BAO CAO TONG KET DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC CO QUAN QUAN LY DE TAI: BO Y TẾ
CO QUAN CHỦ TRÌ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Tên đề tài:
MỐI TƯƠNG QUAN CỦA MỘT SỐ ENZYM THEN CHỐT VÀ CHẤT
CHUYEN HOA 2,3 - DPG TRONG CHUYEN HOA HONG CAU
Chủ nhiệm đề tai:
GS.TSKH Nguyễn Hữu Chấn
Bộ mơn Hố - Hóa sinh - Đại học Y Hà Nội Các cộng tác viên chính:
1.TS.Vũ Thị Phương (thư ký để tài} Đại học Y Hà Nội 2 TS Hoàng Hạnh Phúc Đại học Y Hà Nội
3 TS Đỗ Thị Thu Đại học Y Hà Nội
4.TS Phạm Thị Lý Đại học Y Hà Nội
Phụ trách tài chính:
TS Dé Thi Thu
CN La Ngoc Thuy
Thoi gian thuc hién: 1996 - 2000
Kinh phí tài trợ: Ngân sách của Bộ Y tế : 67.000.000 đ
4„oJ- 6U - 170 /&KÂ
(1/42/20
3956
Trang 2MUC LUC
I - Phần mở đầu
ll - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu II - Kết quả nghiên cứu
IV - Nhận xét và bàn luận
V - Những đóng góp vào sự phát triển khoa hục kỹ
thuật và dao tao can bd
VIL - Những tư liệu khoa học có liên quan , VI - Tài liệu tham khảo
Trang Í
Trang 3NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT G,.PD ALD PK _ 2,3-DPG ° Hb NADP GgPDNa; ‘TBA MDA ADN PEP TIM GDH PGM MĐQH E.M HMP TTTBHC HbTBHC HCL Glucose-6-phosphat dehydrogenase Fructose 1,6 diphosphat Aldolase Pyruvat Kinase 2,3 - diphosphoglycerat Hemoglobin Nicotinamid - Adeniri - Dinucleotid Disodium - glucose-6-phosphat Thiobarbituric acid Malonyldialdehyd Acid deoxyribonucleic Phosphoenol pyruvat Triose phosphat isomerase Glycerol dehydrogenase Phosphoglycerat Phospho glycerat mutase Mật độ quang học Embdem - Meyerhoff Con đường phân giải glucose Hexose monophosphat Chu trình pentose
Trang 4I-PHAN MO DAU
Hồng cầu trưởng thành không có nhân, không có ty thể, lưới nội sinh chất và ribosom Vì vậy hồng cầu không tổng hợp được enzym, protein và
acid nucleic Hồng cầu chỉ sống được với lượng protein và enzym dự trữ của nó, các chất không được đổi mới mà bị phân huỷ dần, hồng cầu sẽ chết khi dự
trữ cạn kiệt [14,21,5 1]
Nhiệm vụ chính của hồng cầu là vận chuyển Ở; đến các mo va idt
phần CO; từ các mô về phổi Chuyển hoá chất trong hồng cầu trưởng thành
có một số đặc điểm riêng, năng lượng được sử dụng trong hồng cầu chú yêu do con đường Embden Mayerhoff (EM) cung cấp, mà cơ chất chính là
glucose Hồng cầu là một tế bào chứa oxy, cho nên các cấu trúc của nó thường xuyên có nguy cơ bị oxy hoá, rất nhạy cảm với quá trình oxy hoá và rất dễ bị huỷ hoại, Vì vậy, trong cơ chế chuyển hoá của hồng cầu, một phần quan trọng là hướng vào việc bảo vệ các cấu tử của hồng cầu chống lại các
quá trình oxy hoá [9,10,66]:
Để chống lại hiện tượng oxy hoá , hồng cầu có cả một bộ máy để thực hiện cơ chế khử Tuy không tổng hợp được protein và enzym, nhưng hồng cầu vẫn có khả năng tổng hợp một số mono và dinucleotid như ATP, NAD", NADP”, FAD để tham gia vào chức năng chống oxy hoá và chức năng khác
của hồng c4u [1,9,86]
Sự chuyển hoá trong hồng cầu chủ yếu là chuyển hoá glucose [1,21]
Quá trình này bao gồm con đường phân giải glucose hay còn gọi là con đường Embden Mayerhoff Con đường này có một chu trình nhánh quan trọng gọi là chu trình pentose hay còn gọi là chu trình hexose monophosphat
(HMP) Nhánh phân giải glucose để cung cấp năng lương bắt dầu từ enzyn
Trang 5chu trinh pentose chi yếu để cung cấp NADPHH” cho các quá trình chống
oxy hoá của hồng cầu Trong con đường chuyển hoá glucose của hồng cầu có
rất nhiều enzym tham gia và hình thành các chất trung gian khác nhau mà
trong công trình này, chúng tôi quan tâm đến một số enzym và chất chuyển
hoa sau day : [1,21,51,86]
* Glucose-6-phosphate dehydrogenase (GsPD) Enzym này nàm trên
chromosom X, là enzym then chốt trên con đường BM, mở đầu cho chu trình
HMP Chu trình này có vai trò đặc biệt quan trọng đối với qúa trình chống oxy hoá trong hồng cầu, liên quan mật thiết với các enzym glutathion reductase, ghutathion peroxydase, catalase, metHb reductase .[2 —>8, 13,15,17—>20]
* Fructose 1,6 - diphosphat - Aldolase (ALD) là.enzym ở ngã ba dường cất hexose diphosphat hành hai triose phosphat ợ
* Pyruvat kinase (PK) là enzym xúc tác quá trình chuyển hoá từ acid phospho
enol pyruvat (PEP) thành pyruvat và tạo ra ATP Enzym này có liên quan mật
thiết với sự chuyển hoá năng lượng trong hồng cầu và liên quan với chu trình
2,3 diphospho glycerat (2/3 DPG) là một nhánh của con đường EM
* Chất chuyển hoá 2.3 - DPG, là chất nằm trong khoang rỗng nơi tiếp giáp của bốn chuỗi globin của phân tử HIb, có tầm quan trọng đặc biệt, có liên quan mật thiết với ái lực của HIb đối với oxy và có vai trò quan trong trong việc điều hoà sự vận chuyển oxy của Hb Chất này có vai trò như một yếu tố dị lập thể Am
Chúng tôi cũng quan tâm đến trạng thái biến đổi về hoạt độ của các enzym kể trên và vai trò của chất chuyển hoá 2,3 - DPG trong những bệnh do đị tật cấu trúc phân tử của hemoglobin
Trang 6Những loại bệnh đo khuyết tat (a) đã phát sinh ra các bệnh HbS, HbC, HbE Những khuyết tật do nguyên nhân (b) thì tương ứng với các bệnh Thalassemia và một số trường hợp bệnh lý khác
Theo nguyên lý chung về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng thì khi có sự thay đổi về cấu trúc sẽ làm ảnh hưởng đến chức năng , Về mat huyét
học thì những vấn để này đã khá rõ ràng, nhưng về mặt chuyển hoá và enzym học thì chưa được chú ý, tài liệu còn nghèo nàn [6]
Điểm qua một số công trình nghiên cứu có liên quan :
* Về GỐPD, enzym này đã được chú ý từ lâu và đã được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu về nhiều mặt, gồm những nghiên cứu cơ bản,
những nghiên cứu phân loại, những nghiên cứu theo vùng địa lý, những nghiên cứu liên quan đến khuyết tật của gen cấu trúc và đặc biệt là khuyết tật gây thiếu hụt hoạt tính của enzym, gây ra hiện tượng huyết tán [25-428,37,38,41>44,74-987,94397|
* Vé ALD, enzym này còn ít được lưu ý, nhưng cũng đã có một số tác giả
nghiên cứu về hoạt độ của nó trong một số trường hợp sinh lý và bệnh lý,
nghiên cứu mối liên quan của nó với sự thiếu hụt của một số enzym khác
trong chuyển hoá, nhưng kết quả cồn rất nghèo nàn và chưa rõ rang (40-45)
* Vé PK, sau G6PD, enzym này cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu về nhiều mặt , bao gồm những nghiên cứu về sự thiếu hụt hoạt độ, một số nghiên cứu cơ bản, các đột biến trên ADN tương ứng (22,23,29,30,55-65,71,73,88,90,91]
* Về 2,3-DPG, một số tác giả đề cập đến mối liên quan với PK và với một số
chất chuyển hoá trung gian khác, với khí máu và một số bệnh Hb
[40,67,70,71,72,77,78]
* Về bệnh B thalassemia, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhưng chủ yéuda về lĩnh vực huyết học và di truyền học, nhưng về mặt hoá sinh học và cnzym học thì chưa được chú ý, những tư liệu mà chúng tôi có còn rất nghèo
Trang 7Hoá sinh hoc ngày nay hầu như đã phát hiện được hầu hết các con đường chuyển hoá, nhưng mối tương quan của các khâu chuyển hoá và sự điều chỉnh lẫn nhau của chúng thì còn nhiêu vấn dé chưa rõ ràng Trong chuyển hoá hồng cầu, người ta đã gợi ý rằng có sự liên quan giữa hoạt động
xúc tác của PK với các chất chuyển hoá, đặc biệt là 2,3 PDG, nhưng cũng
chưa có công trình nào chứng minh về mối tương quan của chúng
Công trình này sẽ được thực hiện tương đối có hệ thống trên nhiều đối
tượng, giữa nhóm bệnh Hb với nhóm người trưởng thành và trẻ em và cũng
được đối chiếu với động vật thực nghiệm là thỏ và chuột , Làm như vậy để tìm một định hướng cho việc nghiên cứu tiến hoá luận về enzym học và cũng để kết hợp giữa hoá sinh học cơ bản với hoá sinh học lâm sàng
Báo cáo khoa học nghiệm thu này là bản tóm tắt khái quất những kết
quả đã thu được của nhóm chúng tôi trong 5 năm làm nghiên cứu, đã trình bầy trên hai ban luận án tiến sĩ và 13 bài báo viết bằng tiếng việt và tiếng anh,
1 luận án thạc sĩ và một số báo cáo khoa học chuyên ngành hoá sinh -
Mục đích của công trình :
Tìm hiểu mối tương-quan của hoạt độ một số enzym then chốt và nồng độ chất chuyển hoá 2,3-DPG trong hồng cầu của trẻ em, người trưởng thành, người bệnh Hb và động vật, đồng thời thu thập và liên hệ những thông tin
khoa học về hoá sinh cơ bản và hoá sinh học lâm sàng
Noi dung cu thé:
* Vé Hoa sinh hoc co ban:
1 Hoạt độ của GgPD, ALD, PK trên nhiều đối tượng khác nhau
2 Tác động của các stress oxy hoá đối với hoạt độ G¿PD và sự peroxy hoá lipid màng hồng cầu
3 Nồng độ 2,3-DPG và mối tương quan của nó với hoạt độ của PK * Về Hoá sinh lâm sàng :
Trang 8- Mối tương quan của hoạt độ G¿PD hồng cầu đối với số lượng hồng cầu trưởng thành
- Mối tương quan của nồng độ 2,3-DPG đối với nồng độ Hb ,
Trang 9I-ĐỐI TƯỢNG, CHẤT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨUƯ
Đối tượng, chất liệu, thiết bị :
1- Chất liệu các mẫu thử từ người và động vật
2- Chất liệu các mẫu thử từ bệnh nhân Hb
3- Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 4- Những hoá chất chính
Phương pháp, kỹ thuật dùng trong nghiên cứu :
1- Phương pháp tách hồng cầu
2- Xác định hoạt độ của GạPD theo phương pháp của WHO 3- Uớc lượng hoạt độ của GạPD bằng thử nghiệm Beutler 4- Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion để xác định tỷ lệ HbA¿, HbE 5- Phuong pháp xác định hồng cầu lưới
6- K¥ thuat dién di Hb trén mang cellulose acetat
7- Xác định hoạt độ GạPD theo kit
8- Xác dinh hoat dé ALD theo kit
9- Xác dịnh hoạt dO PK theo kit
10- Xác định nồng độ 2,3-DPG trong máu theo kít, 11- Phương pháp dịnh lượng Hb
12- Thử nghiệm tác động của stress oxy hoá đối với hoạt độ của G,PD và quá trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu
Trang 10A-ĐỐI TƯỜNG, CHAT LIEU, THIẾT BỊ :
1 Chất liệu các mẫu thử từ người và động vật
Chất liệu của các mẫu thử trong nghiên cứu là hồng cầu người trưởng thành, trẻ em, thỏ (orytolagus culiculus) và chuột cống trắng (Ratus norvegicuss) Đối tượng nghiên cứu được chia làm ba lô :
- Lô thứ nhất gồm người trưởng thành và trễ em :
© Hồng cầu của nguời cho máu tại Viện Huyết học và truyền máu, gồm cả nam và nữ, tuổi từ 18 đến 55, đã được chọn ngẫu nhiên trong số những
người đủ tiêu chuẩn cho máu
e Hồng cầu trẻ em từ 6 tháng tuổi đến 15 tuổi tại Viện Nhị, không có benh về huyết học và enzym Các mẫu máu được kiểm tra với các điều kiện sau : - Hình đạng hồng cầu bình thường - Tỷ lệ hồng cầu lưới trong máu ngoại ví không quá !,5%, các chỉ tiêu huyết học bình thường, - Lô thứ hai :
Hồng cầu của các con thỏ đực và cái, từ 10 đến 15 tuần tuổi, thể trọng từ 1500 đến 2200g, được nuôi trong điều kiện sạch, chế độ ăn đầy đủ
- Lô thứ ba :
Hồng cầu của các con chuột cống trắng đực và cái, từ 10 đến 12 tuần tuổi, thể trọng từ 70 đến 100g, được nuôi trong điều kiện sạch, chế độ ăn đây đủ 2 Chất liệu mẫu thử từ bệnh nhân Hb :
Chất liệu là hồng cầu của các bệnh nhân nhỉ có bệnh Hb, từ 6 tháng tuổi đến 15 tuổi Xác định các thể loại bệnh Hb bằng kỹ thuật điện di Hb trên màng cellulose acetat, cùng với các xét nghiệm huyết học, sinh hoá, x quang có liên
Trang 11Căn cứ vào sự xuất hiện các vạch Hb bất thường trên băng điện di, nhóm bệnh lý được chọn gồm các thể loại :
* Thé di hop tt kép HbE/B thalassemia (cé vach HbE va HbF)
® B “thai và B” thal đồng hợp tử (tỷ lệ HbF tăng)
«Ò HbH
3- Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu :
- Máy li tâm lạnh tốc độ cao Beckman Avanti 30 (của Mỹ)
- Máy quang kế 4010 của hãng Boehringer Mannheim (Đức)
- Máy điện đi Shandon SEA 261 1 (Anh)
- Máy đếm thông số huyết học Hycel HC 680 plus, hãng Hycel Lisabio (Pháp) - Kinh hién vi Olympus CH, (Nhat) |
- Đèn tử ngoại hai sóng 260nm và 340nm UVSL, 58 (Mỹ) - Cân điện FX 4000 (Nhật)
- Cân phân tích Mettler H51R (Đức)
- Máy do pH TOA-pH meter HM 16 S (Nhat)
- Quang phé ké Hitachi U1100 (Nhat)
- Bình cách thuỷ có lắc Kayagaki SW 11S (Nhật)
- Cột sắc ký của hãng Pharmacia Fine Chemicals (Thuy điển) - Dụng cụ thuỷ tinh của các hãng Pyrex, Jena (Đức - Nhật) 4 Những hoá chất chính :
* Hãng BHD chemical (Itd poole (Anh) :
Trang 12* Cyanomethemoglobin standard (Hb chuẩn)
s Thuốc thir Drabkin
® Phenylhydrazine ® Blue Methylene
* Hang Merck (CHLB Đức) :
© Tris - Hydroxymety] Aminoéthan (Tris)
¢ Tri - Sodium Citrate ¢ Tri - chloracetic acid
© Ponceau S
* Hang Reachim (Nga):
© Thiobarbituric acid (TBA)
* Hãng Recinal - Budapest (Hungari) :
Trang 13B- PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU
1 Phương phớp tếch hồng cẩu
Máu được lấy từ tính mạch của người, động mạch cảnh của thổ và
chuột, chống đông bang sodium - citrate 3,8% theo tỷ lệ 1/5
Ly tâm 2000 x g trong 5 phút, ở nhiệt độ 4°C, để loại huyết tương, bạch cầu và các thành phần khác _
Rửa hồng cầu 3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% da dé lanh (4°C) Ly
tâm 3500 x g trong 5 phút, hút bỏ phần dịch rửa ở trên Riêng lần cuối, ly
tâm 5000 x g trong thời gian 10 phút, hút kiệt phần dịch rửa ở trên
Tính thể tích khối hồng cầu, sau đó khối hồng cẩu được sử dụng tuỳ theo yêu cầu của từng thí nghiêm
- Tạo dịch treo có tỷ lệ hematocrit 25% bang dung dich dém kali phosphate 0,04moi, pH 7,4 có chứa 6,6g NaCl/1, để làm thực nghiệm quá trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu
- Tạo dịch huyết tán 1/5 bằng nước cất hai lần có chứa 20 micromol NADP'/,
để ở nhiệt độ 4°C, trong thời gian 30 phút, sau đó ly tâm 7000 x g trong l5 phút, ở nhiệt độ 4'C, để loại bỏ xác hồng cầu
- Pha loãng dịch huyết tán theo tỷ lệ 1/10 để làm thí nghiệm điện di và 1/30 để do hoạt độ enzym thô bằng nước cất hai lần có chứa 20 micromol NADPT/I
(để lạnh ở nhiệt độ 4C)
2.Xúc định hoợt độ của G„PD theo phương phóp của WHO
Nguyên tắc của phương pháp :
+ Hoạt độ của GạPD được xác định bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tăng đần ở bước sóng 340nm do coenzym NADPH sinh ra trong quá trình
phản ứng dưới sự xúc tác của GạPD
Trang 14-10-Hoat do cia G,PD tuong ting tang tuyén tinh theo quang phé hấp thụ của NADPH được sinh ra trong quá trình phản ứng
Phản ứng của enzym đã được tiến bành với dung dịch phản ứng bao gồm các chất có nồng độ cuối cùng như sau : NADP* 2 x 10* mol/l GaPNa; ‘6x 10% mol/l MgCl, 1 x 10? mol/l Tris-HCI pH8 1.x 10 mol/l Dịch huyết tán 1/30 0,05ml (50 microlit) hoac dịch enzyme đã được tách chiết 0,01 m1 (10microlit) Cách tính kết qủa : - Đối với dịch enzyme thô ; AOD/phút.Tf.107 G,PDđU/gHb)= —— 7” , , 6,22, Hb V;; - Đối với dịch enzym đã được tách chiết : AOD/phút.Tf 10” GsPDdU/ml) = -———————— 6,22 VE - AOD/phit là su tang mat d6 quang hoc trung binh trong 1 phút của NADPH
- Hb là nồng độ hemoglobin tinh theo g/dl méu (Hb = MDQH đo được của Hb trong dung dịch huyết tán 1/30, hệ số Hb tính theo biểu đồ mẫu)
- Vự là thé tich dich enzyme (ml) trong | ml dung dich phan ting
- 622 là quang phổ hấp thụ của 1 micromol coenzym NAP” hoặc NADP".,
Trang 153 U6c lugng hoợt độ G„PD hồng cều bằng thử nghiém cua Beutler :
-Nguyên tắc của kỹ thuật : :
Dưới tác dụng của GạPD có coenzym là NADP” glucose-6-phosphate bị oxy hoá tao thanh -6-phosphate gluconolacten va NADPH + H
NADPH tạo thành sẽ phát quang màu xanh lục dưới ánh đèn tử ngoại, bước
song 340 - 360nm
- Chất liệu nghiên cứu : máu toàn phần chống đông bang EDTA 1%
- Thuốc thử : G,.PNa, 15 mmol/l (A)
NADP 10mmol/I the
Saponin 1% (Cy
Dung dịch đệm KH;PO, 0,25mol pH74 (D) Hỗn hợp thuốc thử pha theo tỷ lệ A:B:C:D=1:1:2:4,
- Quá trình tiến hành :
Máu chích ở đầu ngón tay, được lấy vào ống nghiệm có sẵn chất chống
dong EDTA Nhỏ một giọt máu lên các lỗ của phiến sứ, nhỏ lên giọt máu đó hai giọt thuốc thử, 10 - 15 phút sau, nhỏ hỗn hợp này lên giấy lọc, để 5 - 10 phút, soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 360 nm
- Nhận định kết quả :
- Bình thường : Sau 3 - 5 phút, hỗn hợp phát quang màu xanh lục dưới ánh đèn tử ngoại
- Thiếu hụt GạPD : Sau 10 phút vẫn không phát quang - Nghỉ ngờ : Sau 10 phút phát quang yếu
Qua phương pháp xác định bằng thử nghiệm đơn giản, tất cả các trường hợp thiếu hụt hay nghi ngờ thiếu hụt G2PD đều được định lượng lại hoạt độ
GạPD hồng cầu bằng phương pháp quang phổ hấp thụ
Trang 16-12-4-Kỹ thuột sắc ký trao đổi ion xóc định tỷ lệ HbE
Xác định tỷ lệ HbA¿ và HbE được thực hiện theo kỹ thuật sắc ký trao déi ion trén cét gel DEAE cellulose [37,38] Cau tạo cột gồm pha tĩnh va pha động : ** Pha tinh : Diethyl amino ethylcellulose (DEAE cellulose) CH; R-C;H„-N < [A1] H ‘GH,
Chất trao đối ion Chất đối ion
s Pha động : Dung dịch đệm glycin 0,2M, pH 7,3
- Nguyên tắc của kỹ thuật định lượng HbA¿, Hb bang sac ký trau đổi ion trên cột : Trong điều kiện thí nghiệm, HbA¿ tích điện âm thực hiện phần ứng trao đổi ion và sẽ gắn vào nhóm tích điện đương của DAI cellulose và được giữ lại trên cột, Các HbA¿ và HbÍ3 tương tác yếu hơn với
DEAE cellulose sé được đẩy ra khỏi cột theo dụng dịch rửa và như vậy, với kỹ thuật này, chỉ tiến hành giai đoạn 1, sau d6 HbA, va HbE cé trong dich
phân tích sẽ được xác định theo tỷ lệ %
- Chất liệu nghiên cứu : máu chích từ đầu ngón tay chống đông bằng EDTA 1%
Trang 17+ Dung dịch rửa giải : (B) (dung dịch đẩy HbA; và HbE ra khỏi cột) Glycin (0,2M) l5g NaCl (0,01%) 5,82 NaN; (0,1%) 1,0g Nước cất vừa đủ 1000ml Điều chỉnh pH = 7,3 bằng HCI 1N - Các bước tiến hành : + Chuẩn bị cột sắc ký :
Cân 10g DEAE cellulose đủ ding cho khoảng 50-60 cột, mỗi cột cao
10cm đường kính 0,5cm, DEAE cellulose được trộn trong khoảng 250¡nl dung dịch A, khuấy đều trong 10 phút Để lắng, gạn bỏ phần nước trong, đổ tiếp 250m] dung dịch A, khuấy đều, quá trình này lặp lại từ 2 - 3 lần, gel sẽ trương lên trong dung dịch A Điều chỉnh pH về 7,3, bảo quản ở 4 - 8°C, tiêu chuẩn là cột gel không được có bọt và khô gel
+ Tạo dịch huyết tán :
Máu toàn phần : 1 thétich
Nước cất hai lần: 8 thể tích
+ Cho dung dịch A chảy ra khỏi cột cho tới sát bể mặt gel + Cho 50H] dịch huyết tán lên bể mặt cột gel
+ Nhỏ nhẹ nhàng sát thành ống 3 mi dung dịch B
+ Hứng toàn bộ dung dịch thoát ra khỏi cột để định lượng HbA;, HbE
(2 chất này thoát ra cùng một lúc) Thời gian để thoát hết dung địch khoảng 15 - 20 phút
+ Trong một ống nghiệm khác, trộn 50HI địch huyết tán và 15ml nước cất Hỗn địch này được coi là dịch Hb toàn phần
ˆ + Đọc mật độ quang học (MĐQH) cả 2 ống ở bước sóng 415nin, céng lcm, so với nước cất,
Trang 18-14 Tinh két qua : MDQH cta one chảy qua cột Ty le HbA2% = # Trrcrrrrrrrerrrseerrrrerrsrrrrrrrerrrx~ree x 100 MĐQH của mẫu Hb toàn phần x 5 - Nhận định kết quả :
+ Khi tỷ lệ HbAz/Hb toàn phần từ 3,5 - 10% là B.thal di hop tứ
+ Khi HbA;/Hb toàn phần trên 10% là HbE ˆ
Như vậy, kỹ thuật sắc ký trao đối ion cl phát hiện được những trường hợp thal và HbE, không phát hiện được những Hb bất thường khác như
HbH1, HbF như kỹ thuật điện di
5 Phuong phdp xúc định tỷ lệ hồng cầu lưới
Tỷ lệ hồng cầu lưới được xác định theo phương pháp Perls (nhuộm sống) Máu toàn phần có chống đông được ủ với xanh cresy] trong vòng l-2 giờ, sau đó dàn lam để khô rồi đọc trên kính hiển vi Tính tỷ lệ % hồng cầu lưới theo tổng số lượng HC Số lượng hồng cầu lưới được tính bằng tỷ lệ % x số lượng HC (x 1031)
6 Điện di trên mỏng cellulose acetat
Chất liệu nghiên cứu là máu toàn phần chống dông bằng Nati Citrat 3,8% Băng cellulose acetat : 9 x 12cm
Thước thử gồm :
Dung dich dém Tri s Borat EDTA, pH 8,6
Dung dich Ponceau S 1% trong acid trichloracetic 5% Dung dich acid acetic 5%
Dung dich NaCl 0,9% Dung dich NaCl 1%
Trang 19- Tao dich huyét tan :
+ Ly tâm máu toàn phần, tách plasma
+ Rửa 3 lần khối hồng cầu bằng NaC1 1% để co tế bào , + Tạo dịch huyết tấn 1/5 với nước cất
-Tiến hành điện di :
+ Dat dịch huyết tán 1/5 lén bang cellulose acetat
+ Điện di với hiệu điện thế 220-250Vol,:cường độ đồng
điện 4-5mA/1băng, thời gian 20 - 30 phút - Hiện mầu bằng Ponceau § 1% trong 5 phút - Rửa bằng acid acetic 5% trong 15 phút
- Nếu cần xác định thành phần các Hb thì sau khi tiến hành điện di, không làm hiện màu và rửa băng điện đi, cắt riêng các thành phần từng vạch Hb và ngâm trong nước cất từ 2 -3 gid
- Xác định tỷ lệ % của từng loại Hb : đo quang ở bước sóng 412 nm, 7 Phương phớp xóc định hogt dé G,PD hồng cầu theo Ki Hoạt độ GạPD hồng cầu được xác định theo phương pháp quang phổ,
động học enzym của Konberg, kit cha hfing Boehringer Mannheim [33]
- Nguyên tắc : Hoạt độ GạPD được xác định bàng phương pháp do
quang phổ hấp thụ tăng dần ở bước sóng 340nm của coenzym `.ADPH được tạo thành trong phản ứng dưới sự xúc tác của GgPD
Hoạt độ của GạPD tăng tuyến tính với sự tăng quang ph‹ hấp thụ của NADPH tao thanh
- Tién hanh theo kit Cat No 124672 Boehringer Mannheim - Tinh két qua :
+ Hoạt do G,.PD (mU/ml) = AA/1 phút;;o„„ x 30476
7, + Hoat dd GgPD (mU/10°HC) = Hoat do GePD (mU/ml)/s6 lượng hồng cầu
+ Hoạt độ GạPD (1U/gHb) = Hoạt độ GạPD (mU/ml)/nồng độ Hb
Trang 20-16-8 Phuong phdp xdc dinh hoat dé aldolase theo Kit
Hoạt độ ALD được xác định bằng phương pháp quang phổ của
Beisenherz, kit cha hang Boehringer Mannheim [35]
- Nguyên tắc : Hoạt độ ALD được xác định bằng phương pháp đo sự giảm quang phổ hấp thụ ở bước sóng 340nm của NADH tương ứng với sự giảm coenzym này trong chuỗi phản ứng Trước hết ALD xúc tác phản ứng
phan tach fructose 1-6 diphosphat (F, diP) thanh hai phan ti, phosphaglyce- raidehyt (PGA) va phosphodioxyaceton (PDA) (1) Dudéi sự xúc tác của triosephosphat isomerase (TIM), PGA chuyén thành PDA (2) Sau đó, dưới
tác dụng của glycerol dehydrogenase (GDH), PDAbi khử với sự tham gia của
NADI dé tao thanh glycerol 1- phosphat va NAD*(3) F, „điP ‘ PGA 2PDA + 2NADH + 2 H* ALD *®——ÿ PGA+PDA (1) TIM “——_ PDA (2) GDH
a 2 Glycerol t- phosphat + 2NAD* (3) Hoạt độ ALD tỷ lệ với sự giảm quang phổ hấp thụ của NADH - Tiến hành theo kiL Cat No 123838 của hang Bochringer Mannheim - Tính kết quả :
+ Hoạt độ ALD (mU/ml) = AA/1 phútsag„„ x 2192
+ Hoạt độ ALD (mU/10”HC) = Hoạt độ ALD (mU/m))/ số lượng HC + Hoạt độ ALD (IU/gHb) = Hoạt dé ALD (mU/ml)/ néng d6 Hb
9 Phương phúớp xóc định hoạt độ PK theo KIt
Trang 21- Nguyên tắc : Hoạt độ PK được xác định bằng phương pháp đo quang
phổ hấp thụ giảm dân ở bước sóng 340nm của coenzym NADH do sự tạo thanh NAD' trong chuỗi phản ứng : Trước hết là PK xúc tác phân ứng chuyển
phosphat từ phospho enol pyruvat (PEP) sang ADP để tạo thành ATP và pyruvat (1) Sau đó, dưới sự tác dụng của lactat dehydrogense
(LDH), pyruvat được khử với sự tham gia của coenzym NADH để
tạo thành lactat và NAD” (2) |
PK
ADP +PEP T————+ AIP+ Pyruvat (1)
LDH
Pyruvat + NADHI + H” Ll? L Lactat+ NAD" (2)
Hoạt độ PK tăng tuyến tính với sự giảm quang phổ hấp thu cla NADH - Tién hanh theo kit Cat No 126047 ctia hing Boehringer Mannheim - Tinh két qua :
+ Hoat dé PK (mU/ml) = AA/1 phiitzgonm * 5417
+ Hoạt độ PK (mU/10°HC) = Hoạt độ PK (mU/m))/ số lượng HC
+ Hoạt độ PK (IU/gHb) = Hoạt độ PK(mƯ/m]))/ nồng dé Hb
10 Xác định nồng độ 2,3-DPG trong mau theo Kit
Nồng độ 2,3-DPG trong máu được xác định theo phương pháp quang
phổ, kít của hãng Boehringer Mannheim [36]
- Nguyên tắc : 2,3-DPG được tách ra một gốc phosphat (Pi) để tạo ra phosphoglycerat (PG) do tác dụng phụ của phosphoglycerat mutase (PGM), tác dụng này được hoạt hoá bởi glycolat-2-phosphat (1)
PGM
23-DPG ———> PG +Pi (1)
~ Phản ứng (l) có thể tạo ra cả 2 chất 2-PG và 3-PG, 2-PG dược đồng phân hoá thành 3-PG (2); 3-PG được biến đổi tiếp theo duới tác dụng của các enzym phosphoglyceraL kinase (PGK) (3), glyceraldehyd-3-phosphat
Trang 22-18-dehydrogenase (GAP-DH) (4), triosephosphat isomerase (TIM) (5) va
glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GDH) (6) Trong quá trình này, 2 mol
NADH dugc oxy hod theo 1 mol 2,3-DPG PGM 2-DPG —— > 3-PG * (2) PGK : * 1,3-DPG+ ADP (3) „ GAI-DH + 1,3-DPG+NADH+H” ——* Glyceraldehyde-3-P+NAD +Pi (4 3-PG + ATP TIM Glyceraldehyde-3-P ——-——»Dihydroxyaceton - P (5) ` GDH
Dihydroxyaceton-P + NADH + H” ———> Glycerol-3-P.+ NAD* (6)
Những phản ứng (2)-(6) được thực hiện, trước hết là để loại bỏ những cơ chất có mặt trong hỗn dịch phản ứng, còn lượng PGM sẵn có thì quá ít cho nên trên thực tế phản ứng (l) chưa xảy ra
- Tiến hành theo kit Cat No 148334 cha hang Bochringer Mannheim ~ Tính kết quả :
Nồng độ 2,3-DPG (mmol/Ð) = AAsaom * 11,70
Néng dé 2,3-DPG (mmol/l HC) = Nồng độ 2,3-DPG (mmol/l) x 100/HCT
(HCT : Hematocrit)
Nông độ 2,3-DPG (tmol/gHb) = Nông độ 2,3-DPG (mmol/l) x 1000/ndéng 46 Hb 11 Phương phóp định lượng Hemoglobin
Hemoglobin được xác định bằng thuốc thử Drabkin theo nguyên tắc
như sau :
-
Kali fericyanua và kalicyanua có khả năng biến đổi Hb thành MetHb-
Trang 23thuận với nồng d6 Hb Bang thuéc thir nay, tat ca c4c dang Hb (Oxy Hb, Carboxy Hb, Met Hb) đều được định lượng Dùng phương pháp biểu đồ mẫu
để định lượng nồng độ Hb ‘
12 Thử nghiệm tốc động cua stress oxy hod đối với hoợi độ G,PD va qua trinh peroxy hoa lipid mòng hồng cầu
Tạo dịch treo có tỷ lệ hematocrid 25% bằng- dung dịch đệm Kali
phosphat 0,04mol, pH 7,4 có chứa 6,6g NaC1/1 Dịch treo này được chia làm
2 lô
+ Lá chứng :
Dịch treo của hồng cầu không có mặt của chất oxy hoá , được ủ cách
thuỷ ở nhiệt độ 37C, có lắc trong thời gian 0 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút
Sau thời gian ủ kể trên, hồng cầu được tách ra khỏi dịch ủ và sử dụng để làm thí nghiệm đo hoạt độ GạPD theo quy trình chuẩn, dịch ủ được đùng để định luong MDA Cac kết quả của lô chứng được dùng để đối chiếu với kết quả của các mẫu thử nghiệm
st Lô thực nghiệm ‹,
Gồm các mẫu dịch treo với sự có mặt chất oxy hoá là Phenylhydrazine,
Primaquine, blue methylen có các nồng độ khác nhau là I x 10° ‘mol/L, 5 x 10“mol/l va 1 x 10° mol/l Céc mẫu này được ủ cách thuỷ có lắc ở nhiệt dé 37°C với khoảng thời gian là 30, 60 và 90 phút Khi đạt thời gian ủ, dich treo được iy tâm 800 x g/5 phút/ 4°C, lấy dịch nổi để làm phản ứng định lượng MDA, hồng cầu còn lại được rửa nhiều lần bằng dung địch NaCl 0,9% cho đến khi hết màu của chất oxy hoá Hồng cầu này được sử dụng làm chất liệu để xác định hoạt độ của GạPD
Quá trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu phụ thuộc vào thời gian tác
dụng và nồng độ chất oxy hoá
Tốc độ của sự peroxy hoá lipid được xác định bằng lượng malonyl-
diadehyd (MDA) duge tao thành trong quá trình thử nghiệm [40,52]
Trang 24-20-13 Định lugng Malonyldiadehyd
Malonyl - diadehyde (MDA) duge do bằng phản ứng màu với
thiobarbituric acid (TBA) Lugng hợp chất này được hình thành tỷ lệ thuận:
với quá trình peroxy hoá lipid xảy ra
Quá trình peroxy hoá lipid duge ding lại ngay khi cho hỗn dịch TBA- TCA vào dịch nổi theo tỷ lệ 1/T (v/v), ly tam 1500 x g trong 10 phút, lấy dịch nổi, đun cách thuỷ trong 10 phút để tạo phản ứng màu, của MDA, sau đó được
làm lạnh Đạm độ mẫu tỷ lệ thuận với lượng MDA có trong dịch nổi và được
do bằng máy quang phổ ở bước sóng 532nm Thí nghiệm này do sư biến đổi của nmol MDA, hệ số tắt phân tử là 1,56 x 10°mmol/ml
Những thuốc thử TBA-TCA được dùng trong quá trình tiến hành phản ứng peroxy hoá lipid không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm [52]
Quá trình peroxy hoá lipid được đánh giá bằng số nmol MDA đối với
một dl hồng cầu
Những diều kiện dùng để ù phần ứng peroxy hoá được đảm bão cho sự peroxy hoá lipid xây ra trong diều kiện tối ưu trong mỗi thí nghiệm (có oxy và chất oxy hoá) Lượng MDA được tính theo công thức : MĐQ/phút x 2 x 10” x 4 x 100 MDA = (nmol/dl hồng cầu ) ,1,56 x 10”
* Tất cả các số liệu thí nghiệm của các lô thử nghiệm được so sánh với các ~ gid tri tuong ứng của các 16 đối chứng bằng cách sử dụng phép thống kê
(test) T-Student
Trang 25-21-III- KẾT" QUẢ NGHIÊN CỨU
Phần nghiên cứu có bản
1 Hoạt độ của một số enzym then chốt trong chuyển hoá hồng cầu trên nhiều đối tượng khác nhau
Tác động của các Stress oxy hoá đối với hoạt độ của GsPD và sự peroxy hoá lipid màng hồng cầu trên nhiều đối tượng khác nhau
Nông độ chất chuyển hoá 2,3-DPG và mối tương quan của nó đối với hoạt
độ của PK "
Phần nghiên cứu trên nhóm bệnh HD,
‹ Mối tương quan của hoạt độ của GạPD, ALD, PK đối với số lượng hồng
cầu lưới,
Mối tương quan của hoạt độ GzPD hồng cầu đối với số lương hồng cầu trưởng thành và nguyên hồng cầu
„ Mối tương quan của nồng độ 2,3-DPG đối với nồng độ Hb
Khuyết tật thiếu hụt GạPD trong nhóm bệnh có dị tật cấu trúc phân tử Hb
Trang 26-22-PHẦN NGHIÊN CỨU CO BAN
1 Mối tương quơn về hoạt độ của một số enzym then chét trong
chuyển hoá hồng cẩu trên nhiều đối tượng khóc nhau
Các đối tượng nghiên cứu trong phần này bao gồm : trẻ em, người trưởng thành, trẻ em bị bệnh hemogiobin, và động vật thực nghiệm là thỏ và chuột Bệnh Hb ở đây bao gồm HbE/B thalassemia, B thalassemia đồng hợp tử và HbH Hoạt độ của các enzym ở người trưởng thành được dùng làm số liệu qui chiếu (chuẩn) để so sánh với các đối tượng khác và được quy ước là 100% Hoạt độ enzym được sơ sánh bằng các tỷ lệ phần trăm (%) tương ứng
Các kết quả nghiên cứu được tóm tất trong các bảng số liệu và minh
hoa bằng đồ thị oe
1.1 Hoat d6 cua glucose-6-phosphate dehydrogenase (G,PD)
Những kết quả nghiên cứu cho thấy : Hoạt độ của GạPD ở trẻ em gần xấp xỈ với hoạt độ của cnzym này ở người trưởng thành, nhưng hoạt độ enzym này của hồng cầu người bệnh Hb thì cao hơn hẳn, gấp hơn 2 lần người trưởng thành và trẻ em Ở động vật, thỏ cao hơn người 1,5 lần; chuột cao hơn người
2/7 lần
Những kết quả nghiên cứu được tóm tắt trong bảng 1 và minh hoạ trong hình 1 Bảng 1 : Hoạt độ G,PD ở một số đối tượng nghiên cứu
Số Đối tượng nghiên cứu | n Hoạt độ enzym Tý.lệ %
Trang 27So với người trưởng thành, hoạt độ enzym của các đối tượng khác có sự khác
biệt với ý nghia thống kê ở mức p < 0,001 Số liệu phân tán nhiều ở nhóm bệnh lý và chuột Hoạt độ enzym (IU/gHb) 30 25 20 15 10 Trẻ em Người Người Thô Chuột trưởng thành bệnh Hb
Hình 1: Biểu đồ hoạt độ G„PD ở một số đối tượng nghiên cứu 1.2 Heat dé cua Fructose 1,6 diphosphat Adolase : Những kết qủa nghiên cứu cho thấy rằng: -
Hoạt độ của Adolase ở trẻ em cao hơn người trưởng thành khoảng 20%, ở người bệnh HbE/B-thalassemia cao hơn người trưởng thành gấp hơn 2 lần ở người bệnh HbH cao hơn khoảng 8 lần Hoạt độ enzym này ở chuột và thỏ đều cao hơn người trưởng thành khoảng 20 - 30% Kết quả nghiên cứu được tóm tắt trong bảng 2 và minh hoạ trong hình 2
Bảng 2 : Hoạt độ ALD ở một số đối tượng nghiên cứu
Số | Đối tượng nghiên cứu | n Hoạt độ enzym Tỷ lệ'%
Trang 28Những kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, số liệu của các cá thể khá phân tán, đặc biệt là ở những người bệnh Hb
Hoạt độ enzym (mU/10°HC) 600 500 400 300 200 100 0 Trẻem Người Hb/Ptha, HÙH Thỏ trưởng thành Hình 2 : Biểu đồ hoạt độ ALD ở một số đối tượng nghiên cứu Chuột
1.3 Hoạt độ của Pyruvat Kinase (PK)
Kết qủa nghiên cứu cho thấy rằng, hoạt độ của enzym này ở trẻ em chỉ bằng hơn 50% so với người trưởng thành Người bệnh HbE/B thai bằng khoảng 80% và HbH cao hơn 1,7 lần so với người trưởng thành Hoạt độ enzym này ở thỏ và chuột, đều thấp hơn ở người trưởng thành, chỉ bằng 73% va 23%
hình 3
Những kết quả này dược tóm tắt trong bảng 3 và mỉnh hoa trong
Bảng 3 : Hoạt độ PK ở một số đối tượng nghiên cứu
Số Đối tượng nghiên cứu | n Hoạt độ enzym Tỷ lệ %
Trang 29Với bảng số liệu trên dễ đàng nhận thấy rằng, ở tất cả các đối tượng, hoạt độ PK đều thấp hơn, hoạt độ của enzym này ở người trưởng thành khoảng 20% đến 77%, riêng bệnh HbH có hoạt độ PK cao hơn người trưởng thành 1,7 lần Độ phân tán kết quả khá lớn trong các nhóm nghiên cứu
Hoạt độ enzym (mU/10°HC) 500 400 300 200 „100 0 a : I ni Trẻ em Người HbE/B thai © Hb Thỏ Chuột trưởng thành
Hình 3 : Biểu đồ hoạt độ PK ở một số đối tượng nghiên cứu 1.4 Tóm tắt so sánh hoạt độ của các enzym đã nghiên cứu Qua những kết quả đã trình bầy ở trên, có thể nhận xét như sau :
* Đối với GạPD : Hoạt độ enzym của trẻ em và người trưởng thành xấp xỉ ngang nhau, nhưng ở người bệnh Hb và động vật đều cao hơn hẳn so với người
* Đối với ALD : Hoạt độ enzym ở trẻ em và động vật cao hơn người với mức độ vừa phải, nhưng ở người bệnh Hb cao hơn ở người trưởng thành gấp 2 - 8 lần
*% Đối với PK : Hoạt độ PK của tất cả các đối tượng đều thấp hơn khoảng từ - 20% đến 77%, riêng ở bệnh HbH, hoạt độ enzym cao hơn 1,7 lần so với
người trưởng thành
Trang 30-26-Nếu so sánh tỷ lệ tương quan giữa các enzym với nhau :
cao hơn rõ rệt so với GạPD và nhất là so với PK
với GạPD và nhất là so với PK
của PK đều thấp hơn so với G¿PD một cách rõ rệt
, Ở trẻ em, tỷ lệ % hoạt độ enzym so với người trưởng thành ALD
Ở nhóm bệnh Hb, tỷ lệ % về hoạt độ ALD cũng cao hơn rõ rệt so
._ Ở động vật thực nghiệm, tỷ lệ % về hoạt độ của ALD và đặc biệt là
Nếu so sánh nhóm trẻ em bị bệnh Hb với nhóm trẻ em đối chứng thì tỷ lệ tương quán sẽ là 2,03 lần đối với GạPD; 1,83 lần đối với ALD và 1,52 lần đối với PK và 3,2 lần đối với PK trong HbH Những số liệu chỉ tiết được trình bầy ở bảng4 ˆ Bảng 4: Tỷ lệ hoạt độ của GạPD, ALD, PK
Số Đối tượng Tỷ lệ % hoạt độ
Trang 312 Tac déng cla cdc stress oxy hod déi vél hoat dé cua
glucose-6-phosphate dehydrogenase vd: sy peroxy hod lipid
mồng hồng cổu người, thỏ và chuột
Dưới ảnh hưởng của một số chất oxy hoá như phenylhydrazine primaquin va blue methylene, hoạt độ của GạPD và quá trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu người, thỏ và chuột chịu ảnh hưởng rõ rệt, tuy nhiên điều đó còn phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tác động của các chất oxy hoá
2.1 Ảnh hưởng của một số chất oxy hoá đối với hoạt độ của enzym * Lô-chứng : Bảng 5 Sự biến đổi hoạt độ của GạPD theo thời gian ủ hồng cầu Hoạt độ G;PD hồng cầu (X+ SD) IU/gHb G.PD hồng cầu 0 phút 30 phút 6 Ô phút 90 phút Người 4,98 + 0,96 4,89 + 0,82 4,91+ 0,90 4,84 + 0,94 Thỏ 7,18 +0,90 7,34 + 0,80 7,41 + 0,70 7,25 + 0,52 Chuột 22,90 + 1,02 | 23,114 1,06 | 23,08 +0,98 23,12 + 1,07
Kết quả trong bảng được trình bầy với n = 10
Trang 32++ L6 thuc nghiém : Bảng 6 Ảnh hưởng của chất oxy hoá đối với hoạt độ của G,PD hồng cầu người Nồng độ chất oxy hoá Hoạt dé G,PD (X+ SD) IU/gHb (mol/l) 30 phút 6 0 phút 90 phút Phenylhydrazin 1x10” | 4,81+0,82 |4,61+0,81** |4,56+0,92** ¬ 5x10“ | 482+0,87 | 4,67+0,91 ** | 4,66 +0,95 ** ¬ 1x10“ | 492+0,92 |4,84+0,79 4,74+0,98 Primaquin 1x10” | 4,75+0,99 | 4,52+0,95 ** | 4,33 £0,91 ** wee eee eee 5x10 | 4,764 0,98 | 4,6240,75 ** | 4,65 +0,87 ** ¬ 1x10* | 4,84+0,79 14,83 +0,76 4,78 + 0,87 Blue metylene 1x10” | 4,83+0,90 | 4,60+0,84 ** | 4,66 +0,84 ** eee lee eee 5x10* | 4,90+1,00 | 4,66+0,85 ** | 4,72 +0,80 ** ¬ 1x10“ | 4,96+0,82 |4,86+0,80 4,89 + 0,86
- Kết quả trình bẩy trong bằng với n = 10
- Các kết quả thí nghiệm được so sánh với kết quả của lô chứng trong bảng 5
eR pp <0,01
Với nồng độ thấp (1 x 10 4 mol/l) của cả 3 chất oxy hoá , trong 3 thời gian ủ phản ứng là 30, 60 và 90 phút, hoạt độ của enzym hầu như không có sự thay đối đáng kể (p > 0,05)
Trang 33Bảng 7 : Ảnh hưởng của chất oxy hoá đối với hoạt độ của GạPD hồng cầu thỏ Nồng độ chất oxy hoá Hoạt độ GạPD ( x + SD) IU/gHb (mol/l) 30 phut 6 0 phút 90 phút Phenylhydrazin 1x10” | 6,88+0,98 | 6,58£0,82 ** 645 +0,89 ** ch nh 5x10 | 697+0,86 | 6,58+0,86 ** | 6,49 +0,00 ** “an HH he 1x10 | 7,0840,62 }6,8440,60 |6,79+0,68 Primaquin 1x10? | 680+40,89 | 6,56+0,96 ** 6,49 + 0,92 ** wee ee ete 5x10* | 6,86+0,80 | 6,62+0,90 ** | 6,51 +.0,96 ** eee ee eee 1x10“ | 6,89+0,61 |6,88+0,50 6,84 + 0,98 Blue metylene 1x107 | 7/25+0,86 | 6,62+0,72 ** | 6,60 +0,96 ** wee eee eee 5x10* | 7,3440,74 | 6,62+0,78 ** | 6,64 + 0,90 ** eee ee eee 1x 10% | 7,38 40,69 ** | 7,13 +0,70 ** | 7,06 + 0,74 **
- Kết quả trình bdy trong bổng với n = 10
- Các kết quả thí nghiệm được so sánh với kết quả của lô chứng trong bảng 5 -**® ; p<0,01
Dưới tác dụng của 3 chất oxy hoá ở nồng độ thấp (1 x 10 “mol/) trong cả ba thời gian ủ (30, 60 và 90 phút) hoạt độ GạPD hầu như không có sự thay đổi (p > 0,05)
Với nông độ của cả 3 chất oxy hoá cao hơn (5 x10” và 1x10 ”mol/) với thời gian ủ là 30 phút, loạt độ của enzym cũng không có sự thay đổi dáng kể (p > 0,05) Nhưng với thời gian ủ đài hơn (60 và 90 phút) thì hoạt độ enzyme giẩm đi rõ rệt (p < 0,01)
Trang 34Bảng 8 : Ảnh hưởng của chất oxy hoá đối với hoạt độ của G„PD hồng cầu chuột Nồng độ chất oxy hoá Hoạt độ GạPD ( X + SD) IU/gHb (mol/) 30 phút 60 phút 90 phút Phenylhydrazin 1x107 | 21,75+1,10 | 21,23+0,79 | 20,02 +0,99 ** wee eee eee 5x10* | 21,8641,8t | 21,70+1,82 | 21,124 1,00 wee eee eee ixio* | 22,8941,71 | 21,96+1,76 | 21,98 + 1,02 Primaquin 1x10? | 21,844 1,64 | 21,5341,56 | 20,76 + 1,72 ** wee ee eee 5x10“ | 21,9041,94 | 21,60+2,80 | 21,2742,54 ca he 1x10“ | 2297+1,69 | 22,76+2,72 |21,92+2,51 Blue metylene Ix10' | 22/13+2/42 | 22/46+2/72 | 20/70+2,40 ** TH he he 5x10“ | 23/08+132 | 21,98+2,23 |21,98+2,51 22 eee eee 1x10 | 2324#2,16 | 22/71+1/96 | 22,06 + 1,70
- Kết quả trình bầy trong bằng với n = 10
- Các kết quả thí nghiệm được sơ sánh với kết quả của lô chứng trong bảng 5
-** ; p<0,01
Hoạt độ của G¿PD hầu như không có sự thay đổi (p > 0,05)
với sự có mặt của các chất oxy hoá ở nồng do 1 x 10% va 5 x 10% mol/l trong cả 3 thời gian ủ (30, 60 và 90 phút)
Hoạt độ enzym giảm đi rõ rệt (p < 0,01) khi nồng độ của chất oxy hoá
cao (1 x 10” mol/Ð) với thời gian ủ dài (90 phút) Nhưng cũng ở nồng độ
này, với thời gian ủ ngắn (30 và 60 phút) thì hoạt độ enzym hầu như không
Trang 352.2 Sự peroxy hoá lipid màng hồng cầu 3 Lô chứng :
Lượng MDA trung bình của hồng cầu người vào khoảng 135 + 35,8
nmol/dl (n = 10), của thỏ là 151,2 + 56,4 nmol/đl (n = 10) và của chuột là
56,4 + 15,3 nmol/dl hồng cầu (n = 50) với lực ly tâm tách hồng cầu là 5000 x g/10 phút
3£ Lô thực nghiệm :
Ảnh hưởng của chất oxy hoá đối với qúa trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu được trình bẩy trong các hình 4, 5 và 6 MDA (mmolfdl hong cau) Thời gian ii phần ứng (phú
Hình 4: Ảnh hưởng của các chất oxy hoá ở nồng độ 1 x 10Ïmol/1 đối với sự
peroxy hoá màng hồng câu người, thỏ, chuột
Lượng MÙA (nmolldl) của hồng cầu: người (—), của hồng cầu thỏ (—— ®—), của hồng cầu chuột ( )
sù:h ra dưới ảnh luưởng của Phenylhydrazine (®ee—* = 4), Primaquine (A—A = b) vd blue methylene (M@—M=c)
Những kết quả này dược trình bầy với giá trị trung bình của 3 mẫu thí nghiệm song song voi ne 10
Trang 36MDA (nmol/dl hong cau) 100 1 em 0 | _ | , 0 30 60 sơ Thơi gian tÌ phần dìrg (phú)
Hình 5 : Ảnh hưởng của các chất oxy hoá ở nồng độ 5 x 10 mol/l đối với sự peroxy hoá màng hồng cầu người, thỏ, chuột
Lugng MDA (nmoi/dl) cia héng cầu người (—), của hồng cầu thổ (— ® —), của hồng cầu chuột ( )
sinh ra dudi dnh hudng của Phenylhydrazine (e—« = a), Primaquine (A—A = b) vd blue methylene
(@—@=c)
Trang 37MDA (nmolldl hồng cầu) 2
Hình 6 : Ảnh hưởng của các chất oxy hoá ở nồng d6 1 x 10'mol/I đối với sự
peroxy hoá màng hồng cầu người, thỏ, chuột
Lugng MDA (nmol/dl) của hồng cầu ngudi(—), của hồng cầu thỏ (—— ®—)› của hồng cầu chuột ( }
sinh ra đưới ảnh hưởng của Phenylliydrarine (®—®= 8), Prinaquine (A—A = b) và blue methylene
(B—Me=c)
Những kết quả này được trình bảy với giá trị trung binh của 3 mẫu thí nghiệm song song với n = 10
Trang 38-34-Nhận xét :
- Dưới ảnh hưởng của các chất oxy hoá là phenylhydrazin, primaquin và blue
methylen, hoạt độ của G¿PD có sự thay đổi, nhưng ý nghĩa thống kê phụ
thuộc vào nồng độ và thời gian tác đụng của chất oxy hoá
- Phenylhydrazin là chất có khả năng gây quá trình peroxy hoá lipid màng hồng cầu mạnh hơn primaquin và blue methylen ở cả ba nồng độ trên màng hồng cầu người, thỏ và chuột (p < 0,01)
- Lượng MDA được tạo ra từ quá trình peroxy hoá màng hồng cầu người và thỏ luôn xấp xỉ nhau và cao hơn lượng này ở chuột từ 3 đến 4 lần, sự khác biệt này là có ý nghĩa (p < 0,01) -
- Lượng MDA được tạo ra từ quá trình peroxy lipid ba loại màng hồng câu người, thỏ và chuột đều tăng theo nồng độ chất oxy hoá và thời gian ủ phản
ứng Ở nồng độ chất oxy hoá thấp, lượng MDA sinh ra ít hơn rõ rệt, nhất là
ở hồng cầu chuột, những vẫn tăng có ý nghĩa so với nhóm chứng (p < 0,01)
3 Nồng độ 2,3-DPG trong hồng cổu vò mối tương quœn của
nó với hoại độ PK
3.1 Nông độ 2,3-DPG
Các đối tượng nghiên cứu bao gồm : trẻ em, người trưởng thành,
người có bệnh Hb, động vật là thỏ và chuột Bệnh Hb bao gồm
HbE/Pthai và HbH Nồng độ 2,3-DPG được biểu thị bằng mmol/lit HC
Trang 39Ta thấy trị số của các cá thể trong nhóm bệnh khá phân tán, nhưng trị số của các cá thể trong các đối tượng khác thì tương đối lập trung
Trang 40-36-3.2 Mối tương quan của nồng d6 2,3-DPG với hoạt độ của PK
Để thực hiện việc so sánh đối chiếu, nồng độ 2,3-DPG và hoạt độ của
PK của các đối tượng nghiên cứu được đặt song song theo cột dọc Hoạt độ của PK được biểu thị bằng mU/ 10? HC cùng với tỷ lệ % tương ứng so với hoạt độ PK của người trưởng thành Nông độ 2,3-DPG được biểu thị bằng mmol/I HC cùng với tỷ lệ % tương ứng so với nồng độ 2-3DPG của người trưởng thành
Những kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng :
Tất cả các đối tượng nghiên cứu trong công trình này đều có nồng độ
2,3-DPG cao hơn hẫn đối tượng qui chiếu (người trưởng thành), trái lại hoạt
độ PK của chúng đều thấp hơn rõ rệt Riêng hoạt độ PK của nhóm HbH là 170%, nhưng không định lượng được 2,3-DPG
Những kết quả chỉ tiết được trình bây trong bảng 10 va minh hoa trong hinh 8 Bảng 10 So sánh mối tương quan của 2,3-DPG và hoạt độ PK
Số Đốitượng | Nôngđộ243-DPG | - Hoạtđộ của PK