xuất hiện của việc “che” độc tố vi nấm này trên diện rộng dẫn đến sự gia tăng D3G Tác giả đã đưa ra giả thuyết rằng sự hình thành D3G có liên quan đến sự gia tăng hoạt động của các enzym liên quan đến glucose như glycosyltransferase, xảy ra trong quá trình nảy mầm của lúa mạch
Thực vật tự bảo vệ mình khỏi các hợp chất xenobiotic như độc tố vi nấm bằng
5 cách chuyển đổi chúng thành các chất chuyển hóa phân cực hơn như mô tả ở hình 1.2 (DON chuyển hóa thành D3G), được vận chuyển vào không bào để lưu trữ thêm hoặc được liên hợp với các chất tạo sinh học như các thành phần của thành tế bào
Hình 1.2 Thực vật chuyển đổi độc tố nấm Fusarium DON thành D3G
1.1.3 Tính chất hóa lý và độc tính
Giới thiệu chung về DON và các chất chuyển hóa được đưa ra tại bảng 1.3 Bảng 1.3: Giới thiệu chung về DON và các chất chuyển hóa của DON
Công thức phân tử C15H20O6 C21H30O11 log P -0,7 -2,3 Đây là những độc tố vi nấm có cấu trúc đặc trưng bởi sự hiện diện của vòng epoxid và dẫn xuất benzopyran với một số biến thể của hydroxyl, acetyl, hoặc các nhóm thế khác Các đặc điểm cấu trúc quan trọng nhất gây ra các hoạt động sinh học của trichothecen là vòng 12,13-epoxy, sự hiện diện của các nhóm hydroxyl hoặc acetyl ở các vị trí thích hợp trên nhân trichothecen và cấu trúc và vị trí của chuỗi bên D3G là hợp chất có tính bazơ cực kỳ yếu (về cơ bản là trung tính), có tính bền nhiệt và khả năng hòa tan trong nước tương đối tốt
Sự lây nhiễm độc tố vi nấm và các chất chuyển hóa của chúng là một vấn đề toàn cầu về an toàn thực phẩm, trong đó DON là chất phổ biến nhất Một cuộc khảo sát trên
17316 mẫu trên toàn thế giới từ năm 2004 đến năm 2011 do trung tâm nghiên cứu BIOMIN đặt tại Áo tiến hành (40% mẫu lấy từ châu Á, 38% mẫu lấy từ châu Âu, 15% mẫu lấy từ Mỹ, 4% mẫu lấy từ Úc và NewZealand, 2% mẫu lấy từ châu Phi, 1% mẫu lất từ Trung Đông) cho thấy DON chiếm tỷ lệ cao nhất (55%) [28] Độc tính của DON
6 được tổng hợp trong bảng 1.4 [9], [26], [35], [36].
Bảng 1.4 Độc tính của DON
P HƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI NẤM
Nhiều phương pháp phân tích được sử dụng để xác định độc tố vi nấm trong thực phẩm, bao gồm các phương pháp sắc ký như TLC, GC, LC và các phương pháp sinh hóa như ELISA
Phương pháp ELISA có thể xác định nhiều hợp chất (độc tố vi nấm mẹ và các dẫn xuất của nó) và cho phép biết được hàm lượng tổng số, điều này phụ thuộc vào phản ứng chéo giữa kháng thể và các dẫn xuất [27] do đó dễ gây sai số dương Milena Zachariasova và cộng sự [34] đã so sánh 2 phương pháp ELISA và LC-MS/MS khi phân tích DON và các chất chuyển hóa trong bia Kết quả cho thấy khi phân tích bằng ELISA có phản ứng chéo của 3ADON với tất cả các lần thử nghiệm, của D3G trong khoảng từ
32 – 78% trong mẫu nước và 51 – 104% trong mẫu bia Ngoài ra còn có các phản ứng chéo của các chất chuyển hóa chưa biết khác do mối tương quan kém của đường chuẩn
Phương pháp sắc ký được sử dụng phổ biến hơn so với ELISA, bao gồm xác định trực tiếp và gián tiếp thông qua quá trình chuyển đổi các dạng liên kết về dạng chất mẹ
Cách xác định gián tiếp thông qua quá trình thủy phân với ưu điểm là không cần có đầy đủ chất chuẩn, các chất chuyển hóa sẽ được chuyển đổi thành dạng độc tố vi nấm mẹ của chúng Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là hiệu suất của quá trình thủy phân chỉ có thể ước tính dựa vào lượng còn lại của các chất chuyển hóa đã biết trước cấu trúc; không thể xác định các chất chuyển hóa khác nhau của cùng một độc tố vi nấm mẹ Đối với phương pháp xác định trực tiếp, điều kiện tiên quyết là độc tố vi nấm mẹ
8 và các chất chuyển hóa của chúng phải tan trong dung môi chiết, sau đó được làm sạch bằng các kỹ thuật khác nhau trước khi phân tích trên thiết bị DON và các chất chuyển hóa của nó là các hợp chất phân cực, tan tốt trong các dung môi như H2O, ACN, MeOH hoặc hỗn hợp các dung môi này, do đó phương pháp trực tiếp được ưu tiên sử dụng Kỹ thuật LC-MS/MS với nhiều ưu điểm (phân tích nhanh, đồng thời, đặc hiệu, độ nhạy cao, dung môi thân thiện với môi trường) được đa số các nghiên cứu trên thế giới lựa chọn
Làm sạch mẫu sau khi chiết là một yếu tố quan trọng để định lượng chính xác các chất phân tích Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật được ứng dụng rất phổ biến ngày nay trong phân tích hàm lượng vết do khả năng làm giàu và làm sạch mẫu rất tốt Tuy nhiên, do các chất chuyển hóa thường phân cực hơn so với độc tố vi nấm mẹ, nên việc sử dụng các cột SPE hay cột ái lực miễn dịch (IAC) được bán trên thị trường ở dạng thành phẩm có thể không phù hợp [15]
Bảng 1.5 tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới sử dụng LC-MS/MS để xác định DON và các chất chuyển hóa.
9 Bảng 1.5: Một số nghiên cứu phân tích DON sử dụng LC - MS/MS
TLTK Điều kiện sắc ký Điều kiện MS Nền mẫu
Phương pháp xử lý mẫu LOQ Nhận xét
[6] Cột C18, 100 mm × 3,0 mm, 2,7 àm Phenomenex
Chiết mẫu bằng dung môi ACN chứa acid formic 1,25%
Chỉ nghiên cứu DON mà chưa nghiên cứu các chất chuyển hóa của nó Quy trình xử lý mẫu đơn giản, nhanh, tiết kiệm
Pha động: HCOOH 0,1% trong nước (A) và acetonitril (B)
QuEChERS Chiết mẫu bằng dung môi ACN chứa 1% acid formic
Chỉ nghiên cứu DON mà chưa nghiên cứu các chất chuyển hóa của nó Quy trình xử lý mẫu đơn giản, nhanh, tiết kiệm LOQ cao
[22] Cột: Cortecs C18 100 mm x 2 mm x 2,8 àm (Waters)
Pha động: A: Nước, 5 mM amoni acetat, 0,1% acid acetic;
B: Methanol/nước (95/5), 5 mM amoni acetat, 0,1% acid acetic
Ion hóa ESI (+) và (-), ghi phổ SRM
Ngũ cốc Chiết QuEChERS bằng dung môi acid acetic 1% trong ACN Thổi khô và hoàn nguyên bằng MeOH: H2O(2:8)
DON, 3ADON và 15ADON 20 àg/kg
Quy trình xử lý mẫu phức tạp Hình dạng pic cân xứng, LOQ thấp, tách DON, D3G
C18 (3,5 àm, 100 mm x 4,6 mm) (Agilent Technologies,
(95/5), 10 mM amoni acetat, điều chỉnh về pH 3 bằng acid acetic; B: Methanol/nước
(95/5), 10 mM amoni acetat, điều chỉnh về pH 3 bằng acid acetic
Ion hóa ESI (+), ghi phổ SRM
Chiết rắn – lỏng bằng dung môi ACN/H2O/
CH3COOH (79/20/1), loại béo n-hexan Dịch chiết được thổi khô, hòa cặn trong dung môi pha động có pH 3
DON = 12 àg/kg D3G = 16 àg/kg 3ADON 10 àg/kg 15ADON 12 àg/kg
Xác định đồng thời 13 loại độc tố nấm mốc, bao gồm cả các dẫn xuất bị che giấu của chúng Quá tình xử lý mẫu đơn giản, bước khử chất béo hexan bổ sung cho phép tăng độ nhạy, dẫn đến chất chiết tương đối sạch hơn LC đã tách DON với D3G
[30] - Cột: Synergi Polar RP-18 (150 × 3 mm, 4 μm) từ Phenomenex
- Pha động: A: Nước chứa 5 mM amoni acetat; B: ACN
Ion hoa ESI (-), ghi phổ SRM
Ngũ cốc Chiết rắn – lỏng bằng dung môi ACN/H2O/CH3CO
OH (79/20/1) Ly tâm lấy dịch chiết và khảo sát hiệu quả làm sạch của 7 loại cột SPE và IAC khác nhau
Phương pháp xác định đồng thời DON, ZEA và tám chất chuyển hóa của chúng Quy trình xử lý mẫu đơn giản, sử dụng dịch chiết thô để phân tích mà không có bước làm sạch dễ gây ảnh hưởng nền (LOQ của D3G và DON cao), giảm tuổi thọ của thiết bị
11 [31] Cột: Cột Acquity UPLC HSS
Pha động: A: Nước, 0,1% acid formic; B: Methanol, 0,1% acid formic và 10mM amoni format
Ion hóa ESI (+), ghi phổ SRM
Chiết rắn - lỏng bằng dung môi ACN/HCOOH (99/1) Lọc qua màng 0,22 àm
Thổi khô làm giàu và hoàn nguyên bằng MeOH 50%
DON = 3,5 àg/kg D3G = 4,9 àg/kg 3ADON 2,8 àg/kg 15ADON 4,3 àg/kg
Phương pháp xử lý mẫu đơn giản, có thổi khô và chuyển đổi dung môi đạt được độ nhạy cao và pic tốt hơn Phương pháp xác định được nhiều độc tố vi nấm và chất chuyển hóa của chúng
(4,6 x 150 mm, 5 mm) Áp dụng gradient tuyến tính metanol/axit axetic (1%)/dung dịch amoni axetat (5 mM) (từ
Ion hóa ESI (-), ghi phổ SRM DON: (m/z) 355,1 59,1;
Mẫu chiết bằng ACN/H2O/CH3CO
OH (79/20/1), dịch chiết thô được pha loãng 1/1 đối với mẫu có hàm lượng thấp hoặc 1/9 đối với mẫu có hàm lượng cao bằng dung môi chiết trước khi phân tích trên thiết bị
Phương pháp xử lý mẫu đơn giản Nghiên cứu tập trung vào DON và D3G, vẫn có phát hiện các độc tố vi nấm khác như 3ADON và 15ADON nhưng chưa được định lượng rõ ràng
98% ACN, cả hai đều chứa 2 mM amoni acetat
Ion hóa ESI (-), ghi phổ SRM
Chiết rắn – lỏng bằng dung môi ACN/H2O (20:80)
Không làm sạch và phân tích trực tiếp bằng LC-MS/MS
= 40 àg/kg 15ADON 120 àg/kg
Quy trình xử lý mẫu đơn giản, cho phép phân tích trực tiếp các chất phân tích Không dùng các phương pháp làm sạch có thể lần nhiều tạp, ảnh hưởng đến khả năng phân tích, gây nhiễu nền (LOQ cao) và giảm tuổi thọ của cột và thiết bị [32] Cột: 100 × 2,1 mm; 1,7 μm;
Pha động: A: 0,1% amoniac trong nước và B: ACN
Ion hóa ESI (-), ghi phổ MRM
Hạt ngô và các sản phẩm làm từ ngô
Chiết rắn – lỏng bằng dung môi ACN/H2O (84/16)
So sánh SPE và pha loãng mẫu trong việc làm sạch
Quy trình xử lý mẫu đơn giản, độ nhạy cao Điều kiện LC đã tách được DON và D3G
[37] Cột: Agilent Extend-C18 (3,0 mm × 150 mm, 3, 5 μm) ; YMC
CHIRAa ART Cellulose-sc (3,0 mm ì 250 mm, 3 àm)
Pha động: MeOH (A) và nước chứa 5 mM amoni acetat (B)
Ion hóa ESI (+) và ESI (-)
Thức ăn chăn nuôi, ngô
Chiết rắn – lỏng bằng dung môi ACN/ H2O (84/16)
Làm sạch bằng MgSO4 và hexan
Phương pháp tách và phân tích cả 4 độc tố vi nấm Quy trình xử lý mẫu nhanh chóng và đơn giản
Cột sắc ký sử dụng là các cột có pha tĩnh sơ nước (cột C18), nhưng mỗi nghiên cứu lại sử dụng một cột khác nhau nên có hiệu lực tách khác nhau Pha động sử dụng đa dạng như sử dụng đệm acetic-acetat, đệm fomic-fomat và HCOOH 1% giúp tăng khả năng ion hóa, ổn định chất, cộng hợp để tạo mảnh ion mẹ, tăng tín hiệu phân tích Chương trình pha động sử dụng là gradient hỗ trợ quá trình tách các chất phân tích
Có nhiều lựa chọn về ion mẹ của các loại độc tố nấm mốc, cả ở chế độ dương và âm Các ion tiền chất thu được và phản ứng tương đối của chúng phụ thuộc vào thành phần pha động và thiết bị MS được sử dụng
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đ ỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: độc tố vi nấm DON và chất chuyển hóa của DON là D3G Đối tượng mẫu được lựa chọn để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp và để ứng dụng phương pháp là mẫu ngô khô và mẫu sản phẩm từ ngô gồm bột ngô và ngũ cốc ăn liền từ ngô được lấy ngẫu nhiên trên thị trường.
P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ gồm sắc ký lỏng HPLC LC20AD-XR của Shimadzu và khối phổ ABSciex Triple Quad 6500
- Máy đồng nhất mẫu, Phillips
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo
- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich
- Máy rung siêu âm Elmasonic S180 (Đức)
- Micropipet cú thể tớch điều chỉnh được 2 – 20 àL, 10 – 100 àL, 20 – 200 àL, 10 – 1000 àL và 1000 – 5000 àL
- Bình định mức các loại từ 5 mL – 100 mL
- Ống ly tâm 50 mL, 15 mL
- Bộ lọc màng cú cỡ lỗ 0,45 àm và bộ lọc hỳt chõn khụng
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích
- Dung môi loại dùng cho sắc ký methanol, acetonitril (Merck, Đức)
- Các hóa chất Acid formic 89-91%, Acid acetic 100%, Amoni acetat, Natri acetat (Merck, Đức)
- MgSO4 khan (Xilong scientific Co.,Ltd, China)
- NaCl (CTCP tập đoàn hóa chất Đức Giang, Việt Nam)
- Chất hấp phụ gồm có C18, PSA, GCB của Agilent (Hoa Kỳ)
- Dung môi chiết: Dung dịch acetonitril chứa 1% acid acetic (v/v): Hút 10 mL acid acetic hòa vào acetonitril, định mức đến 1 L, lắc đều
- Dung môi hoàn nguyên: Dung dịch methanol:nước (2:8): Pha 20 mL methanol vào nước, định mức đến 100 mL, lắc đều
- Chuẩn Deoxynivalenol; Romer labs (lô số DO84300000), độ tinh khiết 100%
- Chuẩn Deoxynivalenol-3-glucosid 50 àg/mL in Acetonitrile; LGC Standards GmbH (lô số 1000035960)
2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Chuyển toàn bộ chất chuẩn vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ DON (100,1 àg/mL) Bảo quản ở -3 o C – -8 o C, sử dụng trong 1 năm
- Dung dịch chuẩn đơn 5 àg/mL: Hỳt mỗi dung dịch chuẩn gốc và pha bằng MeOH theo bảng 2.1, lắc đều Bảo quản ở -3 o C – -8 o C, sử dụng trong 1 tháng.
Bảng 2.1: Pha dung dịch chuẩn đơn trung gian
VMeOH (àL) Định mức vđ 5 mL 900
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 àg/mL: hỳt mỗi dung dịch chuẩn gốc theo bảng 2.2 vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng MeOH, lắc đều Bảo quản ở -
Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian
- Dãy dung dịch chuẩn làm việc: pha các dung dịch chuẩn làm việc theo bảng 2.3.
Bảng 2.3 Pha dung dịch chuẩn làm việc Nồng độ chuẩn 50 ng/mL
Vdd chuẩn 5 àg/mL (àL) 10 20 40 60 80 100
N ỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định DON và các chất chuyển hóa bằng LC-MS/MS
- Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn DON, D3G nồng độ 1 ppm vào khối phổ và tham khảo các tài liệu để tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp
- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: khảo sát điều kiện pha tĩnh, điều kiện pha động, khảo sát điều kiện gradient
2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
Tham khảo các nghiên cứu trước đây và thực hiện các khảo sát để lựa chọn
19 phương pháp xử lý mẫu tốt nhất, bao gồm hai giai đoạn chính là tìm dung môi thích hợp để chiết xuất chất nghiên cứu và làm sạch dịch chiết để loại bỏ ảnh hưởng của các tạp chất
2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền
Xây dựng đồng thời đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng cho chất phân tích
Xác định ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng cách so sánh 2 hệ số góc của đường chuẩn theo công thức sau:
- ME% >0: ảnh hưởng nền dương, nền mẫu gây tăng tín hiệu chất phân tích
- ME% 249,1 và 297>231,1 cho pic có tín hiệu cao, ít bị ảnh hưởng nền ở mảnh Kết quả ở hình 3.5 cho thấy, D3G xuất hiện pic ở mảnh 297>249,1 và 297>231,1 cho tín hiệu cao hơn so với mảnh 476>249 và 476>297
Do các mảnh này trùng với mảnh của DON nên cần khảo sát điều kiện tách sắc ký
Kết quả ion mẹ, mảnh ion con lựa chọn và các thông số cho từng mảnh được trình bày ở Bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả và điều kiện MS của chất phân tích
CE (eV) DP (eV) Ứng dụng
Tối ưu các thông số thiết bị:
Các thông số áp suất khí mang (CUR), áp suất khí (CAD), thế ion hóa (IS), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất khí nguồn 1 (GS1), áp suất khí nguồn 2 (GS2) được tối ưu tự động sau khi đã chọn được ion mẹ và các mảnh con, được trình bày ở Bảng 3.2
Bảng 3.2: Các thông số tối ưu cho thiết bị MS Áp suất khí màng Curtain gas (CUR) 30 psi Áp suất khí va chạm Collision gas (CAD) 8 psi
Thế ion hóa Ionspray Voltage (IS) 5000 V
Nhiệt độ nguồn ion Temparature (TEM) 550 o c Áp suất khí nguồn 1 Ion source gas 1 (GS1) 60 psi Áp suất khí nguồn 2 Ion source gas 2 (GS2) 70 psi
3.1.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 200 ppb để khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn điều kiện pha tĩnh:
26 Pha tĩnh có khả năng lưu giữ các chất phân tích và đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất trong hệ thống sắc ký Ái lực pha tĩnh với các chất phân tích quyết định hiệu lực tách của sắc ký
Cần lựa chọn cột có khả năng tách DON và D3G khi đo các chất độc tố nấm này vì ở chế độ ion dương D3G dễ bị phân mảnh/mất glucose, phân hủy D3G thành DON Dựa vào cấu trúc hóa học thấy được các chất phân tích là các phất phân cực Qua tham khảo các tài liệu [21], [22], [23], [37] và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã khảo sát các cột sau:
- (2) Waters UPLC BEH amide (2,1 mm × 150 mm, 1,7 μm)
- (3) Waters UPLC BEH C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,7 μm)
Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.8
Hình 3.6 Kết quả khảo sát pha tĩnh
Sau khi khảo sát 3 cột trên, so sánh sắc ký đồ ở điều kiện các cột về hiệu quả tách và hình dạng pic Kết quả ở hình 3.6 cho thấy cột (1) pic DON và D3G không tách Cột (2) cho kết quả pic không tách, chẻ nhiều Trong khi đó, cột (3) cho kết quả DON và D3G đã tách, ngoài ra pic cũng đều, đẹp và cân xứng hơn do cột có kích thước hạt nhỏ và dài nên khả năng tách tốt hơn Do đó, cột Waters UPLC BEH C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,7 μm) được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu
Khưers UPLC BEH C18 (2,1 mm ghiên cm, 1,7
Pha động trong LC – MS/MS ngoài ảnh hưởng đến hiệu quả tách còn ảnh hưởng tới quá trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích Với kỹ thuật ion hóa phun điện tử bắn phá ở chế độ dương ESI (+), quá trình ion hóa tăng khi có thêm các chất cung cấp
H như acid acetic, acid formic, amoni acetat, amoni format…Theo nghiên cứu trước đây hỗn hợp hai dung môi gồm acid acetic 0,1% và 5mM amoni acetat trong nước và methanol được sử dụng phổ biến Tiến hành khảo sát các hệ pha động:
27 (1) Kênh A: nước, amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1%; Kênh B: methanol/nước (95/5), amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1%;
(2) Kênh A: nước, amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1%; Kênh B: acetonitril/nước (95/5), amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1%;
(3) Kênh A: nước, amoni format 5 mM, acid formic 0,1%; Kênh B: acetonitril/nước (95/5), amoni format 5 mM, acid formic 0,1%;
(4) Kênh A: acid formic 0,1%/nước; Kênh B: acetonitril
Kết quả khảo sát pha động được trình bày ở Hình 3.9 Chạy theo chương trình gradient 1 ở bảng 3.3
Hình 3.7 Kết quả khảo sát pha động Nhận xét: Kết quả ở hình 3.9 cho thấy, pha động (1) không tách được D3G với
DON, pic tù, chẻ ngọn Pha động (2), (3) và (4) đã tách được DON với D3G Pha động (3) cho pic tù, kéo đuôi Pha động 4 cho pic của D3G tù, kéo đuôi và bị ảnh hưởng nền cao Pha động (2) cho pic nhọn, không bị chẻ và ít bị ảnh hưởng nền Do đó pha động (2) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
Khược lựa chọn cho cáchương trình gradient:
Cố định các thông số sau:
- Cột Waters UPLC BEH C18 (2,1 mm x 150 mm; 1,7μm) và tiền cột cùng hãng tương ứng
- Tốc độ dòng: 0,15 mL/phút
- Điều kiện MS theo bảng 3.1
- Pha động: A: Nước, amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1%
B: Acetonitril/nước (95/5), amoni acetat 5 mM, acid acetic 0,1% Kết quả khảo sát gradient dược thể hiện ở Bảng 3.3 và Phụ lục 2
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát gradient
TT Điều kiện gradient Nhận xét
Các pic nhọn, không bị chẻ nhưng bị kéo đuôi Độ rộng chân pic khoảng 0,4 phút với DON và D3G tách nhau với Rs = 1,2
Các pic nhọn, không bị chẻ, bị kéo đuôi Độ rộng pic khoảng 0,3
- 0,4 phút với DON và D3G tách chưa với Rs = 1,1
Các pic nhọn, không bị chẻ nhưng bị kéo đuôi Độ rộng chân pic khoảng 0,35 - 0,4 phút với DON và D3G tách với Rs = 1,2
Pic bị chẻ, nền cao Pic ra muộn Độ rộng pic khoảng 0,5 phút Các pic chưa tách ra khỏi nhau
Pic nhọn, không bị chẻ Pic ra sớm hơn, thời gian chạy ngắn hơn Độ rộng chân pic khoảng 0,2-0,3, DON và D3G tách nhau với Rs = 1,2
Pic nhọn, ra sớm , thời gian chạy ngắn Tuy nhiên DON và D3G chưa tách nhau (Rs=0,8)
29 Nhận xét: Sau khi nghiên cứu các chương trình gradient khác nhau, kết quả cho thấy với điều kiện cột của phòng thí nghiệm và pha động trên thì pic của DON và D3G có thể tách bằng sắc ký với Rs là 1,2 Gradient 5 là gradient có hình dạng pic, hiệu lực tách như gradient 1, 2, 3, 4 nhưng thời gian chạy ngắn hơn Vì vậy gradient 5 được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu
Bảng 3.4 Điều kiện sắc ký lựa chọn
Cột sắc ký Cột Waters UPLC BEH C18 (2,1 mm x 150 mm; 1,7 μm) và tiền cột cùng hãng tương ứng
Pha động A: Nước, 5 mM amoni acetat, 0,1% acid acetic
B: Acetonitril/nước (95/5), 5 mM amoni acetat, 0,1% acid acetic
Chương trình gradient Ban đầu 1% B (2 phút), tăng lên 90% từ 2-10 phút; giữ trong 2,5 phút; đưa về 1% từ 12,5-13 phút và giữ 1% trong 2 phút để cân bằng cột Tổng thời gian là
Tốc độ dòng 0,15 mL/phút
3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Mẫu phân tích là các mẫu thực phẩm chứa rất nhiều tạp chất, chúng sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả, do đó cần được xử lý, chiết tách để làm giàu mẫu, loại tạp chất, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện Để chiết tối đa lượng chất phân tích và giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu và tiết kiệm nhất, tiến hành khảo sát các yếu tố có thể ảnh hưởng như dung môi chiết, thiết bị chiêt, thể tích chiết, muối chiết, chất làm sạch, dung môi hoàn nguyên
Sử dụng mẫu ngô dương tính với DON và D3G để thực hiện khảo sát ở các điều kiện khác nhau, mỗi điều kiện thực hiện lặp lại 2-3 lần, lấy giá trị trung bình Kết quả của mỗi lần khảo sát sẽ được so sánh thông qua thông số diện tích pic
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Ứ NG DỤNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DON VÀ MỘT SỐ CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NÓ TRONG MẪU NGÔ VÀ SẢN PHẨM TỪ NGÔ
Các mẫu ngô, sản phẩm từ ngô như ngũ cốc ăn liền, bột bắp… được mua ngẫu nhiên tại các chợ dân sinh, cửa hàng trên địa bàn Hà Nội Tiến hành xử lý mẫu và phân tích theo quy trình đã xây dựng tại Hình 3.15 Đánh giá kết quả:
- So sánh thời gian lưu, mảnh mẹ, mảnh con, tỷ lệ mảnh định tính và định lượng để xác định sự có mặt của chất phân tích
- Tính hàm lượng chất phân tích có trong mẫu dựa trên đường chuẩn xây dựng trong ngày Kết quả được trình bày trong Bảng 3.15 và Phụ lục 8
Bảng 3.15 Kết quả phân tích mẫu thực
Mã mẫu Mẫu Thời điểm lấy mẫu Địa điểm lấy mẫu
N1 Ngô 23/04/2024 Trường Yên 2,5042 < LOD < LOD N2 Ngô 23/04/2024 Chúc Sơn 2,5109 < LOD < LOD N3 Ngô 23/04/2024 Siêu thị 2,5074 28,1 < LOD N4 Ngô 23/04/2024 Thụy Hương 2,5092
