lê xuân an xây dựng phương pháp định lượng chất chuyển hóa 2 chloroethanol của ethylene oxide trên các loại hạt vừng bằng gc msms

Mặc dù việc tiêu thụ sản phẩm nhiễm EO không gây nguy hiểm cấp tính, người tiêu dùng vẫn có khả năng gặp các vấn đề về sức khỏe nếu sử dụng trong thời gian dài như gặp các loại đột biến

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN AN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHẤT CHUYỂN HÓA 2-CHLOROETHANOL CỦA ETHYLENE

OXIDE TRÊN CÁC LOẠI HẠT VỪNG

BẰNG GC-MS/MS

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LƯỢNG CHẤT CHUYỂN HÓA CHLOROETHANOL CỦA ETHYLENE

2-OXIDE TRÊN CÁC LOẠI HẠT VỪNG

BẰNG GC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn đến TS Trần Nguyên Hà là người đã dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học, trực tiếp chỉ bảo , hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong khoa Độc học và dị nguyên thuộc Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là Ths Bùi Cao Tiến, đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình làm việc tại Viện

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm độc chất, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn thể các thầy cô tại các bộ môn đã chỉ dạy và giúp đỡ trong suốt quãng thời gian học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, anh chị em đã luôn bên cạnh giúp đỡ và động viên để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình một cách tốt nhất

Trong quá trình thực hiện đề tài, dù cố gắng hết sức nhưng em vẫn không thể tránh khỏi nhiều sai sót, kính mong nhận được những chỉ bảo, đánh giá từ các thầy cô và mọi người để em có thể hoàn thiện khóa luận của mình

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2024

Sinh viên Lê Xuân An

ii MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU v

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về ethylen oxyd và 2-chloroetanol 2

1.1.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý của EO và 2-CE 2

1.1.2 Sự hình thành 3

1.1.3 Độc tính 3

1.1.4 Quy định hiện hành về EO và 2-CE 4

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.2 Giới thiệu về GC – MS/MS 8

1.2.1 Sắc ký khí 8

1.2.2 Detector MS/MS 8

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu và phân tích 11

2.1.1 Đối tượng phân tích 11

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 11

2.2.1 Chất chuẩn 11

2.2.2 Dung môi, hoá chất 12

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 12

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 2-CE 13

2.3.2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng 14

2.3.3 Ứng dụng phương pháp 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Xây dựng phương pháp 19

iii

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS 19

3.1.2 Điều kiện sắc ký phân tích 2-CE 19

3.1.3 Khảo sát về bước làm sạch bằng d-SPE 20

3.2 Thẩm định phương pháp 23

3.2.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 23

3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 26

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleic

ECD Electron capture detector Detector bắt giữ electron FID Flame ionization detector Detector ion hóa ngọn lửa

GCB Graphitized carbon black Muội than graphit hóa

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

Monitoring

Kỹ thuật ghi phổ phản ứng

chọn lọc MS/MS Mass Spectrometry/Mass

Spectrometry

Detector khối phổ hai lần

m/z Mass to charge ratio Tỷ số khối lượng/điện tích PSA N-propylethylenediamine N-propylethylenediamin RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SIM Selected Ion Monitoring Kỹ thuật ghi phổ chọn lọc

ion d-SPE Dispersive Solid Phase

Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký khí khối phổ hai lần 16

Bảng 3.5 hàm lượng của một số mẫu hạt vừng, sản phẩm về vừng trên

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.6 Biểu đồ mối liên hệ tỉ lệ đáp ứng chuẩn 2-CE và IS với

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ethylene oxide (EO) được sử dụng là hóa chất trung gian sản xuất ethylene glycol (chất chống đông), chất tẩy rửa hoặc một chất khử trung diệt vi sinh vật, nấm mốc hiệu quả trong thực phẩm, nông sản, y tế,… EO tác động đến ADN của sinh vật nên cũng có khả năng gây độc trên cơ thể người Thực tế, hóa chất này đã được xếp vào loại chất gây ung thư, nguy hiểm cho người Liên minh Châu Âu từ lâu đã có động thái mạnh tay khi nghiêm cấm sử dụng những sản phẩm khử trùng có chứa thành phần EO đồng thời đặt ra mức giới hạn dư lượng EO đối với những sản phẩm nhập khẩu từ các nước bên ngoài[21] Mặc dù việc tiêu thụ sản phẩm nhiễm EO không gây nguy hiểm cấp tính, người tiêu dùng vẫn có khả năng gặp các vấn đề về sức khỏe nếu sử dụng trong thời gian dài như gặp các loại đột biến gen hay mắc các loại ung thư,… Nhận thức rõ được tính hai mặt của EO, một số nước trên thế giới đã đặt ra mức giới hạn riêng và vẫn sử dụng hóa chất này như một chất khử trùng bởi tính hiệu quả của nó[21] Trong những năm gần đây, một số sản phẩm xuất khẩu của Việt Nam đã bị trả về do mức dư lượng EO quá cao so với quy định, điển hình như sản phẩm mỳ ăn liền[14] Điều này dấy lên một vấn đề nhức nhối trong việc xuất khẩu hàng hóa ra thị trường nước ngoài của nước ta Như vậy việc thiết lập một giới hạn dành cho EO trong thực phẩm không chỉ liên quan đến vấn đề sức khỏe của người tiêu dùng mà còn là việc mở rộng thị trường kinh doanh, mang sản phẩm của Việt Nam tiếp cận với thế giới

Ở Việt Nam trong giai đoạn gần đây đã có một số nghiên cứu xác định EO trong các loại thực phẩm, chủ yếu là mỳ[1],[6] Trong khi EO được sử dụng để khử trùng rất nhiều loại hạt, ngũ cốc khác như vừng, lạc, điều,…

Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản, EO có thể được chuyển hóa thành chloroethanol (2-CE) Chất này cũng được đặt ra mức dư lượng trong thực phẩm nhưng có sự chênh lệch đáng kể giữa các nước[21] Ngoài ra, khi phân tích bằng phương pháp sắc ký khí sẽ gặp khó khăn do nhiệt độ hóa hơi của EO là trên 10°C nên có thể dẫn xuất thành 2-CE rồi mới định lượng Với lí do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng chất chuyển hoá 2-chloroethanol của ethylene oxide trên các loại hạt vừng bằng gc-ms/ms” hướng tới hai mục tiêu sau:

2 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định chất chuyển hóa 22 chloroethanol của ethylene oxide bằng GC-MS/MS

- Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng 2-chloroethanol trong một số hạt vừng trên thị trường

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ethylen oxyd và 2-chloroethanol

1.1.1 Cấu trúc, tính chất hóa lý của EO và 2-CE

Ethylen oxide 2-Chloroethanol

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của EO và 2-CE

1.1.1.1 EO

Ethylene Oxide (EO) là ete vòng đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 44,05 g/mol EO có công thức phân tử là C2H4O EO là một loại khí không màu,có mùi hơi ngọt, dễ cháy, hòa tan tốt trong nước, ethanol và ete

EO dễ dàng phản ứng với các hợp chất khác nhau khi mở vòng Các phản ứng điển hình của nó là với các nucleophile tiến hành theo cơ chế SN2 cả trong môi trường acit (nucleophile yếu: nước rượu) và môi trường kiềm (nucleophile mạnh: OH-, RO-, NH3, RNH2, RR’NH,…) Sơ đồ phản ứng chung là:

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển đổi của EO [11]

1.1.1.2 2-CE 2-chloroethanol (2-CE) là chlorohydrin đơn giản nhất, có trọng lượng phân tử là 80,51 g/mol 2-CE có công thức phân tử là C2H5OCl

2-CE là chất lỏng không màu, có mùi giống như ete, có thể trộn được với nước Trong công nghiệp, 2-CE được sử dụng làm chất trung gian hóa học, sản xuất thuốc nhuộm, chất tạo dẻo và nó cũng được dùng làm dung môi trong một số quy trình công nghiệp[9]

3 Do có 2 nhóm chức alcol và clorid nên chlorohydrin có các phản ứng hóa học đặc trưng của 2 nhóm này Phản ứng điển hình của nhóm chlorohydrin là phản ứng dehydroclorid hóa trong môi trường kiềm để tạo thành epoxid tương ứng:

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng chuyển hóa của 2-CE và EO[9]

1.1.2 Sự hình thành

EO hiếm khi được tìm thấy trong thực phẩm do nhiệt độ hóa hơi thấp (hóa hơi ở 10°C) hoặc phản ứng chuyển đổi thành 2-chloroethanol (2-CE), 2-bromoethanol và ethylene glycol (EG), nổi bật nhất trong số đó là 2-CE[11]

Với cấu trúc dạng vòng linh hoạt, sau khi tiếp xúc với thực phẩm, EO dễ dàng tạo thành các chất chuyển hóa với sự có mặt của phân tử nước, ion clorid và bromid Về mặt lý thuyết, ethylene cũng có thể phản ứng với hypochlorid (có trong nước được khử trùng bằng clo) để tạo thành 2-CE Quá trình này có thể xảy ra ngay khi khử trùng hoặc trong suốt quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản nguyên liệu

1.1.3 Độc tính

EO được sử dụng làm chất khử trùng trong công nghiệp do khả năng phản ứng của nó với các nhóm nucleophile và làm hỏng ADN như nhóm carboxyl, amino, phenolic hydroxit hoặc sulfohydryl[20]

Việc tiêu thụ sản phẩm chứa EO về lâu dài có thể dẫn đến các vấn đề nghiêm trọng như ung thư máu, ung thư dạ dày và các loại ung thư khác Theo đánh giá của Viện Đánh giá Rủi ro Liên bang Đức (BfR), không có mức độ an toàn nào cho EO trong thực phẩm, vì vậy ngay cả một lượng nhỏ cũng có thể gây nguy hiểm EO nhanh chóng biến mất trong thực phẩm thông qua sự bay hơi hoặc phản ứng, vì vậyngười tiêu dùng tiếp xúc với dư lượng liên quan đến EO thông qua tiêu thụ thực phẩm sẽ chủ yếu liên quan đến các sản phẩm phản ứng EO, trong đó nổi bật nhất là 2-CE Đối với 2-CE, khoảng trống dữ liệu còn quá lớn, dữ liệu về độc tính của 2-CE còn mâu thuẫn và chưa đầy đủ Các nghiên cứu hiện có cho thấy nó có thể gây ta các tác dụng đột biến gen tương tự như EO Do đó, người ta đã quyết định đánh giá 2-CE tương tự như EO về mức độ nguy hiểm[8], [19]

4

1.1.4 Quy định hiện hành về EO và 2-CE

EO được sử dụng do cơ chế gây đột biến ADN ở vi sinh vật, do đó cũng có khả năng gây độc, gây đột biến và gây ung thư ở người Một số thí nghiệm đã chỉ ra rằng EO làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư hạch và ung thư vú[7],[20] và chất chuyển hóa 2-CE của nó cũng nên được đánh giá tương đương về độc tính[8], [19]

Hiện nay, nhiều quốc gia chưa có quy định về việc sử dụng cũng như dư lượng của EO trong nông nghiệp/thực phẩm Một số ít quốc gia và khu vực đã đưa ra quy định nhưng với sự chênh lệch rất lớn

Quốc gia/ khu vực Quy định giới hạn dư lượng trong các loại thực phẩm

Liên minh Châu Âu Trong các loại chất phụ gia thực phẩm:

0,01-0,1 mg/kg đối với EO (tổng EO và 2-CE) Đối với hạt mè: 0,05 mg/kg [16]

Hoa Kỳ Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng:

7 mg/kg đối với EO; 940 mg/kg đối với 2-CE

Canada Trong các loại thảo mộc, rau củ khô, vừng:

7 mg/kg đối với EO; 940 mg/kg đối với 2-CE

Hàn Quốc Giới hạn tạm thời đối với 2-CE:

30 mg/kg trong thực phẩm thông thường, 10 mg/kg đối với thực phẩm cho trẻ sơ sinh

Bảng 1.1 Quy định giới hạn dư lượng EO và 2-CE trong các loại thực phẩm[14]

Liên minh châu Âu (EU) từ năm 1991 đã cấm việc sử dụng các sản phẩm có thành phần EO trong khử trùng thực phẩm hay khu vực lưu trữ thực phẩm, tuy nhiên vẫn ghi nhận việc sản phẩm nhập khẩu từ các quốc gia khác có thể có dư lượng chất

5 này[21]

Tại châu Âu, hợp chất này được xếp vào nhóm 1B về khả năng gây ung thư, gây đột biến, độc tính sinh sản và trong nhóm 3 về độc tính cấp [15]

Hoa Kỳ và Canada hiện nay vẫn cho phép sử dụng EO trong khử trùng thảo mộc và rau củ khô

Ở Hàn Quốc, xuất hiện một số sản phẩm mà doanh nghiệp không sử dụng EO trong sản xuất nhưng lại phát hiện thành phần 2-CE Từ vụ việc này, Hàn Quốc đã ban hành quy định tạm thời về giới hạn dư lượng cho phép đối với chỉ riêng 2-CE

Hiện nay, Việt Nam chưa ban hành quy định cho phép, cấm sử dụng EO trong sản xuất nông nghiệp hay giới hạn dư lượng EO trong thực phẩm

1.1.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các phương pháp đã được xây dựng và áp dụng để xác định EO trên thế giới chủ yếu là GC với các kỹ thuật khác nhau như ECD, FID, MS, MS/MS (bảng 1.2)

Dưới đây là một số phương pháp dùng để xác định EO:

6

Kỹ thuật Chuẩn bị mẫu

Chất phân tích Thực phẩm LoD/LoQ

(mg/ kg)

Tham khảo

GC-FID Chiết xuất

acetonitril/metanol 2-CE

gia vị khô & đồ

ECD

GC-Xử lý bằng NaCl/ H2SO4, etylic chiết xuất acetat

EO + 2-CE Các loại thảo

EO + 2-CE

Tiêu (đen, trắng, xanh lá

cây), hạt tiêu

0,020 (LoD) 0,100 (LoQ) [12]

GC-MS

Xử lý bằng NaCl/ H2SO4, etylic chiết xuất acetat

EO + 2-CE

Các loại thảo mộc, gia vị &

khô rau

0,010 (LoD) 0,050 (LoQ) [5]

GC-MS /MS

Chiết xuất QuEChERS và/hoặc QuOil

EO + 2-CE thực phẩm khô 0,050 (LoQ) [18]

MS/MS

GC-Xử lý bằng NaCl/ H2SO4, Chiết xuất

QuEChERS

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu phân tích xác định EO

Các tài liệu công bố trên đều phân tích EO và 2-CE bằng phương pháp GC với các detector khác nhau như ECD, FID, MS và MS/MS Việc kiểm định EO trong thực phẩm được tiến hành dựa trên hai phương pháp chính:

- Một là phương pháp phân tích GC-MS, dựa trên sự chuyển hóa của EO thành CE, định lượng qui về 2-CE Ưu điểm của phương pháp này là khả năng ổn định, chính

2-7 xác cao, thết bị tương đối phổ biến dễ sử dụng nhưng nhược điểm là tốn thời gian, điều kiện chuyển hóa phức tạp

- Hai là sử dụng kỹ thuật GC-MS/MS phân tích đồng thời EO và 2-CE bằng phương pháp xử lý mẫu QuEChERS Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là xử lí mẫu đơn giản, nhanh chóng, tiết kiệm thời gian, phân tích đồng thời được cả hai chất (EO và 2-CE) với độ nhạy rất cao Điểm đáng lưu ý là khi sử dụng phương pháp này là tính ổn định, tránh được sự nhầm lẫn giữa EO và acetaldehyde, một đồng phân của EO, dễ hình thành ở nhiệt độ cao từ EO và 2-CE

Ngoài ra, còn có các phương pháp như không gian hơi (Headspce) hay định lượng EO bằng cách chuyển đổi 2-CE thành EO Tuy nhiên, các phương pháp này tỏ ra kém hiệu quả do quy trình xử lý mẫu phức tạp, tốn thời gian và có độ nhạy thấp

Tại Việt Nam đã có 2 đề tài nghiên cứu xác định đồng thời EO và dẫn chất của nó 2-CE trong thực phẩm (mỳ, thực phẩm giàu chất béo) bằng GC-MS/MS, mỗi đề tài cho ta thấy những cách tiếp cận xử lý mẫu khác nhau đối với từng loại thực phẩm để có thể tận dụng được ưu nhược điểm của phương pháp phân tích GC-MS/MS

Nền Chuẩn bị mẫu Đối tượng

phân tích

Phương pháp phân

tích

LOQ (mg/kg) Tham khảo

Dầu

QuOil kết hợp chất chuẩn nội

và bi thép không gỉ

EO+2-CE

MS/MS Vtiêm: 4µl

GC-Cột WAX (60m x 0,32mm x

TG-1µm) TR(phút):

EO: 5,87 2-CE: 12,3

2-CE-d4: 12,3

Gia vị mỳ

QuEChERS EO+2-CE

MS/MS Vtiêm: 1µl

GC-Cột 624 (60m x

DB-0,32mm x 1,8µm) TR(phút):

EO: 4,78 2-CE: 9,27

Bảng 1.3 Một số phương pháp ở Việt Nam

8 1.2 Giới thiệu về GC – MS/MS

1.2.1 Sắc ký khí

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các hợp chất ở trạng thái khí, được ứng dựng trong phân tích những hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt, dựa vào ái lực khác nhau của chất phân tích với pha tĩnh và pha động Pha động trong sắc ký khí là chất khí, được gọi là khí mang Khí mang trong GC cần phải có độ tinh khiết cao, trơ về mặt hóa học, phù hợp với detector sử dụng và không gây cháy nổ Tuy nhiên, khí mang vẫn có lẫn các khí tạp khác và những khí này làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích Do đó trước khi vào cột, thường có các bộ phận giữ các khí trên lại, còn gọi là bẫy khí Khí mang trong GC cũng cần phải được kiểm soát về áp suất và tốc độ dòng khí Độ chính xác của tốc độ dòng là yếu tố quan trọng để đảm bảo độ lặp lại của kết quả Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên một chất mang rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng là sắc ký khí rắn và sắc ký khí lỏng Ngoài ra, trong sắc ký khí còn có các yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình phân tích như là nhiệt độ cột hay cách tiêm mẫu Tùy thuộc vào chất phân tích và loại cột sử dựng mà ta chọn nhiệt độ cột và cách tiêm mẫu khác nhau Chất phân tích được pha động đưa vào trong cột dưới dạng hơi, van điều áp đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột tới bộ phận phát hiện là detector Detector sử dụng trong GC có hai loại: detector phụ thuộc khối lượng và detector phụ thuộc nồng độ Có thể kể đến một số loại detector khác nhau như detector dẫn nhiệt, detector ion hóa ngon lửa, detector cộng kết điện tử, detector phát xạ nguyên tử, detector khối phổ,… Một số tiêu chí quan trọng phải được xem xét khi lựa chọn detector để đáp ứng yêu cầu phân tích Khoảng tuyến tính hoặc khoảng động học tuyến tính cần xem xét khi tiến hành định lượng Độ nhạy, độ tin cậy, tính ổn định, tính dễ vận hành cũng như chi phí vận hành cũng cần lưu ý[2]

1.2.2 Detector MS/MS

Detector MS/MS phát hiện chất phân tích bằng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích (m/z) của ion được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Nguyên tắc chung là mẫu từ máy sắc ký khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hóa trong buồng ion để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu được chuyển vào máy tính có cài đặt phần mềm chuyên

9 dụng để xử lý và lưu trữ

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm các phần sau: bộ phận nạp mẫu, nguồn ion hóa, bộ phân tích khối, bộ phận phát hiện, bộ phận ghi và xử lý số liệu

Bảng 1.3 Một số phương pháp ở Việt Nam

Nguồn ion hóa: có hai loại nguồn ion hóa phổ biến là ion hóa va chạm điện tử (EI – Electron impact ionization) và ion hóa hóa học (CI – Chemical ionization) Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật EI, gồm 2 quá trình cơ bản sau: tạo chùm electron có năng lượng 70 eV từ sợi đốt nóng, được tăng tốc chuyển động tới anod dưới tác động điện trường; chùm electron va chạm với các phân tử khí trung hòa về điện của mẫu trong quá trình di chuyển Trong kỹ thuật EI, khí và các mẫu có áp suất hóa hơi cao được nạp trực tiếp vào nguồn ion, còn các mẫu dạng lỏng hoặc rắn phải được làm nóng để làm tăng áp suất hóa hơi khi nạp vào buồng ion

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo nguồn ion hóa kiểu va chạm điện tử

10 Bộ phân tích khối: Có nhiệm vụ tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phận phân tích khối tứ cực kiểu chập ba, gồm ba bộ tư cực nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 Tứ cực có cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song tạo khoảng không ở giữa để các ion bay qua Chỉ các ion có tỷ số m/z phù hợp mới đi qua bộ lọc này Q1 sẽ tách các ion, lựa chọn một hoặc một số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt trong buồng tạo các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng

- Kỹ thuật ghi phổ: SCAN: MS nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổ đồ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích

SIM: MS chỉ cho tín hiệu của ion đã được lựa chọn trước đó, SIM thương được chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

SRM: cô lập ion cần chọn và phân mảnh, trong các mảnh ion tạo thành, cô lập tiếp một mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở Q1, phân mảnh ion cô lập đó ở Q2 thu được các ion con, cô lập hai (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở Q3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

Bộ phận phát hiện: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành các tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Các tín hiệu thu được dẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ[2]

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.2.1 Chất chuẩn

- Chuẩn 2-CE (HPC,Lot 800982, độ tinh khiết ≥ 97%, AccuStandard, Mỹ) - Chuẩn nội 2-CP (hãng ALDRICH, Lot #BCBR2116V, hàm lượng 70%, Aldrich

chemistry, Đức) - Pha dung dịch chuẩn 2-CE:

o Dung dịch chuẩn 2-CE gốc 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 20 mg chuẩn 2-CE vào bình định mức 20 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

o Dung dịch chuẩn 2-CE trung gian 100 µg/ml: Hút chính xác 1000 µl chuẩn 2-CE gốc vào bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

o Dung dịch chuẩn 2-CE trung gian 10 µg/ml: Hút chính xác 1000 µl chuẩn 2-CE trung gian vào bình định mức 10ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 10µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

- Pha dung dịch chuẩn nội 2-CP:

o Dung dịch chuẩn nội 2-CP gốc 1000 µg/ml: Hút chính xác 143 µl chuẩn nội 2-CP vào bình định mức 100 ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

o Dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian 10 µg/ml: Hút chính xác 200µl dung

12 dịch chuẩn nội 2-CP gốc vào bình định mức 20ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn nội trung gian có nồng độ 10 µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C o Dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian 0,05 µg/ml: Hút chính xác 100µl

dung dịch chuẩn nội 2-CP trung gian vào bình định mức 20ml, hòa tan và định mức bằng acetonitrile, thu được dung dịch chuẩn nội trung gian có nồng độ 0,05 µg/ml, bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2 – 8 độ C

2.2.2 Dung môi, hoá chất

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích - Dung môi chiết: acetonitrile của Merck, Đức

- Các hóa chất: muối natri citrate ngậm 2 phân tử nước (Na3C6H5O7.2H2O), muối natri citrat ngậm 1,5 phân tử nước (C6H8Na2O8.1,5H2O), MgSO4 khan, NaCl của Merck, Đức

- Chất hấp phụ PSA(primary secondary amines), C18 được cung cấp bởi Agilent, Mỹ

- Nước cất 2 lần từ hệ thống cất nước Hamilton - Hỗn hợp muối chiết: Cân 4,0g MgSO4 khan, 1,0g NaCl, 1,0g Na3C6H5O7.2H2O,

0,5g C6H8Na2O8.1,5H2O cho vào túi pe nhỏ Lắc trộn đều, mỗi hỗn hợp muối chiết được sử dụng cho một mẫu phân tích

- Hỗn hợp chất phân bố (d-SPE): Cân 150mg MgSO4, 25mg PSA, 25g C18 trên cân phân tích và cho vào ống ly tâm nhỏ 2ml Lắc trộn đều, mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

2.2.3.1 Thiết bị - Hệ thống Thermo TSQ 9000 GC-MS/MS (Thermo Fisher, Mỹ) - Cột TG-WAX (60 m × 0,32 mm × 1 µm) (Thermo Fisher, Mỹ) - Cân phân tích Metler Toledo XPE105 (d = 0,01 mg) (Metler Toledo, Mỹ) - Bình định mức (Isolab, Đức)

- Vial 2ml (Waters, Mỹ) - Ống Eppendorf (Eppendorf, Đức) - Máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 220R (Hettich, Đức) - Máy lắc ngang (IKA, Đức)

- Máy lắc xoáy Vortex mixer VM-300 (Gemmy, Đài Loan)

13 2.2.3.2 Dụng cụ

- Micropipet có thể tích điều chỉnh được 5-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL - Ống ly tâm nhựa 50 mL

- Ống ly tâm nhựa 2 mL - Vial loại 1,8 mL - Insert

2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 2-CE

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Lựa chọn phương pháp QuEChERS và thực hiện các khảo sát về bước làm sạch bằng d-SPE (bước 7)

o Thêm 25/50/75/100 mg GCB o Thêm 25mg PSA

o Thêm 25mg C18 Nguyên tắc: Mẫu phân tích được lắc với acetonitrile, sau đó bổ sung thêm MgSO4và NaCl để giúp quá trình phân lớp giữa nước và acetonitrile, muối dinatricitrat và trinatricitrat có tác dụng làm hệ đệm Chất phân tích được chiết vào lớp acetonitrile sẽ được làm sạch qua chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với việc trộn một phần dịch chiết với các chất hấp phụ như PSA, MgSO4, GCB, C18 để loại tạp chất Dịch chiết được phân tích bằng GC-MS(/MS) và/hoặc LC-MS/MS

Quy trình xử lý mẫu tham khảo[15], [18] và bổ sung dự kiến: - Bước 1: Đồng nhất mẫu, cân 5 ± 0,01g vào ống ly tâm 50ml - Bước 2: Thêm 100µl dung dịch chuẩn nội 2-CP 50 ng/ml - Bước 3: Thêm 5ml acetonitrile, 10ml nước cất, lắc vortex 1 phút - Bước 4: Lắc ngang 45 phút

- Bước 5: Thêm 6,5g hỗn hợp muối chiết MgSO4, NaCl, C6H5Na3O7.2H2O, C6H6Na2O7.1,5H2O (tỉ lệ 4/1/1/0,5 g)

- Bước 6: Lắc mạnh 1 phút, ly tâm 6000 vòng/phút ở -10 độ C - Bước 7: Hút 1ml dịch, đưa vào ống d-SPE chứa C18, PSA, MgSO4 (25/25/150

mg) - Bước 8: Lắc vortex 1 phút, ly tâm 13000 vòng/phút - Bước 9: Hút 500µl cho vào vial

14 - Bước 10: Phân tích mẫu bằng thiết bị GC-MS/MS 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS/MS để xác định ion mẹ, lựa chọn các ion con phù hợp để định tính và định lượng: chế độ ion hóa, năng lượng ion hoa, nhiệt độ ion hóa, nhiệt độ transferline

- Tham khảo các điều kiện sắc ký: tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, chương trình nhiệt độ, khí mang

- Độ thu hồi 2.3.2.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc của phương pháp

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh phổ của chất phân tích ở cùng một nồng độ trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn

Yêu cầu: - Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của

chất phân tích - Thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn tương ứng với thời gian

lưu chất phân tích ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,5% đối với kỹ thuật có sử dụng nội chuẩn

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) quy định cách tính điểm IP đối với phương pháp GC-MS/MS: kỹ thuật tách GC được tính 1 điểm, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm Tổng số điểm nhận dạng được tính theo Bảng 2.1

15 Kỹ thuật Kỹ thuật tách Số ion Số điểm IP

Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký khí khối phổ hai lần

2.3.2.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỉ lệ tín hiệu nhiễu đường nền (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỉ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3 LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10 Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đường nền

2.3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ tại các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, tiến hành xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng nền mẫu đên chất phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được (trục tung y) vào nồng độ (trục hoành x), quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

16 Khoảng tuyến tính tại đó các điểm chuẩn sẽ có tín hiệu phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ với hệ số tương quan R ≥ 0,995 (hoặc R2 ≥ 0,99) và độ chệch tại mỗi điểm không vượt quá 15%, riêng tại LOQ cho phép không vượt quá 20%

Độ chệch theo đường chuẩn tịa mỗi điểm tính theo công thức:

∆I = Ct− Cc

Cc x 100 Trong đó:

ΔI: Độ chệch của từng điểm chuẩn khi xây dựng đường chuẩn Cc: Nồng độ các điểm chuẩn

Ct: Nồng độ được tính theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

2.3.2.4 Độ lặp lại và độ thu hồi Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và có thể được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu thực thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau của 2-CE là 20, 40, 200 ppb và 1ppb chuẩn nội 2-CP và tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối:

RSD(%) = S

x̅ 100 S = √∑ (xi− x̅)

2N

i=1N−1Trong đó:

S : Độ lệch chuẩn Xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ “I” x̅ : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm N : số lần thử nghiệm

- Độ thu hồi:

R% = Cc+m− Cm

Cc x 100%

17 Trong đó:

R : Độ thu hồi (%) Cc+m : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Theo AOAC, với các mức nồng độ như trên, độ thu hồi phải nằm trong khoảng 60 – 115% đối với các mức nồng độ 20ppb và 40ppb, 80 – 110% đối với mức nồng độ 200ppb; độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15% ở các mức nồng độ 20ppb và 40ppb, không vượt quá 11% ở mức nồng độ 200ppb

STT Hàm lượng

(%)

Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%)

Đơn vị Độ lặp lại (%)

2.3.3 Ứng dụng phương pháp

Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định hàm lượng 2-CE trong các mẫu hạt vừng trên thị trường

19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS

Các ion mẹ và ion con của 2-CE và 2-CP được xác định khi qua buồng ion hóa, tại đây nhờ chùm electron mang năng lượng bắn phá tạo thành các ion ban đầu Ion có cường độ cao được lựa chọn để tiếp tục phân mảnh ở tứ cực thứ hai tạo thành các ion con Trong đó ion con có cường độ cao nhất được lựa chọn để định lượng, ion khác để định tính

Kết quả ion mẹ và mảnh ion con được chọn với các thông số tối ưu như sau: Chất phân tích Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Ứng dụng

3.1.2 Điều kiện sắc ký phân tích 2-CE

Qua tài liệu tham khảo [6], chúng tôi lựa chọn chương trình pha động như sau: - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 1 µl, không chia dòng - Chương trình nhiệt độ: giữ ở 40°C trong 2 phút, tăng 5°C mỗi phút cho đến

65°C, tăng 50°C mỗi phút cho đến 230°C và giữ trong 3 phút