Nguyên tắc cơ bản của phương pháp WBE là ước lượng tiêu thụ chất gây nghiện trong cộng đồng dựa vào nồng độ chất chuyển hóa của chúng trong nước thải, hệ số thải trừ, lưu lượng xả thải v
TỔNG QUAN
Tổng quan về ma túy
Theo Tổ chức Liên Hợp Quốc: Ma túy là “Các chất có nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp, khi xâm nhập vào cơ thể sẽ làm thay đổi trạng thái tâm sinh lý của người sử dụng” [3]
Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO): Ma túy theo nghĩa rộng nhất là “Mọi thực thể hoá học hoặc là những thực thể hỗn hợp khác với tất cả những cái được đòi hỏi, để duy trì một sức khoẻ bình thường, việc sử dụng những cái đó sẽ làm biến đổi chức năng sinh học và có thể cả cấu trúc của vật”
Luật Phòng chống ma tuý số 73/2021/QH14 của Việt Nam được Quốc hội thông qua ngày 30/3/2021, có hiệu lực từ ngày 01/01/2022, cũng đưa khái niệm về chất ma túy như sau: “Chất ma tuý là các chất gây nghiện, chất hướng thần được quy định trong danh mục chất ma túy do Chính phủ ban hành.’’[3]
Dựa trên nguồn gốc, tác dụng trên hệ thần kinh, mức độ gây nghiện người ta đưa ra một số phân loại ma tuý như sau:
1.1.2.1 Phân loại theo nguồn gốc
Dựa theo nguồn gốc của ma túy, người ta phân chia thành 3 loại:
Ma túy có nguồn gốc tự nhiên: Đây là các chất ma tuý có sẵn trong tự nhiên, là alcaloid của một số thực vật như cây thuốc phiện (anh túc), cây cần sa (cây gai dầu), cây coca (cocain)
Ma túy bán tổng hợp: Là các chất ma túy được tổng hợp một phần từ một số loại ma tuý có sẵn trong tự nhiên, có tác dụng mạnh hơn chất ma túy ban đầu Ví dụ: morphin, heroin
Ma túy tổng hợp: Là nhóm các chất ma túy không có trong tự nhiên Ma túy tổng hợp được tổng hợp nên từ các loại hóa chất (các hóa chất này được gọi là tiền chất) như AMP, MDMA…[3]
1.1.2.2 Phân loại theo tác động trên thần kinh trung ương
Nhóm gây ức chế hệ thần kinh trung ương: Nhóm này khi sử dụng gây ra trạng thái buồn ngủ, an thần, giảm nhịp tim, ức chế hô hấp Nhóm này gồm thuốc phiện, nguồn gốc thuốc phiện (morphin, heroin, cocain ), các thuốc an thần gây ngủ (seduxen, phenobarbital)
Nhóm gây kích thích thần kinh trung ương: gồm AMP và các dẫn xuất của nó
Khi sử dụng gây tăng hoạt động, tăng sinh lực, tăng nhịp tim, tăng hô hấp,…
Nhóm gây ảo giác: Nhóm này gây thay đổi về nhận thức và môi trường xung quanh, nghe thấy những âm thanh không có thực Bao gồm các loại thuốc lắc (MDMA), cần sa [3]
1.1.3 Một số ma túy nghiên cứu
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của AMP
Amphetamin có công thức C9H13N, khối lượng phân tử 135,21 g/mol, danh pháp theo IUPAC: 1-phenylpropan-2-amin [37]
AMP là chất lỏng không màu, dễ bay hơi, có mùi amin, vị chát, ít tan trong nước, dễ tan trong acid, ethanol và clorofrorm Giá trị pKa là 9,9; logP là 1,76; nhiệt độ nóng chảy là 25ºC [37]
Cơ chế và tác dụng
Cơ chế tác dụng của AMP làm tăng cường giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh như như dopamin, norepinephrin, serotonin từ các túi chứa trong các tế bào thần kinh vào khe synap dẫn đến sự kích thích của các tế bào thần kinh và đồng thời ức chế quá trình tái hấp thu các chất này giúp kéo dài thời gian hoạt động của chúng AMP tăng cường nhận thức, trong đó những cải thiện về điểm kiểm tra trí thông minh Trong hội chứng tăng động giảm chú ý ở người lớn (ADHD), AMP đã được chứng minh là tạo ra những cải thiện đáng kể về biểu hiện, hành vi và cử chỉ Hiệu quả được tạo ra thông qua cả hai dạng đồng phân và cho đến nay, việc sử dụng các dạng racemic 3:1 (D: L) là rất phổ biến Tác dụng điều trị của AMP đối với serotonin hầu như không có trên lâm sàng Tuy nhiên, tác động gián tiếp lên serotonin có thể ảnh hưởng đến chứng trầm cảm và lo âu trên hội chứng tăng động, giảm chú ý ở người lớn [37]
Chất gốc và quá trình chuyển hóa tạo AMP
Amphetamin được chuyển hóa chủ yếu ở gan dưới tác dụng của CYP2D6 thông qua con đường hydroxyl hóa thơm, khử N-alkyl và khử amin Các chất chuyển hóa được hình thành từ con đường này là 4-hydroxyamphetamin, 4- hydroxynorephedrin, acid hippuric, acid benzoic, benzyl methyl keton và p-hydroxyamphetamin (chất gây ảo giác mạnh) Các chất này được được bài tiết qua nước tiểu, trong đó khoảng 40% AMP được tìm thấy dưới dạng nguyên vẹn [37]
Hình 1.2 Công thức cấu tạo METH
Methamphetamin có công thức C10H15N, khối lượng phân tử 149.23 g/mol, danh pháp theo IUPAC: (2S)-N-methyl-1-phenylpropan-2-amin [36]
METH là bột kết tinh màu trắng, có mùi đặc trưng, vị đắng Tan trong nước, hòa tan trong ethanol, dietyl ete và có thể trộn với cloroform Nhiệt độ sôi 212 o C và nhiệt độ nóng chảy 170 o C Giá trị logP là 2,07 và pKa là 9,99 [36]
METH là một ma túy có cấu trúc amphetamin có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương (CNS) METH hoạt động theo cơ chế vừa kích thích giải phóng catecholamin, đặc biệt là noradrenalin, dopamin và serotonin, từ các đầu dây thần kinh trong não và đồng thời cũng ức chế sự hấp thu của các chất này Điều này dẫn đến sự gia tăng nồng độ ở khe synap của các chất dẫn truyền thần kinh này và dẫn đến tăng kích thích các thụ thể sau synap [36]
Chất gốc và quá trình chuyển hóa tạo METH
METH được chuyển hóa chủ yếu ở gan thông qua con đường hydroxyl hóa vòng thơm và khử N-alkyl Ít nhất bảy chất chuyển hóa đã được tìm thấy trong nước tiểu, trong đó chất chuyển hóa chính là AMP (có hoạt tính) và 4-hydroxymethamphetamin METH được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu, tốc độ phụ thuộc vào pH nước tiểu Khoảng 30-54% liều METH đường uống được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng METH nguyên vẹn và 10-23% dưới dạng AMP Sau một liều tiêm tĩnh mạch, 45% METH được bài tiết dưới dạng thuốc gốc không thay đổi và 7% dưới dạng AMP [36]
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của MDMA
6 MDMA có công thức C11H15NO2, khối lượng phân tử 193,24 g/mol, danh pháp theo IUPAC: 1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-methylpropan-2-amin [35]
MDMA có dạng dầu, không màu, nhiệt độ sôi là 100 - 110ºC ở 0,4 mmHg , rất ít tan trong nước Giá trị logP là 2,15 Độ tan trong nước là 7034 mg/L (25ºC) Giá trị pKa là 9,9 [35]
Cơ chế và tác dụng
Tổng quan về phương pháp phân tích dư lượng chất gây nghiện
1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu
Vì thành phần có trong mẫu nước thải rất phức tạp và hàm lượng chất phân tích có trong mẫu nước thải tương đối thấp Vì vậy, việc lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp giúp tối ưu hiệu suất chiết chất gây nghiện và giảm tối đa lượng tạp có trong mẫu này đóng vai trò cực kỳ quan trọng Các phương pháp xử lý mẫu thường sử dụng như chiết bằng dung môi, chiết pha rắn và gần đây là kỹ thuật lọc và phân tích trực tiếp
Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan trong dung môi sang một dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất Trong thực tế thường dùng cân bằng nước – dung môi hữu cơ không tan trong nước để tách và tinh chế chất phân tích
Chất được chuyển từ pha nước vào pha dung môi có thể thuộc nhiều loại hình hóa học khác nhau như: các acid, base hoặc chất lưỡng tính, hợp chất nội phức và cặp ion [1] Ưu điểm của kỹ thuật chiết bằng dung môi là đơn giản, dễ thực hiện, có thể tách và làm giàu mẫu phân tích Ngoài ra, dịch chiết hữu cơ chứa chất phân tích có thể sử dụng trực tiếp để định lượng bằng GC hoặc LC mà không cần tách chất phân tích ra
8 khỏi dung môi Tuy nhiên, một trong những nhược điểm của kỹ thuật này là sử dụng một lượng dung môi quá lớn gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người nghiên cứu cũng như ảnh hưởng xấu đến môi trường [14]
1.2.1.2 Chiết pha rắn (solid phase extraction)
Chiết pha rắn là quá trình tách chất phân tích dựa vào sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha rắn - lỏng Chất phân tích sau khi được tách ra khỏi mẫu bằng một chất rắn sẽ được rửa giải bằng dung môi thích hợp Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự như trong LC, là dẫn chất polysiloxan, polimer tạo pha liên kết Ngoài ra còn sử dụng cả pha không liên kết
Chiết pha rắn khắc phục những nhược điểm của chiết lỏng – lỏng như: sử dụng lượng dung môi ít hơn so với chiết lỏng - lỏng, dịch chiết dễ dàng xử lý do kết nối với
GC hoặc HPLC và cơ chế tách đa dạng do có nhiều lựa chọn pha rắn Tuy nhiên, kỹ thuật này có một vài nhược điểm như khó lưu giữ chất phân cực mạnh, sử dụng dung môi đã giảm nhưng vẫn còn lớn [1]
1.2.1.3 Phương pháp lọc và phân tích trực tiếp
Một trong phương pháp được sử dụng gần đây và kết hợp cùng với kỹ thuật LC-
MS là phương phỏp lọc qua màng lọc 0,45 àm và tiờm trực tiếp vào hệ thống sắc ký Nghiên cứu của Zheng và cộng sự (2021) về đánh giá mô hình sử dụng ma túy bất hợp pháp tại một thành phố ở Trung Quốc đã sử dụng phương pháp lọc và tiêm trực tiếp vào hệ thống LC-MS có độ nhạy cao là Sciex 5500 + QTRAP (Ontario, Canada) với nguồn ESI (+) kết hợp với hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu Nexera HPLC (Kyoto, Nhật Bản) [52] Kết quả sau khi phân tích đã ước lượng được 9 chất gây nghiên được sử dụng tại quốc gia này Nghiên cứu khác của Trần Thị Thanh Huế và cộng sự (2018-2022) ước tính sử dụng ma túy bất hợp pháp tại Hà Nội sử dụng phương pháp lọc và tiêm trực tiếp vào hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu Nexera LC (Kyoto, Nhật Bản) Thông qua nghiên cứu, hầu hết các loại ma túy được phát hiện trong tất cả các mẫu ngoại trừ cocaine và amphetamine cho tỷ lệ sử dụng thấp Trong đó ước lượng methamphetamin sử dụng từ 119,5 – 553,5 mg/ngày/1000 người cao gấp 3 lần so với heroin Từ đó giúp đánh giá được xu hướng sử dụng ma túy tại Hà Nội [47] Mặc dù phương pháp lọc và phân tích trực tiếp mặc dù mẫu không được làm giàu tuy nhiên lại có ưu điểm ít ảnh hưởng đến quá trình chiết tách nên hiệu suất thu được xem như là 100%
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC- MS/MS)
1.2.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên lý: HPLC là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng để tách các chất khỏi hỗn hợp các thành phần của nó dựa trên sự khác biệt về ái lực giữa các phân tử khác nhau
9 với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách giúp định tính, định lượng và tinh chế các thành phần trong hỗn hợp Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [1] Ưu điểm của HPLC so với các quá trình tách khác là có độ nhạy cao, có khả năng định lượng tốt, mức chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các chất khó bay hơi và chất dễ bị phân hủy nhiệt Có rất nhiều detector khác nhau được sử dụng trong HPLC như detector huỳnh quang, detector khối phổ, detector UV-VIS Tuy nhiên trong phân tích dư lượng chất gây nghiện có trong mẫu nước thải đa phần các nghiên cứu thường sử dụng detector khối phổ vì có độ nhạy và đặc hiệu cao [1]
1.2.2.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ:
Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận HPLC và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS) [2] a Sắc ký lỏng
Trong sắc ký lỏng khối phổ, sắc ký lỏng có vai trò tách hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng rửa giải cùng với hoạt chất đi vào nguồn ion, góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích [2] b Khối phổ MS
Khối phổ MS là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon 12 C) hoặc bằng dalton (Da bằng khối lượng của nguyên tử hydro) Một máy khối phổ thường có năm bộ phận chính là: bộ phận nạp mẫu, bộ nguồn ion hóa, bộ
10 phân tích khối, detector và bộ phận xử lý số liệu Trong đó, bộ phận phân tích khối được coi là quả tim của máy khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt [1]
Bộ phận phân tích khối (Mass analyser) có 4 loại bao gồm: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay, bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron Trong số đó bộ phân tích tứ cực kiểu chập ba được dùng phổ biến trong phân tích gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3 trong đó Q1 và Q3 làm nhiệm vụ phân tích [1]
Hình 1.5 Bộ phân tích tứ cực chập ba
Tổng quan về nghiên cứu dịch tễ học từ phân tích nước thải với chất gây nghiện (WBE)
1.3.1 Giới thiệu về phương pháp dịch tễ học từ phân tích nước thải (WBE)
Nguyên tắc của phương pháp Dịch tễ học dựa trên phân tích nước thải (WBE –
Wastewater-Based Epidemiology) là dựa vào nồng độ các chất trong nước thải, lưu lượng xả thải hàng ngày và dân số trong khu vực để ước tính tổng lượng tiêu thụ theo đầu người và sau đó là lượng tiêu thụ của từng chất theo đầu người trong phạm vi khảo sát Lượng tiêu thụ bình quân mỗi ngày của từng chất (ví dụ như thuốc) trong cộng đồng ở khu vực khảo sát được tính theo công thức (1) sau đây:
Lượng tiêu thụ ước tính = 𝐹 ×𝐶 𝐷𝑅
Lượng tiêu thụ ước tính được tính theo mg/ngày/người
CDR là dư lượng của thuốc trong nước thải, tính theo đơn vị mg/L;
F là lưu lượng nước thải trong vòng 24 giờ, tính theo đơn vị L/ngày;
P là dân số của khu vực khảo sát (số người);
CF là hệ số hiệu chỉnh trung bình của chất tồn dư so với chất gốc có tính đến sự mất mát trong quá trình chuyển hóa và qua quá trình vận chuyển trong đường ống xả thải [53]
Phương pháp này cho phép ước tính lượng thuốc sử dụng bởi dân cư sống trong khu vực khảo sát dựa trên hàm lượng dư lượng thuốc được xác định trong nước thải và sự chuyển hóa chất gốc trong cơ thể con người Mẫu nước thải sau khi lấy từ hiện trường sẽ được xử lý và phân tích để xác định dư lượng Sau đó, lượng thuốc tiêu thụ trong cộng đồng sẽ được tính toán theo công thức (1) Lượng tiêu thụ bình quân (mg/ngày/1000 người) cho phép đánh giá mức độ sử dụng thuốc trong cộng đồng theo không gian và thời gian cũng như phản ánh hiệu quả của các chính sách về quản lý thuốc hoặc hóa chất trong cộng đồng Cách tiếp cận này không gây xâm lấn và được thực hiện ở quy mô cộng đồng, vì vậy tôn trọng quyền riêng tư cá nhân và đảm bảo tính khách quan
Nguyên tắc quan trọng của phương pháp WBE là ước tính lại lượng tiêu thụ trong cộng đồng dựa vào Hệ số CF Hệ số này đã được tính toán dựa vào hệ số thải trừ EF (% chất gốc được thải trừ dưới dạng chất chuyển hóa) và tỷ số khối lượng phân tử giữa chất gốc/chất chuyển hóa theo công thức sau đây [53]:
KLPT (chất gốc) KLPT (chất chuyển hóa)
17 Ngày nay các nghiên cứu WBE được mở rộng và chuyên sâu hơn để hiệu chỉnh lại hệ số CF dựa vào thông số độ ổn định của các chất chuyển hóa trong đường ống xả thải [23]
Phương pháp WBE được ứng dụng ngày càng nhiều trong các nghiên cứu ngày nay Ứng dụng phương pháp này bao gồm:
- Giám sát các nguồn bệnh, ước tính tỷ lệ nhiễm bệnh như virus bại liệt [11] [45], sởi [10], enterovirus [13], viêm gan A [34] và gần đây nhất là virus SARS-CoV-2 [45], [50]
- Đánh giá mức độ phơi nhiễm con người với thuốc trừ sâu trên tám thành phố ở Châu Âu [44]
- Giám sát tình trạng kháng kháng sinh trong cộng đồng [5]
- Phát hiện và ước tính mức độ sử dụng các loại ma túy bất hợp pháp
Trong đó việc sử dụng phương pháp WBE để ước tính lượng tiêu thụ chất gây nghiện bất hợp pháp trong cộng đồng được chú ý nhiều nhất Sử dụng WBE để phát hiện ma túy bất hợp pháp lần đầu bởi Daughton [17] và được Zuccato ứng dụng để giám sát sử dụng cocain và theo dõi xu hướng dùng ma túy bất hợp pháp ở Ý [54] Sau đó, WBE đã được áp dụng rộng rãi ban đầu là để đánh giá và ước lượng việc tiêu thụ các chất gây nghiện ở châu Âu [15], [40]; ở Úc [30], [46]; và gần đây cũng đã được áp dụng tại châu Á [20], [27], [28], [38]
1.3.2 Các nghiên cứu WBE đối với chất gây nghiện
1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng
Một số các yếu tố có thể dẫn đến sai lệch kết quả của phương pháp được trình bày dưới đây: a Quy mô dân số
Việc ước tính quy mô dân số trong lưu vực nhà máy xử lý nước thải rất khó thực hiện Lý tưởng nhất là sử dụng số lượng người thực tế trong một khu vực tại bất kỳ thời điểm nào, tuy nhiên số liệu này rất khó có được Do đó, các nghiên cứu vẫn sử dụng số liệu số lượng người những người cư trú trong khu vực mặc dù số liệu này không tính đến sự di chuyển dân số giữa lưu vực b Hoạt lực và mức liều tiêu chuẩn
Mức liều tiêu chuẩn của một số thuốc hoặc sản phẩm phổ biến có thể dễ dàng xác định được mức liều tiêu chuẩn Tuy nhiên, mức liều của ma túy bất hợp pháp rất khó để xác định do nó tùy thuộc vào từng người Những người nghiện lâu có hiện tượng dung nạp thuốc nên cần dùng liều ma túy cao hơn so với người mới nghiện và do đó mỗi người sẽ đóng góp lượng chất chuyển hóa vào dòng nước thải khác nhau
18 Hoạt lực của các ma túy cũng khác nhau với cùng một liều lượng Loại tác dụng mạnh thì chỉ cần một liều nhỏ cũng đủ gây tác dụng và ngược lại Ở Úc năm 2009, mức liều tiêu chuẩn của METH là 41 mg; mức liều của cocain là 140 mg [43] Nếu chỉ sử dụng dữ liệu mức tải hay lượng tiêu thụ bởi 1000 người sẽ không thấy khác biệt trên Việc ước tính liều lượng tiêu thụ mỗi ngày trên 1.000 người có tính đến hiệu lực và tạo điều kiện cho việc so sánh độ mạnh tương đối của thuốc trên các thị trường thuốc khác nhau Điều này được chứng minh rõ ràng trong nghiên cứu ở Úc ban đầu Phân tích liều trung bình tiêu thụ trên 1000 người của METH và cocain lần lượt là 158 mg và 221 mg Tuy nhiên, khi quy đổi mỗi ngày có 3,9 mg liều METH và 1,6 mg liều cocain – chỉ ra rằng METH tác dụng mạnh hơn [43] c Hệ số hiệu chỉnh
Trước năm 2016, một loạt các hệ số hiệu chỉnh khác nhau đã được sử dụng trong các nghiên cứu và phải dự kiến một số sai lệch khi so sánh kết quả Ví dụ như đối với METH có CF dao động từ 2,3 đến 4,06; đối với MDMA thì CF dao động từ 1,5 đến 6,7 Nghiên cứu của Gracia – Lor và cộng sự đã đề xuất các hệ số CF bằng cách sử dụng tỷ lệ phần trăm thải trừ của chất gốc và chất chuyển hóa được tính toán ở mỗi đường dùng thuốc thông qua các nghiên cứu dược động học có trong y văn Cuối cùng, những giá trị này được tính trọng số xem xét theo đường dùng thuốc thường xuyên nhất và thu được
CF mới Các hệ số CF đã hiệu chỉnh mà nhóm nghiên cứu đã đề xuất có thể được đưa vào nghiên cứu WBE nhằm giảm độ sai số và cải thiện khả năng so sánh của các kết quả [24] d Sự phức tạp do bản thân chất chỉ điểm sinh học:
Các nghiên cứu về nước thải thường xuyên theo dõi cả METH và AMP Tuy nhiên, việc ước tính lượng tiêu thụ cần phải tính đến tính đến việc tiêu thụ dược phẩm của mỗi quốc gia cũng như các hình thức sử dụng ma túy bất hợp pháp Một thách thức đối với các nhà nghiên cứu WBE là METH được bài tiết một phần dưới dạng không đổi và một phần được chuyển hóa thành AMP [9] Ngoài ra, cả METH và AMP là sản phẩm phụ chuyển hóa của một số thuốc [6], như những thuốc được sử dụng để điều trị rối loạn tăng động giảm chú ý (dexamphetamin) và bệnh Parkinson (selegilin) [33] e Đổ thuốc bất hợp pháp vào hệ thống cống rãnh
Phương pháp WBE không thể phân biệt giữa METH được bài tiết ra khỏi cơ thể và METH đổ trực tiếp xuống cống do những tội phạm sợ bị cảnh sát phát hiện Một trong những cách giúp kiểm tra vấn đề này là kiểm tra mối tương quan giữa chất gốc và chất được chọn làm chỉ dấu sinh học Nếu như có sự gia tăng bất thường của chất gốc (ví dụ: cocain hoặc METH) không tương ứng với tải lượng của chất chuyển hóa (như BEN hoặc AMP tương ứng) có thể chứng minh chất gây nghiện đã được đổ trực tiếp xuống hệ thống cống rãnh
1.3.2.2 Ưu điểm, nhược điểm của phương pháp Ưu điểm của phương pháp WBE:
So với các cuộc điều tra hộ gia đình được thực hiện vài năm một lần, WBE có thể cung cấp dữ liệu thô cho các cơ quan chức năng khoảng hai tháng sau khi lấy mẫu từ các lưu vực liên quan nên có thể đưa ra bằng chứng mạnh mẽ các xu hướng và mức độ phổ biến của các loại ma tuý được sử dụng [16]
Dữ liệu WBE vẫn mang khách quan hơn và ít bị ảnh hưởng bởi các tác động lựa chọn liên quan đến các cuộc điều tra nên giảm thiểu sự sai sót thông tin từ những người cung cấp
Với phương pháp WBE chỉ cần một phần nhỏ để phân tích và phần còn lại được dán nhãn và lưu trữ để phân tích lại khi cần thiết
Nhược điểm của phương pháp WBE:
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP ƯỚC TÍNH MỨC ĐỘ TIÊU THỤ CỦA MỘT SỐ MA TÚY TỔNG HỢP NHÓM AMPHETAMIN
Đối tượng nghiên cứu, nguyên liệu và trang thiết bị
- Các ma túy: AMP, METH, MDMA
- Các chất chuyển hóa chính được phân tích trong nước thải: AMP, METH, MDMA
+ Vị trí lấy mẫu: Nước thải được lấy ở sông Kim Ngưu (Hà Nội) cách đầu vào nhà máy xử lý nước thải Yên Sở khoảng 500 m
+ Thời điểm lấy mẫu: lấy vào một thời điểm cố định trong ngày (10 – 11 giờ) + Dụng cụ lấy: ca nhựa có dây nối dài
+ Cách lấy mẫu: Lấy cách bờ khoảng 0,5 m (khoảng 500 ml/lần đựng vào chai nhựa) Mẫu được điều chỉnh về pH 2 bằng dung dịch HCl 10%
+ Bảo quản: ở -20ºC cho đến khi tiến hành phân tích
- Mẫu nền: Nước thải sinh hoạt từ các hộ gia đình không sử dụng ma túy
- Mẫu tự tạo: Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định
2.1.2 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất
Chất chuẩn ngoại và chuẩn nội: được trình bày trong bảng 2.1 dưới đây
Bảng 2.1 Bảng chất chuẩn ngoại và chuẩn nội
STT Tên chất chuẩn ngoại, chuẩn nội
Hãng cung cấp Số lô
Dung môi, hóa chất: methanol (Merck – Đức), Amoni acetat (Fisher – Mỹ), acid formic (Fisher – Mỹ), acid hydrocloric (Univar – Úc)
2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu
Thiết bị phân tích: Hệ thống sắc ký lỏng Nexera (Shimadzu) kết nối hệ thống khối phổ SCIEX 5500 QTrap (Sciex, Concord, Ontario, Canada)
Thiết bị phụ trợ: Cân phân tích Mettler MS 105DU (Thụy Sĩ), màng lọc cellulose
Xây dựng phương pháp định lượng dư lượng một số ma túy tổng hợp nhóm
Lựa chọn chuẩn nội: Từ các bài báo và tài liệu tham khảo, chúng tôi lựa chọn chuẩn nội là AMP-d6, METH-d9, MDMA-d5 do tính chất lý hóa và công thức cấu tạo tương tự như chất phân tích chỉ khác nhau về số khối và không có mặt trong tự nhiên nên giúp giảm sai số trong quá trình xử lý mẫu, không bị ion hóa
2.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Phân tích trên thiết bị có bộ tứ cực chập ba Tiến hành tìm điều kiện phân mảnh, nguồn ion hóa, ion con để định tính và định lượng sao cho:
- Thế phân mảnh được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ, cho mảnh định lượng có tín hiệu cao nhất
- Lựa chọn được ion con có tín hiệu lớn nhất và ổn định để định lượng, ion còn lại định tính
2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Lựa chọn pha tĩnh: dựa trên các nghiên cứu trước đó [52], [47] và điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn cột Cột Kinetex biphenyl (Phenomenex;
50 x 2,1 mm; 1,7 àm) vỡ cú ưu điểm tỏch tốt và độ chọn lọc cao hơn cỏc cột C18 thụng thường
Khảo sát pha động: qua tham khảo các quy trình phân tích ma túy đã được công bố, chúng tôi tiến hành cố định pha tĩnh, tốc độ dòng 0,45 ml/phút và thể tích tiêm mẫu là 7 àL, nhiệt độ cột ở 45 o C Tiến hành pha loóng dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ppb về nồng độ 1 ppb và chuẩn nội 100 ppb về nồng độ 5 ppb bằng dung môi nước để khảo sát hệ pha động sau: pha động A là dung dịch amoni acetat 5 mM và acid formic 0,1% trong nước siêu sạch, pha động B là dung dịch amoni acetat 5 mM và aicd formic 0,1
% trong methanol với chương trình gradient sau:
2.2.3 Phương pháp thu thập và khảo sát quy trình xử lý mẫu
Phương pháp thu thập và xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách: Dựa trên các nghiên cứu trước đó, mẫu nước thải sau khi được thu sẽ được acid hóa về pH 2 và bảo quản ở -20 o C Khi phân tích, mẫu nước thải sẽ được rã đông ở nhiệt độ phòng, lắc đều và ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C Sau đó, lọc qua 2 lần giấy lọc băng xanh
Phương phỏp xử lý mẫu : Mẫu được lọc qua màng lọc nilong 0,45àm sau đú thờm chuẩn nội với nồng độ 5 ng/ml rồi tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thẩm định phương pháp
Dung dịch chuẩn làm việc 10 àg/ml: Từ dung dịch chuẩn gốc của cỏc chất phõn tớch và nội chuẩn, tiến hành pha cỏc dung dịch chuẩn 10 àg/ml cho mỗi chất trong MeOH
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 àg/ml: lấy 1 ml dung dịch chuẩn làm việc 10 àg/ml của mỗi chất cho vào bình định mức 10 ml và bổ sung MeOH đến vạch
Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp 100 ppb: lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc 10 àg/ml của mỗi nội chuẩn cho vào bình định mức 100 ml và bổ sung MeOH đến vạch
Dóy chuẩn: từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 àg/ml, dung dịch chuẩn nội hỗn hợp
100 ppb pha dãy hỗn hợp các dung dịch chuẩn của 3 chất phân tích với các nồng độ khác nhau với nồng độ từ 0,05 đến 100 ppb, thêm dung dịch chuẩn nội với nồng độ 5 ppb, sử dụng dung môi H2O
Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 4 ºC
Thẩm định phương pháp dựa trên các tiêu chí của AOAC [7] và 2002/657/EC [21] Bao gồm các tiêu chí sau:
2.3.1 Độ phù hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần hỗn hợp chuẩn phân tích AMP, METH và MDMA với nồng độ 1 ppb mỗi chất và hỗn hợp chuẩn nội tương ứng với nồng độ 5 ppb được pha loãng từ dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 100 ppb và chuẩn nội 100 ppb bằng dung môi nước vào hệ thống LC-MS/MS Ghi lại thời gian lưu và giá trị diện tích pic Sự phù hợp của hệ thống được biểu thị thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD
Yêu cầu: RSD (%) thời gian lưu ≤ 2% và diện tích pic ≤ 5%
2.3.2 Độ đặc hiệu (độ chọn lọc)
- Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn:
+ Mẫu trắng: mẫu nền đã qua quá trình xử lý mẫu
+ Mẫu chuẩn: chuẩn hỗn hợp 5 ppb và các chuẩn nội 5 ppb
+ Mẫu trắng thêm chuẩn: mẫu trắng thêm chuẩn 5 ppb và chuẩn nội nồng độ 5 ppb
24 Yêu cầu: Với LC-MS/MS, mỗi chất phân tích cần xác nhận sự có mặt của một ion mẹ và hai ion con, đạt yêu cầu về độ đặc hiệu của phương pháp LC-MS/MS với số điểm
IP là 4 Ngoài ra, trên sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn cho các pic với thời gian lưu trùng với thời gian lưu của các pic trên mẫu chuẩn và mẫu trắng không cho pic ở khoảng thời gian lưu
Thực hiện phân tích dãy chuẩn hỗn hợp của chất phân tích từ nồng độ 0,05 ppb đến 100 ppb, nội chuẩn nồng độ 5 ppb Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện đã chọn Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và xác định hệ số r giữa nồng độ chất phân tích và tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích/nội chuẩn
Yêu cầu hệ số hồi quy tuyến tính r ≥ 0,995
2.3.4 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp được đánh giá dựa trên độ đúng và độ chụm Độ đúng được đánh giá qua độ thu hồi, là tỷ lệ phần trăm giá trị thu được so với giá trị lý thuyết
Cách tiến hành: Phân tích mẫu chứa chất phân tích AMP, METH và MDMA ở 3 nồng độ đã biết trước: 0,5 ppb, 50 ppb và 80 ppb; các chuẩn nội tương ứng ở nồng độ 5 ppb Ở mỗi nồng độ tiến hành phân tích 3 mẫu độc lập Thêm chuẩn vào nền mẫu rồi tiến hành chiết tách, phân tích theo quy trình đã xây dựng Xác định độ thu hồi (%) Độ chụm được đánh giá dựa trên độ lặp lại và độ tái lặp Độ lặp lại là độ chính xác của quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Độ tái lặp là độ chính xác của quy trình phân tích khi được thực hiện trong các điều kiện khác nhau bao gồm (người thực hiện, thiết bị khác nhau, phòng thí nghiệm khác nhau, thời gian khác nhau)
Cách tiến hành: tương tự như độ thu hồi để xác định RSD (%)
Cách tiến hành: thực hiện tương tự như tiến hành đánh giá độ thu hồi nhưng vào một ngày khác để xác định RSD (%)
Yêu cầu: Độ đúng và độ chụm đạt yêu cầu AOAC (AOAC-2016) [7]
Bảng 2.2 Độ thu hồi, độ lặp lại và độ tái lặp chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo
Từ 10 - 100 Từ 1 - 10 < 1 Độ thu hồi (%) 80 - 110 60 - 115 40 - 120 Độ lặp lại (%) 15 21 30 Độ tái lặp 22 32 45
2.3.5 Giới hạn phát hiện (LOQ)
Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N > 10)
Tiến hành: xác định LOQ của phương pháp bằng cách chuẩn bị chuẩn hỗn hợp các chất phân tích MDMA, METH, AMP nồng độ lần lượt là 0,05 ppb; 0,1 ppb; 0,2 ppb và cố định các nội chuẩn MDMA - d5, METH - d5 nồng độ 5 ppb trong nền mẫu Tiến hành chiết tách và phân tích theo quy trình Tính tỉ lệ chuẩn tìm lại và lượng chuẩn thêm vào và RSD để có được độ đúng và độ chụm Độ đúng và độ chụm phải đạt yêu cầu của AOAC [7]
2.4 Phương pháp ước tính mức tiêu thụ ma túy nhóm amphetamin trong cộng đồng
2.4.1 Định lượng nồng độ dư lượng các chất gây nghiện trong mẫu nước thải
Tiến hành xử lý mẫu nước thải và phân tích theo quy trình đã xây dựng
Kết quả: nồng độ dư lượng ma túy được tính toán dựa trên tỷ lệ chất diện tích pic của các dấu ấn sinh học/nội chuẩn tương ứng theo phương trình hồi quy tuyến tính trong cùng ngày phân tích với r ≥ 0,995
2.4.2 Ước tính lượng chất ma túy gốc được tiêu thụ trong cộng đồng Ước tính lượng chất ma túy gốc được tiêu thụ trong cộng đồng bằng phương pháp dịch tễ học nước thải (WBE) được tính toán theo công thức (1) sau:
Chất gốc MDMA lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là MDMA để tính toán lượng
Chất gốc METH lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là METH để tính toán lượng
Chất gốc AMP lựa chọn chất chỉ điểm sinh học là AMP để tính toán lượng AMP tiêu thụ Tuy nhiên AMP còn là chất chuyển hóa của METH với hệ số thải trừ EFMETH- AMP (9%) [9] Do đó, tính toán lượng AMP còn nguyên vẹn chỉ do AMP thải trừ như sau:
𝐸𝐹 𝑀𝐸𝑇𝐻−𝑀𝐸𝑇𝐻 𝑥 𝑀𝑊 𝑀𝐸𝑇𝐻 Lượng tiêu thụ ước tính = 𝐹 ×𝐶 𝐷𝑅
AMPAMP : lượng AMP trong nước thải dưới dạng nguyên vẹn
AMPWW : tổng lượng AMP trong nước thải
AMPMETH: lượng AMP do METH chuyển hóa trong nước thải
METH: lượng METH trong nước thải
EFMETH-AMP:tỉ lệ thải trừ của METH thành AMP
MWAMP = 135,21 là khối lượng phân tử của AMP
MWMETH = 149,23 là khối lượng phân tử của METH
Thống kê tỷ lệ thải trừ (EF) và hệ số hiệu chỉnh (CF) của các chất chỉ điểm sinh học được thể hiện bảng 2.3 [24]
Bảng 2.3 Tỷ lệ thải trừ và hệ số hiệu chỉnh của các chất chỉ điểm sinh học
Chất gốc Chất chỉ điểm sinh học EF %
CF (hệ số hiệu chỉnh)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng phương pháp phân tích
3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Cách tiến hành: tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn đơn các chất phân tích và chuẩn nội nồng độ 100 ppb vào hệ thống khối phổ (không qua cột) với hệ dung môi methanol và nước chứa acid formic 0,1% để tối ưu hóa điều kiện khối phổ
Kết quả khảo sát nguồn ion hóa và điều kiện phân mảnh được trình bày trong bảng 3.1 và 3.2 Phổ đồ MS của MDMA và MDMA-d5 được thể hiện trong hình 3.1, phổ đồ MS/MS của MDMA và MDMA-d5 được thể hiện trong hình 3.2
Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa
Nguồn ion hoá ESI (+) Điện thế ion hoá (V) 4500
Bảng 3.2 Các điều kiện khối phổ để phân tích ma túy và chuẩn nội
Q1 Ion định lượng Q3 Ion định tính Q3 m/z DP m/z CE CXP m/z CE CXP
Hình 3.1 Phổ đồ MS của MDMA và MDMA-d5
+Q1: 50 MCA scans from Sample 1 (MDMA_fullscan) of MDMA_fullscan.wiff (Turbo Spray IonDrive) Max 1.6e9 cps
+Q1: 50 MCA scans from Sample 1 (MDMA-d5_fullscan) of MDMA-d5_fullscan.wiff (Turbo Spray IonD Max 2.6e9 cps
Hình 3.2 Phổ đồ MS/MS của MDMA và MDMA-d5
Nhận xét: các điều kiện ion hóa và điều kiện phân mảnh các điều kiện ion hóa và điều kiện khối phổ ở bảng 3.1 và bảng 3.2 đã xác định được điều kiện MS/MS để phân
+MS2 (194.10) CE (20): 50 MCA scans from Sample 1 (MDMA_Productscan) of MDMA_Productscan.w Max 6.7e8 cps
194.2 MDMA +MS2 (194.10) CE (20): 50 MCA scans from Sample 1 (MDMA_Productscan) of MDMA_Productscan.w Max 6.7e8 cps
31 tích các chất phân tích nghiên cứu và chất chuẩn nội Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của các chất phân tích và chuẩn nội đều ở dạng [M-H] + có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Từ đó, mỗi chất được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định danh Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC - MS/MS của châu Âu với số điểm nhận dạng (IP) là 4
3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Hình 3.3 Sắc ký đồ của chất phân tích và chuẩn nội sau khi khảo sát
Nhận xét: kết quả khảo sát cho thấy các pic chất phân tích và chuẩn nội tương ứng cân đối, cân xứng và cho tín hiệu tốt Do đó, lựa chọn điều kiện sắc ký như mục 2.2.2 đã nêu để phân tích chất gây nghiệm trong mẫu nước thải
3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu: mẫu sau khi lấy được acid hóa về pH 2,0 bằng dung dịch acid hydrocloric 1 M, sau đó bảo quản ở -20°C Sau khi lấy đủ mẫu, rã đông về điều kiện thường, lọc qua màng lọc 0,45 àm Lấy 1 ml dịch lọc cho vào lọ đựng mẫu 2 ml, bảo quản ở -70°C đến khi phân tích
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từ 0,05-100 ppb mỗi chất chuẩn và chuẩn nội 5 ppb
32 Điều kiện phân tích: phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng Nexera (Shimadzu) kết nối hệ thống khối phổ SCIEX 5500 QTrap (Sciex, Concord, Ontario, Canada) với loại cột, điều kiện pha động, tốc độ dòng và thể tích tiêm như đã nêu ở mục 2.2.2 Điều kiện khối phổ: đã trình bày ở bảng 3.1 và bảng 3.2
Tính toán kết quả: nồng độ các chất gây nghiện trong mẫu thử được tính toán dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính, tỷ lệ đáp ứng của chất phân tích/nội chuẩn tương ứng.
Kết quả thẩm định phương pháp
3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống
Tiến hành tiêm sắc ký 6 lần hỗn hợp dung dịch chuẩn AMP, METH và MDMA có nồng độ mỗi chất 1 ppb và chuẩn nội tương ứng nồng độ 5 ppb bằng dung môi nước Kết quả phân tích thu được sau khi chạy hệ thống LC-MS/MS để đánh giá độ phù hợp của hệ thống như sau:
Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống
Nhận xét: RSD (%) của thời gian lưu đều < 2% và RSD của tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích/chuẩn nội trong khoảng (2,47% - 2,74%) (
