Thông tin tài liệu
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC === === 664 N TT NGHIP Đề tài: nh lng mt số chất dinh dƣỡng nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst) nuôi cấy môi trƣờng lỏng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) GV hướng dẫn : PGS.TS.Trần Đình Thắng SV thực : Trần Thị Hậu Lớp : 50K - Công nghệ thực phẩm MSSV : 0952040401 Vinh, 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Trần Thị Hậu Khóa : 50 MSV : 0952040401 Ngành : Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài: Định lƣợng số chất dinh dƣỡng có nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst) nuôi môi trƣờng lỏng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cán hƣớng dẫn : PGs.Ts Trần Đình Thắng Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2012 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 2012 : Ngày năm 2012 Cán hƣớng dẫn Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng (Ký, ghi rõ họ tên) tháng năm 2012 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trần Thị Hậu Msv: 0952040401 Khóa: 50 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGs.Ts.Trần Đình Thắng Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trần Thị Hậu Msv: 0952040401 Khóa: 50 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm Cán hƣớng dẫn: PGs.Ts.Trần Đình Thắng Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………… …………………………………… Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Đồ án đƣợc thực phịng thí nghiệm Vi sinh, phịng thí nghiệm Hóa thực phẩm Trung tâm Phân tích - Chuyển giao Công nghệ Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Vinh Xin chân thành cảm ơn: PGS.TS Trần Đình Thắng hết lịng hướng dẫn động viên tơi suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Các thầy cô khoa Hóa học cán hƣớng dẫn thí nghiệm phịng Hóa thực phẩm, phịng Vi sinh, Trung tâm Phân tích - Chuyển giao Cơng nghệ thực phẩm Mơi trƣờng Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Các bạn phịng thí nghiệm Hóa thực phẩm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ hạn tới gia đình, ngƣời thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập làm đồ án tốt nghiệp Vinh, tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực hiên Trần Thị Hậu C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC HÌNH iv DANH MỤC CÁC BẢNG v MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài .1 Đối tƣợng nghiên cứu .1 Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm 1.1.1 Khái quát nấm .2 1.1.2 Hình thái học sợi nấm 1.1.2.1 Hình thái sợi nấm 1.1.2.2 Hình thái thể 1.1.3 Các giai đoạn phát triển nấm .3 1.1.4 Đặc điểm biến dưỡng nấm 1.1.5 Điều kiện sinh trưởng nấm 1.1.5.1 Chất dinh dưỡng .4 1.1.5.2 Ảnh hưởng yếu tố vật lý lên sinh trưởng hệ sợi nấm 1.2 Nấm linh chi 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Đặc điểm nấm linh chi .6 1.2.3 Phân bố sinh thái 1.2.4 Tính vị cơng 1.2.5 Thành phần hóa học hoạt chất sinh học nấm linh chi 10 1.3 Tổng quan axit amin .13 1.4 Tổng quan vitamin 14 1.4.1 Vitamin C .15 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1.4.2 Vitamin E 16 1.5 Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao(HPLC) .16 1.5.1 Cơ sở lý thuyết 17 1.5.2 Nguyên tắc trình sắc kí cột 17 1.5.3 Phân loại 18 1.5.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 18 1.5.5 Các đại lƣợng đặc trƣng hệ thống HPLC 22 1.5.6 Cách đo HPLC 22 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 23 2.1 Vật liệu thí nghiệm 23 2.1.1 Giống 23 2.1.2 Môi trƣờng giữ giống .23 2.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy thạch 23 2.1.4 Môi trƣờng nhân sinh khối .23 2.1.5 Dụng cụ 24 2.1.6 Hóa chất sử dụng 24 2.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 25 2.2.1 Định danh nấm linh chi thu hái đƣợc bào tử dƣới kính hiển vi .25 2.2.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống .26 2.2.3 Tốc độ phát triển hệ sợi nấm môi trƣờng thạch 26 2.2.4 Tốc độ phất triển hệ sợi nấm môi trƣờng lỏng 26 2.2.5 Xác định hàm lƣợng axit amin nấm 27 2.2.5.1 Chuẩn bị hóa chất phân tích 27 2.2.5.2 Nguyên tắc 27 2.2.5.3 Xây dựng đƣờng chuẩn 29 2.2.5.4 Xác định hàm lƣợng axit amin tự mẫu nấm 29 2.2.5.5 Xác định hàm lƣợng axit amin sau thủy phân mẫu nấm 29 2.2.5.6 Điều kiện chạy sắc ký 30 2.2.6 Xác định hàm lƣợng vitamin E nấm .32 2.2.6.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 32 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2.6.2 Xác định hàm lƣợng vitamin E mẫu nấm 34 2.2.6.3 Điều kiện sắc ký 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng vitamin C nấm .34 2.2.7.1 Xây dựng đƣờng chuẩn 34 2.2.7.2 Xác định hàm lƣợng vitamin C mẫu nấm 34 2.2.7.3 Điều kiện chạy sắc ký 34 2.2.8 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phƣơng pháp 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Quan sát cấu trúc bào tử nấm 36 3.2 Tốc độ phát triển nấm môi trƣờng .36 3.2.1 Tốc độ phát triển nấm môi trƣờng thạch 37 3.2.1 Tốc độ phát triển nấm môi trƣờng lỏng 37 3.3 Axit amin 38 3.3.1 Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ…38 3.3.2 Sắc đồ hỗn hợp axit amin tự mẫu nấm .44 3.3.3 Sắc đồ hỗn hợp axit amin thủy phân mẫu nấm .45 3.3.4 Xử lý kết 45 3.4 Vitamin C 48 3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn vitamin C 48 3.4.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C 51 3.4.3 Sắc đồ mẫu thử vitamin C 52 3.5 Vitamin E 53 3.5.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn vitamin E 53 3.5.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E 55 3.5.3 Sắc đồ mẫu thử vitamin E .58 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vịng đời nấm .3 Hình 1.2 Quả thể nấm linh chi Hình 1.3 Chu trình phát triển nấm linh chi Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 19 Hình 2.1 Nấm linh chi mọc tự nhiên 23 Hình 3.1 Hình thái thể nấm linh chi (Ganoderma lucidum) .36 Hình 3.2 Cấu trúc bào tử nấm linh chi (Ganoderma lucidum) 36 Hình 3.3 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol 38 Hình 3.4 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25pmol 39 Hình 3.5 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 100pmol 39 Hình 3.6 Sắc đồ hỗn hợp axit amin tự mẫu nấm .45 Hình 3.7 Sắc đồ hỗn hợp axit amin thủy phân mẫu nấm .45 Hình 3.8 Đƣờng chuẩn biểu thị mơi quan hệ diện tích peak thu đƣợc nồng độ chuẩn vitamin C 49 Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 5ppm 51 Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 10ppm .51 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 20ppm .52 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 50ppm .52 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu thử vitamin C mẫu nấm .53 Hình 3.14 Đƣờng chuẩn biểu thị mơi quan hệ diện tích peak thu đƣợc nồng độ chuẩn vitamin E 54 Hình 3.15 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 4ppm .56 Hình 3.16 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 10ppm .56 Hình 3.17 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 20ppm .57 Hình 3.18 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 40ppm .57 Hình 3.19 Sắc đồ mẫu thử vitamin E mẫu nấm .58 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ axit aspatic 40 Bảng 3.2 Giá trị LOD LOQ chuẩn axit amin aspatic 43 Bảng 3.3 Giá trị LOD LOQ chuẩn 17 axit amin 44 Bảng 3.4 Đổi đơn vị 46 Bảng 3.5 Hàm lƣợng axit amin tự mẫu nấm .47 Bảng 3.6 Hàm lƣợng axit amin thủy phân mẫu nấm .48 Bảng 3.7 Diện tích peak vitamin C tƣơng ứng với nồng độ chuẩn 49 Bảng 3.8 Giá trị LOD LOQ chuẩn vitamin C 50 Bảng 3.9 Hàm lƣợng vitamin C mẫu nấm .50 Bảng 3.10 Diện tích peak vitamin E tƣơng ứng với nồng độ chuẩn 53 Bảng 3.11 Giá trị LOD LOQ chuẩn vitamin E 55 Bảng 3.12 Hàm lƣợng vitamin E mẫu nấm 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Ta có hàm lƣợng axit amin thủy phân 1g mẫu nấm nhƣ sau: Bảng 3.6 Hàm lƣợng axit amin thủy phân mẫu nấm Thứ tự Axit amin Co(pmol) Asp KPH Glu 46,42287 Ser 0,00000 His 0,00000 Gly 3,48722 Thr 32,38409 Ala 33,40363 Arg 22,69090 Try 5,20564 10 Cys-SS-Cys 29,53352 11 Val 15,07065 12 Met 4,22947 13 Phe - 14 Ile 23,19549 15 Leu 14,93184 16 Lys 21,92158 160,0275 17 Pro 39,91690 229,5222 C(µg/g) KPH 341,2080 13,0770 192,6853 148,6462 197,4108 47,1110 178,6778 88,1634 31,5096 151,9303 KPH 97,8036 3.4 Vitamin C 3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn vitamin C Dãy chuẩn vitamin C đƣợc khảo sát có nồng độ nhƣ sau: 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50 ppm Phân tích chuẩn nói xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.7 Diện tích peak vitamin C tƣơng ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ Diện tích pic Lần Lần Lần 78,05327 78,14250 77,98865 10 160,60375 160,63390 160,64068 chuẩn 20 346,72051 346,86193 346,76569 50 898,75709 898,87325 898,91066 m b R2 18,325 - 18,319 0,9999 Sử dụng chƣơng trình Microsoft Excel để xây dựng đƣờng chuẩn, ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng vitamin C nhƣ sau: Phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = 18,325x - 18,319 x nồng độ, y diện tích pic Hệ số hồi quy tuyến tính R2 = 0,9999 1000 y = 18.325x - 18.319 R2 = 0.9999 900 800 700 area 600 Series1 500 Linear (Series1) 400 300 200 100 0 10 20 30 40 50 60 amount:(ppm) Hình 3.9 Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích peak thu đƣợc nồng độ chuẩn vitamin 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Giá trị LOD LOQ phƣơng pháp qua lần đo nồng độ khác 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm ta đƣơc kết bảng sau : Bảng 3.8 Giá trị LOD LOQ chuẩn vitamin C Ghi : LOD = * Sy m Giá trị Chuẩn vitamin C(ppm) LOD 0,0102 LOQ 0,0340 LOQ = 10 * LOD m : hệ số góc phƣơng trình hồi quy Độ lệch chuẩn Sy : Sy = ( Xi Xtb )2 Xtb = n 1 Xi n Qua bảng số liệu ta thấy phƣơng pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lƣợng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát đƣợc hàm lƣợng vitamin C dƣới dạng vết có mẫu phân tích Từ giá trị diện tích peak đo đƣợc ta tính đƣợc hàm lƣợng vitamin C (Co ppm) Hàm lƣợng vitamin C (mg/l) có mẫu nấm theo cơng thức sau: C= Trong đó: C0 V f m C nồng độ viatmin C có mẫu tính mg/kg Co nồng độ vitamin C mẫu từ đƣờng chuẩn, tính theo mg/l V thể tích bình định mức (ml) m khối lƣợng mẫu cân (g) f hệ số pha lỗng Ta có hàm lƣợng vitamin C 10g mẫu nấm nhƣ sau: Bảng 3.9 Hàm lƣợng vitamin C mẫu nấm Mẫu nấm Diện tích pic Co(mg/l) C(mg/kg) 01 2138,20581 120,92207 302,305175 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.4.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 5ppm Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 10ppm 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.11 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 20ppm Hình 3.12 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C nồng độ 50ppm 3.4.3 Sắc đồ mẫu thử vitamin C 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.13 Sắc đồ mẫu thử vitamin C mẫu nấm 3.5 Vitamin E 3.5.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn vitamin E Dãy chuẩn vitamin E đƣợc khảo sát có nồng độ nhƣ sau: 4ppm; 10ppm; 20 ppm, 40ppm Phân tích chuẩn nói xác định phƣơng trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic Bảng 3.10 Diện tích peak vitamin E tƣơng ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ Diện tích pic Lần Lần Lần 130,69550 130,58432 130,69908 10 420,45960 420,53052 420,45872 chuẩn 20 955,86340 955,70453 40 1924,53967 1924,68963 1924,53846 m b R2 49,99 - 66,92 0,9996 955,86503 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Sử dụng chƣơng trình Microsoft Excel để xây dựng đƣờng chuẩn, ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng vitamin E nhƣ sau: Phƣơng trình hồi quy đƣờng chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m = 49,99 b = - 66,92 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0,9996 2500 y = 49.99x - 66.92 R2 = 0.9996 2000 Area 1500 1000 500 0 10 20 30 40 50 Amount (ppm) Hình 3.14 Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu đƣợc nồng độ chuẩn vitamin E Giá trị LOD LOQ phƣơng pháp qua lần đo nồng độ khác 4ppm, 10ppm, 20ppm, 40ppm ta đƣơc kết bảng sau : 54 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.11 Giá trị LOD LOQ chuẩn vitamin E Giá trị Chuẩn vitamin E(ppm) LOD 0,0043 LOQ 0,0143 Từ giá trị diện tích peak đo đƣợc ta tính đƣợc hàm lƣợng vitamin E (ppm) Sau ta tính hàm lƣợng vitamin E (mg/kg) có mẫu nấm theo công thức sau: C= C0 V f m Trong đó: C nồng độ vitamin E có mẫu tính mg/kg Co nồng độ vitamin E mẫu từ đƣờng chuẩn, tính theo mg/l V thể tích bình định mức (ml) m khối lƣợng mẫu cân (g) f hệ số pha lỗng Ta có hàm lƣợng vitamin E 15g mẫu nấm nhƣ sau: Bảng 3.12 Hàm lƣợng vitamin E mẫu nấm Mẫu Diện tích peak Co(mg/l) C(mg/kg) 01 4487,16992 92,49783 61,66522 3.5.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.15 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 4ppm Hình 3.16 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 10ppm 56 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.17 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 20ppm Hình 3.18 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E nồng độ 40ppm 57 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.5.3 Sắc đồ mẫu thử xác định vitamin E Hình 3.19 Sắc đồ mẫu thử vitamin E mẫu nấm 58 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau hồn thành khóa luận, tơi thu đƣợc kết sau: - Đã định danh sơ nấm linh chi (Ganoderma lucidum) Karst bào tử - Xác định quy trình ni cấy nấm mơi trƣờng thạch lỏng - Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lƣợng axit amin, vitamin C vitamin E + Đã xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn + Đã xác định đƣợc giới hạn phát giới hạn xác định - Trong mẫu nấm (Ganoderma lucidum) xác định hàm lƣợng axit amin nhƣ sau: + Tổng hàm lƣợng axit amin tự 1g mẫu C= 1014,37135µg/g + Tổng hàm lƣợng axit amin thủy phân 1g mẫu C = 1877,7727µg/g - Trong 1g mẫu nấm (Ganoderma lucidum) khơng thủy phân hàm lƣợng axit tyrosine C = 265,17743 µg/g cao tất axit amin phát đƣợc - Trong 1g mẫu nấm thủy phân hàm lƣợng axit glutamic C = 341,2080 µg/g cao - Trong mẫu nấm (Ganoderma lucidum) có hàm lƣợng vitamin C vitamin E: + Hàm lƣợng vitamin C: C = 302,305175mg/kg + Hàm lƣợng vitamin E: C= 61,66522mg/kg - Kết có độ tin cậy cao, độ nhạy tốt nên sử dụng quy trình để định lƣợng axit amin, vitamin phƣơng pháp HPLC mẫu nấm khác 4.2 Kiến nghị Kết thu đƣợc luận văn góp phần đánh giá hàm lƣợng số loại axit amin vitamin thực phẩm Do thời gian không cho phép nên tiến hành nuôi trồng môi trƣờng rắn lỏng khác nhau, khơng thể tiến hành phân tích hàm lƣợng axit amin, vitamin C, E theo phƣơng pháp phân tích khác nhƣ khơng thể tiến hành phân tích mẫu khô 59 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Trong trình chuẩn bị xử lý mẫu hàm lƣợng axit amin bị tổn thất nhiều, đặc biệt bị bay Còn hàm lƣợng vitamin dễ bị hao hụt dƣới tác dụng ánh sáng, nhiệt độ cao Muốn đƣợc khảo sát thêm điều kiện nhằm tối ƣu hóa phƣơng pháp nhƣ: môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu (nồng độ, pH, thành phần dinh dƣỡng môi trƣờng), nồng độ axit thủy phân, nhiệt độ thủy phân, …Mong muốn đƣợc tiếp tục nghiên cứu đánh giá thành phần axit amin, vitamin nhiều loại nấm linh chi khác để khẳng định đƣợc giá trị loại nấm dƣợc liệu Tơi hy vọng quy trình phân tích đƣợc áp dụng để phân tích hàm lƣợng axit amin, vitamin thực phẩm khác thị trƣờng 60 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Báo Nông nghiệp (ngày 27/04/2004) – Công nghệ nuôi trồng nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), (Theo Cơ sở Khoa học & Công nghệ nuôi trồng - NXB Hà Nội 2002) Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng số ngƣời khác 2004 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Phạm Thị Trân Châu – Nguyễn Thị Hiền – Phùng Gia Tƣờng, 2000 Thực hành sinh hóa học Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thi Sơn, Zanl Fderico (2000) Nấm ăn – sở khoa học công nghệ nuôi trồng, Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Lân Dũng ( 2002), Công nghệ nuôi trồng nấm – Tập 1, Nhà xuất Nông nghiệp Huỳnh Thị Lệ Duyên, 1999 Đề tài: “Thử nghiệm khả kháng khuẩn cao Linh chi Ganoderma lucidum chủng Staphylococcus aureus – Vibrio cholerae mô hình bệnh lý Mus Musculus Var.Albino” Tiểu luận tốt nghiệp, khoa sinh học, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp HCM Trần Hùng, 2004 Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại dọc Y Dƣợc TP.HCM Nguyễn Minh Khang, 2005 Đề tài “Trồng nấm linh chi đen” Khóa luận tốt nghiệp khoa Cơng nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp HCM 10 Trần Văn Mão, 2004 Sử dụng vi sinh vật có ích – Tập 1: Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông Nghiệp 11 Lê Xuân Thám (1996), Nấm linh chi – dược liệu quý Việt Nam Nhà xuất mũi Cà Mau 12 Lê Xuân Thám (1996), Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hấp thu khoáng 61 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Ngày đăng: 21/08/2023, 00:44
Xem thêm:
