lê bảo trâm xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần hóa học trong lá quế và tinh dầu quế bằng hplc

TỔNG QUAN

Tổng quan về lá quế và tinh dầu quế

1.1.1 Tổng quan về dược liệu quế

Quế là một giống cây đặc trưng riêng biệt của miền nhiệt đới, rất thích hợp với môi trường khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển là 20 – 30 oC Lượng mưa thích hợp giúp cây sinh trưởng phát triển là 2000 - 3000 mm/năm, độ ẩm 85 % Quế có thể trồng được trên nhiều kiểu đất mẹ khác nhau, đất ẩm nhiều mùn, tơi xốp, đất đỏ, đất cát pha, đất đồi núi, đất chua, đất thiếu dinh dưỡng nhưng thoát hơi nước [9]

Hiện nay, Cinnamomum Cassia là loài quế phổ biến nhất ở Việt Nam Quế phân bố khắp các vùng trên cả nước, trong đó có bốn vùng trồng quế tập trung là Yên Bái – Lào Cai, Quảng Ninh, Thanh Hóa – Nghệ An và Quảng Nam – Quảng Ngãi [9]

Tất cả các bộ phận của cây quế đều có giá trị sử dụng Vỏ cây quế có màu nâu đỏ và có mùi thơm đặc trưng Vỏ thân, vỏ cành non được phơi hoặc sấy khô Vỏ thân được phơi khô trong bóng râm (Quế nhục) Lá quế được biết đến là một bộ phận có hàm lượng tinh dầu khá cao chỉ sau vỏ quế, được sử dụng để chiết xuất tinh dầu ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau Hiện tại, lá quế đang được quan tâm nghiên cứu nhiều với các thành phần có tác dụng chống oxy hoá, đái tháo đường tuýp II, Parkinson,

…[29], [58], [60] Ngoài ra, lá quế còn được sử dụng như một loại hương liệu tạo mùi hương tự nhiên trong phòng, khử mùi ô tô giúp chống say xe hiệu quả Tinh dầu quế được sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày như làm hương liệu nước hoa, khử mùi, đuổi côn trùng, chống nấm mốc cho gỗ, hạn chế vi khuẩn trong kim chi … [15] Đồng thời, hương thơm từ tinh dầu quế còn có tác dụng giúp thư giãn, an thần nên được sử dụng trong nhiều các cơ sở trị liệu, chăm sóc sức khỏe, sắc đẹp

1.1.2 Đặc điểm của lá quế và tinh dầu quế

Lá quế là loại lá đơn, mọc cách, mọc so le hoặc gần như đối; phiến lá hình bầu dục hẹp tới gần hình mũi mác, dài 8 - 16 cm, rộng 4 - 5,5 cm; chóp nhọn; mặt trên màu xanh lục, nhẵn bóng; mặt dưới màu xanh lục nhạt, có lông màu vàng xám về sau nhẵn; hệ 3 gân gồm 2 gân bên phẳng, xuất phát cách gốc 0,5 - 1 cm, hình vòng cung chạy gần tới chóp lá và gân chính phẳng hoặc nổi ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới; gân bên có nhiều gân bổ sung bên ngoài, các gân này liên kết với nhau theo hình vòng cung, gân mạng gần như song song ở khoảng cách xa 3 - 4 mm, nhìn thấy ở cả 2 mặt nhưng nhìn rõ hơn ở mặt dưới Gốc lá nhọn, rìa lá hơi cong, đỉnh hơi nhọn Cuống to, khỏe, dài 1,2 - 2 cm, có rãnh ở trên [5]

3 Tinh dầu quế là chất lỏng trong suốt, màu vàng đến nâu đỏ Mùi thơm, vị cay nóng rất đặc trưng, dễ tan trong Ethanol 70% Tỷ trọng của tinh dầu quế là 1,040 – 1,072 ở 20  C, chỉ số khúc xạ là 1,590 – 1,610, góc quay cực riêng từ -1 o – 1 o [3] Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của các loài Quế, thể hiện ở mùi thơm đặc trưng của các cây trong chi [5] Tinh dầu lá quế được chiết xuất từ phần lá nên giá thành thấp hơn đồng thời dược tính thường ôn hòa và dễ sử dụng hơn tinh dầu vỏ quế Hai bộ phận của Quế được nghiên cứu nhiều về thành phần tinh dầu là vỏ thân và lá Hiện nay, nguồn nguyên liệu chủ yếu để chiết xuất tinh dầu quế là lá và cành quế

1.1.3.1 Các thành phần có trong lá quế và tinh dầu quế

Quế là một loài cây có chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu quế trong lá và vỏ quế khá cao Chất chiếm thành phần cao nhất trong tinh dầu quế phải nhắc đến là cinnamaldehyd với hàm lượng dao động 60 - 80 % [33] Đã có nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học trong quế [10], [18], [19], [23], [32], [47], [49],[50], từ đó đưa ra một số nhóm chất và hoạt chất có mặt trong lá quế và tinh dầu quế bao gồm: a) Aldehyd: Cinnamaldehyd, Methoxycinnamaldehyd, Benzenepropanal, Benzaldehyd,… b) Acid: acid cinnamic, acid ferulic, acid caffeic, acid protocatechuic, acid vanillic, acid syringic,… c) Monoterpen: p-Cymen, Limonen, α-Terpinen, α-Pinen, Camphen, Camphor,

(1,4)-Cineol, β-Pinen, β-Phellandren, α-Phellandren, 3-Caren,… d) Sesquiterpen: Humulen, Caryophyllen oxit, β-Caryophyllen, α-Muurolen, α-

Copaen, Cedren, α-Tumeron, β-Tumeron, α-Cadinol, τ-Cadinol, Calamenen, α- Ylangen,… e) Diterpen: Cinnzeylanin, Cinnzeylanol,…

Hình 1.1 Hình ảnh lá quế [5]

4 f) Ceton: Coumarin,… g) Hydrocarbon: δ-Cadinen, Myrcen, Styren, Dodecan,… h) Alcohol: α-Terpineol, Linalool, Cinnamyl alcohol, Benzenmethanol,

Benzenethanol,… i) Este: Cinnamyl acetat, Methyl cinnamat, Benzyl benzoat,…

1.1.3.2 Phân tích một số thành phần có hoạt tính sinh học

Tùy từng loài mà tinh dầu Quế sẽ có hai thành phần chính là cinnamaldehyd hay eugenol, thông thường thành phần cinnamaldehyd là phổ biến hơn Theo chuyên luận tinh dầu cành con và lá Quế - Dược điển Trung Quốc [16], hàm lượng cinnamaldehyd yêu cầu không nhỏ hơn 75 % Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận lá Quế; đối với tinh dầu vỏ thân, vỏ cành thì yêu cầu về hàm lượng cinnamaldehyd ít nhất là 85 % [3] a) Cinnamaldehyd

Công thức phân tử: C9H8O (M = 132,15 g/mol)

Tên khác: Cinnamaldehyd, trans-cinnamaldehyd, cinnamic aldehyd

- Chất lỏng màu vàng, ít tan trong nước (1,42 mg/ml ở 25 °C), hòa tan trong cloroform, ether, alcohol không hòa tan trong dầu hỏa

- Nhiệt độ nóng chảy: -7,5 °C, nhiệt độ sôi: 253 °C, tỷ trọng: 1,048 - 1,052 g/ml ở

25 °C, áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ: 1,6195

- Bước sóng hấp thụ cực đại: 291 nm [42]

Cinnamaldehyd là một phenylpropanoid, thành phần chính có trong quế Cinnamaldehyd có khả năng khử trùng, đuổi muỗi rất hiệu quả [38], ngoài ra còn có đặc tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm [51], [55] Cinnamaldehyd thường được sử dụng trong hương liệu làm kẹo cao su, đồ uống, kem, kẹo và cũng được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, nước hoa Cinnamaldehyd có thể được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí [7], [16], [54]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cinnamaldehyd

Tên IUPAC: 2-metoxy-4-prop-2-enylphenol

Công thức phân tử: C10H 12O2 (M = 164,20 g/mol)

Tên khác: Eugenol, 4-Allyl-2-metoxyphenol, 4-Allylguaiacol

- Chất lỏng trong suốt, màu vàng nhạt hoặc màu hổ phách, mùi đinh hương, vị cay nồng, ít tan trong nước (2,46 mg/ml ở 25  C), tan trong rượu, chloroform, ether, các loại dầu

- Nhiệt độ nóng chảy: - 9,2  C, nhiệt độ sôi: 225  C, tỷ trọng: 1,064 - 1,070 g/ml ở

25 °C, áp suất hóa hơi: 0,0221 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ: 1,5405

- Bước sóng hấp thụ cực đại: 290 nm [45]

Eugenol là một phân tử phenolic tự nhiên được tìm thấy trong một số loại thực vật như quế, đinh hương và lá nguyệt quế [45] Nó đã được sử dụng như một chất khử trùng tại chỗ như một chất chống kích ứng và trong các chế phẩm nha khoa với oxit kẽm để bịt kín ống tủy và kiểm soát cơn đau [40] Ngoài ra, eugenol đã được phát hiện có đặc tính chống viêm, bảo vệ thần kinh, hạ sốt, chống oxy hóa, kháng nấm và giảm đau [39] Eugenol có thể được định lượng bằng phương pháp sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao [25], [31] c) Coumarin (chromen-2-on)

Tên gọi khác: Rattex, chromen-2-on, coumarinic anhydrid, 2H-1-benzopyran-2- on…

Công thức phân tử: C9H6O2 (M = 146,14 g/mol)

- Tinh thể không màu hoặc màu trắng, mùi thơm dễ chịu, có mùi hoa quế

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của eugenol

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của coumarin

- Độ tan trong nước: 0,19 g/100 mL ở 20 °C, hòa tan trong ethanol và các alcohol, rất tan trong ether và cloroform

- Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [44]

Coumarin và dẫn xuất của nó có hoạt tính sinh học như chống đông máu, kháng khuẩn, kháng virus chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế enzym Liều cao coumarin được phát hiện là có nguy cơ gây độc cho gan, tuy nhiên có thể giúp giảm nguy cơ gây ung thư và bệnh lý về thần kinh và tim mạch [24] Những năm 1950, các nghiên cứu chỉ ra rằng coumarin gây độc cho gan ở chuột và chó được cho thức ăn có chứa coumarin [28] Thực tế, coumarin có mặt nhiều trong thực phẩm, trái cây, rau quả và cả trong mỹ phẩm Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority - EFSA) và Viện Đánh giá rủi ro Liên Bang Đức (Bundesinstitut für Risikobewertung - BfR) đã thiết lập lượng coumarin có thể chấp nhận được hàng ngày là 0,1 mg/kg thể trọng [21] Hiện nay, thông tin về con đường thải trừ các chất chuyển hóa coumarin cho thấy sự khác biệt đáng kể ở người và động vật [34] Ở chuột các chất chuyển hóa của coumarin được thải trừ chủ yếu qua phân trong khi đó ở người chúng được bài tiết qua nước tiểu, do đó thời gian lưu của coumarin và các chất chuyển hóa của nó ở người ngắn hơn so với ở chuột Nhiều nghiên cứu về độc tính của coumarin đã đưa ra kết luận rằng độc tính ở gan do nó gây ra chỉ giới hạn trên một nhóm nhỏ bệnh nhân nhạy cảm [36], [46] d) Acid cinnamic

Tên IUPAC: Acid (E)-3-Phenylprop-2-enoic

Công thức phân tử: C9H8O2 (M = 148,159 g/mol)

Tên khác: trans-acid cinnamic, acid phenylacrylic, acid cinnamylic, acid 3- phenylacrylic, acid (E)-cinnamic, acid benzenepropenoic, acid isocinnamic

- Chất kết tinh không màu Ít tan trong nước (0,546 mg/ml), dễ tan trong dung môi hữu cơ: ether, diethyl ether, cloroform, dầu, pyridin hòa tan trong cồn

- Nhiệt độ nóng chảy: 133 o C, nhiệt độ sôi: 298 - 300 °C ở 760 mmHg

- Tỷ trọng: 1,185 g/cm3; áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25 °C; chỉ số khúc xạ:

- Hợp chất có tính acid yếu, pKa: 4,45

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid cinnamic

- Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [43]

Acid trans-cinnamic được sử dụng trong hương liệu và một số dược phẩm Acid trans-cinnamic có tác dụng dược lý như: Chống nấm, kháng khuẩn, có hiệu quả chống lại sự tổn thương da, ngoài ra còn có tính chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư [22], và chống sốt rét [52], [48] Những năm gần đây, acid cinnamic còn được nghiên cứu như là một hợp chất tiềm năng để phát triển các tác nhân kiểm soát các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer [20]

1.1.4 Ứng dụng của lá quế và tinh dầu quế

1.1.4.1 Tác dụng sinh học chung của quế

Trong tây y, quế và tinh dầu quế được coi là một vị thuốc có tác dụng kích thích làm tăng tuần hoàn máu (huyết được lưu thông), hô hấp tăng, gây co mạch, tăng bài tiết, co bóp tử cung và tăng nhu động ruột Tinh dầu có khả năng sát trùng mạnh [4]

Theo Đông y: Quế có vị ngọt, cay, mùi thơm, tính rất nóng, có tác dụng bổ hỏa, hồi dương, ấm thận tỳ, thông huyết mạch, trừ tàn tích, là một vị thuốc bổ Quế được dùng làm thuốc cấp cứu bệnh do hàn như chân tay lạnh (cảm lạnh), mạch chậm nhỏ, hôn mê, đau bụng trúng thực, phong tê bại, đau bụng lạnh, chữa tiêu hóa kém, tả lỵ, tiêu chảy, thũng do tiểu tiện bất lợi, kinh bế, rắn cắn, ung thư [4]

Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là một kỹ thuật phân tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chất phân tích giữa hai pha nghĩa là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần và tỉ lệ pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2], [1]

1.2.1 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký a) Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

9 Trong đó CS là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1] b) Thời gian lưu

Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ đạt cực đại, là đại lượng để định tính 1 chất c) Hệ số dung lượng k’

Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố giữa 2 pha k’ được tính bằng thời gian lưu của chất phân tích và thời gian pha động ra khỏi cột phân tích

Nếu hệ số k’ 1; thường chọn α trong khoảng 1,05 - 2 e) Độ phân giải Độ phân giải RS cho khả năng tách 2 chất A, B ra khỏi hỗn hợp Rs được tính bằng hiệu thời gian lưu của 2 chất chia trung bình độ rộng chân pic của 2 chất đó

Hình 1.6 Cấu tạo cơ bản của máy HPLC (a): Sơ đồ cấu tạo cơ bản hệ thống HPLC (sưu tầm); (b): Hệ thống

HPLC Shimadzu sử dụng trong nghiên cứu

10 Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có những bộ phận sau:

- Hệ thống pha động sắc ký lỏng: Pha động được cung cấp từ một hay vài bình chứa và chạy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và chạy qua detector

- Bộ phận tiêm mẫu: Dùng để đưa mẫu phân tích vào dòng dung môi Bộ tiêm mẫu có thể hoạt động tự động hoặc thủ công

- Cột sắc ký (pha tĩnh): Là thành phần quan trọng nhất, chứa pha tĩnh là một chất liệu rắn hoặc gel đặc biệt, giúp tách biệt các hợp chất trong mẫu dựa trên các tính chất hóa lý khác nhau như độ tan, kích thước phân tử, và ái lực hóa học

- Detector: Thiết bị phát hiện và ghi nhận các hợp chất tách ra từ cột phân tích Các loại detector phổ biến bao gồm detector hấp thụ tia tử ngoại - khả kiến (UV- Vis – Ultraviolet -Visible), detector khối phổ (MS - Mass Spectrometry), và detector dẫn điện (Conductivity)

- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu: Máy tính và phần mềm đi kèm được dùng để thu thập và phân tích dữ liệu từ detector, từ đó xác định và định lượng các thành phần trong mẫu.

Một số nghiên cứu về phân tích các thành phần chính trong lá và tinh dầu quế

1.3.1 Một số nghiên cứu phân tích coumarin, cinnamaldehyd và acid cinnamic

Các chất phân tích đã được biết đến từ lâu là thành phần chính của quế, được xuất hiện nhiều trong các dược điển và nghiên cứu trên thế giới

Dược điển Mỹ USP 2022 [54] đã định lượng procyanidin B2, coumarin, 2- hydroxycinnamaldehyd, acid cinnamic, cinnamaldehyd, và 2 - methoxycinnamaldehyd trong vỏ quế Cinnamomum cassia bằng HPLC với cột tách L1 (2,1 mm x 10 cm; 1,5 àm), pha động gồm dung dịch acid formic 0,1% và ACN chạy chờ́ độ gradient, phát hiện ở bước sóng 280 nm Đối vởi mẫu thử là quế chi Cinnamomum cassia định lượng coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamic acid, 2-methoxycinnamic acid, cinnamaldehyd và 2- methoxycinnamaldehyd điờ̀u kiện sắc ký: Cột L1 (4,6 mm x 25 cm, 5 àm) pha động gồm dung dịch acid phosphoric 0,05 % và ACN chế độ gradient, bước sóng phát hiện 256 nm, tốc độ dũng 1 ml/phỳt, thể tớch tiờm mẫu 10 àl

Trong chuyên luận Cinnamomi Cortex Dược điển Trung Quốc 2015 [16] đã đưa ra phương pháp định lượng cinnamaldehyd Chương trình chạy đẳng dòng với điều kiện sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 àm), pha động: ACN : nước (35:75), bước súng phát hiện là 290 nm

Năm 2023, nghiên cứu của Trần Ngọc Phan đã định lượng đồng thời coumarin, acid cinnamic, cinnamaldehyd trong vỏ Quế bằng phương pháp HPLC dựa trên Dược điển Mỹ [54] Điều kiện sắc ký tham khảo Dược điển Mỹ với mục tiêu có thể áp dụng cho mọi phòng thí nghiệm với quy trình như sau: Sử dụng cột C18 (25 cm × 4,6 mm; 5

11 àm); nhiệt độ cột 25 o C; tốc độ dũng 1 ml/phỳt; dung mụi pha mẫu: MeOH - H2O (7:3); bước sóng phát hiện 280 nm; pha động acid phosphoric 0,05 % - ACN với chương trình gradient Thẩm định phương pháp theo ICH [30] Kết quả cho thấy các pic tách tốt, chân pic gọn, cân xứng rõ ràng [7]

1.3.2 Một số phương pháp xử lý mẫu đối với bộ phận lá và lá quế

Lá có một số đặc điểm riêng như lạp lục, nhiều mô mềm và lỗ khí hỗ trợ cho quá trình quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước Lạp lục trong lá thường khiến dịch chiết có màu, ảnh hưởng đến kết quả phân tích đối với phương pháp đo quang Một số thành phần trong lá quế được đưa ra bao gồm nước, chất béo, protein thô [29], các thành phần hóa học chính là cinnamaldehyd, eugenol, linalool, acic cinnamic và các các hợp chất phenolic [56]

Phương pháp và dung môi chiết ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình chiết hoạt chất [59] Một số yếu tố cụ có thể ảnh hưởng tới hiệu suất chiết và các phương pháp xử lý mẫu thường dùng:

- Xử lý ban đầu: Làm khô nguyên liệu thực vật giúp loại bỏ nước, giảm thiểu sự phân hủy enzyme và vi khuẩn, từ đó bảo quản các hoạt chất chính Xay nhỏ mẫu giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa mẫu và dung môi, từ đó nâng cao hiệu suất chiết xuất các chất phân tích Trong hầu hết các quy trình chiết xuất dược liệu, phương pháp làm khô và xay nhỏ đều được sử dụng [6], [7], [11]

- Dung môi chiết: Dung môi được lựa chọn phải phù hợp với đặc tính của chất phân tích, có thể hòa tan tốt các chất cần chiết và ít hòa tan tạp chất Dung môi thường được sử dụng là ethanol, methanol do hòa tan được nhiều chất với độ phân cực khác nhau, hạn chế hòa tan tạp chất

- Phương pháp chiết: Sử dụng sóng siêu âm là phương pháp phổ biến và dễ thực hiện giúp khuấy trộn mạnh dung môi, gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với hoạt chất, làm tăng tốc độ hòa tan và hiệu quả chiết xuất Phương pháp chiết nóng sử dụng nhiệt độ cao để tăng tốc độ phản ứng và hòa tan các hợp chất, nhưng có thể làm phân hủy các hợp chất nhạy cảm với nhiệt Trong khi đó việc chiết lạnh thực hiện ở nhiệt độ thấp để bảo vệ các hợp chất nhạy cảm với nhiệt, tuy nhiên, quá trình chiết thường chậm hơn

- Thu mẫu: Sử dụng lực ly tâm để tách các tạp chất ra khỏi dung dịch, giúp tăng tốc độ và hiệu quả thu mẫu Để lắng cho phép các hợp chất lắng đọng tự nhiên dưới tác động của trọng lực, phương pháp này thường mất thời gian hơn và không hiệu quả với các hạt nhỏ

1.3.3 Một số nghiên cứu về phân tích tinh dầu

Phần lớn các nghiên cứu về phân tích chất trong nền mẫu tinh dầu sử dụng phương pháp GC do tính phù hợp của nó với các thành phần dễ bay hơi Tinh dầu quế

12 cũng đã được nghiên cứu rất nhiều bằng phương pháp này [5], [35], [56], đồng thời trong Dược điển Châu Âu [17] và Dược điển Trung Quốc [16], hàm lượng các chất trong tinh dầu quế cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký khí Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế khi sử dụng cho các mẫu phức tạp hơn, thiết bị chưa được phổ biến nhiều tại các phòng thí nghiệm Đã có một vài nghiên cứu đưa ra phương pháp HPLC để xác định hàm lượng các chất trong mẫu tinh dầu thay cho phương pháp GC thường dùng Nhóm nghiên cứu Hajimedihpoor H đã phân tích tinh dầu Thymus vulgaris L đồng thời với 2 phương pháp là HPLC và GC đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) Nồng độ thymol và carvacrol trong tinh dầu thu được bằng HPLC và GC được so sánh bằng phương pháp thống kê và cho thấy có sự thống nhất [27] Năm 2013, Liu Jing và các công sự cũng đã đưa ra sự so sánh 2 phương pháp HPLC-DAD và GC-MS trong việc phân tích tinh dầu Perilla frutescens (L.) Britt, kết quả ghi nhận phương pháp HPLC nhanh chóng, dễ dàng thực hiện đạt các chỉ tiêu thẩm định và có sự thống nhất với phương pháp GM-MS [37] Có thể thấy rằng việc phát triển phương pháp phân tích tinh dầu bằng HPLC là khả thi và ngày càng được chú ý hơn

Nhằm mục tiêu phát triển phương pháp HPLC để định lượng CM, CA, CAL trong mẫu tinh dầu quế, nhóm nghiên cứu đưa ra dung môi pha mẫu thử dựa trên khả năng tan tốt của tinh dầu quế trong các alcohol [3], tiến hành thẩm định phương pháp, ứng dụng định lượng một số mẫu tinh dầu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu lá quế được thu hái, được phơi trong bóng râm đến độ ẩm nhỏ hơn 14%, sau đó được bảo quản trong túi Polyethylen hạt silicagel kín, được ghi nhãn rõ ràng Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát Các mẫu quế được định danh đúng tên khoa học là

Cinnamomun cassia, bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Văn Ơn, Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu tinh dầu quế lưu hành trên thị trường có CoA, được cung cấp bởi Công ty

Cổ phần Vietplantex, mẫu tinh dầu được lưu hành trên thị trường được cung cấp bởi hộ kinh doanh ông Phạm Văn Tiền tại thôn Yên Tiên, xã Yên Phú, huyện Văn Yên, tỉnh Yên Bái, các mẫu tinh dầu quế được cất từ lá quế đã được định danh đúng tên khoa học là Cinnamomun cassia, bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Văn Ơn, Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Đối tượng nghiên cứu của đề tài là CM, CA và CAL trong lá quế và tinh dầu quế.

Nguyên vật liệu, thiết bị

- Dung môi tinh khiết dùng cho HPLC: MeOH (Fisher), Acetonitril (Merck), nước siêu sạch

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric 85 % (Merck)

- Chất chuẩn acid cinnamic 99%, công thức phân tử C9H8O2 (Hãng: Shanghai Xian Ding Biotiec, CAS: 621829, HB517250, Lot IWFDXAW, MW: 148,16)

- Chất chuẩn cinnamaldehyd 98%, công thức phân tử C9H8O (Hãng: Ark Pharm, CAS No: 14371-10-9, Lot No: BRL645, MW: 132,16)

- Chất chuẩn coumarin 99,99% (K4MC6MLG-25g, CAS 91-64-5, MW:14,14)

- Máy xay High-speed multifunction grinder model 150A, công suất định mức 850W, điện áp 220V, tốc độ xoay lưỡi dao 2800 vòng/ phút

- Hệ thống HPLC-DAD Shimadzu LC-40D XR (Nhật Bản) trang bị hệ thống bơm gradient áp suất thấp 4 kênh dung môi và detector PDA, phần mềm Labsolution

- Cột sắc ký Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 àm)

- Cân phân tích Mettler Toledo GF-244A, độ chính xác 0,0001g (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo XPE105, độ chính xác 0,01 mg (Mettler Toledo, Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm DAIHAN WUC - A22H (Daihan, Hàn Quốc)

- Máy ly tâm HERMILE Z306 (Hermile, Đức)

- Tủ sấy MEMMERT ULM-500 (Memmert, Đức)

- Tủ lạnh Haier HYC 940 (Haier, Trung Quốc)

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25ml, 50 ml, 100 ml, cốc có mỏ, ống đong 1000, 250, 25 ml của Class A, Isolab (Đức) ; vial (Waters, Mỹ)

- Micropipet 100 - 1000 àl Nichipet (Nhật Bản) Ống ly tõm 15 ml Màng lọc 0,45 àm.

Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu lá quế, thẩm định phương pháp phân tích mẫu lá quế

- Thẩm định phương pháp phân tích mẫu tinh dầu quế

- Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu lá quế và tinh dầu quế.

Phương pháp nghiên cứu

2.4.2.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn (1): cân chính xác khoảng 125 mg CM chuẩn vào bình định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CM (1) có nồng độ chính xác khoảng 5 mg/ml

- Dung dịch chuẩn (2): cân chính xác khoảng 125 mg CAL chuẩn vào bình định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CAL (2) có nồng độ chính xác khoảng 5 mg/ml

- Dung dịch chuẩn (3): cân chính xác khoảng 25 mg CA chuẩn vào bình định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CA (3) có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml

2.4.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu lá quế

Sau khi tham khảo điều kiện xử lý mẫu trong các tài liệu tham khảo [6], [11], [26], [29], [37], [59], dựa theo điều kiện cơ sở vật chất tại phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát tỉ lệ dung môi chiết, số lần chiết, thời gian chiết trên mẫu TVO 22 – 19

15 Khoảng 20 g mẫu lá quế được xay bằng máy xay trong tổng thời gian khoảng 30

- 60 giây Rây bột qua rây 250 μm

Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung môi pha mẫu, xử lý mẫu theo các điều kiện khảo sát Thêm dung môi đến vạch, lắc đều Lấy khoảng 10 ml dung dịch vào ống ly tâm và ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút Lớp dịch phía trên được lọc qua màng lọc 0,45 μm thu được dung dịch tiêm sắc ký Mỗi dung môi chiết 3 lần, tính giá trị trung bình

Bảng 2.1 Dung môi và điều kiện khảo sát xử lý mẫu lá

Dung môi pha mẫu Điều kiện khảo sát

- Điều kiện 1: Siêu âm lạnh 30 phút

- Điều kiện 2: Siêu âm lạnh 60 phút (siêu âm 30 phút, nghỉ 10 phút sau đó siêu âm tiếp 30 phút)

- Điều kiện 3: lắc bập bênh trong 2 giờ, sau đó siêu âm 30 phút

- Điều kiện 4: ngâm mẫu qua đêm sau đó siêu âm 30 phút

2.4.2.3 Chuẩn bị mẫu tinh dầu

Lựa chọn dung môi pha mẫu là methanol : nước tỉ lệ 7 : 3

Do CAL là thành phần chính, chiếm tỉ lệ rất cao trong tinh dầu quế, trong khi đó

CM và CA chiếm tỉ lệ rất nhỏ [16], [56], nên để phù hợp với việc định lượng cả 3 chất bằng phương pháp HPLC, mẫu thử sẽ được pha thành dung dịch thử (1) có nồng độ cao nhằm định lượng CM, CA và dung dịch thử (2) pha loãng hơn để định lượng CAL

• Dung dịch định lượng CM, CA: Cân chính xác khoảng 0,10 g tinh dầu vào bình định mức 25 mL, Thêm khoảng 20 mL dung môi pha mẫu lắc nhẹ đến khi tinh dầu hòa tan hoàn toàn Thêm dung môi đến vạch, lắc đều được dung dịch thử (1) Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch tiêm sắc ký

• Dung dịch định lượng CAL: Hút 5 ml dung dịch thử (1) và bình định mức

20 ml, thêm dung môi pha mẫu, lắc nhẹ đến khi tinh dầu hòa tan hoàn toàn Thêm dung môi đến vạch, lắc đều được dung dịch thử (2) Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch tiêm sắc ký

2.4.2 Điều kiện sắc ký Đối tượng nghiên cứu của nghiên cứu này là CAL, CA và CM trên nền mẫu lá và tinh dầu, do đó sử dụng điều kiện sắc ký kế thừa từ nghiên cứu trước [7], có điều chỉnh như sau:

- Cột Phenomenex C18 (4.6 nm x 25 cm; 5 àm) , nhiệt độ cột 25 o C,

- Bước sóng phát hiện 280nm,

- Thể tớch tiờm mẫu 10 àL,

- Pha động: Kênh A: acid phosphoric 0,05%, Kênh B: acetonitril

Bảng 2.2 Chương trình pha động

Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%)

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Dựa vào các hướng dẫn về thẩm định của ICH [30], yêu cầu về độ thu hồi và RSD của AOAC 2016 [14], tiến hành thẩm định phương pháp với các chỉ tiêu sau:

2.4.3.1 Độ chọn lọc/độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn chất phân tích trong sự hiện diện của các chất khác có thể trông đợi có mặt Các chất này có thể gồm: tạp chất, sản phẩm phân hủy, nền mẫu

Với phương pháp định lượng: Các phương pháp sử dụng kỹ thuật sắc ký, cần sử dụng các sắc ký đồ đại diện để chứng minh độ đặc hiệu và từng thành phần được tách ra phải được nhận diện đầy đủ Hiệu năng tách của quá trình sắc ký cần được đánh giá một cách thích hợp Đánh giá độ tinh khiết của pic sắc ký có thể hữu ích trong việc chứng tỏ pic sắc ký của chất phân tích không chứa đựng nhiều hơn một thành phần (dựa vào đặc tính của phương pháp phát hiện sử dụng, như phổ UV-VIS với detector PDA) [13], [30]

Cách tiến hành: tiến hành phân tích lần lượt các mẫu: dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp CM, CA, CAL, dung môi pha mẫu, mẫu thử

- Thời gian lưu của pic CM, CA, CAL của dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu thử, phải tương đương nhau

- Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn ở bước sóng 280 nm

- Phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn tương đồng

2.4.3.2 Độ phù hợp hệ thống Đánh giá độ thích hợp hệ thống dựa trên dựa trên nguyên tắc thiết bị phân tích cũng như các điều kiện bổ trợ cho hoạt động của thiết bị (điện, khí, nước…), điều kiện hoạt động thực nghiệm của thiết bị và mẫu cần phân tích cấu thành một chỉnh thể cần được đánh giá như một chỉnh thể hoàn chỉnh [30] Độ phù hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic Tính giá trị trung bình và RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic, số đĩa lý thuyết của 6 lần phân tích 1 mẫu hỗn hợp chuẩn

Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp CM, CA,

CAL Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi, độ phân giải của từng chất trong từng lần tiêm sắc ký

- RSD % của diện tích pic ≤ 2,0 % và tR ≤ 1,0 %

- Số đĩa lý thuyết > 3000 ; 0,8 < hệ số kéo đuôi < 1,5

2.4.3.3 Độ tuyến tính Độ tuyến tính là khả năng (trong một khoảng nồng độ nhất định) cho phép thu được kết quả đo tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ các chất phân tích có trong mẫu [30]

Phương pháp xử lý số liệu

- Các kết quả thu được trong quá trình thực nghiệm đều được xử lý bằng phần mềm Labsolution

- Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel 365 để tính toán: Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp, F-test, dựng đường hồi quy, giá trị y-intercept, tính

- Tính toán FTN (F thực nghiệm) và so sánh với FLT (F lý thuyết):

Trong đó: 𝑆 1 2 , 𝑆 2 2 là các phương sai kết của của 2 kết quả Quy ước 𝑆 1 2 > 𝑆 2 2 Nếu FTN ≤ FLT (φ = 95 %, n1 – 1, n2 – 1): Hai kết quả có độ lặp lại giống nhau Nếu FTN ≥ FLT (φ = 95 %, n1 – 1, n2 – 1): Hai kết quả có độ lặp lại khác nhau

- Hiệu suất chiết của CM, CA, CAL được tính theo công thức:

H % là hiệu suất chiết chất phân tích

S: Diện tích pic CM, CA, CAL trong mẫu thử (mAu.s) m: Khối lượng cân mẫu thử (g)

- Hàm lượng % của CM, CA, CAL trong lá quế tính theo dược liệu khô kiệt được tính theo công thức:

Sthử, Schuẩn: Diện tích pic của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn (mAu.s) mthử, mchuẩn: Khối lượng mẫu thử, mẫu chuẩn (g)

Vthử : Thể tích pha mẫu thử (ml)

Dchuẩn: Độ pha loãng của dung dịch chuẩn

21 B: Độ ẩm mẫu thử (%) được xác định bằng phương pháp cất với dung môi[3]

L (%): Hàm lượng CM, CA, CALtương ứng

- Hàm lượng % của CM, CA CAL trong tinh dầu quế được tính theo công thức:

Sthử, Schuẩn: Diện tích pic của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn mthử, mchuẩn: Khối lượng mẫu thử, mẫu chuẩn (mg)

Vthử : Thể tích pha mẫu thử (ml)

Dchuẩn: Độ pha loãng của dung dịch chuẩn

T (%): Hàm lượng CM, CA, CAL tương ứng

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xây dựng phương pháp định lượng coumarin, acid cinnamic và

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Chuẩn bị mẫu thử theo các quy trình khảo sát đã đưa ra ở mục 2.4.1.2 Tiến hành phân tích bằng HPLC theo điều kiện sắc ký ở mục 2.4.2 Tính toán kết quả hiệu suất chiết các chất phân tích trong mẫu thử và RSD của mỗi tỉ lệ dung môi Kết quả được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu lá quế

Chú thích: Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3 Điều kiện 4

- Điều kiện 2 cho SD nhỏ nhất trong 4 điều kiện khảo sát

- Ở dung môi chiết MeOH : H2O = 9 : 1 và MeOH hiệu suất chiết của các chất tương đương nhau và cao hơn so với các dung môi còn lại

Lựa chọn quy trình xử lý mẫu thứ 2 với dung môi MeOH : H2O = 9 : 1 Cụ thể như sau: cân chính xác khoảng 0,50 g bột lá quế vào bình định mức 25 mL, thêm khoảng

20 mL dung môi pha mẫu (MeOH : H2O = 9 :1) Lắc nhẹ nhàng Siêu âm lạnh 30 phút Để yên 10 phút Sau đó lại siêu âm lạnh 30 phút Để nguội Thêm dung môi chiết đến vạch, lắc đều Lấy khoảng 10ml dung dịch vào ống ly tâm và ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút Lớp dịch phía trên được lọc qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch tiêm sắc ký

% MeOH có trong dung môi chiết

% MeOH có trong dung môi chiết

% MeOH có trong dung môi chiết

Từ các dung dịch chuẩn gốc đã đưa ra ở mục 2.4.1.1, pha loãng thành dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ các chất phân tích khoảng CM 200 μg/ml, CAL 300 μg/ml,

CA 6 μg/ml Chuẩn bị mẫu thử theo quy trình đưa ra ở mục 3.1.1, ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, độ tinh khiết pic, và hệ số chồng phổ của CM, CA, CAL ở mẫu thử và mẫu chuẩn Kết quả thu được trình bày ở hình 3.2, 3.3 và bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả độ đặc hiệu

Mẫu t R (phút) Purity Hệ số match

Hình 3.2 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và dung môi pha mẫu

Hình 3.3 Chồng phổ UV của 3 chất phân tích

- Thời gian lưu của các chất phân tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch thử lần lượt là CM 25,284; CAL 31,657 và CA 28,207 phút tương đương với thời gian lưu trong dung dịch chuẩn là CM 25,312; CAL 31,714 và CA 28,202 phút

- Mẫu dung môi pha mẫu: không xuất hiện pic nào trong thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn

- Độ tinh khiết pic CM, CAL và CA trong mẫu thử đạt 99,59; 99,91 và 99,97 %

- Phổ UV của CM, CAL, CA trong mẫu thử và trong mẫu chuẩn có hình dạng và các đỉnh ở bước sóng tương đồng

Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích định lượng CM, CAL, CA trong lá quế đạt yêu cầu về phép thử độ đặc hiệu

3.1.2.2 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp của hệ thống được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi của 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp cú nồng độ CAL 306,40 àg/ml, CM 210,90 àg/ml, CA 7,52 μg/ml với điều kiện sắc ký đã lựa chọn

Bảng 3.2 Kết quả độ phù hợp hệ thống

- RSD thời gian lưu của CM, CA, CAL trong 6 lần tiêm đều là 0,1; 0,1 và 0,2 %

- RSD diện tích pic CM, CA, CAL trong 6 lần tiêm lặp lại lần lượt là 0,5; 0,3 và 0,5% < 2,0 %

- Hệ số kéo đuôi của pic CM, CA, CAL lần lượt là 1,139; 1,213; 1,272 < 1,5 Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp phân tích định lượng CM, CA, CAL đạt yêu cầu về phép thử độ tương thích hệ thống

3.1.2.3 Độ tuyến tính Để xây dựng khoảng tuyến tính và đường chuẩn, nghiên cứu tiến hành chạy sắc ký 18 mẫu lá Từ kết quả chạy sơ bộ 18 mẫu khoảng nồng các chất phân tích lần lượt là:

CM 94,48 – 676,27 àg/ml; CA 1,05 – 10,00 àg/ml; CAL 172,08 – 506,90 àg/ml

Tiến hành chuẩn bị dãy hỗn hợp dung dịch chuẩn CM, CA, CAL với các khoảng nồng độ lần lượt là 51,9 – 691,3 àg/ml, 1,00 – 20,10 àg/ml và 152,45 – 609,80 àg/ml Tiến hành sắc ký với điều kiện đã đưa ra ở mục 2.4.2 Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic Kết quả được trình bày ở bảng ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CM, CA, CAL

Mẫu C lt (àg/ml) C thực tế

(àg/ml) S pic (mAu.s) C tinh lại

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic (a): Coumarin

Trong khoảng nồng độ khảo sát của cả 3 chất CM, CA, CAL, có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất với hệ số tương quan tuyến tính R đều lớn hơn 0,999, độ chệch tại mỗi nồng độ trên đường chuẩn đều < 15,0 % và giá trị Pvalue

> 0,05 (Bảng 3.3), cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, không mắc sai số hệ thống đảm bảo yêu cầu

Như vậy, có sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của coumarin trong khoảng nồng độ 51,9 – 691,308  g/ml; acid cinnamic trong khoảng nồng độ 1,00 – 20,10 y = 46294x - 43999 R² = 0.9998

27 μg/ml và cinnamaldehyd trong khoảng 152,45 – 609,8 g/ml trong phép thử định lượng trong lá quế

3.1.2.4 Độ chính xác Độ chính xác được đánh giá dựa trên kết quả phân tích 6 lần 1 mẫu thử (n = 6) Kết quả độ chính xác trung gian được đánh giá dựa kết quả phân tích lặp lại của 2 điều kiện phân tích khác nhau (khác ngày phân tích và kiểm nghiệm viên) (n = 12) Tiến hành trên mẫu thử TVO 22-28 (độ ẩm 11,04 %) Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và 3.5

Bảng 3.4 Kết quả độ lặp lại 2 kiểm nghiệm viên

Thử 1 0,5018 9963096 0,84 35436669 1,40 1370894 0,05 Thử 2 0,5023 9998619 0,85 35452874 1,40 1374067 0,05 Thử 3 0,5020 10053540 0,85 35838847 1,42 1381673 0,05 Thử 4 0,5011 10035029 0,85 35635856 1,41 1379900 0,05 Thử 5 0,5061 10047291 0,84 35672170 1,40 1383465 0,05 Thử 6 0,5016 10035343 0,85 35738246 1,42 1381064 0,05

Bảng 3.5 Bảng kết quả độ chính xác trung gian của 2 kiểm nghiệm viên

KNV 1 KNV 2 KNV 1 KNV 2 KNV 1 KNV 2

- Kết quả của KNV 1: Hàm lượng CM, CA, CAL trung bình trong mẫu thử của lần lượt là: 0,85 %; 0,05 % và 1,41 %, RSD (n = 6) lần lượt là CM 0,4 %, CAL 0,6

- Kết quả của KNV 2: Hàm lượng CM, CA, CAL trung bình trong mẫu thử lần lượt là: 0,85 %; 0,05 % và 1,41 %, RSD (n = 6) lần lượt là CM 0,6 %; CAL 0,6 % < 1,9 % và CA 0,5 % < 2,7 %

- Giá trị độ lệch chuẩn tương đối của CM, CA, CAL của mỗi ngày và của cả hai ngày đều nằm trong giới hạn cho phép Kết quả so sánh hàm lượng hoạt chất trong

2 ngày với 2 kiểm nghiệm viên khác nhau, cả 3 chất đều có FTN < FLT : kết quả 2 ngày với 2 KNV khác nhau có độ lặp lại giống nhau

Như vậy phương pháp có độ chính xác cao, ổn định, đạt yêu cầu về độ chính xác

Dựa vào dữ liệu khảo sát sơ bộ, nghiên cứu lựa chọn mức nồng 100 % của các chất phân tích là nồng độ trung bình trong khoảng nồng độ tập trung nhiều mẫu thử, lần lượt là CM 204 àg/ml, CA 7,2 àg/ml, CAL 310 àg/ml

29 Mẫu thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,15 g bột dược liệu vào bình định mức

Ứng dụng phương pháp vào định lượng một số mẫu lá quế và tinh dầu quế

Tiến hành định lượng thành phần CM, CA, CAL trong 18 mẫu lá bằng phương pháp vừa thẩm định Kết quả thể hiện ở bảng 3.11 và hình 3.6

Bảng 3.11 Kết quả định lượng 18 mẫu lá quế

STT Mẫu Độ ẩm (%) Hàm lượng coumarin (%)

Hình 3.6 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu lá quế

3.3.2 Định lượng thành phần hóa học trong tinh dầu quế

Sử dụng phương pháp đã thẩm định, tiến hành định lượng 14 mẫu tinh dầu theo phương pháp đã xây dựng Tính kết quả dựa vào mẫu chuẩn có nồng độ khoảng CM 12,01 μg/ml, CA 40,07 μg/ml và CAL 221,02 μg/ml

Kết quả thể hiện ở bảng 3.12 và hình 3.8

Tinh dầu lá TVO 22 - 17 Tinh dầu lá TVO 22 - 20

Tinh dầu CoA (mẫu thử pha loãng) Tinh dầu CoA

4.00 hàm lượn g cá c ch ất ph ân tích ( %)

Hàm lượng coumarin (%) Mẫu Hàm lượng cinnamaldehyd (%) Hàm lượng acid cinnamic (%)

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện hàm lượng các chất phân tích trong các mẫu lá

Hình 3.8 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu tinh dầu quế

Bảng 3.12 Kết quả định lượng một số mẫu tinh dầu quế

STT Mẫu Hàm lượng coumarin (%)

Bàn luận

3.4.1 Xây dựng phương pháp định lượng cinnamaldehyd, acid cinnamic và coumarin trong lá quế

Lá quế hiện nay đang được quan tâm nhiều hơn Những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu hơn về phân tích thành phần của lá quế Một nghiên cứu gần đây [58] đã sử dụng cột UPLC là loại cột có giá thành cao, không phổ biến tại các cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta Nhằm hướng tới mục đích tiêu chuẩn hóa nguyên liệu lá đầu vào, việc phát

TD CoA TDTT TVO 22-5 TVO 22-11 TVO 22-15 TVO 22-17 TVO 22-18 TVO 22-20 TVO 22-11 TVO 22-15 TVO 22-17 TVO 22-21 TVO 22-25 TVO 22-26 Mẫu tinh dầu lá Mẫu tinh dầu vỏ

Hàm lượn g cá c ch ất ph ân tích tr on g m ẫu tin h dầu ( %)

Mẫu tinh dầu ứng dụng Hàm lượng coumarin (%) Hàm lượng acid cinnamic (%) Hàm lượng cinnamaldehyd (%)

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tinh dầu

37 triển phương pháp HPLC có tính phổ biến đối ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm với quy trình xử lý mẫu đơn giản dễ thực hiện để đánh giá nguồn nguyên liệu lá là cần thiết

3.4.1.1 Điều kiện xử lý mẫu

Xử lý mẫu là bước vô cùng quan trọng, nó ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và độ chính xác của kết quả phân tích Quy trình xử lý mẫu lựa chọn đơn giản với tổng thời gian chiết là 80 phút, có thể thực hiện được ở nhiều phòng thí nghiệm giúp cho việc xác định và định lượng các chất trên sắc ký đồ dễ dàng Quy trình xử lý mẫu lựa chọn phương pháp chiết siêu âm Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, giúp dung môi xâm nhập vào trong tế bào dễ hơn Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với chất cần thiết và cải thiện hiệu suất chiết đáng kể Một số nghiên cứu [8], [12], [59] sử dụng phương pháp chiết hồi lưu, chiết soxhlet sẽ tốn thời gian, quy trình xử lý mẫu phức tạp và kết quả định lượng của các chất phân tích không làm tăng hiệu quả

Quy trình xử lý mẫu được lựa chọn là quy trình 2 với tổng thời gian siêu âm là

60 phút và mẫu được kiểm soát nhiệt độ trong quá trình siêu âm Kết quả thực nghiệm cho thấy, ở 4 quy trình đưa ra khảo sát hiệu suất chiết các chất phân tích không có sự khác biệt rõ rệt nhưng độ lệch chuẩn tương đối lại rất khác nhau trong cùng một dung môi chiết Có thể thấy rằng việc chiết siêu âm với tổng thời gian là 60 phút cho kết quả phân tích các chất đồng đều hơn, ổn định hơn so với quy trình 1 với thời gian siêu âm là 30 phút Các quy trình 3 và 4 đưa thêm phương pháp lắc bập bênh và sử dụng siêu âm với điều kiện nhiệt độ không được kiểm soát Có thể thấy rằng việc thêm phương pháp lắc bập bênh vào quy trình không làm tăng hiệu suất chiết của chất phân tích Thực tế khi làm thực nghiệm, trong điều kiện nhiệt độ không được kiểm soát, nhiệt độ của bể siêu âm tăng lên nhanh và đáng kể, có thể ảnh hưởng đến các chất bay hơi trong mẫu

Dung môi chiết được đưa ra gồm methanol, nước và kết hợp methanol – nước ở các tỉ lệ 1 – 9, 3 – 7, 5 – 5, 7 – 3, 9 – 1 Methanol là một dung môi rất phổ biến bởi sự hòa tan chọn lọc nhiều hoạt chất với độ phân cực khác nhau và không hòa tan nhiều tạp chất Methanol cũng là dung môi dễ tìm kiếm, có thể thấy ở nhiều phòng thí nghiệm Dung môi này cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về quế [7] và chuyên luận vỏ quế, quế chi trong Dược điển Mỹ [54], Dược điển Trung Quốc [16] Từ kết quả khảo sát, có thể thấy dung môi ảnh hưởng rõ rệt tới hiệu suất chiết Hiệu suất chiết của các chất phân tích ở dung môi chiết methanol và methanol – nước tỉ lệ 9 – 1 là tương đương nhau và cao nhất trong các dung môi đưa ra Nghiên cứu đã lựa chọn dung môi chiết là methanol – nước tỉ lệ 9 – 1 làm dung môi chiết do giảm bớt lượng dung môi methanol cần dùng trong nghiên cứu, thân thiện với môi trường hơn và hiệu quả vẫn được đảm bảo Các bước ly tâm, lọc mẫu trong quy trình chiết nhằm loại bỏ các tạp chất không tan, tạp có kích thước phân tử lớn không được đưa vào hệ thống sắc ký lỏng

38 Quy trình xử lý mẫu lựa chọn đơn giản, dễ dàng thực hiện Tuy nhiên, quy trình vẫn còn một số điểm hạn chế như sau: thời gian siêu âm dài và nhiều khoảng nghỉ, nhiệt độ bể siêu âm tăng cao và nhanh chóng nên cần được kiểm soát kỹ lưỡng Điều kiện sắc ký được kế thừa từ nghiên cứu trước đó với đối tượng mẫu vỏ quế [7], đã được điều chỉnh để phù hợp với nền mẫu lá quế Với quy trình xử lý mẫu thử đã chọn và điều kiện sắc ký đưa ra, nhận thấy kết quả sắc ký đồ của các chất phân tích trong cả mẫu thử và mẫu chuẩn đều gọn gàng, cân xứng, các pic tách rõ và có độ phân giải tốt Kết quả thẩm định phương pháp đã cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác đảm bảo, giới hạn định lượng thấp, có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát

3.4.1.2 Kết quả định lượng các chất phân tích trong một số mẫu lá quế

Hiện tại, chưa có tiêu chuẩn về hàm lượng các chất phân tích trong mẫu lá Quế Nghiên cứu ở 18 mẫu lá Quế cho thấy hàm lượng CM có sự dao động là khá lớn (0,52 - 3,68 %) Trong đó mẫu TVO 22-18 ở Quảng Ninh có hàm lượng CM thấp nhất, mẫu TVO 23-36 ở Bắc Kạn có hàm lượng CM cao nhất Hàm lượng CAL dao động trong khoảng 0,96 - 2,90 %, trong đó mẫu TVO 22-20 ở Thanh Hóa có hàm lượng thấp nhất, mẫu TVO 22-11 ở Yên Bái có hàm lượng cao nhất CA trong lá quế chiếm thành phần khá nhỏ với hàm lượng dao động trong khoảng 0,01 - 0,07 %, trong đó 2 mẫu TVO 22-

19 ở Quảng Ninh và TVO 22-23 ở Trà My (Quảng Nam) có hàm lượng nhỏ nhất 3 mẫu có hàm lượng CA nhỏ nhất bao gồm 2 mẫu quế từ tỉnh Hòa Bình TVO 22-13, TVO 23-

44 và 1 mẫu quế đến từ tỉnh Quảng Ninh là TVO 22-18

Theo kết quả của nhóm nghiên cứu trước đó [7], đánh giá trên 102 mẫu vỏ quế ở

8 tỉnh thành khác nhau: Hàm lượng CM nằm trong khoảng 0,06 - 2,58 %, CA nằm trong khoảng 0,01 - 0,41 % và CAL nằm trong khoảng 0,98 - 9,83 % Dễ dàng thấy được sự khác biệt trong kết quả xác định hàm lượng các chất phân tích trong mẫu lá và mẫu vỏ quế Nghiên cứu cho thấy hàm lượng CA trong mẫu lá và mẫu vỏ đều khá thấp, hàm lượng trong mẫu vỏ có xu hướng cao hơn trong mẫu lá Hàm lượng CAL trong mẫu vỏ cũng có xu hướng cao hơn hàm lượng chất này trong mẫu lá Trong khi đó, hàm lượng

CM trong mẫu vỏ lại có xu hướng thấp hơn trong mẫu lá CAL là chất mang tác dụng sinh học chính trong quế Chênh lệch hàm lượng CAL với 2 chất còn lại trong mẫu lá thấp hơn đáng kể so với trong mẫu vỏ quế

3.4.2 Sử dụng phương pháp định lượng cinnamaldehyd, acid cinnamic và coumarin trong tinh dầu quế

3.4.2.1 Thẩm định phương pháp phân tích

Nhóm nghiên cứu đưa ra phương pháp HPLC với mong muốn có thể định lượng chính xác một số thành phần chính trong tinh dầu quế cụ thể là CAL, CA, CM Phương pháp GC đã được đưa vào sử dụng rất phổ biến trong việc xác định thành phần các chất

39 bay hơi trong tinh dầu quế Tuy nhiên phương pháp này khó xác định được các chất không bay hơi, thường chỉ phân tích tỉ lệ của các chất dựa trên phần trăm diện tích pic của chất so với tổng diện tích pic các chất bay hơi Trong khi đó, phương pháp HPLC có thể định lượng được chính xác hàm lượng chất phân tích có trong mẫu, có thể định lượng những chất không bay hơi, phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm với quy trình thao tác đơn giản

Vì đối tượng chất phân tích là CAL, CA, CM, giống với các chất cần phân tích ở mẫu lá quế trong nghiên cứu, chúng tôi tiến hành áp dụng cùng một điều kiện sắc ký cho cả 2 đối tượng mẫu Dung môi pha mẫu tinh dầu được lựa chọn là methanol – nước tỉ lệ 7 – 3 dựa vào tính tan tốt trong alcohol 70 % của tinh dầu và các chất phân tích

Kết quả thẩm định phương pháp đã cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác đảm bảo, giới hạn định lượng thấp, có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát

3.4.2.2 Kết quả định lượng trong một số mẫu tinh dầu quế

Kết quả định lượng một số mẫu tinh dầu cho thấy: sắc ký đồ của mẫu tinh dầu quế cho ít pic tạp hơn nhiều so với mẫu lá quế, sắc ký đồ các chất chính tách rõ ràng, chân pic gọn, đẹp, sắc ký đồ của CAL lớn hơn nhiều lần so với các chất còn lại