Định lượng loureirin b trong dược liệu huyết giác (dracaena cambodiana pierre ex gagnep) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA DƯỢC BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRONG DƯỢC LIỆU HUYẾT GIÁC (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Đồng Nai – Tháng 08 /2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG KHOA DƯỢC BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRONG DƯỢC LIỆU HUYẾT GIÁC (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Đồng Nai – Tháng 08/2021 i LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo tập thể quý thầy cô trường Đại Học Lạc Hồng nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ em suốt thời gian học tập mái trường Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô PGS giao đề tài, tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo, anh chị kỹ thuật viên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, khoa Dược trường Đại Học Lạc Hồng hỗ trợ giúp đỡ em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn anh Long Quý Huấn, Giám đốc công ty TNHH Đông dược An Triệu hỗ trợ cho em nguồn nguyên liệu để em hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc! Biên Hòa, ngày 06 tháng 08 năm 2021 Sinh viên ii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HUYẾT GIÁC 1.1.1 Phân loại thực vật học 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố, thu hái phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Một số ứng dụng chủ yếu Huyết giác 1.2 TỔNG QUAN VỀ LOUREIRIN B .6 1.2.1 Tính chất loureirin B .7 1.2.2 Tác dụng sinh học loureirin B 1.2.3 Một số quy trình định lượng loureirin B .8 1.3 PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA BOX BEHNKEN .9 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC 10 1.4.1 Ngoài nước 10 1.4.2 Trong nước 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12 2.2 CHẤT CHUẨN, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 12 2.2.1 Chất chuẩn 12 2.2.2 Thiết bị 12 2.2.3 Dung mơi, hóa chất .12 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .13 2.3.1 Định tính dược liệu Huyết giác: 13 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an iii 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng Loureirin B Huyết giác 14 2.3.3 Thẩm định quy trình định lượng Loureirin B Huyết giác 17 2.3.4 Ứng dụng quy trình định lượng loureirin B số nguồn Huyết giác khác 20 CHƯƠNG 3: 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .21 ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU HUYẾT GIÁC 21 3.1.1 Phương pháp hóa học 21 3.1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 21 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRONG HUYẾT GIÁC .22 3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 22 3.2.2 Khảo sát cỡ bột dược liệu Huyết giác 26 3.2.3 Khảo sát phương pháp chiết xuất loureirin B Huyết giác 27 3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRONG HUYẾT GIÁC .33 3.3.1 Tính phù hợp hệ thống 33 3.3.2 Tính đặc hiệu .33 3.3.3 Tính tuyến tính 35 3.3.4 Độ xác 36 3.3.5 Độ .37 3.3.6 Khoảng xác định 38 3.4 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRÊN MỘT SỐ NGUỒN HUYẾT GIÁC KHÁC NHAU 39 3.5 BÀN LUẬN 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 4.1 KẾT LUẬN 42 4.2 ĐỀ NGHỊ .42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số quy trình định lượng loureirin B Bảng 1.2 Ma trận yếu tố mã hóa thí nghiệm Box-Behnken yếu tố .10 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa theo mơ hình Box Behnken 16 Bảng 2.2 Dãy nồng độ khảo sát tính tuyến tính 18 Bảng 2.3 Pha dung dịch khảo sát độ 19 Bảng 3.1 Kết khảo sát điều kiện sắc ký 22 Bảng 3.2 Kết khảo sát điều kiện sắc ký mẫu thử mẫu chuẩn điều kiện .24 Bảng 3.3 Kết khảo sát cỡ bột 26 Bảng 3.4 Kết khảo sát phương pháp chiết xuất 28 Bảng 3.5 Kết tối ưu thông số chiết xuất theo phương pháp Box Behnken 29 Bảng 3.6 Kết thông số chiết xuất với điều kiện dự đoán 32 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống .33 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ đặc hiệu 34 Bảng 3.9 Kết xác định phương trình hồi quy hệ số tuyến tính .35 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ lặp lại 36 Bảng 3.11 Kết xác định độ xác trung gian 37 Bảng 3.12 Kết xác định độ 38 Bảng 3.13 Kết khảo sát hàm lượng loureirin B nguồn Huyết giác .39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ phân loại thực vật học Huyết giác Hình 1.2 Cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.) Hình 1.3 Thành phần hợp chất Huyết giác Hình 1.4 Các hợp chất phenolic Huyết giác Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo loureirin B Hình 1.6 Tác dụng loureirin B tế bào Insulin-1 Hình 1.7 Một khối lập phương bao gồm điểm điểm cạnh .9 Hình 1.8 Ba thiết kế giai thừa 22 lồng vào Hình 2.1 Bột dược liệu Huyết giác từ nguồn Bình Thuận, Hà Nội Trung Quốc 12 Hình 3.1 Quy trình định tính Huyết giác phương pháp hóa học 21 Hình 3.2 Kết định tính Huyết giác phương pháp hóa học 21 Hình 3.3 Quy trình định tính Huyết giác phương pháp sắc ký lớp mỏng 21 Hình 3.4 Quy trình định định tính Huyết giác sắc ký lớp mỏng 22 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn thử điều kiện sắc ký 24 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch thử điều kiện sắc ký 24 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn thử điều kiện sắc ký 25 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch thử điều kiện sắc ký 25 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn thử điều kiện sắc ký 25 Hình 3.10 Sắc ký đồ cỡ bột thô 26 Hình 3.11 Sắc ký đồ cỡ bột nửa thô 26 Hình 3.12 Sắc ký đồ cỡ bột nửa mịn 27 Hình 3.13 Kết phân tích ANOVA 30 Hình 3.14 Kết đánh giá hệ số phương trình hồi quy tuyến tính 30 Hình 3.15 Mơ hình bề mặt đáp ứng 3D yếu tố hàm lượng 31 Hình 3.16 Ảnh hưởng yếu tố hàm lượng (độ tin cậy 95%) 31 Hình 3.17 Các điều kiện tối ưu dự đoán phần mềm MODDE 5.0 32 Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn loureirin B 34 Hình 3.19 Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử 34 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vi Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch mẫu thử thêm chuẩn 34 Hình 3.21 Sắc ký đồ dung mơi pha mẫu 34 Hình 3.22 Phổ UV – Vis biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic loureirin B mẫu chuẩn mẫu thử 34 Hình 3.23 Đường biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic 35 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitril ANOVA As DĐVN V EtOH HPLC MeOH N Number of Theoretical Plate Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode Array Detector Đầu dò đi-ốt quang 10 R Resolution Độ phân giải 11 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 12 T Tailing Factor Hệ số kéo đuôi 13 TB 14 tR Retention time Thời gian lưu 15 UV Ultraviolet Tia tử ngoại Analysis of variance Phân tích phương sai Hệ số kéo Dược điển Việt Nam V Ethanol High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Methanol Trung bình Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam đất nước mệnh danh “rừng vàng biển bạc” với địa hình đa dạng khí hậu thích hợp, góp phần vào đa dạng hệ thực vật Việt Nam Vì Việt Nam ln có nguồn dược liệu vơ phong phú với hàng ngàn lồi thực vật, nấm, động vật khống vật dùng làm thuốc để phòng chữa bệnh Dược liệu nguyên liệu dùng để sản xuất thuốc từ dược liệu, thực phẩm chức mỹ phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Chất lượng nguyên liệu yếu tố quan trọng định chất lượng sản phẩm Mỗi loài dược liệu chứa nhiều hợp chất hữu khác với nhiều tác dụng khác nhau, tùy vào mục đích sử dụng mà ta chọn hay nhiều hợp chất phù hợp Định lượng để xác định hàm lượng hợp chất đặc trưng dược liệu tiêu đánh giá chất lượng dược liệu Các hợp chất khác có tính chất khác nhau, địi hỏi phải có quy trình phân tích khác để đảm bảo tính phù hợp xác phương pháp Huyết giác dược liệu phân bố rộng rãi Việt Nam, vị thuốc sử dụng y học cổ truyền từ lâu đời, có nhiều tác dụng sinh học quan tâm Một số doanh nghiệp Việt Nam nghiên cứu sản xuất thuốc từ dược liệu Huyết giác Và dược liệu đưa vào làm thuốc việc định lượng hoạt chất cần thiết Loureirin B hợp chất đặc trưng thuộc nhóm flavonoid, coi hợp chất có liên quan nhiều đến tác dụng dược lý Huyết giác [5] Định lượng loureirin B dược liệu Huyết giác tiêu quan trọng việc đánh giá chất lượng dược liệu Huyết giác Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, đề tài “Định lượng loureirin B dược liệu Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” thực với mục tiêu cụ thể sau: - Định tính dược liệu Huyết giác phương pháp hóa học sắc ký lớp mỏng - Xây dựng quy trình định lượng loureirin B phương pháp HPLC - Thẩm định quy trình định lượng loureirin B phương pháp HPLC - Ứng dụng định lượng loureirin B mẫu dược liệu Huyết giác khác Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 32 Biểu đồ nồng độ, cho thấy hàm lượng tăng tăng từ 50% đến 80% Nhưng tăng tiếp nồng độ methanol đến 100% lại thấy hàm lượng giảm Điều chứng tỏ, nồng độ 75% nồng độ tối ưu chiết xuất hoạt chất Hình 3.17 Các điều kiện tối ưu dự đoán phần mềm MODDE 5.0 Nhận xét: Các điều kiện tối ưu dự đoán phần mềm MODDE 5.0 sau: Chiết xuất nhiệt độ 50 oC, siêu âm thời gian 45 phút dùng dung môi chiết xuất methanol 75% cho hàm lượng loureirin B cao 0,6077% Lặp lại lần thông số chiết xuất với điều kiện dự đoán Kết thể bảng sau: Bảng 3.6 Kết thông số chiết xuất với điều kiện dự đoán STT Khối lượng mẫu thử (g) 0,7529 0,7578 0,7572 Diện tích pic (mAU*s) 2163,60 2192,70 2185,40 Hàm lượng (%) 0,600 0,605 0,603 Kết xử lý thống kê: n=3 , Xtb = 0,603 %, SD= 0,02; RSD = 0,35% Độ tin cậy= 0,95; Khoảng giới hạn tin cậy: 0,603 ± 0,005% Nhận xét: Giá trị hàm lượng tìm thấy hàm lượng dự đốn khác khơng có ý nghĩa Vì vậy, chọn nhiệt độ 50 oC, siêu âm 45 phút dung môi methanol 75% thông số tối ưu để chiết xuất Huyết giác Như vậy, quy trình xử lý mẫu tiến hành sau: Cân xác khoảng 0,75 g bột thô mẫu thử vào bình nón nút mài 100 ml Thêm xác 25,0 ml methanol 75% đậy nắp, cân xác định khối lượng Siêu âm 45 phút Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 33 50ºC, để nguội, bổ sung lượng methanol 75% Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial Tiến hành thẩm định quy trình định lượng 3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRONG HUYẾT GIÁC 3.3.1 Tính phù hợp hệ thống Tiến hành tiêm lần mẫu chuẩn 100% (80 µg/ml) vào hệ thống ghi nhận sắc ký đồ Kết thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống Thời gian Diện tích Hệ số đối Hệ số dung Số đĩa lý lưu pic xứng lượng thuyết (phút) (mAU.S) (0,8-1,5) (1-8) (≥ 2000) 18,850 23985,000 0,926 6,363 17065 18,842 2406,677 0,926 6,360 16817 18,850 2404,435 0,927 6,363 16869 18,860 2404,274 0,924 6,367 16767 18,866 2406,663 0,925 6,369 16790 18,863 2408,900 0,927 6,368 16795 TB 18,855 2404,908 0,926 6,365 16850,500 RSD(%) 0,05 0,15 0,13 0,06 0,66 STT Nhận xét: Kết cho thấy thời gian lưu, diện tích đỉnh có RSD < 2% - Thời gian lưu: RSD = 0,05% (< 2,0%) - Diện tích pic: RSD = 0,15% (< 2,0%) - Hệ số đối xứng: 0,926 (0,8 - 1,5) - Hệ số dung lượng: 6,365 (1 - 8) - Số đĩa lý thuyết: 16850 (> 2000) Từ cho thấy quy trình đạt tính tương thích hệ thống 3.3.2 Tính đặc hiệu Tiến hành tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn vào hệ thống sắc ký Kết thể bảng 3.8 hình 3.18 - hình 3.22 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 34 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ đặc hiệu Mẫu TR Diện tích (phút) pic As chuẩn Mẫu thử dung N lượng (mAU*s) Mẫu Độ Hệ số Purity Threshold phân giải 18,89 2378,49 0,92 6,38 16786 0,00 999,949 999,000 18,92 2502,35 0,94 6,39 16191 1.97 999,642 990,000 18,86 4876,43 0,92 Mẫu thử thêm chuẩn Nhận xét: - Trên sắc ký đồ dung môi pha mẫu không xuất pic có thời gian lưu trùng với pic loureirin B sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Hình 3.18 Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn Hình 3.19 Sắc ký đồ dung loureirin B dịch mẫu thử Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch mẫu Hình 3.21 Sắc ký đồ dung mơi thử thêm chuẩn pha mẫu Hình 3.22 Phổ UV – Vis biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic loureirin B Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn mẫu chuẩn mẫu thử C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 35 - Trên sắc ký đồ dung dịch mẫu thử có xuất pic có thời gian lưu tương ứng với pic loureirin B sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn - Trên sắc ký đồ dung dịch mẫu thử thêm chuẩn có xuất pic có thời gian lưu tương ứng với pic loureirin B sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn, có diện tích lớn pic loureirin B dung dịch mẫu thử - Pic loureirin B đạt yêu cầu độ tinh khiết pic Như vậy, quy trình đạt yêu cầu tính đặc hiệu 3.3.3 Tính tuyến tính Tiến hành sắc ký dãy mẫu chuẩn 50%, 100%, 150%, 200%, 250% nồng độ định lượng Kết trình bày bảng 3.9 hình 3.23 Bảng 3.9 Kết xác định phương trình hồi quy hệ số tuyến tính STT Nồng độ dung dịch 39,9 79,8 119,7 159,6 199,5 chuẩn (µg/ml) Diện tích pic 1198,719 2376,796 3588,8 4855,337 5873,021 (mAU*s) Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 29,6420x + 30,3985 hệ số tương quan: R² = 0,9990 7000 y = 29.6420x + 30.3985 R² = 0.9990 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 Hình 3.23 Đường biểu diễn tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 29,6420x + 30,3985 Hệ số tương quan: R² = 0,9990 Khảo sát đường biểu diễn diện tích pic theo nồng độ phân tích loureirin B - Độ dốc: a = 29,6420 - Tung độ gốc: b0 = + 30,3985 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 36 Ta có: Significance F = 1,42 x 10-5 < 0,05 nên nồng độ diện tích pic có tương quan tuyến tính với Hệ số a: p-value a = 1,42×10-5 < 𝛼 = 0,05 nên hệ số a có ý nghĩa Hệ số b: p-value b = 0,70 > 𝛼 = 0,05 nên hệ số khơng b có ý nghĩa Vậy phương trình hồi quy có dạng: y = 29,6420x Nhận xét: Với R² = 0,9990 ≥ 0,999 cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic khoảng nồng độ từ 39,9 µg/ml – 199,5 µg/ml theo phương trình hồi quy tuyến tính: y = 29,6420x Quy trình đạt u cầu tính tuyến tính 3.3.4 Độ xác a Độ lặp lại Tiến hành sắc ký mẫu thử chuẩn bị theo quy trình Kết khảo sát độ lặp lại trình bày theo bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết khảo sát độ lặp lại STT Khối lượng Diện tích pic Diện tích pic Hàm lượng mẫu thử (g) chuẩn (mAU.s) thử (mAU.s) (%) 0,7525 2115,80 0,588 0,7532 2167,70 0,601 0,7551 2165,70 0,599 0,7562 2060,30 0,569 0,7549 2117,40 0,586 0,7538 2098,50 0,582 2386,80 Trung bình 0,596 RSD (%) 1,98 Nhận xét: Giá trị RSD % hàm lượng hoạt chất có mẫu thử ≤ 2,0% Vậy quy trình đạt yêu cầu độ lặp lại Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 37 b Độ xác trung gian Hai người phân tích tiến hành sắc ký mẫu thử ngày khác Kết bảng 3.11 Bảng 3.11 Kết xác định độ xác trung gian STT Người phân tích 1: Người phân tích 2: Nguyễn Thị Bạch Lê Trần Thị Thu Hiền Diện Diện tích M cân tích pic Hàm lượng M cân Hàm lượng pic (g) (mAU* (%) (g) (%) (mAU*s) s) 0,7525 2115,80 0,588 0,7534 2159,60 0,599 0,7532 2167,70 0,601 0,7525 2068,60 0,574 0,7551 2165,70 0,599 0,7528 2140,70 0,594 0,7562 2060,30 0,569 0,7529 2163,60 0,600 0,7549 2117,40 0,586 0,7578 2192,70 0,605 0,7538 2098,50 0,582 0,7572 2185,40 0,603 Trung bình: 0,596(%) Trung bình: 0,596 (%) RSD: 1,98% RSD: 1,87% Kết người phân tích Trung bình: 0,592 (%) RSD: 1,99% Nhận xét: - Giá trị RSD (%) kết định lượng người phân tích hai kết phân tích ≤ 2,0 % - Kết định lượng kiểm nghiệm viên khác khơng có ý nghĩa thống kê - (F= 1,60  F crit = 4,96 P-value = 0,23 > 0,05) Quy trình đạt u cầu độ xác trung gian 3.3.5 Độ Tiến hành sắc ký mẫu thử thêm chuẩn Kết trình bày bảng 3.12 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 38 Bảng 3.12 Kết xác định độ Mẫu 80% 100% 120% Thể tích mẫu STT chuẩn (ml) 1,6 Lượng chuẩn thêm vào (mg/ml) 0,06384 Diện tích pic thử thêm chuẩn (mAU*s) 4015,20 Lượng chuẩn tìm lại Tỷ lệ thu hồi (%) 0,0629 98,58 1,6 0,06384 4059,60 0,0644 100,92 1,6 0,06384 4038,10 0,0637 99,79 TB 99,76 RSD 0,96 2,0 0,0798 4549,80 0,0806 101,36 2,0 0,0798 4539,40 0,0803 100,92 2,0 0,0798 4478,00 0,0782 98,34 TB 100,21 RSD 1,33 2,4 0,09576 5001,10 0,0955 100,29 2,4 0,09576 4973,40 0,0946 99,32 2,4 0,09576 5029,60 0,0965 101,29 TB 100,30 RSD 0,80 Tỷ lệ hồi phục trung bình (%) 100,09 Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi nằm khoảng 98,34% đến 101,36% giá trị RSD ≤ 2% Vậy quy trình định lượng đạt yêu cầu độ 3.3.6 Khoảng xác định Từ kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác độ đúng, suy quy trình định lượng Loureirin B Huyết giác có khoảng xác định 63,84 – 95,76 µg/ml (tương ứng 80 - 120 % nồng độ định lượng) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 39 Nhận xét chung: Kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng Loureirin B Huyết giác phương pháp HPLC với đầu dò PAD đạt tất yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính – khoảng xác định, độ xác, độ xác trung gian độ 3.4 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG LOUREIRIN B TRÊN MỘT SỐ NGUỒN HUYẾT GIÁC KHÁC NHAU Cảm quan: Về mặt cảm quan, màu sắc mẫu Huyết giác khác Huyết giác Hà Nội có màu đỏ đậm Huyết giác Bình Thuận Huyết giác Trung Quốc Về thể chất, Huyết giác Hà Nội cứng nên tiến hành xay có nhiều khó khăn, phải thực chặt nhỏ xay nhiều lần, Huyết giác Bình Thuận dễ xay hơn, Huyết giác Trung Quốc dễ xay Tiến hành sắc ký mẫu Huyết giác theo quy trình định lượng thẩm định kết bảng 3.13 sau: Bảng 3.13 Kết khảo sát hàm lượng loureirin B nguồn Huyết giác Nguồn Bình Thuận Hà Nội Trung Quốc M cân Diện tích Hàm lượng (g) pic (mAU*s) Loureirin B (%) 0,7549 3835,0 0,586 0,7538 3771,5 0,582 0,7522 3929,1 1,095 0,7550 3961,9 1,100 0,7563 1287,6 0,357 0,7525 1292,0 0,360 TB RSD (%) 0,584 0,60 1,098 0,32 0,359 0,48 Nhận xét: Hàm lượng loureirin B Huyết giác Hà Nội cao Huyết giác Bình Thuận Trung Quốc Hàm lượng loureirin B nguồn có khác biệt rõ ràng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 40 3.5 BÀN LUẬN Xây dựng thẩm định quy trình định lượng Loureirin B Huyết giác phương pháp HPLC Khảo sát điều kiện sắc ký Thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến hiệu tách pic sắc ký Với điều kiện sắc ký ban đầu theo DĐVN V sau: Pha động sử dụng dung dịch acid acetic 1% - acetonitril (61:39), thể tích tiêm 20 µl nồng độ mẫu khoảng 0,16 mg/ml Nhưng qua trình khảo sát, kết cho thấy điều kiện không đạt yêu cầu thông số: hệ số dung lượng (thời gian lưu dài) hệ số tách Do có điều chỉnh lại tỷ lệ pha động, tăng dần tỷ lệ ACN để rút ngắn thời gian lưu giảm lượng mẫu để tách pic Đồng thời có thay đổi dung dịch acid acetic từ 1% sang acid acetic 0,1% có nhiều nghiên cứu nước ngồi [24] sử dụng nồng độ acid acetic 0,1% nên đề tài tiến hành khảo sát nồng độ Kết hai nồng độ cho thông số sắc ký giống Nên đề tài lựa chọn dung dịch acid acetic 0,1% nồng độ acid thấp ảnh hưởng đến cột sắc ký Kết tỷ lệ dung dịch acid acetic 0,1% - acetonitril (58:42) thể tích tiêm 10 µl, nồng độ mẫu 80 µg/ml cho kết đạt yêu cầu Khảo sát cỡ bột Các cỡ bột khảo sát là: bột thô, bột nửa thơ bột mịn Do cỡ bột có ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất, nên thực khảo sát cỡ bột để so sánh cỡ bột cho hàm lượng loureirin B cao Qua kết khảo sát cho thấy cỡ bột cho kết giống thông số sắc ký Hàm lượng cỡ bột thô nửa mịn cho kết giống nhau, cỡ bột nửa thô cho kết thấp Nên đề tài lựa chọn cỡ bột thô xay bột thơ nhanh bột nửa thô bột nửa mịn Khi xử lý mẫu nhiệt độ 40-50 C kết hợp siêu âm, bột thô sinh tạp chất ảnh hưởng kết sắc ký Và lọc dễ lọc không sinh cặn dược liệu gây nghẹt lọc Khảo sát thông số chiết xuất Các biện pháp xử lý mẫu sử dụng tài liệu đun sôi hồi lưu siêu âm Nên đề tài tiến hành xử lý dược liệu Huyết giác hai phương pháp để so sánh kết hàm lượng phương pháp cao đạt thông số sắc ký Kết khảo sát Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 41 cho thấy phương pháp siêu âm đun hồi lưu có hàm lượng giống Nhưng phương pháp siêu âm dễ thực không cần lắp đặt dụng cụ phức tạp đơn giản hơn, dễ kiểm sốt thơng số q trình (như nhiệt độ, thời gian) Nên đề tài chọn siêu âm phương pháp xử lý mẫu thử Dung môi chiết xuất, thời gian chiết nhiệt độ chiết xuất cần tối ưu để mang lại kết hàm lượng cao Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp Box Behnken, cho thông số tối ưu cho trình định lượng Theo biểu đồ thu sau chạy phần mềm Modde5.0 Nhiệt độ tăng hàm lượng tăng tăng nhiệt độ đến 50 C, đề tài không tiếp tục tăng thêm nhiệt độ nhiệt độ cao dung mơi bay Hoạt chất loureirin B tan methanol mà dung môi bay nhiều không đủ dung môi chiết xuất hoạt chất Và siêu âm có gia nhiệt thời gian khảo sát dài từ 15-45 phút dễ sinh tạp chất ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất Nên phần mềm lựa chọn điều kiện tối ưu, đề tài thực lặp lại lần chọn cho thấy kết giống với kết phần mềm Modde 5.0 dự đốn Vì vậy, thơng số chiết xuất tối ưu lựa chọn là: dung môi chiết xuất methanol 75%, thời gian 45 phút, nhiệt độ 50C Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 42 CHƯƠNG 4: 4.1 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Sau thực đề tài đạt kết sau: Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu hóa thơng số chiết xuất Điều kiện sắc ký: − Ct C18 (5 àm; 250 ì 4,6 mm) Pha động: Dung dịch acid acetic 0,1% - acetonitril (58 : 42) − Detector quang phổ tử ngoại đặt bước sóng 276 nm − Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút − Nhiệt độ cột: 30 oC − Thể tích tiêm: 10 µl Cỡ bột: bột thô Thông số chiết xuất: − Xử lý mẫu phương pháp siêu âm − Dung môi chiết xuất mẫu: MeOH 75% − Thời gian siêu âm: 45 phút − Nhiệt độ siêu âm: 50 oC Xây dựng thẩm định quy trình định lượng loureirin B Huyết giác phương pháp HPLC Quy trình đạt tính đặc hiệu, tính phù hợp hệ thống (RSD = 0,15%), độ lặp lại (RSD = 1,98%), độ xác trung gian (RSD người phân tích = 1,99%), độ với tỷ lệ hồi phục: 98,34% đến 101,36%, phương trình hồi quy có dạng: y = 29,6420x khoảng xác định 63,84 – 95,76 µg/ml Ứng dụng quy trình định lượng loureirin B số nguồn Huyết giác khác Hàm lượng loureirin B cao Huyết giác Hà Nội (1,098 mg/ml) so với Bình Thuận (0,584 mg/ml) Trung Quốc thấp (0,359 mg/ml) 4.2 ĐỀ NGHỊ Vì thời gian thực hạn chế, nên tiếp tục đề xuất số kiến nghị sau: − Xây dựng quy trình định lượng đồng thời loureirin A B Huyết giác − Xây dựng quy trình chiết loureirin B Huyết giác làm chuẩn đối chiếu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Bộ Y Tế (2019), Dược Điển Việt Nam V, Nhà Xuất Bản Y Học, tr 1201-1202; 13921393 Dương Thị Ly Hương, Trần Văn Thanh, Trần Mạnh Dũng (2005) Nghiên cứu sơ thành phần hoá học tác dụng giảm đau Huyết giác, Tạp chí Dược liệu; 6; tr.179-183 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, tr 59-60 Ngô Vân Thu, Trần Hùng ( 2011), Dược liệu học, Tập 1, Nhà xuất Y học Tr.353- 383 Nguyễn Lê Thanh Tuyền, Đồn Trí Hạnh Dung, Ngơ Thị Ngọc Yến, Trần Thị Vân Anh, Đỗ Thị Hồng Tươi (2018), Khảo sát độc tính cấp tác động chống đơng máu huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep., Dracaenaceae), Tạp chí dược học, tập 58 số 6 Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Thị Kim Danh, Lữ Thị Kim Chi (2016), Kiểm nghiệm 116 dược liệu phương pháp thực vật học phương pháp sắc ký lớp mỏng, Nhà xuất Y học, Tr 7-10 Nguyễn Thị Lan Phương , Nguyễn Tuấn Anh, Nguyễn Thị Phương Mai, Trần Việt Hùng (2018), Nghiên cứu khảo nghiệm xây dựng chuyên luận Huyết giác cao khô huyết giác Dược điển Việt Nam xuất lần thứ năm, Tạp chí dược học, tập 58 số Tuệ Tĩnh Thiền Sư, “Tuyển tập 3033 thuốc đông y”, Y học cổ truyền Tuệ Tĩnh, Tr.529-530 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh Acta Cryst, (2006), “1-(4-Hydroxyphenyl)-3-(2,4,6-trimethoxyphenyl)propan-1- one”, E62, pp 0469-0472 10 Haiyan Zhao, Zilin Chen (2013), An HPLC-ESI-MS method for analysis of loureirin A and B in dragon's blood and application in pharmacokinetics and tissue distribution in rats, Fitoterapia, Vol 86, pp 149-158 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 44 11 Hui Wang, Guanyong Luo, Jiayuan Wang, Haiyan Shen, Ying Luo, Haofu Dai and Wenli Mei (2014), Flavonoids Produced by Tissue Culture of Dracaena cambodiana, Natural Product Communications, Vol 9, pp 39-40 12 I.C.H Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp 1-13 13 Jin-Long Cui , Chun-Lan Wang , Shun-Xing Guo, Pei-Gen Xiao , Meng-Liang Wang (2013), Stimulation of dragon's blood accumulation in Dracaena cambodiana via fungal inoculation, Fitoterapia, Vol 87, pp 31-36 14 Sha, Y.; Zhang, Y.; Cao, J.; Qian, K.; Niu, B.; Chen, Q (2017), Insulin Secretion with the Effect of Loureirin B through KATP Channel–Dependent Pathway, Preprints , pp 2-13 15 Shujuan Shi, Quianru Zhao, Caihua Ke, Siru Long, Feng Zhang, Xu Zhang, Yi Li, Xinquiao Liu, Hongzhen Hu, Shijin Yin (2021), Loureirin B Exerts its Immunosuppressive Effects by Inhibiting STIM1/Orai1 and K V 1.3 Channels, Frontiers in Pharmacol , Vol 12, pp 5-9 16 The plant List, (2010), “Dracaena cambodiana” 17 Xiaoshuang Chen, Gaofeng Li, Shangfang Ma, Xujia Hu (2015), “A Rapid Centrifugation-Assisted Solid-Phase Extraction and Liquid Chromatography Method for Determination of Loureirin A and Loureirin B of Dragon's Blood Capsules in Rat Plasma and Urine After Oral Administration” , J Chromatogr Sci, Vol 53(6), pp 979-985 18 Xiaozhi Bai (2015), “Loureirin B inhibits fibroblast proliferation and extracellular matrix deposition in hypertrophic scar via TGF-β/Smad pathway”, Exp Dermatol, Vol 24(5), pp 355-360 19 Xueliang Sun, Ke Wen, Zhizhong Xu, Zongqi He, Bensheng Wu, Xiao Yang & Xiaopeng Wang (2020),“ Effect of Loureirin B on Crohn’s disease rat model induced by TNBS via IL-6/STAT3/NF-kB signaling pathway”, Chinese Medicine, Vol15(2), pp 282- 295 20 Xu-jia Hu, Xiao-xiaoWang , Mou-sheng Liu , Zhi-gang Tai and Gao-feng Li (2014), Quantitative evaluation of Loureirin A and Loureirin B in Dragon’s blood capsules Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 45 from different manufacturers by HPLC, Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, Vol 6, pp 2243-2248 21 Yijie Sha Yuelin Zhang (2017) , “Loureirin B promotes insulin secretion through inhibition of KATP channel and influx of intracellular calcium”, J Cell Biochem, vol 119(2), pp 2012-2021 22 Ying Luo , Hui Wang , Xuerong Xu , Wenli Mei , Haofu Da ( 2010) Antioxidant Phenolic Compounds of Dracaena Cambodiana, Molecules, Vol 15, pp 8904-8914 23 Yuhao Liu , Chao Wang, Gang Wang and etc (2019), Loureirin B suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and ovariectomized osteoporosis via attenuating NFATc1 and ROS activities, Theranostics, Vol 16, pp 4648-4662 24 Yushi zhang,Yongzhi, Bo Chen, Yulin Deng, Yujuan Li (2011), Simultaneous quantification of loureirin A and loureirin B in rat urine, feces, and bile by HPLCMS/MS method and its application to excretion study, Anal Bioanal Chem; Vol 400(4), pp.1181-1187 25 Zaw Min Thu, Sann Myint Oo, Thinn Myat Nwe, Hnin Thanda Aung, Chabaco Armijos, Faiq H S Hussain and Giovanni Vidari (2020), Flavonoids and Stilbenoids of the Genera Dracaena and Sansevieria: Structures and Bioactivities, Molecule, Volum 25, Issue 11, 2608 pp 3-5 26 Zaw Min Thu, Sann Myint Oo, Thinn Myat Nwe, Hnin Thanda Aung, Chabaco Armijos, Faiq H S Hussain and Giovanni Vidari (2021), “Structures and Bioactivities of Steroidal Saponins Isolated from the Genera Dracaena and Sansevieria”, Molecule, Volum 26, Issue 7, pp.1916 27 https://www.caymanchem.com/pdfs/27454.pdf (02/08/2021) 28 https://vi.wikiqube.net/wiki/Box%E2%80%93Behnken_design(26/07/2021) 29 http://xdulieu.com/thiet-ke-thi-nghiem/tn5-be-mat-dap-ung/md3-phuong-phap- thiet-ke-Box-Behnken.html (26/07/2021) 30 https://journals.sagepub.com/doi/pdf/10.1177/1934578X1400900113(25/07/2021) 31 https://cmjournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13020-019-0282-5 (20/07/2021) 32 https://pdfslide.net/documents/hdsd-phan-mem-modde-50.html (02/08/2021) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn