lê xuân an xây dựng phương pháp định lượng chất chuyển hóa 2 chloroethanol của ethylene oxide trên các loại hạt vừng bằng gc msms

Mặc dù việc tiêu thụ sản phẩm nhiễm EO không gây nguy hiểm cấp tính, người tiêu dùng vẫn có khả năng gặp các vấn đề về sức khỏe nếu sử dụng trong thời gian dài như gặp các loại đột biến

TỔNG QUAN

Tổng quan về ethylen oxyd và 2-chloroetanol

1.1.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý của EO và 2-CE

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của EO và 2-CE

Ethylene Oxide (EO) là ete vòng đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 44,05 g/mol EO có công thức phân tử là C2H4O EO là một loại khí không màu,có mùi hơi ngọt, dễ cháy, hòa tan tốt trong nước, ethanol và ete

EO dễ dàng phản ứng với các hợp chất khác nhau khi mở vòng Các phản ứng điển hình của nó là với các nucleophile tiến hành theo cơ chế SN2 cả trong môi trường acit (nucleophile yếu: nước rượu) và môi trường kiềm (nucleophile mạnh: OH - , RO - , NH3, RNH2, RR’NH,…) Sơ đồ phản ứng chung là:

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển đổi của EO [11]

2-chloroethanol (2-CE) là chlorohydrin đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 80,51 g/mol 2-CE có công thức phân tử là C2H5OCl

2-CE là chất lỏng không màu, có mùi giống như ete, có thể trộn được với nước Trong công nghiệp, 2-CE được sử dụng làm chất trung gian hóa học, sản xuất thuốc nhuộm, chất tạo dẻo và nó cũng được dùng làm dung môi trong một số quy trình công nghiệp[9]

Do có 2 nhóm chức alcol và clorid nên chlorohydrin có các phản ứng hóa học đặc trưng của 2 nhóm này Phản ứng điển hình của nhóm chlorohydrin là phản ứng dehydroclorid hóa trong môi trường kiềm để tạo thành epoxid tương ứng:

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuyển hóa của 2-CE và EO[9]

EO hiếm khi được tìm thấy trong thực phẩm do nhiệt độ hóa hơi thấp (hóa hơi ở 10°C) hoặc phản ứng chuyển đổi thành 2-chloroethanol (2-CE), 2-bromoethanol và ethylene glycol (EG), nổi bật nhất trong số đó là 2-CE[11]

Với cấu trúc dạng vòng linh hoạt, sau khi tiếp xúc với thực phẩm, EO dễ dàng tạo thành các chất chuyển hóa với sự có mặt của phân tử nước, ion clorid và bromid Về mặt lý thuyết, ethylene cũng có thể phản ứng với hypochlorid (có trong nước được khử trùng bằng clo) để tạo thành 2-CE Quá trình này có thể xảy ra ngay khi khử trùng hoặc trong suốt quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản nguyên liệu

EO được sử dụng làm chất khử trùng trong công nghiệp do khả năng phản ứng của nó với các nhóm nucleophile và làm hỏng ADN như nhóm carboxyl, amino, phenolic hydroxit hoặc sulfohydryl[20]

Việc tiêu thụ sản phẩm chứa EO về lâu dài có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như ung thư máu, ung thư dạ dày và các loại ung thư khác Theo đánh giá của Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang Đức (BfR), không có mức độ an toàn nào cho EO trong thực phẩm, vì vậy ngay cả một lượng nhỏ cũng có thể gây nguy hiểm EO nhanh chóng biến mất trong thực phẩm thông qua sự bay hơi hoặc phản ứng, vì vậyngười tiêu dùng tiếp xúc với dư lượng liên quan đến EO thông qua tiêu thụ thực phẩm sẽ chủ yếu liên quan đến các sản phẩm phản ứng EO, trong đó nổi bật nhất là 2-CE Đối với 2-CE, khoảng trống dữ liệu còn quá lớn, dữ liệu về độc tính của 2-CE còn mâu thuẫn và chưa đầy đủ Các nghiên cứu hiện có cho thấy nó có thể gây ta các tác dụng đột biến gen tương tự như EO Do đó, người ta đã quyết định đánh giá 2-CE tương tự như EO về mức độ nguy hiểm[8], [19]

4 1.1.4 Quy định hiện hành về EO và 2-CE

EO được sử dụng do cơ chế gây đột biến ADN ở vi sinh vật, do đó cũng có khả năng gây độc, gây đột biến và gây ung thư ở người Một số thí nghiệm đã chỉ ra rằng

EO làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư hạch và ung thư vú[7],[20] và chất chuyển hóa 2-CE của nó cũng nên được đánh giá tương đương về độc tính[8], [19]

Hiện nay, nhiều quốc gia chưa có quy định về việc sử dụng cũng như dư lượng của EO trong nông nghiệp/thực phẩm Một số ít quốc gia và khu vực đã đưa ra quy định nhưng với sự chênh lệch rất lớn

Quốc gia/ khu vực Quy định giới hạn dư lượng trong các loại thực phẩm

Liên minh Châu Âu Trong các loại chất phụ gia thực phẩm:

0,01-0,1 mg/kg đối với EO (tổng EO và 2-CE) Đối với hạt mè: 0,05 mg/kg [16]

Hoa Kỳ Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng:

7 mg/kg đối với EO;

940 mg/kg đối với 2-CE

Canada Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng:

7 mg/kg đối với EO;

940 mg/kg đối với 2-CE

Hàn Quốc Giới hạn tạm thời đối với 2-CE:

30 mg/kg trong thực phẩm thông thường,

10 mg/kg đối với thực phẩm cho trẻ sơ sinh

Bảng 1.1 Quy định giới hạn dư lượng EO và 2-CE trong các loại thực phẩm[14]

Liên minh châu Âu (EU) từ năm 1991 đã cấm việc sử dụng các sản phẩm có thành phần EO trong khử trùng thực phẩm hay khu vực lưu trữ thực phẩm, tuy nhiên vẫn ghi nhận việc sản phẩm nhập khẩu từ các quốc gia khác có thể có dư lượng chất

Tại châu Âu, hợp chất này được xếp vào nhóm 1B về khả năng gây ung thư, gây đột biến, độc tính sinh sản và trong nhóm 3 về độc tính cấp [15]

Hoa Kỳ và Canada hiện nay vẫn cho phép sử dụng EO trong khử trùng thảo mộc và rau củ khô Ở Hàn Quốc, xuất hiện một số sản phẩm mà doanh nghiệp không sử dụng EO trong sản xuất nhưng lại phát hiện thành phần 2-CE Từ vụ việc này, Hàn Quốc đã ban hành quy định tạm thời về giới hạn dư lượng cho phép đối với chỉ riêng 2-CE Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định cho phép, cấm sử dụng EO trong sản xuất nông nghiệp hay giới hạn dư lượng EO trong thực phẩm

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các phương pháp đã được xây dựng và áp dụng để xác định EO trên thế giới chủ yếu là GC với các kỹ thuật khác nhau như ECD, FID, MS, MS/MS (bảng 1.2) Dưới đây là một số phương pháp dùng để xác định EO:

Kỹ thuật Chuẩn bị mẫu Chất phân tích Thực phẩm LoD/LoQ

GC-FID Chiết xuất acetonitril/metanol 2-CE gia vị khô & đồ gia vị 1 (LoD) [3]

H2SO4, etylic chiết xuất acetat

EO + 2-CE Các loại thảo mộc, gia vị,… 0,050 (LoD)

GC-FID Head Space (HS) EO gia vị 1 (LoQ) [13]

H2SO4, etylic chiết xuất acetat

Tiêu (đen, trắng, xanh lá cây), hạt tiêu

H2SO4, etylic chiết xuất acetat

Các loại thảo mộc, gia vị & khô rau

Chiết xuất QuEChERS và/hoặc QuOil

EO + 2-CE thực phẩm khô 0,050 (LoQ) [18]

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu phân tích xác định EO

Giới thiệu về GC – MS/MS

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dựng trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt, dựa vào ái lực khác nhau của chất phân tích với pha tĩnh và pha động Pha động trong sắc ký khí là chất khí, được gọi là khí mang Khí mang trong GC cần phải có độ tinh khiết cao, trơ về mặt hóa học, phù hợp với detector sử dụng và không gây cháy nổ Tuy nhiên, khí mang vẫn có lẫn các khí tạp khác và những khí này làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích Do đó trước khi vào cột, thường có các bộ phận giữ các khí trên lại, còn gọi là bẫy khí Khí mang trong GC cũng cần phải được kiểm soát về áp suất và tốc độ dòng khí Độ chính xác của tốc độ dòng là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ lặp lại của kết quả Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn và sắc ký khí lỏng Ngoài ra, trong sắc ký khí còn có các yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình phân tích như là nhiệt độ cột hay cách tiêm mẫu Tùy thuộc vào chất phân tích và loại cột sử dựng mà ta chọn nhiệt độ cột và cách tiêm mẫu khác nhau Chất phân tích được pha động đưa vào trong cột dưới dạng hơi, van điều áp đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột tới bộ phận phát hiện là detector Detector sử dụng trong GC có hai loại: detector phụ thuộc khối lượng và detector phụ thuộc nồng độ Có thể kể đến một số loại detector khác nhau như detector dẫn nhiệt, detector ion hóa ngon lửa, detector cộng kết điện tử, detector phát xạ nguyên tử, detector khối phổ,… Một số tiêu chí quan trọng phải được xem xét khi lựa chọn detector để đáp ứng yêu cầu phân tích Khoảng tuyến tính hoặc khoảng động học tuyến tính cần xem xét khi tiến hành định lượng Độ nhạy, độ tin cậy, tính ổn định, tính dễ vận hành cũng như chi phí vận hành cũng cần lưu ý[2]

Detector MS/MS phát hiện chất phân tích bằng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích (m/z) của ion được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Nguyên tắc chung là mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu được chuyển vào máy tính có cài đặt phần mềm chuyên

9 dụng để xử lý và lưu trữ

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm các phần sau: bộ phận nạp mẫu, nguồn ion hóa, bộ phân tích khối, bộ phận phát hiện, bộ phận ghi và xử lý số liệu

Bảng 1.3 Một số phương pháp ở Việt Nam

Nguồn ion hóa: có hai loại nguồn ion hóa phổ biến là ion hóa va chạm điện tử (EI – Electron impact ionization) và ion hóa hóa học (CI – Chemical ionization) Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật EI, gồm 2 quá trình cơ bản sau: tạo chùm electron có năng lượng 70 eV từ sợi đốt nóng, được tăng tốc chuyển động tới anod dưới tác động điện trường; chùm electron va chạm với các phân tử khí trung hòa về điện của mẫu trong quá trình di chuyển Trong kỹ thuật EI, khí và các mẫu có áp suất hóa hơi cao được nạp trực tiếp vào nguồn ion, còn các mẫu dạng lỏng hoặc rắn phải được làm nóng để làm tăng áp suất hóa hơi khi nạp vào buồng ion

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo nguồn ion hóa kiểu va chạm điện tử

Bộ phân tích khối: Có nhiệm vụ tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phận phân tích khối tứ cực kiểu chập ba, gồm ba bộ tư cực nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 Tứ cực có cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song tạo khoảng không ở giữa để các ion bay qua Chỉ các ion có tỷ số m/z phù hợp mới đi qua bộ lọc này Q1 sẽ tách các ion, lựa chọn một hoặc một số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt trong buồng tạo các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng

SCAN: MS nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổ đồ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích

SIM: MS chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn trước đó, SIM thương được chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

SRM: cô lập ion cần chọn và phân mảnh, trong các mảnh ion tạo thành, cô lập tiếp một mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở Q1, phân mảnh ion cô lập đó ở Q2 thu được các ion con, cô lập hai (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở Q3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

Bộ phận phát hiện: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành các tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Các tín hiệu thu được dẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ[2]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu và phân tích

2-chloroethanol (2-CE) Đối tượng phân tích:

Mẫu trắng: mẫu vừng không chứa 2-CE và 2-CP

Mẫu giả định: mẫu vừng thêm chuẩn 2-CE và 2-CP ở các nồng độ cần thiết

Mẫu thực: các mẫu hạt vừng, điều mua trên thị trường Hà Nội.

Nguyên vật liệu, thiết bị

- Chuẩn 2-CE (HPC,Lot 800982, độ tinh khiết ≥ 97%, AccuStandard, Mỹ)

- Chuẩn nội 2-CP (hãng ALDRICH, Lot #BCBR2116V, hàm lượng 70%, Aldrich chemistry, Đức)

- Pha dung dịch chuẩn 2-CE: o Dung dịch chuẩn 2-CE gốc 1000 àg/ml: Cõn chớnh xỏc khoảng 20 mg chuẩn 2-CE vào bình định mức 20 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ 1000 àg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C o Dung dịch chuẩn 2-CE trung gian 100 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 1000 àl chuẩn 2-CE gốc vào bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ 100àg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C o Dung dịch chuẩn 2-CE trung gian 10 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 1000 àl chuẩn 2-CE trung gian vào bình định mức 10ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ 10àg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

- Pha dung dịch chuẩn nội 2-CP: o Dung dịch chuẩn nội 2-CP gốc 1000 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 143 àl chuẩn nội 2-CP vào bình định mức 100 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc cú nồng độ 1000 àg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C o Dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian 10 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 200àl dung

12 dịch chuẩn nội 2-CP gốc vào bình định mức 20ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn nội trung gian có nồng độ 10 àg/ml, bảo quản trong điều kiện trỏnh ỏnh sỏng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C o Dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian 0,05 àg/ml: Hỳt chớnh xỏc 100àl dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian vào bình định mức 20ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn nội trung gian có nồng độ 0,05 àg/ml, bảo quản trong điều kiện trỏnh ỏnh sỏng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Dung môi chiết: acetonitrile của Merck, Đức

- Các hóa chất: muối natri citrate ngậm 2 phân tử nước (Na3C6H5O7.2H2O), muối natri citrat ngậm 1,5 phân tử nước (C6H8Na2O8.1,5H2O), MgSO4 khan, NaCl của Merck, Đức

- Chất hấp phụ PSA(primary secondary amines), C18 được cung cấp bởi Agilent,

- Nước cất 2 lần từ hệ thống cất nước Hamilton

- Hỗn hợp muối chiết: Cân 4,0g MgSO4 khan, 1,0g NaCl, 1,0g Na3C6H5O7.2H2O, 0,5g C6H8Na2O8.1,5H2O cho vào túi pe nhỏ Lắc trộn đều, mỗi hỗn hợp muối chiết được sử dụng cho một mẫu phân tích

- Hỗn hợp chất phân bố (d-SPE): Cân 150mg MgSO4, 25mg PSA, 25g C18 trên cân phân tích và cho vào ống ly tâm nhỏ 2ml Lắc trộn đều, mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích

- Hệ thống Thermo TSQ 9000 GC-MS/MS (Thermo Fisher, Mỹ)

- Cột TG-WAX (60 m ì 0,32 mm ì 1 àm) (Thermo Fisher, Mỹ)

- Cân phân tích Metler Toledo XPE105 (d = 0,01 mg) (Metler Toledo, Mỹ)

- Bình định mức (Isolab, Đức)

- Máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 220R (Hettich, Đức)

- Máy lắc ngang (IKA, Đức)

- Máy lắc xoáy Vortex mixer VM-300 (Gemmy, Đài Loan)

- Micropipet cú thể tớch điều chỉnh được 5-20 àL, 20-200 àL, 100-1000 àL

- Ống ly tâm nhựa 50 mL

- Ống ly tâm nhựa 2 mL

Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 2-CE

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Lựa chọn phương pháp QuEChERS và thực hiện các khảo sát về bước làm sạch bằng d-SPE (bước 7) o Thêm 25/50/75/100 mg GCB o Thêm 25mg PSA o Thêm 25mg C18

Nguyên tắc: Mẫu phân tích được lắc với acetonitrile, sau đó bổ sung thêm MgSO4 và NaCl để giúp quá trình phân lớp giữa nước và acetonitrile, muối dinatricitrat và trinatricitrat có tác dụng làm hệ đệm Chất phân tích được chiết vào lớp acetonitrile sẽ được làm sạch qua chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với việc trộn một phần dịch chiết với các chất hấp phụ như PSA, MgSO4, GCB, C18 để loại tạp chất Dịch chiết được phân tích bằng GC-MS(/MS) và/hoặc LC-MS/MS

Quy trình xử lý mẫu tham khảo[15], [18] và bổ sung dự kiến:

- Bước 1: Đồng nhất mẫu, cân 5 ± 0,01g vào ống ly tâm 50ml

- Bước 2: Thờm 100àl dung dịch chuẩn nội 2-CP 50 ng/ml

- Bước 3: Thêm 5ml acetonitrile, 10ml nước cất, lắc vortex 1 phút

- Bước 5: Thêm 6,5g hỗn hợp muối chiết MgSO4, NaCl, C6H5Na3O7.2H2O,

- Bước 6: Lắc mạnh 1 phút, ly tâm 6000 vòng/phút ở -10 độ C

- Bước 7: Hút 1ml dịch, đưa vào ống d-SPE chứa C18, PSA, MgSO4 (25/25/150 mg)

- Bước 8: Lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút

- Bước 9: Hỳt 500àl cho vào vial

- Bước 10: Phân tích mẫu bằng thiết bị GC-MS/MS

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS/MS để xác định ion mẹ, lựa chọn các ion con phù hợp để định tính và định lượng: chế độ ion hóa, năng lượng ion hoa, nhiệt độ ion hóa, nhiệt độ transferline

- Tham khảo các điều kiện sắc ký: tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, chương trình nhiệt độ, khí mang

2.3.2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng

- Độ đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp

- Giới hạn phát hiện (LOD)

- Giới hạn định lượng (LOQ)

2.3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh phổ của chất phân tích ở cùng một nồng độ trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Yêu cầu:

- Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích

- Thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn tương ứng với thời gian lưu chất phân tích ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,5% đối với kỹ thuật có sử dụng nội chuẩn

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) quy định cách tính điểm IP đối với phương pháp GC-MS/MS: kỹ thuật tách GC được tính 1 điểm, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm Tổng số điểm nhận dạng được tính theo Bảng 2.1

Kỹ thuật Kỹ thuật tách Số ion Số điểm IP

GC-MS-MS GC 1 ion mẹ, 2 ion con

GC-MS-MS GC 2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con

Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký khí khối phổ hai lần

2.3.2.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỉ lệ tín hiệu nhiễu đường nền (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3

LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ tại các chất phân tích Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng nền mẫu đên chất phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được (trục tung y) vào nồng độ (trục hoành x), quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

16 Khoảng tuyến tính tại đó các điểm chuẩn sẽ có tín hiệu phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ với hệ số tương quan R ≥ 0,995 (hoặc R 2 ≥ 0,99) và độ chệch tại mỗi điểm không vượt quá 15%, riêng tại LOQ cho phép không vượt quá 20% Độ chệch theo đường chuẩn tịa mỗi điểm tính theo công thức:

C c x 100 Trong đó: ΔI: Độ chệch của từng điểm chuẩn khi xây dựng đường chuẩn

Cc: Nồng độ các điểm chuẩn

Ct: Nồng độ được tính theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

2.3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu thực thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau của 2-CE là 20, 40, 200 ppb và 1ppb chuẩn nội 2-CP và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối:

Xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “I” x̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

Cc+m : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Theo AOAC, với các mức nồng độ như trên, độ thu hồi phải nằm trong khoảng 60 – 115% đối với các mức nồng độ 20ppb và 40ppb, 80 – 110% đối với mức nồng độ 200ppb; độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15% ở các mức nồng độ 20ppb và 40ppb, không vượt quá 11% ở mức nồng độ 200ppb

Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)

Bảng 2.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các khoảng nồng độ khác nhau

Tỷ lệ chất Đơn vị Độ lặp lại (%)

Bảng 2.3 Độ lặp lại chấp nhận ở các mức nồng độ khác nhau

2.3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Xcalibur) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

2.3.3 Ứng dụng phương pháp Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định hàm lượng 2-CE trong các mẫu hạt vừng trên thị trường

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xây dựng phương pháp

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS

Các ion mẹ và ion con của 2-CE và 2-CP được xác định khi qua buồng ion hóa, tại đây nhờ chùm electron mang năng lượng bắn phá tạo thành các ion ban đầu Ion có cường độ cao được lựa chọn để tiếp tục phân mảnh ở tứ cực thứ hai tạo thành các ion con Trong đó ion con có cường độ cao nhất được lựa chọn để định lượng, ion khác để định tính

Kết quả ion mẹ và mảnh ion con được chọn với các thông số tối ưu như sau: Chất phân tích Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Ứng dụng

Bảng 3.1 Kết quả các mảnh chất phân tích

Hình 3.1 Phổ đồ của 2-CE và 2-CP

Nhận xét: chất chuẩn 2-CE xác định được 2 ion mẹ và 1 ion con như vậy điểm IP = 4,5, chất chuẩn nội 2-CP xác định được 1 ion mẹ và 2 ion con như vậy điểm IP = 5 Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay là IP ≥ 4 theo quy định của EC808/2021

3.1.2 Điều kiện sắc ký phân tích 2-CE

Qua tài liệu tham khảo [6], chúng tôi lựa chọn chương trình pha động như sau:

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 1 àl, khụng chia dũng

- Chương trình nhiệt độ: giữ ở 40°C trong 2 phút, tăng 5°C mỗi phút cho đến 65°C, tăng 50°C mỗi phút cho đến 230°C và giữ trong 3 phút

20 Chương trình gradient nhiệt độ được lựa chọn đã cho kết quả phân tích mẫu 2-CE chuẩn nồng độ 200 ppb và 2-CP nội chuẩn nồng độ 1 ppb như sau:

Hình 3.2 Sắc ký đồ của 2-CE và 2-CP

Nhận xét: Sắc ký đồ của hai chất 2-CE và 2-CP tách hẳn nhau và có thời gian lưu khác nhau tR 2-CE: 12,59 phút tR 2-CP: 12,87 phút

3.1.3 Khảo sát về bước làm sạch bằng d-SPE

Bởi các mẫu thực phẩm đều có nền rất phức tạp, đặc biệt là các nền thực phẩm có dầu như hạt vừng, gia vị Vậy nên để phát hiện được dư lượng chất phân tích trong các nền này cần thực hiện các bước tinh chế dịch chiết ban đầu và loại bỏ nước dư để đảm bảo tính chọn lọc của phương pháp phân tích

Hình 3.3 Dịch chiết cuối của 3 mẫu (trái sang phải) vừng đen, vừng vàng, vừng trắng

Dịch chiết thông thường sẽ được làm sạch bằng các chất MgSO4, PSA, C18, GCB

MgSO4 khan được sử dụng để loại bỏ nước dư ra khỏi dịch chiết PSA là chất hấp thụ trao đổi anion yếu giúp loại bỏ hiệu quả các thành phần phân cực khỏi nền mẫu, chẳng hạn như các axit hữu cơ, sắc tố phân cực và đường C18 dùng để loại các chất lipid có trong mẫu thực phẩm GCB cực kỳ hữu ích trong việc loại bỏ các sắc tố, đặc biệt là

21 những sắc tố mà PSA không loại bỏ hiệu quả Tuy nhiên, trong một số trường hợp GCB không được sử dụng trong quy trình vì lí do rất khó để loại bỏ khỏi dịch chiết, và cũng có nguy cơ hấp phụ chất phân tích

Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các điều kiện sau: thêm 25mg C18/PSA, thêm GCB với lượng 25/50/75/100 mg

3.1.3.1 Thêm GCB ở các mức 25/50/75/100 mg

Thêm GCB vào ống ly tâm nhỏ cùng với hỗn hợp muối ở mục 2.3.1.1 với các lượng: 25mg, 50mg, 75mg, 100mg Một mẫu đối chiếu (DC) không có GCB ở bước làm sạch cũng được thực hiện Sau đó tiến hành sắc ký được kết quả như sau

Hình 3.4 Biểu đồ mối liên hệ tỉ lệ đáp ứng chuẩn 2-CE và IS với lượng khảo sát GCB

Hình 3.5 Dịch chiết cuối của các mẫu (trái sang phải) đối chiếu, GCB 25/50/75/100 mg

DC GCB25 GCB50 GCB75 GCB100

22 Nhận xét: Với các lượng GCB là 25/50/75/100 mg thì tỉ lệ diện tích pic chất chuẩn và IS không có sự khác biệt rõ rệt so với tỉ lệ diện tích pic này của mẫu đối chiếu Tỉ lệ diện tích pic chất chuẩn và IS cửa mẫu thêm 50 mg GCB là thấp nhất ,với các lượng 75/100 mg GCB thì tỉ lệ diện tíc pic này không có sự thay đổi Điều đó cho thấy với lượng bất kỳ của GCB thì đều không làm ảnh hưởng đến chất phân tích và phương pháp phân tích Theo như hình, màu sắc của dịch chiết có sử dụng GCB giảm đáng kể so với mẫu đối chiếu và màu sắc giảm dần (nhưng không đáng kể) theo sự tăng của lượng GCB cho vào Thế nhưng cho càng nhiều GCB thì thể tích dịch chiết cuối hút được cũng bị giảm đi Vì vậy, chúng tôi đề xuất sử dụng GCB với lượng 25 mg để đảm bảo độ sạch của mẫu phân tích và cũng để tiết kiệm hóa chất

Thêm 50mg PSA hoặc C18 vào các ống ly tâm nhỏ có sẵn hỗn hợp muối chiết ở mục 2.3.1.1 Một mẫu đối chiếu (DC) không cho thêm PSA,C18 cũng được thực hiện cùng điều kiện Kết quả được trình bày như sau:

Hình 3.6 Biểu đồ mối liên hệ tỉ lệ đáp ứng chuẩn 2-CE và IS với lượng khảo sát

Nhận xét: Ảnh hưởng của việc cho thêm 50mg PSA gây sai số thừa còn mẫu cho thêm C18 có tỉ lệ diện tích pic chất chuẩn so với IS thấp hơn tỉ lệ diện tích pic này của mẫu đối chiếu Bởi các lí do trên, chúng tôi vẫn giữ nguyên lượng 25mg đối với mỗi chất PSA, C18 trong quy trình ở mục 2.3.1.1 vào bước làm sạch bằng d-SPE Sau quá trình khảo sát, quy trình xử lý mẫu tối ưu được trình bày như sau:

- Bước 1: Đồng nhất mẫu, cân 5 ± 0,01g vào ống ly tâm 50ml

- Bước 2: Thờm 100àl dung dịch chuẩn nội 2-CP 50 ng/ml

- Bước 3: Thêm 5ml acetonitrile, 10ml nước cất, lắc vortex 1 phút

- Bước 5: Thêm 6,5g hỗn hợp muối chiết MgSO4, NaCl, C6H5Na3O7.2H2O,

- Bước 6: Lắc mạnh 1 phút, ly tâm 6000 vòng/phút ở -10 độ C

- Bước 7: Hút 1ml dịch, đưa vào ống d-SPE chứa 25mg C18, 25mg PSA, 150mg MgSO4, 25mg GCB

- Bước 8: Lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút

- Bước 9: Hỳt 500àl cho vào vial

- Bước 10: Phân tích mẫu bằng thiết bị GC-MS/MS

Thẩm định phương pháp

3.2.1 Tính đặc hiệu của phương pháp

Tiến hành bắn phá ion mẹ và ghi lại các ion con Theo cách tính điểm IP, mỗi ion con là 1,5 điểm, ion mẹ là 1 điểm, như vậy số điểm IP tính được theo bảng 3.1 là 4,5 điểm đối với 2-CE và 5 điểm đối với 2-CP , thỏa mãn yêu cầu phân tích trên khối phổ

- Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn 2-CE, mẫu trắng thêm chuẩn 2-CE, mẫu trắng thêm chuẩn nội 2-CP

• Mẫu trắng: sử dụng nền mẫu vừng không phát hiện 2-CE, 2-CP Cân chính xác khoảng 5,0 g vừng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50 ml Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.1.3

• Mẫu trắng thêm chuẩn nội 2-CP: sử dụng nền mẫu vừng không phát hiện 2-

CE Cân chính xác khoảng 5,0 g vừng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50 ml Thờm 100 àl dung dịch nội chuẩn 2-CP Tiến hành xử lý mẫu theo quy trỡnh đã xây dựng tại mục 3.1.3

• Mẫu trắng thêm chuẩn 2-CE: sử dụng nền mẫu vừng không phát hiện 2-CE Cân chính xác khoảng 5,0 g vừng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50 ml Thêm chớnh xỏc 10àl dung dịch chuẩn 2-CE 10ppm, 100 àl dung dịch nội chuẩn 2-

CP vào nền mẫu Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.1.3

• Mẫu chuẩn 2-CE: Hỳt chớnh xỏc 10àl dung dịch chuẩn 2-CE 10ppm, 100 àl dung dịch nội chuẩn 2-CP vào 5,0 ml nước cất và tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.1.3

Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn 2-CE, mẫu trắng thêm chuẩn 2-CE, mẫu trắng thêm chuẩn nội 2-CP

Thu được các sắc ký đồ sau:

- Mẫu trắng thêm chuẩn 2-CE

- Mẫu thêm chuẩn nội 2-CP

Hình 3.7 Sắc ký đồ của mẫu thẩm định độ đặc hiệu

26 Nhận xét: Thời gian lưu của 2-CE ở mẫu thêm chuẩn chênh lệch không quá 0,5% với thời gian lưu ở mẫu chuẩn trên nền dung môi Mẫu trắng không phát hiện tín hiệu của 2-CE và tín hiệu ở thời gian lưu của 2-CP thấp hơn 1% Thời gian lưu của 2-CP ở mẫu trắng thêm chuẩn nội chênh lệch không quá 0,5% so với thời gian lưu của 2-CP trong mẫu chuẩn trên nền dung môi

3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành thêm chuẩn 2-CE ở mức 10 ppb, 20 ppb, 40 ppb trên nền mẫu vừng đen Xác định tỷ lệ S/N bằng phần mềm của máy Kết quả được trình bày

2-CE S/N LOQ (ppb) LOD (ppb)

Bảng 3.2 Kết quả LOQ của 2-CE

Hình 3.8 Sắc ký đồ LOQ của 2-CE

Nhận xét: Mức LOQ của phương pháp trên nền mẫu vừng đen là 20 ppb So với một số phương pháp trong bảng và mức giới hạn dư lượng 0,05 mg/kg của EU thì phương pháp có LOQ tương đối tốt, có khả năng phân tích những nồng độ thấp hơn giới hạn quy định nhiều lần

Tiến hành thêm chuẩn vào nền mẫu với các mức nồng độ là 20; 40; 100; 200; 500 ng/ml, nồng độ nội chuẩn là 1ng/ml và phân tích Xây dựng đường phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic của chuẩn ngoại và chuẩn nội phụ thuộc nồng độ

Nồng độ chuẩn nội (ng/ml)

Diện tích pic chuẩn ngoại

Diện tích pic chuẩn nội

Tỉ lệ diện tích pic 2-CE/2-

Nồng độ tính theo đường chuẩn (ng/ml) Độ chệch (%)

Bảng 3.3 Kết quả khoảng tuyến tính

Hình 3.9 Khoảng tuyến tính của 2-CE y = 0.014x + 0.0728 R² = 0.9998

Hình 3.10 Sắc ký đồ của các điểm chuẩn

Kết quả: trong khoảng nồng độ làm việc từ 20-500 ng/ml dịch, tín hiệu của chất phân tích phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ theo công thức y = 0,0728 + 0,014x với R=0,9998 ( > 0,995) và độ chệch ở nồng độ LOQ ≤20%, độ chệch các nồng độ khác

≤15%, đáp ứng yêu cầu của AOAC

3.2.3 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp được đánh giá bằng các phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 20, 40, 200 ng/ml Phân tích lặp lại với n=6 cho mỗi nồng độ

Kết quả thu được trong bảng:

Nồng độ thu được (ng/ml)

Bảng 3.4 Kết quả độ thu hồi và lặp lại

Hình 3.11 Sắc ký đồ của mẫu thẩm định độ thu hồi, lặp lại

Nhận xét: Độ thu hồi của các nền mẫu đều nằm trong khoảng cho phép 80 – 110% và 60 – 115%, giá trị RSD (%) đều không vượt quá 15% ở mức nồng độ 20 ng/ml và

40 ng/ml, không vượt quá 11% ở mức nồng độ 200ng/ml Đáp ứng yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại của AOAC.

Ứng dụng phương pháp

Sử dụng phương pháp đã thẩm định để xác định sơ bộ hàm lượng 2-CE trong một số mẫu hạt vừng và sản phẩm về vừng trên thị trường, mỗi mẫu được cân ~ 5,00g và thêm 1ppb chuẩn nội 2-CP, kết quả thu được như sau:

Tên mẫu Nguồn gốc Diện tích pic

Diện tích pic IS Hàm lượng

(mg/kg) Hạt vừng đen

Hạt vừng rang KPH 1688 KPH

Bảng 3.5 hàm lượng của một số mẫu hạt vừng trên thị trường

Nhận xét: Các mẫu hạt vừng phát hiện có chứa 2-CE với hàm lượng thấp hơn mức LOQ của phương pháp

Dưới đây là sắc ký đồ của một số mẫu phát hiện có chứa 2-CE và mẫu không có 2-

Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu hạt vừng trên thị trường

Bàn luận

- Về quy trình xử lý mẫu:

Quy trình xử lý mẫu đã được thay đổi nhằm tối ưu hóa phù hợp với mẫu nghiên cứu o Trong phần khảo sát GCB, ở lượng 50 mg GCB cho tỉ lệ diện tích pic chất chuẩn, chuẩn IS là thấp nhất Điều này có thể là do sai số thao tác bởi ở các mức 75 và 100 mg tỉ lệ diện tích pic này cho thấy một sự chênh lệch không đáng kể o Đối với các mẫu có nhiều dầu như hạt vừng thì việc xuất hiện thêm một lượng C18 có thể làm giảm bớt ảnh hưởng của tạp chất có trong mẫu Tuy nhiên, điều này do thiếu sót của em là đã không khảo sát được hết mọi yếu tố và thao tác thực hiện còn chưa được tốt mà dẫn đến việc khảo sát C18 dừng lại ở việc dùng lượng C18 như trong các tài liệu tham khảo

Trong đề tài này chúng tôi đã không dẫn xuất EO thành 2-CE để có thể xác định được toàn lượng EO (EO = EO + 2-CE) có trong thực phẩm Bởi trong tài liệu tham khảo [4]

35 đã chỉ ra rằng chỉ có lượng 2-CE sẵn có đóng góp vào lượng EO tương đương (đo bằng EO+2CE) Như vậy, ta có thể thấy rằng thiếu đi bước dẫn xuất hóa EO thành 2-CE không quá quan trọng trong việc định lượng EO thông qua dẫn xuất 2-CE của chất này

- Về Thẩm định phương pháp:

Phương pháp đã được thẩm định và đạt tất cả các tiêu chí theo hướng dẫn thẩm định của AOAC về tính đặc hiệu, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi

Phương pháp cho độ nhạy tốt với LOQ là 20ppb cao hơn mức LOQ của đa số phương pháp trong bảng nhưng thấp hơn mức LOQ của các phương pháp trong tài liệu tham khảo [1],[4],[6] (LOQ = 10ppb) Tuy nhiên mức LOQ của phương pháp phân tích trong đề tài vẫn thấp hơn nhiều mức MRL mà EU đặt ra là 50ppb đối với các mẫu hạt vừng, nên phương pháp phân tích của chúng tôi vẫn có thể ứng dụng trong phân tích các mẫu thực tế

- Về kết quả phân tích: Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng 2-CE trong các mẫu hạt vừng, hạt điều và các sản phẩm của chúng cho kết quả tích cực, khi mà các mẫu phát hiện 2-CE có hàm lượng rất thấp (