lê bảo trâm xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần hóa học trong lá quế và tinh dầu quế bằng hplc

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ BẢO TRÂM

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẦN

HÓA HỌC TRONG LÁ QUẾ VÀ TINH

DẦU QUẾ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ BẢO TRÂM

Mã sinh viên: 1901709

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẦN

HÓA HỌC TRONG LÁ QUẾ VÀ TINH

DẦU QUẾ BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Phân tích - Kiểm nghiệm và thử tương đương sinh học tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia dưới sự hướng

dẫn, tận tình chỉ bảo của PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và ThS Nguyễn Thu Hiền

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến đến PGS.TS Nguyễn Thị

Kiều Anh và ThS Nguyễn Thu Hiền đã dành nhiều thời gian để hướng dẫn, chỉ bảo

và đưa ra những góp ý quý báu để em hoàn thiện bài khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn NCS ThS Bùi Thị Lan Phương, người đã luôn đồng

hành, hỗ trợ em trong suốt quá trình thực nghiệm Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị công tác tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất cho em được hoàn thành khóa luận tốt nghiệp cũng như động viên, giúp đỡ, chỉ bảo em sử dụng thiết bị và góp ý giúp em hoàn thiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô công tác tại Trường Đại học Dược Hà nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu, là nền tảng để em xây dựng và hoàn thiện khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Văn Ơn,

Bộ môn Thực vật, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội,

Công ty cổ phần Vietplantex và hộ kinh doanh ông Phạm Văn Tiền đã cung cấp các

mẫu nghiên cứu cho khóa luận này

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thị Khánh Ly, bạn Hoàng

Thị Bích, anh Trần Ngọc Phan cùng các bạn, các em nghiên cứu tại Viện Công nghệ

Dược phẩm Quốc gia đã luôn hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình làm thực nghiệm cũng như hoàn thiện khóa luận

Sau cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bạn bè, người thân và gia đình đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Lê Bảo Trâm

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về lá quế và tinh dầu quế 2

1.1.1 Tổng quan về dược liệu quế 2

1.1.2 Đặc điểm của lá quế và tinh dầu quế 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.1.4 Ứng dụng của lá quế và tinh dầu quế 7

1.2 Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8

1.2.1 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký 8

1.2.2 Cấu tạo máy HPLC 9

1.3 Một số nghiên cứu về phân tích các thành phần chính trong lá và tinh dầu quế 10

1.3.1 Một số nghiên cứu phân tích coumarin, cinnamaldehyd và acid cinnamic 10

1.3.2 Một số phương pháp xử lý mẫu đối với bộ phận lá và lá quế 11

1.3.3 Một số nghiên cứu về phân tích tinh dầu 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 13

2.2.1 Hóa chất 13

2.2.2 Chất đối chiếu 13

2.2.3 Thiết bị 13

2.3 Nội dung nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 14

2.4.2 Xây dựng phương pháp 14

2.4.2 Điều kiện sắc ký 15

2.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích 16

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng coumarin, acid cinnamic và cinnamaldehyd trong lá quế 22

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 22

3.1.2 Thẩm định phương pháp 23

3.2 Đánh giá phương pháp định lượng cinnamaldehyd, coumarin và acid

cinnamic trong tinh dầu quế 30

3.2.1 Thẩm định phương pháp 30

3.3 Ứng dụng phương pháp vào định lượng một số mẫu lá quế và tinh dầu quế 33

3.3.1 Định lượng thành phần hóa học trong lá quế 33

3.3.2 Định lượng thành phần hóa học trong tinh dầu quế 35

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril CA Acid cinnamic CAL Cinnamaldehyd CM Coumarin CoA Giấy chứng nhận phân tích (Certificate Of Analysis) FID Đầu dò ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector) GACP Thực hành tốt trồng trọt và thu hái dược liệu (Good

Agricultural and Collection Practices) GAP Thực hành tốt trồng trọt dược liệu (Good Agricultural

Practices) GC – MS Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography – mass

spectrometry) GCP Thực hành tốt thu hái dược liệu (Good Collection

Practices) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid

chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) MeOH Methanol

OCOP Mỗi xã một sản phẩm (One commune one product) Rs Độ phân giải (Resolution)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard

deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SKĐ Sắc ký đồ

STT Số thứ tự TB Trung bình TD CoA Mẫu tinh dầu có CoA được cung cấp bởi công ty

Vietplantex TDTT Mẫu tinh dầu được lưu hành trên thị trường TLTK Tài liệu tham khảo

tR Thời gian lưu (Retention time) USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopeia) UV - Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet - Visible) WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của CM, CA, CAL 25

Bảng 3.4 Kết quả độ lặp lại 2 kiểm nghiệm viên 27

Bảng 3.5 Bảng kết quả độ chính xác trung gian của 2 kiểm nghiệm viên 28

Bảng 3.6 Nồng độ tại các mức thêm chuẩn 29

Bảng 3.7 Kết quả độ đúng 29

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp 30

Bảng 3.9 Kết quả độ đặc hiệu mẫu tinh dầu 31

Bảng 3.10 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích tinh dầu quế 33

Bảng 3.11 Kết quả định lượng 18 mẫu lá quế 34

Bảng 3.12 Kết quả định lượng một số mẫu tinh dầu quế 36

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh lá quế [5] 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cinnamaldehyd 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của eugenol 5

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của coumarin 5

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid cinnamic 6

Hình 1.6 Cấu tạo cơ bản của máy HPLC 9

Hình 3.1 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu lá quế 22

Hình 3.2 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử và dung môi pha mẫu 23

Hình 3.3 Chồng phổ UV của 3 chất phân tích 23

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic 26

Hình 3.5 Sắc ký đồ LOD, LOQ 32

Hình 3.6 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu lá quế 34

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện hàm lượng các chất phân tích trong các mẫu lá 35

Hình 3.8 Sắc ký đồ phân tích một số mẫu tinh dầu quế 35

Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện hàm lượng các chất phân tích trong mẫu tinh dầu 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Quế được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trong đời sống hiện nay, đặc biệt được nhiều người biết đến như một loại gia vị trong nấu nướng, pha chế Lá quế thường được sử dụng như một loại hương liệu làm thơm tự nhiên trong nhà Những năm gần đây, lá quế được chú ý nhiều hơn và được sử dụng để chiết tinh dầu với dược tính ôn hòa, giá thành rẻ và dễ sử dụng hơn tinh dầu từ vỏ quế Tinh dầu quế được sử dụng như một cách tạo hương thơm, khử nấm mốc hiệu quả trong đời sống hàng ngày Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trong lá quế và tinh dầu quế có chứa nhiều thành phần hóa học như dẫn xuất của terpenoid, phenyl propanoid, [5], [17], [56]

Trong bối cảnh hiện nay, các sản phẩm từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng, lá quế và tinh dầu quế ngày càng thể hiện giá trị của mình Trong chương trình OCOP (One Commune One Product - Mỗi xã một sản phẩm), quế được xem là một trong những sản phẩm chiến lược, có vai trò quan trọng trong việc phát triển kinh tế - xã hội ở các vùng miền núi, trong đó tinh dầu quế được chiết xuất chủ yếu từ lá quế và cành con, là sản phẩm được quan tâm rất nhiều Tuy nhiên, quy trình trồng trọt, thu hái quế ở nước ta vẫn chưa được tối ưu hóa dẫn tới việc sản xuất các sản phẩm còn nhiều cản trở, chất lượng sản phẩm chưa được cao và đồng đều Thêm vào đó, việc hướng tới mục tiêu đạt chứng nhận GACP-WHO (Good Agricultural and Collection Practices-World Health Organization) cho cây quế là một bước tiến quan trọng trong việc nâng cao giá trị của quế, mở rộng thị trường Để đáp ứng được tiêu chuẩn này, việc đảm bảo chất lượng tinh dầu quế cũng như kiểm soát chất lượng lá quế nguyên liệu là rất cần thiết Trong khi đó, chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng chính xác các thành phần hóa học cũng như các tiêu chuẩn đánh giá cụ thể của lá quế Tinh dầu quế đã được đưa vào sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày Tuy nhiên, các phương pháp phân tích hàm lượng tinh dầu hiện nay hầu hết đều sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography – GC), chưa được phổ biến nhiều tại các phòng kiểm nghiệm trong nước Việc phát triển phương pháp mang tính phổ biến với nhiều phòng kiểm nghiệm để định lượng các thành phần trong lá quế và tinh dầu là cần thiết để tối ưu giá trị sử dụng của loài cây này

Do đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số

thành phần hóa học trong lá quế và tinh dầu quế bằng phương pháp HPLC” được

thực hiện với 2 mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định lượng acid cinnamic, cinnamaldehyd, coumarin

trong lá quế (C cassia) và tinh dầu quế

- Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng acid cinnamic,

cinnamaldehyd và coumarin trong các mẫu thực thu thập trên thị trường

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về lá quế và tinh dầu quế

1.1.1 Tổng quan về dược liệu quế

Quế là một giống cây đặc trưng riêng biệt của miền nhiệt đới, rất thích hợp với môi trường khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp để cây sinh trưởng và phát triển là 20 – 30

oC Lượng mưa thích hợp giúp cây sinh trưởng phát triển là 2000 - 3000 mm/năm, độ ẩm 85 % Quế có thể trồng được trên nhiều kiểu đất mẹ khác nhau, đất ẩm nhiều mùn, tơi xốp, đất đỏ, đất cát pha, đất đồi núi, đất chua, đất thiếu dinh dưỡng nhưng thoát hơi nước [9]

Hiện nay, Cinnamomum Cassia là loài quế phổ biến nhất ở Việt Nam Quế phân bố

khắp các vùng trên cả nước, trong đó có bốn vùng trồng quế tập trung là Yên Bái – Lào Cai, Quảng Ninh, Thanh Hóa – Nghệ An và Quảng Nam – Quảng Ngãi [9]

Tất cả các bộ phận của cây quế đều có giá trị sử dụng Vỏ cây quế có màu nâu đỏ và có mùi thơm đặc trưng Vỏ thân, vỏ cành non được phơi hoặc sấy khô Vỏ thân được phơi khô trong bóng râm (Quế nhục) Lá quế được biết đến là một bộ phận có hàm lượng tinh dầu khá cao chỉ sau vỏ quế, được sử dụng để chiết xuất tinh dầu ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau Hiện tại, lá quế đang được quan tâm nghiên cứu nhiều với các thành phần có tác dụng chống oxy hoá, đái tháo đường tuýp II, Parkinson, …[29], [58], [60] Ngoài ra, lá quế còn được sử dụng như một loại hương liệu tạo mùi hương tự nhiên trong phòng, khử mùi ô tô giúp chống say xe hiệu quả Tinh dầu quế được sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày như làm hương liệu nước hoa, khử mùi, đuổi côn trùng, chống nấm mốc cho gỗ, hạn chế vi khuẩn trong kim chi … [15] Đồng thời, hương thơm từ tinh dầu quế còn có tác dụng giúp thư giãn, an thần nên được sử

dụng trong nhiều các cơ sở trị liệu, chăm sóc sức khỏe, sắc đẹp

1.1.2 Đặc điểm của lá quế và tinh dầu quế

Lá quế là loại lá đơn, mọc cách, mọc so le hoặc gần như đối; phiến lá hình bầu dục hẹp tới gần hình mũi mác, dài 8 - 16 cm, rộng 4 - 5,5 cm; chóp nhọn; mặt trên màu xanh lục, nhẵn bóng; mặt dưới màu xanh lục nhạt, có lông màu vàng xám về sau nhẵn; hệ 3 gân gồm 2 gân bên phẳng, xuất phát cách gốc 0,5 - 1 cm, hình vòng cung chạy gần tới chóp lá và gân chính phẳng hoặc nổi ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới; gân bên có nhiều gân bổ sung bên ngoài, các gân này liên kết với nhau theo hình vòng cung, gân mạng gần như song song ở khoảng cách xa 3 - 4 mm, nhìn thấy ở cả 2 mặt nhưng nhìn rõ hơn ở mặt dưới Gốc lá nhọn, rìa lá hơi cong, đỉnh hơi nhọn Cuống to, khỏe, dài 1,2 - 2 cm, có rãnh ở trên [5]

Tinh dầu quế là chất lỏng trong suốt, màu vàng đến nâu đỏ Mùi thơm, vị cay nóng rất đặc trưng, dễ tan trong Ethanol 70% Tỷ trọng của tinh dầu quế là 1,040 – 1,072 ở 20 C, chỉ số khúc xạ là 1,590 – 1,610, góc quay cực riêng từ -1o – 1o [3] Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của các loài Quế, thể hiện ở mùi thơm đặc trưng của các cây trong chi [5] Tinh dầu lá quế được chiết xuất từ phần lá nên giá thành thấp hơn đồng thời dược tính thường ôn hòa và dễ sử dụng hơn tinh dầu vỏ quế Hai bộ phận của Quế được nghiên cứu nhiều về thành phần tinh dầu là vỏ thân và lá Hiện nay, nguồn nguyên liệu chủ yếu để chiết xuất tinh dầu quế là lá và cành quế

1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.3.1 Các thành phần có trong lá quế và tinh dầu quế

Quế là một loài cây có chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu quế trong lá và vỏ quế khá cao Chất chiếm thành phần cao nhất trong tinh dầu quế phải nhắc đến là cinnamaldehyd với hàm lượng dao động 60 - 80 % [33]

Đã có nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học trong quế [10], [18], [19], [23], [32], [47], [49],[50], từ đó đưa ra một số nhóm chất và hoạt chất có mặt trong lá quế và tinh dầu quế bao gồm:

a) Aldehyd: Cinnamaldehyd, Methoxycinnamaldehyd, Benzenepropanal, Benzaldehyd,…

b) Acid: acid cinnamic, acid ferulic, acid caffeic, acid protocatechuic, acid vanillic,

acid syringic,…

c) Monoterpen: p-Cymen, Limonen, α-Terpinen, α-Pinen, Camphen, Camphor,

(1,4)-Cineol, β-Pinen, β-Phellandren, α-Phellandren, 3-Caren,…

d) Sesquiterpen: Humulen, Caryophyllen oxit, β-Caryophyllen, Muurolen,

Copaen, Cedren, Tumeron, β-Tumeron, Cadinol, τ-Cadinol, Calamenen, Ylangen,…

α-e) Diterpen: Cinnzeylanin, Cinnzeylanol,…

Hình 1.1 Hình ảnh lá quế [5]

4

f) Ceton: Coumarin,… g) Hydrocarbon: δ-Cadinen, Myrcen, Styren, Dodecan,… h) Alcohol: α-Terpineol, Linalool, Cinnamyl alcohol, Benzenmethanol,

a) Cinnamaldehyd

Tên IUPAC: (E)-3-Phenylprop-2-enal

Công thức phân tử: C9H8O (M = 132,15 g/mol)

Tên khác: Cinnamaldehyd, trans-cinnamaldehyd, cinnamic aldehyd

Tính chất: - Chất lỏng màu vàng, ít tan trong nước (1,42 mg/ml ở 25 °C), hòa tan trong

cloroform, ether, alcohol không hòa tan trong dầu hỏa - Nhiệt độ nóng chảy: -7,5 °C, nhiệt độ sôi: 253 °C, tỷ trọng: 1,048 - 1,052 g/ml ở

25 °C, áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ: 1,6195 - Bước sóng hấp thụ cực đại: 291 nm [42]

Cinnamaldehyd là một phenylpropanoid, thành phần chính có trong quế Cinnamaldehyd có khả năng khử trùng, đuổi muỗi rất hiệu quả [38], ngoài ra còn có đặc tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng nấm [51], [55] Cinnamaldehyd thường được sử dụng trong hương liệu làm kẹo cao su, đồ uống, kem, kẹo và cũng được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, nước hoa Cinnamaldehyd có thể được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký khí [7], [16], [54]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của cinnamaldehyd

b) Eugenol

Tên IUPAC: 2-metoxy-4-prop-2-enylphenol

Công thức phân tử: C10H 12O2 (M = 164,20 g/mol) Tên khác: Eugenol, 4-Allyl-2-metoxyphenol, 4-Allylguaiacol Tính chất:

- Chất lỏng trong suốt, màu vàng nhạt hoặc màu hổ phách, mùi đinh hương, vị cay

nồng, ít tan trong nước (2,46 mg/ml ở 25 C), tan trong rượu, chloroform, ether, các loại dầu

- Nhiệt độ nóng chảy: - 9,2 C, nhiệt độ sôi: 225 C, tỷ trọng: 1,064 - 1,070 g/ml ở

25 °C, áp suất hóa hơi: 0,0221 mmHg ở 25°C, chỉ số khúc xạ: 1,5405 - Bước sóng hấp thụ cực đại: 290 nm [45]

Eugenol là một phân tử phenolic tự nhiên được tìm thấy trong một số loại thực vật như quế, đinh hương và lá nguyệt quế [45] Nó đã được sử dụng như một chất khử trùng tại chỗ như một chất chống kích ứng và trong các chế phẩm nha khoa với oxit kẽm để bịt kín ống tủy và kiểm soát cơn đau [40] Ngoài ra, eugenol đã được phát hiện có đặc tính chống viêm, bảo vệ thần kinh, hạ sốt, chống oxy hóa, kháng nấm và giảm đau [39] Eugenol có thể được định lượng bằng phương pháp sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao [25], [31]

c) Coumarin (chromen-2-on)

Tên IUPAC: 2H-coumarin

Tên gọi khác: Rattex, chromen-2-on, coumarinic anhydrid,

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của eugenol

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của coumarin

6 - Độ tan trong nước: 0,19 g/100 mL ở 20 °C, hòa tan trong ethanol và các alcohol,

rất tan trong ether và cloroform - Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [44]

Coumarin và dẫn xuất của nó có hoạt tính sinh học như chống đông máu, kháng khuẩn, kháng virus chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư và ức chế enzym Liều cao coumarin được phát hiện là có nguy cơ gây độc cho gan, tuy nhiên có thể giúp giảm nguy cơ gây ung thư và bệnh lý về thần kinh và tim mạch [24] Những năm 1950, các nghiên cứu chỉ ra rằng coumarin gây độc cho gan ở chuột và chó được cho thức ăn có chứa coumarin [28] Thực tế, coumarin có mặt nhiều trong thực phẩm, trái cây, rau quả và cả trong mỹ phẩm Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (European Food Safety Authority - EFSA) và Viện Đánh giá rủi ro Liên Bang Đức (Bundesinstitut für Risikobewertung - BfR) đã thiết lập lượng coumarin có thể chấp nhận được hàng ngày là 0,1 mg/kg thể trọng [21] Hiện nay, thông tin về con đường thải trừ các chất chuyển hóa coumarin cho thấy sự khác biệt đáng kể ở người và động vật [34] Ở chuột các chất chuyển hóa của coumarin được thải trừ chủ yếu qua phân trong khi đó ở người chúng được bài tiết qua nước tiểu, do đó thời gian lưu của coumarin và các chất chuyển hóa của nó ở người ngắn hơn so với ở chuột Nhiều nghiên cứu về độc tính của coumarin đã đưa ra kết luận rằng độc tính ở gan do nó gây ra chỉ giới hạn trên một nhóm nhỏ bệnh nhân nhạy cảm [36], [46]

d) Acid cinnamic

Tên IUPAC: Acid (E)-3-Phenylprop-2-enoic

Công thức phân tử: C9H8O2 (M = 148,159 g/mol) Tên khác: trans-acid cinnamic, acid phenylacrylic, acid cinnamylic, acid 3- phenylacrylic, acid (E)-cinnamic, acid benzenepropenoic, acid isocinnamic

Tính chất: - Chất kết tinh không màu Ít tan trong nước (0,546 mg/ml), dễ tan trong dung môi

hữu cơ: ether, diethyl ether, cloroform, dầu, pyridin hòa tan trong cồn - Nhiệt độ nóng chảy: 133 oC, nhiệt độ sôi: 298 - 300 °C ở 760 mmHg - Tỷ trọng: 1,185 g/cm3; áp suất hóa hơi: 0,005 mmHg ở 25 °C; chỉ số khúc xạ:

1,616 - Hợp chất có tính acid yếu, pKa: 4,45

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của acid cinnamic

- Bước sóng hấp thụ cực đại 273 nm [43]

Acid trans-cinnamic được sử dụng trong hương liệu và một số dược phẩm Acid

trans-cinnamic có tác dụng dược lý như: Chống nấm, kháng khuẩn, có hiệu quả chống

lại sự tổn thương da, ngoài ra còn có tính chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư [22], và chống sốt rét [52], [48] Những năm gần đây, acid cinnamic còn được nghiên cứu như là một hợp chất tiềm năng để phát triển các tác nhân kiểm soát các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer [20]

1.1.4 Ứng dụng của lá quế và tinh dầu quế 1.1.4.1 Tác dụng sinh học chung của quế

Trong tây y, quế và tinh dầu quế được coi là một vị thuốc có tác dụng kích thích làm tăng tuần hoàn máu (huyết được lưu thông), hô hấp tăng, gây co mạch, tăng bài tiết, co bóp tử cung và tăng nhu động ruột Tinh dầu có khả năng sát trùng mạnh [4]

Theo Đông y: Quế có vị ngọt, cay, mùi thơm, tính rất nóng, có tác dụng bổ hỏa, hồi dương, ấm thận tỳ, thông huyết mạch, trừ tàn tích, là một vị thuốc bổ Quế được dùng làm thuốc cấp cứu bệnh do hàn như chân tay lạnh (cảm lạnh), mạch chậm nhỏ, hôn mê, đau bụng trúng thực, phong tê bại, đau bụng lạnh, chữa tiêu hóa kém, tả lỵ, tiêu chảy, thũng do tiểu tiện bất lợi, kinh bế, rắn cắn, ung thư [4]

Quế đã được sử dụng rộng rãi trong Đông y và trong y học hiện đại với nhiều bài thuốc và tác dụng khác nhau: kích thích tiêu hóa, chống ung thư, chống viêm, giảm đau, an thần, tăng huyết áp, kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa [4], [19], giảm lượng đường trong máu [53], hỗ trợ điều trị bệnh lý thần kinh [41]

1.1.4.2 Lá quế và tinh dầu quế trong đời sống

Quế hiện nay đã trở nên vô cùng phổ biến trong cuộc sống với nhiều công dụng đã được chứng minh Tinh dầu quế được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau với rất nhiều mục đích khác nhau Nguyên liệu thường được sử dụng để tổng hợp tinh dầu quế là lá quế và quế cành Ngày nay, nhu cầu thị trường đối với quế đang mở rộng với việc chế biến tinh chế và tổng hợp tinh dầu Do đó, việc khai thác và sử dụng các nguyên liệu thô sẽ đòi hỏi nguồn tài nguyên bền vững và đảm bảo chất lượng đầu vào Lá quế cũng chứa một lượng lớn tinh dầu và được sử dụng tương tự như vỏ quế trong lĩnh vực hương liệu, y học [4], [29]

Trước nhu cầu sử dụng ngày càng một tăng cao, các sản phẩm về quế ngày càng được chú trọng về chất lượng Hiện nay, Chương trình Quốc gia Mỗi xã một sản phẩm (OCOP) nhằm phát triển kinh tế khu vực nông thôn, phát triển quốc gia xây dựng nông thôn mới với các sản phẩm có giá trị gia tăng, đặc biệt tiêu chí đánh giá quan trọng nhất của một sản phẩm OCOP chính là về chất lượng sản phẩm bao gồm dinh dưỡng, tiêu chuẩn của sản phẩm và khả năng xuất khẩu tại thị trường quốc tế Đã có nhiều sản phẩm từ quế được đánh giá xếp hạng OCOP như quế bột, tinh dầu quế, quế thuốc lá, các sản

8 phẩm thủ công mỹ nghệ… Vì vậy việc hoàn thiện sản phẩm và kiểm soát quy trình chế biến để đa dạng hóa sản phẩm và tối ưu chất lượng sản phẩm là cần thiết

Đồng thời, Việt Nam là quốc gia có sản lượng xuất khẩu các mặt hàng quế lớn nhưng chủ yếu là xuất khẩu quế nguyên liệu Trước xu thế hội nhập kinh tế khu vực và trên thế giới, các nhà sản xuất thuốc từ dược liệu nước ngoài sẽ đưa sản phẩm của họ vào Việt Nam Ngược lại, chúng ta cũng cần đưa dược liệu và thuốc Đông dược của Việt Nam ra thị trường nước ngoài Để có thể mở rộng việc xuất khẩu các sản phẩm tinh dầu quế, nâng cao giá trị của cây quế thì việc hướng tới mục tiêu kiểm soát chất lượng cho lá quế và sản phẩm tinh dầu quế là cần thiết

GACP - WHO được biết đến là hệ thống các nguyên tắc, tiêu chuẩn Thực hành tốt trồng trọt và thu hái dược liệu theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), bao gồm hai nội dung chính là Thực hành tốt trồng cây thuốc (GAP) và Thực hành tốt thu hái cây thuốc hoang dã (GCP) [57] Nó đóng vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra nguồn nguyên liệu làm thuốc đảm bảo chất lượng Mỗi công đoạn sẽ có những tiêu chuẩn riêng cho từng loại cây cụ thể, phụ thuộc vào môi trường tự nhiên, điều kiện sinh thái, nguồn giống, đất trồng, biện pháp canh tác, chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh, thu hái, vận chuyển, xử lý kiểm tra sau khi thu hoạch đến cách đóng gói và bảo quản dược liệu trong kho Có thể thấy rằng, nội dung của GACP rất rộng và phức tạp, liên quan đến nhiều lĩnh vực khoa học kỹ thuật Và để đảm bảo thực hiện tốt các nội dung này GACP còn yêu cầu nhiều điều kiện về cơ sở vật chất và nhân lực, trong đó có điều kiện về phòng thực nghiệm với các thiết bị đo đạc và kiểm tra chất lượng sản phẩm [57]

Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu, tiêu chuẩn cụ thể đánh giá chất lượng nguyên liệu thô từ lá quế cũng như tinh dầu quế Do đó, việc phát triển hợp lý các quy trình tổng hợp tinh dầu sử dụng lá quế là rất quan trọng, không chỉ để cải thiện tỉ lệ sử dụng nguyên liệu thô từ quế mà còn để bảo vệ tài nguyên của nó

1.2 Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là một kỹ thuật phân tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chất phân tích giữa hai pha nghĩa là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần và tỉ lệ pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2], [1]

1.2.1 Các thông số đặc trưng trong quá trình sắc ký

a) Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

K = CSCM

Trong đó CS là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và CM là nồng độ mol trong pha động Ái lực tương đối của chất tan với hai pha sẽ lượng giá hệ số K Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn [1]

b) Thời gian lưu

Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ đạt cực đại, là đại lượng để định tính 1 chất

10 Một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản đều có những bộ phận sau: - Hệ thống pha động sắc ký lỏng: Pha động được cung cấp từ một hay vài bình chứa và chạy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và chạy qua detector

- Bộ phận tiêm mẫu: Dùng để đưa mẫu phân tích vào dòng dung môi Bộ tiêm mẫu có thể hoạt động tự động hoặc thủ công

- Cột sắc ký (pha tĩnh): Là thành phần quan trọng nhất, chứa pha tĩnh là một chất liệu rắn hoặc gel đặc biệt, giúp tách biệt các hợp chất trong mẫu dựa trên các tính chất hóa lý khác nhau như độ tan, kích thước phân tử, và ái lực hóa học

- Detector: Thiết bị phát hiện và ghi nhận các hợp chất tách ra từ cột phân tích Các loại detector phổ biến bao gồm detector hấp thụ tia tử ngoại - khả kiến (UV-Vis – Ultraviolet -Visible), detector khối phổ (MS - Mass Spectrometry), và detector dẫn điện (Conductivity)

- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu: Máy tính và phần mềm đi kèm được dùng để thu thập và phân tích dữ liệu từ detector, từ đó xác định và định lượng các thành phần trong mẫu

1.3 Một số nghiên cứu về phân tích các thành phần chính trong lá và tinh dầu

quế 1.3.1 Một số nghiên cứu phân tích coumarin, cinnamaldehyd và acid cinnamic

Các chất phân tích đã được biết đến từ lâu là thành phần chính của quế, được xuất hiện nhiều trong các dược điển và nghiên cứu trên thế giới

Dược điển Mỹ USP 2022 [54] đã định lượng procyanidin B2, coumarin, 2- hydroxycinnamaldehyd, acid cinnamic, cinnamaldehyd, và 2 - methoxycinnamaldehyd trong vỏ quế Cinnamomum cassia bằng HPLC với cột tách L1 (2,1 mm x 10 cm; 1,5

µm), pha động gồm dung dịch acid formic 0,1% và ACN chạy chế độ gradient, phát hiện ở bước sóng 280 nm Đối vởi mẫu thử là quế chi Cinnamomum cassia định lượng coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamic acid, 2-methoxycinnamic acid, cinnamaldehyd và 2- methoxycinnamaldehyd điều kiện sắc ký: Cột L1 (4,6 mm x 25 cm, 5 µm) pha động gồm dung dịch acid phosphoric 0,05 % và ACN chế độ gradient, bước sóng phát hiện 256 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl

Trong chuyên luận Cinnamomi Cortex Dược điển Trung Quốc 2015 [16] đã đưa ra phương pháp định lượng cinnamaldehyd Chương trình chạy đẳng dòng với điều kiện

sắc ký: Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), pha động: ACN : nước (35:75), bước sóng phát hiện là 290 nm

Năm 2023, nghiên cứu của Trần Ngọc Phan đã định lượng đồng thời coumarin,

acid cinnamic, cinnamaldehyd trong vỏ Quế bằng phương pháp HPLC dựa trên Dược

điển Mỹ [54] Điều kiện sắc ký tham khảo Dược điển Mỹ với mục tiêu có thể áp dụng cho mọi phòng thí nghiệm với quy trình như sau: Sử dụng cột C18 (25 cm × 4,6 mm; 5

µm); nhiệt độ cột 25 oC; tốc độ dòng 1 ml/phút; dung môi pha mẫu: MeOH - H2O (7:3); bước sóng phát hiện 280 nm; pha động acid phosphoric 0,05 % - ACN với chương trình gradient Thẩm định phương pháp theo ICH [30] Kết quả cho thấy các pic tách tốt, chân pic gọn, cân xứng rõ ràng [7]

1.3.2 Một số phương pháp xử lý mẫu đối với bộ phận lá và lá quế

Lá có một số đặc điểm riêng như lạp lục, nhiều mô mềm và lỗ khí hỗ trợ cho quá trình quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước Lạp lục trong lá thường khiến dịch chiết có màu, ảnh hưởng đến kết quả phân tích đối với phương pháp đo quang Một số thành phần trong lá quế được đưa ra bao gồm nước, chất béo, protein thô [29], các thành phần hóa học chính là cinnamaldehyd, eugenol, linalool, acic cinnamic và các các hợp chất phenolic [56]

Phương pháp và dung môi chiết ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình chiết hoạt chất [59] Một số yếu tố cụ có thể ảnh hưởng tới hiệu suất chiết và các phương pháp xử lý mẫu thường dùng:

- Xử lý ban đầu: Làm khô nguyên liệu thực vật giúp loại bỏ nước, giảm thiểu sự phân hủy enzyme và vi khuẩn, từ đó bảo quản các hoạt chất chính Xay nhỏ mẫu giúp tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa mẫu và dung môi, từ đó nâng cao hiệu suất chiết xuất các chất phân tích Trong hầu hết các quy trình chiết xuất dược liệu, phương pháp làm khô và xay nhỏ đều được sử dụng [6], [7], [11]

- Dung môi chiết: Dung môi được lựa chọn phải phù hợp với đặc tính của chất phân tích, có thể hòa tan tốt các chất cần chiết và ít hòa tan tạp chất Dung môi thường được sử dụng là ethanol, methanol do hòa tan được nhiều chất với độ phân cực khác nhau, hạn chế hòa tan tạp chất

- Phương pháp chiết: Sử dụng sóng siêu âm là phương pháp phổ biến và dễ thực hiện giúp khuấy trộn mạnh dung môi, gia tăng sự tiếp xúc của dung môi với hoạt chất, làm tăng tốc độ hòa tan và hiệu quả chiết xuất Phương pháp chiết nóng sử dụng nhiệt độ cao để tăng tốc độ phản ứng và hòa tan các hợp chất, nhưng có thể làm phân hủy các hợp chất nhạy cảm với nhiệt Trong khi đó việc chiết lạnh thực hiện ở nhiệt độ thấp để bảo vệ các hợp chất nhạy cảm với nhiệt, tuy nhiên, quá trình chiết thường chậm hơn

- Thu mẫu: Sử dụng lực ly tâm để tách các tạp chất ra khỏi dung dịch, giúp tăng tốc độ và hiệu quả thu mẫu Để lắng cho phép các hợp chất lắng đọng tự nhiên dưới tác động của trọng lực, phương pháp này thường mất thời gian hơn và không hiệu quả với các hạt nhỏ

1.3.3 Một số nghiên cứu về phân tích tinh dầu

Phần lớn các nghiên cứu về phân tích chất trong nền mẫu tinh dầu sử dụng phương pháp GC do tính phù hợp của nó với các thành phần dễ bay hơi Tinh dầu quế

12 cũng đã được nghiên cứu rất nhiều bằng phương pháp này [5], [35], [56], đồng thời trong Dược điển Châu Âu [17] và Dược điển Trung Quốc [16], hàm lượng các chất trong tinh dầu quế cũng được xác định bằng phương pháp sắc ký khí Tuy nhiên phương pháp này có hạn chế khi sử dụng cho các mẫu phức tạp hơn, thiết bị chưa được phổ biến nhiều tại các phòng thí nghiệm

Đã có một vài nghiên cứu đưa ra phương pháp HPLC để xác định hàm lượng các chất trong mẫu tinh dầu thay cho phương pháp GC thường dùng Nhóm nghiên cứu

Hajimedihpoor H đã phân tích tinh dầu Thymus vulgaris L đồng thời với 2 phương

pháp là HPLC và GC đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) Nồng độ thymol và carvacrol trong tinh dầu thu được bằng HPLC và GC được so sánh bằng phương pháp thống kê và cho thấy có sự thống nhất [27] Năm 2013, Liu Jing và các công sự cũng đã đưa ra sự so

sánh 2 phương pháp HPLC-DAD và GC-MS trong việc phân tích tinh dầu Perilla

frutescens (L.) Britt, kết quả ghi nhận phương pháp HPLC nhanh chóng, dễ dàng thực

hiện đạt các chỉ tiêu thẩm định và có sự thống nhất với phương pháp GM-MS [37] Có thể thấy rằng việc phát triển phương pháp phân tích tinh dầu bằng HPLC là khả thi và ngày càng được chú ý hơn

Nhằm mục tiêu phát triển phương pháp HPLC để định lượng CM, CA, CAL trong mẫu tinh dầu quế, nhóm nghiên cứu đưa ra dung môi pha mẫu thử dựa trên khả năng tan tốt của tinh dầu quế trong các alcohol [3], tiến hành thẩm định phương pháp, ứng dụng định lượng một số mẫu tinh dầu

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu lá quế được thu hái, được phơi trong bóng râm đến độ ẩm nhỏ hơn 14%, sau đó được bảo quản trong túi Polyethylen hạt silicagel kín, được ghi nhãn rõ ràng Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát Các mẫu quế được định danh đúng tên khoa học là

Cinnamomun cassia, bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Văn Ơn, Bộ môn Thực

vật, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu tinh dầu quế lưu hành trên thị trường có CoA, được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Vietplantex, mẫu tinh dầu được lưu hành trên thị trường được cung cấp bởi hộ kinh doanh ông Phạm Văn Tiền tại thôn Yên Tiên, xã Yên Phú, huyện Văn Yên, tỉnh Yên Bái, các mẫu tinh dầu quế được cất từ lá quế đã được định danh đúng tên khoa học

là Cinnamomun cassia, bởi nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Văn Ơn, Bộ môn Thực

vật, Khoa Dược liệu – Dược cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là CM, CA và CAL trong lá quế và tinh dầu quế

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.2.1 Hóa chất

- Dung môi tinh khiết dùng cho HPLC: MeOH (Fisher), Acetonitril

(Merck), nước siêu sạch

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid phosphoric 85 % (Merck)

- Máy xay High-speed multifunction grinder model 150A, công suất định

mức 850W, điện áp 220V, tốc độ xoay lưỡi dao 2800 vòng/ phút

- Hệ thống HPLC-DAD Shimadzu LC-40D XR (Nhật Bản) trang bị hệ thống bơm gradient áp suất thấp 4 kênh dung môi và detector PDA, phần mềm

Labsolution

- Cột sắc ký Phenomenex C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Cân phân tích Mettler Toledo GF-244A, độ chính xác 0,0001g (Mettler

Toledo, Thụy Sỹ)

14 - Cân phân tích Mettler Toledo XPE105, độ chính xác 0,01 mg (Mettler

Toledo, Thụy Sỹ)

- Máy siêu âm DAIHAN WUC - A22H (Daihan, Hàn Quốc)

- Máy ly tâm HERMILE Z306 (Hermile, Đức)

- Tủ sấy MEMMERT ULM-500 (Memmert, Đức)

- Tủ lạnh Haier HYC 940 (Haier, Trung Quốc)

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25ml, 50 ml, 100 ml, cốc có mỏ, ống đong 1000, 250, 25 ml của Class A, Isolab (Đức) ; vial

(Waters, Mỹ)

- Micropipet 100 - 1000 µl Nichipet (Nhật Bản) Ống ly tâm 15 ml Màng

lọc 0,45 µm

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu lá quế, thẩm định phương pháp phân tích mẫu lá quế

- Thẩm định phương pháp phân tích mẫu tinh dầu quế - Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu lá quế và tinh dầu quế

2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.2 Xây dựng phương pháp 2.4.2.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn (1): cân chính xác khoảng 125 mg CM chuẩn vào bình

định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CM (1) có nồng độ chính xác khoảng 5 mg/ml

- Dung dịch chuẩn (2): cân chính xác khoảng 125 mg CAL chuẩn vào bình

định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CAL (2) có nồng độ chính xác khoảng 5 mg/ml

- Dung dịch chuẩn (3): cân chính xác khoảng 25 mg CA chuẩn vào bình

định mức 25 ml thêm MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, định mức đến vạch bằng

MeOH, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc CA (3) có nồng độ chính xác khoảng 1

mg/ml

2.4.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu lá quế

Sau khi tham khảo điều kiện xử lý mẫu trong các tài liệu tham khảo [6], [11], [26], [29], [37], [59], dựa theo điều kiện cơ sở vật chất tại phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát tỉ lệ dung môi chiết, số lần chiết, thời gian chiết trên mẫu TVO 22 – 19

Khoảng 20 g mẫu lá quế được xay bằng máy xay trong tổng thời gian khoảng 30 - 60 giây Rây bột qua rây 250 μm

Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 20 ml dung môi pha mẫu, xử lý mẫu theo các điều kiện khảo sát Thêm dung môi đến vạch, lắc đều Lấy khoảng 10 ml dung dịch vào ống ly tâm và ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút Lớp dịch phía trên được lọc qua màng lọc 0,45 μm thu được dung dịch tiêm sắc ký Mỗi dung môi chiết 3 lần, tính giá trị trung bình

Bảng 2.1 Dung môi và điều kiện khảo sát xử lý mẫu lá

- MeOH - MeOH : Nước = 9 : 1 - MeOH : Nước = 7 : 3 - MeOH : Nước = 5: 5 - MeOH : Nước = 3 : 7 - MeOH : Nước = 1 : 9 - Nước

- Điều kiện 1: Siêu âm lạnh 30 phút - Điều kiện 2: Siêu âm lạnh 60 phút (siêu

âm 30 phút, nghỉ 10 phút sau đó siêu âm tiếp 30 phút)

- Điều kiện 3: lắc bập bênh trong 2 giờ, sau đó siêu âm 30 phút

- Điều kiện 4: ngâm mẫu qua đêm sau đó siêu âm 30 phút

2.4.2.3 Chuẩn bị mẫu tinh dầu

Lựa chọn dung môi pha mẫu là methanol : nước tỉ lệ 7 : 3 Do CAL là thành phần chính, chiếm tỉ lệ rất cao trong tinh dầu quế, trong khi đó CM và CA chiếm tỉ lệ rất nhỏ [16], [56], nên để phù hợp với việc định lượng cả 3 chất bằng phương pháp HPLC, mẫu thử sẽ được pha thành dung dịch thử (1) có nồng độ cao nhằm định lượng CM, CA và dung dịch thử (2) pha loãng hơn để định lượng CAL

• Dung dịch định lượng CM, CA: Cân chính xác khoảng 0,10 g tinh dầu vào bình định mức 25 mL, Thêm khoảng 20 mL dung môi pha mẫu lắc nhẹ đến khi tinh dầu hòa tan hoàn toàn Thêm dung môi đến vạch, lắc đều được dung dịch thử (1) Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch tiêm sắc ký

• Dung dịch định lượng CAL: Hút 5 ml dung dịch thử (1) và bình định mức 20 ml, thêm dung môi pha mẫu, lắc nhẹ đến khi tinh dầu hòa tan hoàn toàn Thêm dung môi đến vạch, lắc đều được dung dịch thử (2) Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch tiêm sắc ký

2.4.2 Điều kiện sắc ký

Đối tượng nghiên cứu của nghiên cứu này là CAL, CA và CM trên nền mẫu lá và tinh dầu, do đó sử dụng điều kiện sắc ký kế thừa từ nghiên cứu trước [7], có điều chỉnh như sau:

- Cột Phenomenex C18 (4.6 nm x 25 cm; 5 µm) , nhiệt độ cột 25 oC,

16 - Tốc độ 0,7 mL/ phút,

- Bước sóng phát hiện 280nm, - Thể tích tiêm mẫu 10 µL, - Pha động: Kênh A: acid phosphoric 0,05%, Kênh B: acetonitril - Chương trình pha động:

Với phương pháp định lượng: Các phương pháp sử dụng kỹ thuật sắc ký, cần sử dụng các sắc ký đồ đại diện để chứng minh độ đặc hiệu và từng thành phần được tách ra phải được nhận diện đầy đủ Hiệu năng tách của quá trình sắc ký cần được đánh giá một cách thích hợp Đánh giá độ tinh khiết của pic sắc ký có thể hữu ích trong việc chứng tỏ pic sắc ký của chất phân tích không chứa đựng nhiều hơn một thành phần (dựa vào đặc tính của phương pháp phát hiện sử dụng, như phổ UV-VIS với detector PDA) [13], [30]

Cách tiến hành: tiến hành phân tích lần lượt các mẫu: dung dịch chuẩn đơn, chuẩn

hỗn hợp CM, CA, CAL, dung môi pha mẫu, mẫu thử

Yêu cầu:

- Thời gian lưu của pic CM, CA, CAL của dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn

hợp, dung dịch mẫu thử, phải tương đương nhau

- Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu tương ứng

với thời gian lưu của chất chuẩn ở bước sóng 280 nm

- Phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn tương đồng

2.4.3.2 Độ phù hợp hệ thống

Đánh giá độ thích hợp hệ thống dựa trên dựa trên nguyên tắc thiết bị phân tích cũng như các điều kiện bổ trợ cho hoạt động của thiết bị (điện, khí, nước…), điều kiện hoạt động thực nghiệm của thiết bị và mẫu cần phân tích cấu thành một chỉnh thể cần được đánh giá như một chỉnh thể hoàn chỉnh [30]

Độ phù hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic Tính giá trị trung bình và RSD (%) của thời gian lưu và diện tích pic, số đĩa lý thuyết của 6 lần phân tích 1 mẫu hỗn hợp chuẩn

Cách tiến hành: Phân tích lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp CM, CA,

CAL Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi, độ phân giải của từng chất trong từng lần tiêm sắc ký

Yêu cầu:

- RSD % của diện tích pic ≤ 2,0 % và tR ≤ 1,0 %

- Số đĩa lý thuyết > 3000 ; 0,8 < hệ số kéo đuôi < 1,5

Cách tiến hành: Từ các dung dịch chuẩn gốc CM, CA, CAL, pha loãng thành các

dung dịch có nồng độ tăng dần

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn trên, ghi lại sắc ký đồ Xây dựng đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất trong dung dịch chuẩn (Y=aX + b) Xác định hệ số tương quan tuyến tính (R), đánh giá sai số hệ thống của đường chuẩn bằng giá trị Pvalue

Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính (R) nằm trong giới hạn R ≥ 0,999; Pvalue > 0,05

2.4.3.4 Độ chính xác

Thể hiện mức độ gần sát của một chuỗi kết quả đo thực nghiệm thu được từ nhiều lần lấy mẫu phân tích của cùng một mẫu đồng nhất dưới các điều kiện xác định trước

a Độ lặp lại

Độ lặp lại diễn tả độ chụm của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí

nghiệm trong khoảng thời gian ngắn [13] Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết quả

18 của tối thiểu 6 lần định lượng của dung dịch mẫu thử hoặc tối thiểu 9 lần phân tích bao phủ toàn khoảng làm việc của phương pháp

Cách tiến hành: Chuẩn bị 6 dung dịch thử

Ghi lại thời gian lưu, diện tích pic, tính RSD (%) của hàm lượng CM, CA, CAL trong lá quế

Yêu cầu:

– Đối với mẫu lá: • CM, CAL: RSD ≤ 1,9 % • CA: RSD ≤ 2,7 %

- Đối với mẫu tinh dầu: • CAL: RSD ≤ 1,3 % • CM, CA: RSD ≤ 2,7 % [14]

b Độ chính xác trung gian

Quá trình thẩm định cần xác lập được tác động của các biến cố ngẫu nhiên lên độ chụm của phương pháp phân tích Những biến số cần nghiên cứu gồm: ngày phân tích, kiềm nghiệm viên, thiết bị… Không nhất thiết phải nghiên cứu riêng rẽ các biến số này

[30]

Cách tiến hành: Tiến hành tương tự như phần độ lặp lại nhưng khác ngày, khác

người thử nghiệm Ghi lại thời gian lưu, diện tích pic, tính RSD (%) của hàm lượng CM, CA, CAL trong lá quế của 6 kết quả định lượng khác ngày và 12 kết quả định lượng của

độ lặp lại khác ngày

Yêu cầu:

– Đối với mẫu lá: • CM, CAL: RSD ≤ 3,0 % • CA: RSD ≤ 4,0 %

- Đối với mẫu tinh dầu: • CAL: RSD ≤ 2,0 % • CM, CA: RSD ≤ 4,0 % [14]

2.4.3.5 Độ đúng

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một các chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng) [30]

Xác định độ đúng thông qua xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn

Cách tiến hành:

- Mẫu lá quế: Cân chính xác khoảng 0,15 g mẫu lá quế, thêm một lượng dung dịch chuẩn CM, CA, CAL tương ứng với khoảng 3 mức nồng độ thấp - trung bình - cao của khoảng nồng độ định lượng mỗi chất (tổng hàm lượng sau khi thêm nằm trong đường chuẩn)

- Mẫu tinh dầu quế: Độ đúng của CM, CA: Cân chính xác khoảng 0,05 g mẫu tinh dầu quế, thêm một lượng dung dịch chuẩn CM, CA tương ứng với khoảng 3 mức nồng độ thấp - trung bình - cao của khoảng nồng độ định lượng mỗi chất (tổng hàm lượng sau khi thêm nằm trong đường chuẩn)

Độ đúng của CAL: Cân chính xác khoảng 0,013 g mẫu tinh dầu quế, thêm một lượng dung dịch chuẩn CAL tương ứng với khoảng 3 mức nồng độ thấp - trung bình - cao của khoảng nồng độ định lượng mỗi chất (tổng hàm lượng sau khi thêm nằm trong đường chuẩn)

Tiến hành chuẩn bị mẫu thêm chuẩn theo quy trình và điều kiện sắc ký đã đưa ra mỗi nồng độ thực hiện 3 lần

Độ thu hồi = 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ì𝑚 𝑙ạ𝑖

Yêu cầu:

– Đối với mẫu lá: • CM, CAL: Độ thu hồi từ 98,0 - 102,0 %, RSD ≤ 1,9 % • CA: Độ thu hồi từ 97,0 – 103,0 %, RSD ≤ 2,7 %

- Đối với mẫu tinh dầu: • CAL: Độ thu hồi từ 98,0 – 102,0 %, RSD ≤ 1,3 % • CM, CA: Độ thu hồi từ 97,0 – 103,0 %, RSD ≤ 2,7 % [14]

2.4.3.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu mà tại đó chất phân tích có thể phát hiện hoặc định lượng một cách đáng tin cậy

Có một số cách phân tiếp cận để xác định giới hạn định lượng, phụ thuộc vào phương pháp phân tích là phương pháp dụng cụ hay phi dụng cụ :

- Dựa trên tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Xác định thông qua việc so sánh tín hiệu đo được từ các mẫu có nồng độ thấp đã biết của chất phân tích và tín hiệu đo được từ mẫu trắng, từ đó xác lập nồng độ tối thiểu tại đó có thể phát hiện chất phân tích một cách tin cậy Giới hạn phát hiện (LOD) được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tỉ lệ S/N = 3/1 Giới hạn định lượng (LOQ) tỉ lệ S/N=10/1 [23]

- Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường chuẩn

LOD = 10.𝜎

𝑆

Trong đó : σ là độ lệch chuẩn của đáp ứng, S là độ dốc của đường chuẩn [30]

20 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp dựa vào tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu nền (S/N)

Cách xác định: Pha loãng dung dịch mẫu thử đã biết nồng độ Xử lý và pha loãng

đến S/N = 3 và S/N = 10 xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

(LOQ) Phân tích lặp lại 4 lần

- Tính toán FTN (F thực nghiệm) và so sánh với FLT (F lý thuyết):

- Hiệu suất chiết của CM, CA, CAL được tính theo công thức:

- Hàm lượng % của CM, CA, CAL trong lá quế tính theo dược liệu khô kiệt

được tính theo công thức:

B: Độ ẩm mẫu thử (%) được xác định bằng phương pháp cất với dung môi[3] L (%): Hàm lượng CM, CA, CALtương ứng

- Hàm lượng % của CM, CA CAL trong tinh dầu quế được tính theo công thức: