lê quang huy xây dựng phương pháp định lượng quercitrin và quercetin trong dược liệu tang ký sinh scurrula parasitica l bằng phương pháp hplc

Nhóm nghiên cứu tại khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn tại Viện Dược Liệu đã tiến hành chiết xuất và phân lập và xác định cấu trúc được một số hoạt chất nhóm flavonoid có trong Tang ký sinh

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ QUANG HUY

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG QUERCITRIN VÀ QUERCETIN TRONG

DƯỢC LIỆU TANG KÝ SINH SCURRULA PARASITICA L BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ QUANG HUY Mã sinh viên: 1901294

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ FLAVONOID TRONG DƯỢC LIỆU

TANG KÝ SINH SCURRULA PARASITICA L

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:1 TS Nguyễn Lâm Hồng 2 PGS TS Đỗ Thị Hà Nơi thực hiện:

1 Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

2 Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Lâm Hồng và PGS TS Đỗ Thị Hà, những người cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu, luôn quan

tâm, giúp đỡ, động viên khi em gặp khó khăn và đưa ra những lời khuyên giúp em có những hướng đi đúng đắn trong quá trình thực hiện khóa luận này Những kiến thức và góp ý này chắc chắn sẽ là hành trang giúp em vững bước trên chặng đường phía trước

Em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản lý đào tạo, Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy cô giáo đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vũ Thị Diệp và Nghiên cứu viên Phạm Thị Hiền – Viện Dược Liệu cùng các cán bộ công tác tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn là những người đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và các cán bộ tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn – Viện Dược Liệu đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tốt nhất

Em gửi lời cảm ơn đề tài “Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen Tang

ký sinh (Scurrula parasitica L.) làm dược liệu” – đề tài nghiên cứu cấp quốc gia, Viện

Dược Liệu, Bộ Y Tế đã tạo điều kiện và tài trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người luôn ở cạnh ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập vừa qua

Sinh viên

Lê Quang Huy

MỤC LỤC

MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

1.2.1 Tổng quan về quercitrin và quercetin 7

1.2.2 Nghiên cứu về đánh giá chất lượng dược liệu Tang ký sinh 9

1.2.3 Quy trình phân tích quercetin và quercitrin bằng HPLC trên dược liệu 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 13

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 13

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 15

2.3.4 Xác định hàm lượng Quercitrin và quercetin trong dược liệu Tang ký sinh Scurrula parasitca trong các mẫu thu hái được 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Xây dựng quy trình phân tích 22

3.1.1 Xây dựng điều kiện sắc ký 22

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lí mẫu 26

3.1.3 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercitrin và quercetin trong Tang ký sinh bằng HPLC 30

3.2.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 38

3.2.7 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng đồng thời hai hoạt chất quercitrin và quercetin trong Tang ký sinh 38

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 40

3.3 Về quy trình phân tích 40

3.4 Về ứng dụng trong phân tích dược liệu Tang ký sinh 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

(Association of Official Analytical Chemists)

EC50

Nồng độ hiệu quả 50% Effective concentration 50%

(High Performance Liquid Chromatography) IC50

Nồng độ ức chế 50% Half-maximal inhibitory concentration

(Relative Standard Deviation)

(Standard Deviation) SKOV3

CAOV3 OVCAR-3

Tế bào ung thư buồng trứng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất phân lập được từ Tang ký sinh 3

Bảng 1.2 Tổng quan về hai hợp chất quercitrin và quercetin 8

Bảng 1.3 Một số phương pháp định tính, định lượng các hoạt chất trong Tang ký sinh 10

Bảng 1.4 Phương pháp định lượng đồng thời quercitrin và quercetin một số dược liệu 11

Bảng 2.1 Danh sách mẫu Tầm gửi thu được 12

Bảng 2.2 Nồng độ các dung dịch chuẩn quercitrin và quercetin 18

Bảng 3.1 Chương trình khảo sát lựa chọn pha động 22

Bảng 3.2 Thông số sắc ký của các chất phân tích 24

Bảng 3.3 Thông số sắc ký của các chất phân tích 26

Bảng 3.4 Hàm lượng các chất chiết được theo tỉ lệ dung môi – dược liệu 29

Bảng 3.5 Hàm lượng các chất chiết được theo số lần chiết 29

Bảng 3.6 Chương trình gradient dung môi và tốc độ dòng 30

Bảng 3.7 Thời gian lưu (phút) của các chất phân tích 32

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống của phương pháp 32

Bảng 3.9 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic 34

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp 35

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian của phương pháp 36

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 37

Bảng 3.13 LOD và LOQ của phương pháp 38

Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng quercitrin và quercetin trên các mẫu thu được 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh cây Tang ký sinh Scurrula parasitica 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ Tang ký sinh 5

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của quercetin 8

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của quercitrin 8

Hình 3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chương trình sắc ký trên mẫu chuẩn và mẫu thử 23

Hình 3.2 Kết quả khảo sát lựa chọn tốc độ dòng trên mẫu chuẩn 25

Hình 3.3 Hình ảnh quét phổ của các dung dịch chuẩn quercitrin (A) và quercetin (B) 26

Hình 3.4 Kết quả khảo sát chiết quercitrin bằng các dung môi khác nhau 27

Hình 3.5 Kết quả khảo sát chiết quercetin bằng các dung môi khác nhau 27

Hình 3.6 Kết quả khảo sát hàm lượng quercitrin kỹ thuật chiết và thời gian chiết 28

Hình 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng quercetin kỹ thuật chiết và thời gian chiết 28

Hình 3.8 Kết quả chồng phổ định tính của 2 chất (A) Quercitrin; (B) Quercetin giữ dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử 31

Hình 3.9 Đường chuẩn của quercitrin và quercetin 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tang ký sinh hay tầm gửi cây dâu có tên khoa học là Loranthus parasiticus(L.) Merr [1] hay Scurrula parasitica L [3] thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae), là loài sống ký sinh trên cây Dâu tằm (Morus alba L.) [3] Trên thế giới cây phân bố chủ yếu ở một số nước

Châu Á như Ấn độ, Myanmar, Trung Quốc, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philipin [3], các châu lục khác như Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ, New Zealand [38] Tại Việt Nam có thể tìm thấy ở một số tỉnh thành như: Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Đắk Lắk, Đắk Nông Theo y học Trung Quốc, tang ký sinh có tác dụng kích thích sự tạo máu, để điều trị thiếu máu và chảy máu ở phụ nữ mang thai, và sau khi đẻ, đau kinh và tăng sức khỏe người bệnh mãn tính [3], bổ can thận, mạnh gân xương, thông kinh an lạc [1]

Các nghiên cứu về thành phần hóa học từ loài Scurrula parasitica cho biết nhóm

hoạt chất chính là flavonoid, ngoài ra còn có một số nhóm hợp chất khác như hydrocarbon, sesquiterpen, sitosterol… Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V chưa xây dựng phương pháp định lượng cho cả flavonoid toàn phần cũng như một số flavonoid có trong Tang ký sinh Nhóm nghiên cứu tại khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn tại Viện Dược Liệu đã tiến hành chiết xuất và phân lập và xác định cấu trúc được một số hoạt chất nhóm flavonoid có trong Tang ký sinh như Quercitrin, Quercetin, Avicularin, Kaempferol Tại Việt Nam hiện chưa có công bố nghiên cứu định lượng Quercitrin, Quercetin trong dược liệu Tang ký sinh bằng

HPLC Xuất phát từ thực tế trên, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng phương pháp định

lượng một số Flavonoid trong dược liệu Tang ký sinh Scurrula parasitica L bằng

phương pháp HPLC” được thực hiện nghiên cứu với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng 2 flavonoid: Quercitrin và

Quercetin trong dược liệu Tang ký sinh Scurrula parasitica L bằng HPLC

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Quercitrin và Quercetin trong

một số mẫu dược liệu Tang ký sinh thu thập được trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Tang ký sinh

Tang ký sinh hay tầm gửi cây dâu có tên khoa học là Loranthus parasiticus (L.) Merr [1] hay Scurrula parasitica L [3] thuộc họ Tầm gửi (Loranthaceae), sống ký sinh trên cây Dâu tằm (Morus alba L.), họ dâu tằm (Moraceae) [3]

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tang ký sinh là cây nhỏ, thường xanh, ký sinh trên cây dâu tằm nhờ các rễ mút, cành hình trụ, khúc khuỷu, màu xám hay màu nâu đen Lá mọc so le, hình bầu dục, dài 3 – 8 cm, rộng 2 - 2,5cm, gốc thuôn hoặc hơi tròn, đầu tù đôi khi hơi lõm, mép hơi lượn sóng, gân phụ cong, cuống lá ngắn [3]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành chum rất ngắn gần như bình tán, lá bắc nhỏ hình tam giác, hoa màu đỏ hoặc màu hồng tím, đài hình chùy có bánh răng rất nhỏ, tràng hình trụ, hơi phình ở giữa, có lông, nhị 4, chỉ nhị dài hơn bao phấn, bầu ba Quả hình bầu dục, có vết tích của đài tồn tại [3]

Mùa hoa quả: tháng 1 – 3 [3]

Hình 1.1 Hình ảnh cây Tang ký sinh Scurrula parasitica 1.1.2 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng của Tang ký sinh

Tang ký sinh có vùng phân bố tự nhiên phụ thuộc hoàn toàn vào nơi có trồng cây

dâu tằm Ngoài ra có thể tìm thấy loài này ở một số cây chủ khác như Bưởi (Citrus grandis

L.), Trúc đào (Nerium indicum), Chanh (Citrus aurantifolia), Hạt dẻ (Castanea sativa), Hoa

sinh cũng được đã được ghi nhận có ở một số nước Châu Á như Ấn độ, Myanmar, Trung Quốc, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philipin [3], các châu lục khác như Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ, New Zealand [44] Tại Việt Nam có thể tìm thấy ở một số tỉnh thành như: Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Đắk Lắk, Đắk Nông [2]

Cây ưa sáng và ưa ẩm, ra hoa quả nhiều hằng năm Tuy nhiên, ở những vùng trồng dâu tằm rộng lớn cũng hiếm khi gặp tang ký sinh Hạt giống của cây phát tán có lẽ do chim hoặc một số loài động vật nào đó, trong quá trình ăn và tiêu hóa quả chín đã đưa hạt tang ký sinh sang các cây dâu tằm khác Bước đầu hạt phải mắc được vào các kẽ nứt của vỏ hoặc hốc của cây và gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm nhanh, các rễ cây từng bước len lỏi vào trong lớp vỏ cây chủ để hút chất dinh dưỡng nuôi cây Trong trường hợp các cành lá của cây tang ký sinh được thu hái, phần gốc và rễ ký sinh vẫn bám được trên cây chủ và tiếp tục phát triển [3]

Bộ phận dùng của tang ký sinh là toàn bộ phần cây được thu hái quanh năm, phơi hoặc sấy khô [3]

1.1.3 Thành phần hóa học

Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của S parasitica cho thấy sự có mặt của

các nhóm hợp chất như flavonoid, phenol, glycosid, alkaloid và triterpen, acid amin [3], [17], [23], [24]

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng thành phần hóa học của S parasitica phụ thuộc vào cây chủ mà Scurrula parasitica ký sinh, cây chủ sẽ cung cấp một số thành phần đặc trưng

sang cây ký sinh trên chúng thông qua một tương tác đặc trưng của họ Loranthaceae Năm

2019, một nghiên cứu đã xác định được nhóm glycosid tim từ S parasitica và Taxillus chinensis ký sinh trên cây chủ Trúc đào (Nerium indicum), kết quả cho thấy có tổng cộng

29 hợp chất glycosid tim được tìm thấy trong cây ký sinh, trong khi đó trên cây chủ chỉ có 28 hợp chất glycosid tim [33]

Công thức cấu tạo của một số hợp chất được phân lập từ S parasitica được trình bày

Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số hợp chất phân lập từ Tang ký sinh 1.1.4 Tác dụng dược lý

Tác dụng chống oxy hóa là một trong những tác dụng đặc trưng của các hợp chất

phenolic đối với các loài thuộc họ Loranthaceae hay chính với S parasitica Theo nghiên cứu của Moghadamtousi, S parasitica có tổng hàm lượng phenol cao nhất trong 50 dược

liệu được nghiên cứu (theo phương pháp Folin-Ciocalteu) [26]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác đã cho thấy mối tương quan giữa các khả năng chống oxy hóa và nồng độ các hợp chất phenolic [6], [10], [32] Trong đó các hợp chất quercetin, quercitrin cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [3], [16] Giá trị IC50 của quercitrin là 5,00 µg/ml [6]

Nghiên cứu in vitro trên dịch chiết nước từ cành S parasitica chống lại ba dòng tế

bào ung thư buồng trứng là SKOV3, CAOV3 và OVCAR-3 cho thấy tác dụng chống lại tế bào ung thư của dịch chiết trên các tế bào mẫu thử [31]

Trong Y học Trung Quốc, S parasitica được sử dụng như một bài thuốc cổ truyền

trong điều trị sốc gây ra do tâm thần phân liệt Trong đó các coriaria lacton là hoạt chất chính đóng vai trò quan trọng trong điều trị Một nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các

coriaria lacton cho thấy rutin và coriamyrtin có trong S parasitica có tác dụng trong liệu

pháp sốc điện nhằm kiểm soát tâm thần phân liệt [30]

Tang ký sinh dưới dạng lỏng cho chó uống, có tác dụng gây hạ huyết áp trên chó

gây mê với liều 2 g/kg thể trọng, gây giãn mạch ngoại biên trong thí nghiệm in vitro, làm

giảm nhu động ruột và trương lực cơ trơn ruột thỏ cô lập, làm an thần, kéo dài thời gian gây ngủ gây ra bời hexobarbital [3]

Nghiên cứu tác dụng chống lại độc tính trên thận do cisplatin gây ra ở tế bào HEK

293 Kết quả cho thấy rằng cao chiết nước S parasitica có tác dụng trong phục hồi khi tế

bào với tỷ lệ phục hồi tối đa là 43,6% Khả năng sống của tế bào và giá trị EC50 là 3,810 × 10-10 mg/mL [35]

1.1.5 Công năng, chủ trị

Theo y học Trung Quốc, Tang ký sinh có tác dụng kích thích sự tạo máu, để điều trị thiếu máu và chảy máu ở phụ nữ mang thai, và sau khi đẻ, đau kinh và tăng sức khỏe người bệnh mãn tính [3], bổ can thận, mạnh gân xương, thông kinh an lạc [1]

1.2 Tổng quan về nhóm chất flavonoid

Flavonoid là một nhóm lớn của các hợp chất phenol thực vật có cấu trúc cơ bản là diphenylpropan (C6-C3-C6) Là một nhóm chất phổ biến trong thực vật, có thể thường gặp ở nhiều loại hoa quả, rau củ, ngũ cốc, phần rễ, hoa, cành và lá của một số loại dược liệu, [21] Flavonoid cũng là nhóm chất và đóng vai trò tạo nên các nhiều dụng sinh học của Tang ký sinh [21]

Quercetin thuộc nhóm flavonol có thể được tìm thấy phổ biến ở trong nhiều loại rau củ và hoa quả thường ngày như súp lơ, cà chua bi, cải xoăn, hành tây, trà xanh, trà đen, táo, nho, việt quất [20], [21], [27], [29] Tên gọi Quercetin được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1857 bắt nguồn từ Quercetum, theo tiếng latin có nghĩa rừng sồi [22]

Quercitrin hay Quercetin 3-O-a-L-rhamnosid là dẫn xuất của Quercetin và phần đường 3-O-a-L-rhamnosid Có một số nghiên cứu cho thấy Quercitrin được tìm thấy ở Yến mạch (Fagopyrum tataricum) và một số loài thuộc họ sồi như Sồi trắng Bắc Mỹ (Quercus alba) và sồi Anh (Quercus robur) [14], [25]

1.2.1 Tổng quan về quercitrin và quercetin

Nhiều nghiên cứu cho thấy quercitrin và quercetin là các flavonoid chính có trong Tang ký sinh [3], [6], [17], [21] Không chỉ có hàm lượng lớn, hai hợp chất quercitrin và quercetin còn được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học Do đó, hai hợp chất này được lựa chọn là các chất đánh dấu “marker” để đánh giá chất lượng của dược liệu Tang ký sinh

Bảng 1.2 Tổng quan về hai hợp chất quercitrin và quercetin

Tên IUPAC

trihydroxychromen-4-on

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-dihydroxy-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxychromen-4-on

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-Công thức cấu tạo

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của

quercetin Hình 1.4 Công thức cấu tạo của quercitrin

Tính chất lý hóa

- Công thức phân tử: C15H10O7

- pKa: 6,17 - log P: 1,8

- Khối lượng phân tử: 302,24 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy: 316,5ºC [20], [22]

- Độ tan trong nước ở 16 ºC: 60 mg/ml và <1 mg/ml ºC ở 70 ºC, tan tốt trong ether, methanol, tan trong ethanol, aceton pyridin, acid acetic Hầu như không tan trong kiềm và lipid [20]

- Hấp thụ UV cực đại ở bước sóng 255 nm và 371 nm [36]

- Công thức phân tử: C21H20O11

- pKa: 7,17 - log P: 1,3 - Khối lượng phân tử: 448,1 g/mol - Nhiệt độ nóng chảy: 176 - 179ºC [28]

- Tan kém trong nước lạnh và ether, độ tan trong nước ở 16 ºC là 0,064 mg/ml, tan trong ethanol và methanol, hơi tan trong nước nóng [5], [28]

- Hấp thụ UV cực đại ở bước sóng 258 nm và 350 nm [28]

Tác dụng sinh học

- Chống viêm [9], [20], [21], [22], [27]

- Chống oxy hóa [7], [14] - Chống viêm [14]

- Chống oxy hóa [20], [27], [34] - Kháng virus [27]

- Chống ung thư [27]

- Điều hòa miễn dịch [14] - Chống nhiễm khuẩn [8], [14] - Giảm đau, giãn mạch [12], [14]

1.2.2 Nghiên cứu về đánh giá chất lượng dược liệu Tang ký sinh

Hiện nay, Dược Điển Việt Nam V hiện chỉ có phương pháp định tính flavonoid bằng phản ứng cyanidin nhưng chưa thiết lập phương pháp định lượng flavonoid nói riêng cũng như các thành phần khác nói chung về định lượng các hoạt chất có trong dược liệu Tang ký sinh

Trên thế giới, hiện có một số nghiên cứu, bài báo khoa học đã được công bố, nhằm định tính, định lượng các hoạt chất có trong dược liệu Tang ký sinh bằng các phương pháp

khác nhau Một số phương pháp đã được tóm tắt trong bảng 1.3 cho thấy các nghiên cứu

đều sử dụng cột C18, là loại cột phổ biến ở các phòng thí nghiệm Pha động là acetonitril - dung dịch acid acetic loãng, là hỗn hợp pha động thường sử dụng trong sắc ký pha đảo Chất phân tích được chiết bằng dung môi thông dụng, quá trình chiết được tăng cường nhờ siêu âm và ly tâm Hệ thống và thiết bị HPLC thông dụng, phổ biến tại các phòng thí nghiệm của Việt Nam

Bảng 1.3 Một số phương pháp định lượng các hoạt chất trong Tang ký sinh

1 Marker:1-deoxynojiri-mycin

Cây chủ: Dâu tằm Morus alba

Chiết với HCl 0,05M, siêu âm 30 phút, ly tâm lấy phần dịch trong pha loãng

Pha tĩnh: Cột Agilent TC-C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 30oC Pha động: Acetonitril – acid acetic 0,1% (51:49), chạy đẳng dòng Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Bước sóng phát hiện: 254 và 322 nm

[15]

2 Marker:1-deoxynojiri-mycin

Cây chủ: Dâu tằm Morus alba

Chiết với HCl 0,05M, khuấy đều trong 15 giây, siêu âm 15 phút, dẫn xuất hóa với 9-fluorenylmethyl chloroformat, lọc qua màng lọc 0,20 µm

Pha tĩnh: Cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

Pha động: Acetonitril – acid acetic 0,1% (1:1, v/v), chạy đẳng dòng Tốc độ dòng 1,0 ml/phút

Bước sóng phát hiện: 254 nm và 366 nm

[18]

3 Marker: Các dẫn xuất của Digitoxigenin

Cây chủ: Trúc đào Nerium indicum

Mẫu (tỉ lệ cành : lá là 1:2), nghiền và xay thành bột mịn, chiết với ethanol 70%, siêu âm 40 phút, ly tâm lấy phần dịch lọc, phần rắn tiếp tục chiết với ethanol 70% như lần thứ 1, gộp phần dịch lọc, pha loãng, lọc qua màng 0,20 µm

Pha tĩnh: Cột ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 x 100 mm; 1,8 µm), nhiệt độ cột 40oC

Pha động: acid formic 0,1% – acetonitril, chương trình gradient Tốc độ dòng 0,6 ml/phút

[33]

1.2.3 Quy trình phân tích quercetin và quercitrin bằng HPLC trên dược liệu

Trên thế giới, hiện có một số nghiên cứu, bài báo khoa học đã được công bố, nhằm định lượng đồng thời quercitrin và quercetin trong các dược liệu khác nhau Một

số phương pháp đã được tóm tắt trong bảng 1.4:

Bảng 1.4 Phương pháp định lượng đồng thời quercitrin và quercetin một số dược liệu

Tốc độ dòng 2,0 ml/phút Bước sóng phát hiện: 254 nm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu dược liệu Tang ký sinh Mẫu được giám

định tên khoa học là Scurrula parasitica L bởi Trung tâm Tài nguyên Dược liệu – Viện

Dược liệu Danh sách mẫu được trình bày ở bảng 2.1:

Bảng 2.1 Danh sách mẫu Tầm gửi thu được

TT Ký hiệu

phận

Thời điểm thu thập

Dung môi, hóa chất sử dụng: Acetonitril (HPLC), Acid formic (HPLC) của Merck, Methanol, Ethanol loại tinh khiết phân tích (Trung Quốc), Nước RO, khử ion của Viện Dược Liệu

Các dụng cụ gồm: cốc có mỏ 100ml, ống ly tâm 50ml, màng lọc cellulose acetat 0,45 µm; ống đong, cốc có mỏ (Trung Quốc) …

Các thiết bị và dụng cụ đặt tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu

2.2 Nội dung nghiên cứu

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời quercitrin và quercetin trong Tang ký

sinh Scurrula parasitica bao gồm xác định phương pháp xử lí mẫu và điều kiện sắc ký

Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn của AOAC 2016 với các tiêu chí: Độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng, độ lặp lại

Áp dụng phương pháp xây dựng được để xác định hàm lượng quercitrin và quercetin có trong dược liệu Tang ký sinh thu hái được tại một số vùng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Dựa trên công thức cấu tạo, đặc điểm lý hóa của quercitrin và quercetin, các tài liệu tham khảo [11], [19], [34] cũng như các đặc điểm của phương pháp phân tích, tiến hành khảo sát để chọn được điều kiện tối ưu cho việc phân tích đồng thời 2 chất quercitrin và quercetin, đảm bảo các pic thu được có hình dạng cân đối, tách hoàn toàn khỏi nhau và khỏi nền mẫu, thời gian phân tích hợp lí

Lựa chọn cột sắc ký Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp định lượng các flavonoid trong các dược liệu khác nhau [11], [19], [34] và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, lựa chọn cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) để tiến hành khảo sát

Lựa chọn pha động Dựa vào tính chất lý hóa của các chất cần nghiên cứu và tham khảo một số tài liệu, tiến hành khảo sát với pha động là hỗn hợp acetonitril – acid formic 0,1% với tỷ lệ các thành phần khác nhau, chương trình rửa giải đẳng dòng hoặc gradient

Lựa chọn bước sóng phát hiện Quét phổ UV-VIS dung dịch chuẩn đơn của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của chúng, từ đó chọn bước sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích có độ hấp thụ đủ lớn, cho kết quả phân tích có độ chính xác cao

Lựa chọn tốc độ dòng Tiến hành khảo sát với các tốc độ dòng 0,5 – 2,0 ml/phút kết hợp với chương trình gradient tốc độ dòng để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp, đảm bảo phân tách được các chất với thời gian phân tích hợp lý

2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu

Để định lượng đồng thời quercitrin và quercetin cần phải chiết được hoàn toàn 2 chất này và loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu, đồng thời quy trình xử lí mẫu phải đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Quy trình xử lí mẫu gồm các bước sau: - Dược liệu sau khi thu hái về thu được phần lá và cành, rửa sạch loại bỏ đất cát, sấy khô, cắt nhỏ, xay thành bột mịn, rây qua rây số 355

- Xác định hàm ẩm bằng cân phân tích hàm ẩm SCALTEC, yêu cầu độ ẩm của mẫu không quá 13,0%

- Chiết các flavonoid bằng dung môi chiết và kỹ thuật chiết thích hợp - Lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 µm để tiêm sắc ký

Căn cứ vào công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của các hoạt chất cần phân tích và các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát và tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu như sau:

Từ các tài liệu tham khảo thu được kết hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, có các loại dung môi chiết là ethanol methanol, và nước Do đó, với mục tiêu lựa chọn được dung môi chiết tối ưu, tiến hành khảo sát dung môi chiết là methanol, ethanol và nước ở các nồng độ khác nhau

Tiến hành khảo sát dung môi chiết với một số điều kiện sau Dung môi chiết:

- Methanol nồng độ 10, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100% - Ethanol nồng độ 10, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96% - Nước

Khối lượng dược liệu: 0,5 g Thể tích dung môi chiết: 25 ml Nhiệt độ chiết: 80oC

Kỹ thuật chiết: siêu âm trong 45 phút Sau khi chiết, lọc lấy dịch lọc, rửa bã dược liệu bằng dung môi chiết, gộp dịch lọc và dịch rửa vào bình định mức 25 ml, thêm dung môi chiếtvừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành chạy sắc ký dịch lọc theo chương trình phân tích đã chọn

Từ các tài liệu tham khảo thu được kết hợp với điều kiện thực tế phòng thí nghiệm, có 2 kỹ thuật chiết thường được sử dụng là chiết siêu âm và chiết hồi lưu Đồng thời, thời gian chiết là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Với mục tiêu lựa chọn được kỹ thuật chiết tối ưu, tiến hành khảo sát ở 2 kỹ thuật là chiết hồi lưu và chiết siêu âm ở các thời gian khác nhau

Tiến hành khảo sát kỹ thuật chiết và thời gian chiết với một số điều kiện cố định và dung môi chiết như đã trình bày ở mục 2.3.2.1

Kỹ thuật chiết:

- Chiết siêu âm ở các mốc thời gian khác nhau: 15, 30, 45, 60, 90, 120 phút - Chiết hồi lưu ở các mốc thời gian khác nhau: 15, 30, 45, 60, 90, 120 phút Sau khi chiết, lọc lấy dịch lọc, rửa bã dược liệu bằng ethanol 60%, gộp dịch lọc và dịch rửa vào bình định mức 25 ml, thêm ethanol 60%vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành chạy sắc ký dịch lọc theo chương trình phân tích đã chọn

Ngoài yếu tố thời gian và kỹ thuật chiết, số lần chiết và tỉ lệ dung môi – dược liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết và thời gian chuẩn bị mẫu Trong nghiên cứu này tiến hành khảo sát số lần chiết và tỉ lệ dược liệu/dung môi với kỹ thuật đã chọn, tỉ lệ dược liệu/dung môi lần lượt là 0,5 : 10 (kl/tt), 0,5 : 25 (kl/tt) và 0,5 : 50 (kl/tt), chiết trong thời gian chiết đã khảo sát Với mỗi điều kiện, tiến hành lặp lại 3 lần

Số lần chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tiến hành khảo sát số lần chiết với các điều kiện dung môi, kỹ thuật, thời gian chiết và tỉ lệ dung môi – dược liệu đã chọn, lặp lại số lần chiết 1 lần, 2 lần Với mỗi điều kiện tiến hành lặp lại 3 lần

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại theo hướng dẫn của AOAC

Tiến hành: Phân tích lặp lại ít nhất 06 lần theo phương pháp đã xây dựng trên mẫu

chuẩn hỗn hợp quercitrin và quercetin có nồng độ khoảng 0,05 mg/ml Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic của các chất cần phân tích

Cách pha các dung dịch như sau:

- Dung dịch chuẩn gốc quercitrin: cân chính xác 5,00 mg chuẩn quercitrin vào bình

định mức 10 ml hòa tan và định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 500 µg/ml

- Dung dịch chuẩn gốc quercetin: cân chính xác 5,00 mg chuẩn quercetin vào bình

định mức 10 ml hòa tan và định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 500 µg/ml

- Hỗn hợp chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc quercitrin và

1,0 ml dung dịch chuẩn gốc quercetin cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60% Thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ 50 µg/ml

Tiêm 06 lần hỗn hợp chuẩn Ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích pic các pic thu được

Yêu cầu:

Đối với mỗi chất, độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp với thời gian lưu của của các pic quercitrin và quercetin không quá 1,0% và với diện tích pic không quá 2,0%

Tiến hành: Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch mẫu trắng (ethanol 60%), mẫu

chuẩn, mẫu thử Ghi lại sắc ký đồ và các thông số thời gian lưu, diện tích pic của các chất cần phân tích

Tiến hành chuẩn bị các dung dịch như sau:

- Mẫu trắng: dung dịch ethanol 60% - Mẫu chuẩn: Hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc quercitrin và 5,0 ml dung

dịch chuẩn gốc quercetin cho vào bình định mức 100 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón có nút mài,

thêm vào 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Yêu cầu:

Thời gian lưu của quercitrin và quercetin trong mẫu chuẩn, mẫu thử phải tương đương nhau Mẫu trắng không xuất hiện pic ở khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của quercitrin và quercetin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn Nếu xuất hiện pic tương ứng với quercitrin và quercetin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn thì ảnh hưởng của pic không được quá 1,0%

Phổ hấp thụ lấy tại đỉnh pic quercitrin và quercetin trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có phổ trung với phổ lấy tại đỉnh pic quercitrin và quercetin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (Hệ số Match ≥ 0,998)

Tiến hành: Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn (ít nhất 05 dung dịch) có nồng độ các

chất từ Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ và diện tích các pic tại mỗi nồng độ Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ mỗi chất trong dung dịch chuẩn và diện tích pic chất đó thu được trên sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn

Các dung dịch được chuẩn bị như sau:

- Dung dịch chuẩn gốc đơn quercitrin và quercetin: có nồng độ 500 µg/ml, cách pha

như đã trình bày ở mục 2.3.3.1

- Dung dịch chuẩn quercitrin C1: Dung dịch chuẩn gốc đơn quercitrin có nồng độ

500 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercitrin C2: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercitrin

C1 cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercitrin C2 có nồng độ 250 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercitrin C3: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercitrin

C2 cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercitrin C3 có nồng độ 125 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercitrin C4: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercitrin

C3 cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercitrin C4 có nồng độ 64 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercitrin C5: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercitrin

C4 cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercitrin C5 có nồng độ 32 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercitrin C6: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercitrin

C5 cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercitrin C6 có nồng độ 16 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C1: hút chính xác 3,2 ml dung dịch chuẩn gốc quercetin

vào bình định mức 20 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C1 có nồng độ 80 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C2: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C1

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C2 có nồng độ 40 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C3: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C2

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C3 có nồng độ 20 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C4: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C3

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C4 có nồng độ 10 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C5: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C4

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C5 có nồng độ 5,0 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C6: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C5

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C6 có nồng độ 2,5 µg/ml

- Dung dịch chuẩn quercetin C7: hút chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn quercetin C6

cho vào bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn quercetin C7 có nồng độ 1,25 µg/ml

Lọc qua màng lọc 0,45 µm, tiến hành tiêm sắc ký Ghi lại sắc ký đồ và thông số diện tích pic của từng mẫu

Bảng 2.2 Nồng độ các dung dịch chuẩn quercitrin và quercetin

Tiến hành:

- Độ lặp lại trong ngày: Chuẩn bị 06 mẫu thử riêng biệt Cân chính xác khoảng 0,5g

bột dược liệu, cho vào bình nón có nút mài, thêm vào 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích theo phương pháp đã xây dựng, ghi lại sắc ký đồ và diện tích các pic của mỗi mẫu

- Độ chính xác trung gian: Chuẩn bị 06 mẫu thử riêng biệt như độ lặp lại trong ngày

nhưng thực hiện khác ngày, khác kiểm nghiệm viên

Xác định hàm lượng các chất quercitrin và quercetin trong các mẫu thử và RSD (%) của hàm lượng mỗi chất, công thức tính hàm lượng của quercitrin và quercetin được tính theo công thức:

C (µg/ml) =(S − b)

aX (%) =C x 50 x 100

106 x m x (1 − h)

Trong đó: X: Hàm lượng chất phân tích có trong mẫu dược liệu, tính theo lượng dược liệu khô kiệt (%kl/kl)

C: Nồng độ chất phân tích trong dung dịch thử (µg/ml) S: Diện tích pic chất phân tích thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử (mAU.s) a: Hệ số góc của đường chuẩn

b: Hệ số chắn của đường chuẩn m: Khối lượng mẫu thử (g) h: Độ ẩm của mẫu thử

Yêu cầu: Đối với mỗi chất phân tích, RSD (%) hàm lượng trong ngày và khác ngày

phải đạt theo hướng dẫn của AOAC được trình bày ở phụ lục 3.1

Xác định trên các mẫu thêm chuẩn Chuẩn bị 03 loạt mẫu thêm chuẩn bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn quercitrin và quercetin vào các mẫu dược liệu với 3 mức nồng độ 50, 100, 150% Lượng các chất chuẩn thêm vào tại mỗi mức nồng độ được tính toán để đảm bảo tổng lượng chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính đã xây dựng Tại mỗi mức nồng độ, chuẩn bị ít nhất 03 mẫu độc lập

Các mẫu thêm chuẩn được chuẩn bị như sau:

- Dung dịch chuẩn gốc quercitrin: cân chính xác 12,0 mg chuẩn quercitrin cho vào

bình định mức 10 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc quercitrin có nồng độ 1200 µg/ml

- Dung dịch chuẩn gốc quercetin: cân chính xác 1,0 mg chuẩn quercetin cho vào

bình định mức 5 ml Định mức vừa đủ bằng ethanol 60%, lắc đều thu được dung dịch chuẩn gốc quercetin có nồng độ 200 µg/ml

- Mẫu thêm chuẩn 50% (3 mẫu): hút chính xác 1,5 ml dung dịch chuẩn gốc quercitrin

và 0,3 ml dung dịch chuẩn gốc quercetin cho vào bình định mức 25 ml, định mức vừa đủ bằng ethanol 60% Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón có nút mài, thêm vào toàn bộ 25 ml dung môi ethanol 60% đã thêm chuẩn ở trên, đun hồi lưu 30 phút,

để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều

- Mẫu thêm chuẩn 100% (3 mẫu): hút chính xác 3,0 ml dung dịch chuẩn gốc

quercitrin và 0,6 ml dung dịch chuẩn gốc quercetin cho vào bình định mức 25 ml, định mức vừa đủ bằng ethanol 60% Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón có nút mài, thêm vào toàn bộ 25 ml dung môi ethanol 60% đã thêm chuẩn ở trên, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều

- Mẫu thêm chuẩn 150% (3 mẫu): hút chính xác 4,5 ml dung dịch chuẩn gốc

quercitrin và 0,9 ml dung dịch chuẩn gốc quercetin cho vào bình định mức 25 ml, định mức vừa đủ bằng ethanol 60% Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu, cho vào bình nón có nút mài, thêm vào toàn bộ 25 ml dung môi ethanol 60% đã thêm chuẩn ở trên, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều

Lọc các mẫu qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích mẫu theo phương pháp đã xây dựng Xác định hàm lượng các chất quercitrin và quercetin trong các mẫu tự tạo (lượng hoạt chất tìm thấy) Xác định độ đúng (tỷ lệ thu hồi) của từng chất, theo công thức:

R% = Ct+c − Ct

Cc x100% Trong đó:

R%: Độ thu hồi Ct+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu đem chuẩn Ct: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ thêm chuẩn (lý thuyết) Kết quả phải đạt theo hướng dẫn của AOAC

Yêu cầu: Tại mỗi mức nồng độ, tỷ lệ thu hồi và RSD tỷ lệ thu hồi phải đạt theo hướng dẫn của AOAC được trình bày ở phụ lục 3.2

LOQ của phương pháp được xác định đồng thời với khảo sát khoảng tuyến tính Pha loãng dung dịch thử 5, 8, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 1200 lần bằng dung môi pha mẫu để thu được có nồng độ các chất phân tích có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn Phân tích lặp lại 06 lần dung dịch này theo quy trình phân tích

Nồng độ LOQ được xác định là nồng độ thấp nhất của đường chuẩn, đồng thời phải đảm bảo trên dung dịch thử có nồng độ chất phân tích xấp xỉ mức nồng độ này, pic sắc ký thu được có giá trị S/N không dưới 10 và RSD diện tích pic từ 06 lần tiêm lại đạt theo hướng dẫn của AOAC

Từ giá trị LOD, giá trị LOQ được ngoại suy bằng cách nhân mức nồng độ LOD với 3,3

2.3.4 Xác định hàm lượng Quercitrin và quercetin trong dược liệu Tang ký sinh Scurrula parasitca trong các mẫu thu hái được

Áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để định lượng đồng thời hai hoạt chất Quercitrin và quercetin trong một số mẫu Tang ký sinh được thu hái tại các vùng khác nhau của Việt Nam

Hàm lượng của quercitrin và quercetin trong Tang ký sinh được tính dựa vào phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic là nồng độ của các chất phân tích Hàm lượng quercitrin và quercetin được tính theo công thức đã nêu ở mục 2.3.3.4

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng quy trình phân tích

3.1.1 Xây dựng điều kiện sắc ký

Dựa vào tính chất hóa lý của các chất cần phân tích kết hợp với các tài liệu tham khảo được, lựa chọn pha động bao gồm acetonitril và acid formic 0,1%, chương trình

gradient theo 3 chương trình để tiến hành khảo sát ban đầu (bảng 3.1)

Tiến hành tiêm sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp hai chất có nồng độ mỗi chất khoảng 0,05 mg/ml, cột Agilent Eclipse Plus C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), duy trì nhiệt độ cột ở 40oC, khảo sát với 3 chương trình được trình bày ở bảng 3.1:

Bảng 3.1 Chương trình khảo sát lựa chọn pha động

Chương trình dung môi

Tốc độ dòng (ml/phút) Thời gian (phút) Acetonitril (%,

Hình 3.1 Kết quả khảo sát lựa chọn chương trình sắc ký trên mẫu chuẩn và mẫu thử

Cột C18(250 mm x 4,6 mm, 5 µm (A): chương trình 1; (B): chương trình 2; (C): chương trình 3;

(1: pic quercitrin), (2: pic quercetin)

Bảng 3.2 Thông số sắc ký của các chất phân tích

Thời gian lưu (phút) Độ phân giải (Rs)

(yêu cầu >1,5) Số đĩa lý thuyết quercitrin quercetin quercitrin quercetin quercitrin quercetin Chương

Chương trình 2 23,789 33,865 2,219 4,281 103483 141595

Tiến hành khảo sát sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 chất với pha động 2, khảo sát với acid formic ở các nồng độ 0,05; 0,1; 0,2%, chương trình gradient dung môi và tốc độ

dòng như khảo sát ở 3.1.1.2, Kết quả thu được thể hiện trong hình 3.2:

Hình 3.2 Kết quả khảo sát lựa chọn tốc độ dòng trên mẫu chuẩn

D: Pha động 1: acetonitril – acid formic 0,05% E: Pha động 2: acetonitril – acid formic 0,1% F: Pha động 3: acetonitril – acid formic 0,2%

(1: pic quercitrin), (2: pic quercetin)

Bảng 3.3 Thông số sắc ký của các chất phân tích

Thời gian lưu (phút) Độ phân giải (Rs)

(yêu cầu >1,5) Số đĩa lý thuyết quercitrin quercetin quercitrin quercetin quercitrin quercetin Pha động 1 35,713 51,088 2,596 8,049 114177 246988

Thực hiện quét phổ UV của dung dịch chuẩn đơn của 2 chất quercitrin và quercetin có nồng độ các chất khoảng 0,05 mg/ml ở dải bước sóng 200 – 400 nm Kết quả thu được

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lí mẫu

Kết quả khảo sát dung môi chiết được thể hiện ở hình 3.4, 3.5 và phụ lục IV:

05001000150020002500

mAU 0.9992

mAU 0.9939

Hình 3.4 Kết quả khảo sát chiết quercitrin bằng các dung môi khác nhau

Hình 3.5 Kết quả khảo sát chiết quercetin bằng các dung môi khác nhau Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy: - Đối với quercitrin, dung môi ethanol và methanol ở mức 60%cho hiệu suất chiết quercitrin tối ưu nhất Còn đối với quercetin, dung môi ethanol và methanol ở mức 30% lại cho hiệu suất chiết quercetin tối ưu nhất

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

Hàm lượng (%) quercitrin chiết được bằng các dung môi khác nhau

Quercitrin

00.010.020.030.040.050.060.070.080.09

Hàm lượng (%) quercetin chiết được bằng các dung môi khác nhau

Quercetin

- Tuy nhiên, hàm lượng của quercitrin trong mẫu cao hơn nhiều so với quercetin nên lựa chọn dung môi ở mức nồng độ 60% để chiết So với methanol, ethanol có ưu điểm ít độc hại hơn Do đó lựa chọn ethanol 60% làm dung môi chiết để tiến hành các khảo sát tiếp theo

Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết và thời gian chiết thu được thể hiện trong hình 3.6 và hình 3.7:

Hình 3.6 Kết quả khảo sát hàm lượng quercitrin kỹ thuật chiết và thời gian chiết

Hình 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng quercetin kỹ thuật chiết và thời gian chiết

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

SA15SA30SA45SA60SA90 SA120 HL15HL30HL45HL60HL90 HL120

Hàm lượng % quercitrin chiết được theo thời gian

quercitrin

00.0050.010.0150.020.025

SA15 SA30 SA45 SA60 SA90 SA120 HL15HL30HL45HL60HL90 HL120

Hàm lượng % quercetin chiết được theo thời gian

quercetin

Nhận xét:

Kết quả khảo sát cho thấy: Trong cùng 1 thời gian chiết, hiệu suất chiết của cả hai chất quercitrin và quercetin khi sử dụng kỹ thuật hồi lưu cao hơn so với hiệu suất chiết kỹ thuật siêu âm Khi chiết bằng kỹ thuật hồi lưu, trong khoảng thời gian 30 – 45 phút, hiệu suất chiết đạt ổn định, có sự tăng nhưng không đáng kể Do đó để tối ưu thời gian và hiệu suất chiết, lựa chọn kỹ thuật chiết hồi lưu, thời gian chiết 30 phút để tiến hành các khảo sát tiếp theo

Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi – dược liệu được thể hiện trong bảng 3.4:

Bảng 3.4 Hàm lượng các chất chiết được theo tỉ lệ dung môi – dược liệu

Tỉ lệ dung môi – dược

lần lượt là 1,2 lần Kết quả thu được được biểu diễn ở bảng 3.5:

Bảng 3.5 Hàm lượng các chất chiết được theo số lần chiết

có thể thấy sau 2 lần chiết về cơ bản đã đảm bảo chiết kiệt được hai chất cần phân tích từ mẫu Do đó, lựa chọn chiết 2 lần, mỗi lần 25 ml dung môi để xử lí mẫu

3.1.3 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercitrin và quercetin trong Tang ký sinh bằng HPLC

Sau quá trình khảo sát điều kiện sắc ký bằng phương pháp HPLC và điều kiện xử lí mẫu, phương pháp định lượng đồng thời quercitrin và quercetin trong Tang ký sinh được thiết lập như sau:

Điều kiện sắc ký

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu kết nối detector PDA - Cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18, (250 x 4,6 mm, 5 µm) - Nhiệt độ cột 40oC

- Bước sóng phát hiện: 254 nm - Thể tích tiêm: 10 µl

- Pha động: Acetonitril – dung dịch acid formic 0,1%, chương trình gradient

Bảng 3.6 Chương trình gradient dung môi và tốc độ dòng

Thời gian (phút)

Acetonitril (%, tt/tt) Tốc độ dòng

Quy trình xử lí mẫu - Dung dịch chuẩn gốc quercitrin: Dung dịch chuẩn chứa quercitrin và pha trong

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5g bột dược liệu, cho vào bình nón có nút

mài, thêm vào 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Lọc lấy dịch chiết vào bình định mức mức 50 ml, thêm tiếp vào phần bã dược liệu 25 ml dung môi ethanol 60%, đun hồi lưu 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc lấy dịch chiết thêm vào bình định mức có dịch chiết lần 1, thêm dung môi đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm, lấy dịch lọc để tiêm sắc ký