ninh quang nhã xây dựng phương pháp định tính định lượng acid protocatechuic trong dược liệu cốt toái bổ drynaria bonii h christ thu tại việt nam

22 3.1.3 Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ..... Nghiên cứu “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid pr

LIỆU CỐT TOÁI BỔ (DRYNARIA BONII

H CHRIST) THU TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

LIỆU CỐT TOÁI BỔ (DRYNARIA BONII

H CHRIST) THU TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Mai Hương – Giảng viên Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược Hà Nội, TS Nguyễn Thị Hà Ly – Khoa Hóa phân tích và tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tận tình chỉ bảo,

giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin được bày tỏ lòng kýnh trọng và biết ơn sâu sắc đối với TS Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Dược

Hà Nội đã tận tình giải đáp thắc mắc, đưa ra những lời khuyên bổ ích và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho em những kiến thức và kỹ năng trong thời gian em theo học dưới mái trường

Em xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị nghiên cứu viên tại Khoa Hóa phân tích và tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã đồng hành cùng em trong suốt thời gian làm thực nghiệm

Cuối cùng, lời cảm ơn thân thương nhất em muốn gửi đến gia đình, bạn bè Những người đã luôn động viên và âm thầm giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 5 năm 2024

Sinh viên

Ninh Quang Nhã

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC BẢNG

1.3 Tình hình nghiên cứu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) tại Việt Nam 12

1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.1 Nguyên liệu 15

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp định tính bằng TLC 16

2.2.2 Nghiên cứu phương pháp định lượng 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 21

3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính 21

3.1.1 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 21

3.1.2 Thẩm định phương pháp định tính 22

3.1.3 Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ 25

3.2 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng 26

3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 26

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn tiến hành nghiên cứu 29

3.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tên tiếng Việt 2D-LC Two-Dimensional Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hai chiều

AP Acid protocatechuic Acid protocatechuic

ASE Accelerated Solvent Extraction Chiết xuất bằng dung

môi tăng tốc

CEC Capillary Electrochromatography Điện sắc ký mao quản

CZE Capillary Zone Electrophoresis Điện di mao quản vùng

DAD Diode array detector Detector mảng đi-ốt

ECD Electrochemical Detector Detector điện hóa

LLE Liquid-Liquid Extraction Chiết lỏng lỏng

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

MAE Microwave-Assisted Extraction Chiết có hỗ trợ vi sóng

MAEE Microwave-Assisted Enzymatic Extraction Chiết bằng enzym có hỗ

trợ vi sóng

MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography Sắc ký điện động Mixen

MS Mass spectrometry Khối phổ

NP Acid diphenylboric – 2 – aminoethyl ester/

SDE Simultaneous Distillation Extraction Chưng cất và chiết xuất

đồng thời

SFE Supercritical Fluid Extraction Chiết bằng chất lỏng siêu

tới hạn

SPE Solid-Phase Extraction Chiết pha rắn

SPME Solid-Phase Microextraction Vi chiết pha rắn

TLC Thin-Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng

UAE Ultrasound-Assisted Extraction Chiết có hỗ trợ siêu âm

UAEE Ultrasound-Assisted Enzymatic Extraction Chiết bằng enzym có hỗ

trợ siêu âm

UMAE Ultrasound/Microwave-Assisted Extraction Chiết có hỗ trợ siêu

âm/vi sóng

UV - VIS Ultra violet - Visible

Vùng ánh sáng tử ngoại –

nhìn thấy

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cây Cốt toái bổ - Drynaria bonii H Christ……… ……….2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của AP……….4

Hình 1.3 Sắc ký đồ D fortinei và D bonii…… ………13

Hình 2.1 Dược liệu Cốt toái bổ (Drynaria bonii) dùng trong nghiên cứu………….15

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát các hệ dung môi pha động……… 21

Hình 3.2 Sắc ký đồ các mẫu được xử lý theo quy trình trong mục 2.1.1……… 22

Hình 3.7 Sắc ký đồ các mẫu dược liệu Cốt toái bổ ……… 26

Hình 3.8 Phổ UV – VIS của chất chuẩn AP……… 26

Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải 28

Hình 3.10 Đường chuẩn AP… ………30

Hình 3.11 Kết quả đánh giá tính chọn lọc của phương pháp ………34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích AP bằng sắc ký lớp mỏng………6

Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích AP bằng HPLC………9

Bảng 3.1 Đánh giá LOD phương pháp định tính……….25

Bảng 3 2 Các chương trình gradient khảo sát……….…27

Bảng 3.3 Các thông số sắc ký của pic AP ứng với các điều kiện khảo sát………….29

Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AP…… ……….…30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết……… 31

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết……… ………….32

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung môi chiết và số lần chiết……….……….33

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống……….………35

Bảng 3.9 LOD và LOQ của AP……….……….35

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp….……… 36

Bảng 3 11 Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp……… 37

Bảng 3 12 Hàm lượng AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ………38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên đang dần trở thành một mối quan tâm lớn đối với con người Với kinh nghiệm dân gian có từ ngàn đời, ông cha ta đã để lại một kho tàng quý báu về các vị thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, góp phần làm phong phú thêm cho nền y học nước nhà Tuy nhiên, kiểm soát chất lượng dược liệu hiện nay đang gặp nhiều khó khăn do dược liệu thường có nền mẫu phức tạp, quy trình xử lý mất nhiều thời gian hay khan hiếm chất chuẩn,…[1] Do vậy công tác tiêu chuẩn hóa dược liệu đang được đẩy mạnh và là một hướng nghiên cứu cần được đầu tư toàn diện

Đã từ lâu, Cốt toái bổ được nhắc đến như là một vị thuốc có công năng bổ can thận, mạnh gân cốt, được sử dụng trong các trường hợp gan thận yếu, đau nhức xương khớp [2, 4] Dược điển Việt Nam V (2018) đã có chuyên luận về Cốt toái bổ, quy định

hai loài được sử dụng làm thuốc là Drynaria fortunei và Drynaria bonii [7] Thực tế

ngày nay cả hai loài nay đang bị khai thác quá mức, đe dọa đến số lượng loài và đã được đưa vào danh mục sách đỏ Việt Nam [3] Để ngăn chặn tình trạng số lượng loài đang khan hiếm và chất lượng dược liệu khai thác ngoài tự nhiên ngày cảng giảm, việc bảo tồn và nhân giống Cốt toái bổ đang dần được quan tâm [49] Tuy nhiên, trồng và phát triển dược liệu luôn phải gắn với công tác đảm bảo chất lượng Dược điển Trung Quốc

2020 [15] và Dược điển Hồng Kông 2018 [9] đã có chuyên luận về loài D fortunei bao gồm cả các chỉ tiêu định tính, định lượng Đối với loài D bonii, chưa có nghiên cứu nào

về xác định và định lượng hoạt chất trong dược liệu này Một số nghiên cứu về thành

phần hóa học của D bonii cho thấy dược liệu này chứa thành phần chính là acid

protocatechuic (AP) [37] AP đã được chứng minh với vai trò bảo vệ xương khớp, chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn [22, 23, 24, 26, 41], đồng thời AP đã được chọn làm chất đánh dấu và yêu cầu định đính, định lượng trong một số chuyên luận của Dược điển

[9, 15, 26-29] Vì thế có thể coi AP là chất đánh dấu cho loài D bonii, quyết định chất

lượng của dược liệu này Nghiên cứu “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng

acid protocatechuic trong dược liệu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) thu tại Việt

Nam” được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng AP trong dược liệu

Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ)

2 Ứng dụng phương pháp định tính, định lượng đã xây dựng để xác nhận sự có

mặt của AP và hàm lượng AP trong các mẫu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) thu

tại Việt Nam

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ)

1.1.1 Về vị trí phân loại

Cốt toái bổ có tên khoa học là Drynaria bonii H Christ, thuộc họ Dương xỉ

(Polypodiaceae) hay còn được gọi dưới các tên Tắc kè đá, Ráng bay, Hộc quyết, Hầu khương, Hồ tôn khương, Thân khương, Tổ phượng, Tổ rồng, Tổ diều, Co tạng tó, Co in

tó [7] 1.1.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố

Cây Cốt toái bổ mọc bám thành mảng trên các hốc đá, trên thân cây gỗ ở rửng kýn thường xanh ẩm Cây sống lâu năm, có thân rễ mọc bò,dày, mọng nước, có lông dạng vảy cứng màu vàng nâu, vảy hình ngọn giáo Có 2 loại lá: loại lá bất thụ là lá ở gốc có tác dụng hứng mùn, hình thận hay hình trái xoan, không cuống màu nâu, mép nguyên lượn sóng; loại lá hữu thụ - sinh sản có cuống dài 10 – 20 cm, phiến lá dài 25 - 40 cm, rộng 15- 20cm màu lục sẫm, chẻ lông chim thành 7- 9 thùy hình trái xoan – ngọn giáo, mép uốn lượn Các túi bào tử rất nhỏ, xếp hai hàng giữa gân phụ mặt duới lá, bào

tử vàng nhạt, hình trái xoan [4] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây Cốt toái bổ - Drynaria bonii H Christ

Tại Việt Nam, D bonii phân bố rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao

Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,… qua các tỉnh Tây Nguyên tới Đồng Nai, Kiên Giang (Phú Quốc) Loài này còn được tìm thấy ở Trung Quốc và Lào [2, 4]

Cốt toái bổ sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng chậm, phát tán nhờ gió và nước mưa Mùa có sinh sản tháng 5 đến tháng 8 [2]

[4]

Đoạn thân rễ tương đối thẳng, ít phân nhánh, dài 5 cm đến 17 cm, rộng 0,6 cm đến 1 cm Lông dạng vẩy màu vàng nâu dễ rụng, để lộ thân rễ màu vàng nâu hoặc nâu nhạt Chất dai Mặt cắt màu vàng [2, 4]

1.1.4 Thành phần hóa học

Trong cây Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ), thành phần hóa học chính bao

gồm các phenolic, các terpenoid, saponin Ngoài ra còn có steroid, tanin, đường, vitamin,…[8, 30, 32, 36-38] [30, 32, 36-38, 8]

Các phenolic là thành phần quan trọng trong Cốt toái bổ, bao gồm: acid protocatechuic (PA), protocatechualdehyd, chrysophanol, nobiletin, isoliquiritigenin, rutin, nicotiflorin, linocaffein, kaempferol, drynaether A, 4'-hydroxy-7-methoxyflavan,…[37, 38]

Các terpenoid được phân lập từ Cốt toái bổ, bao gồm: ol, triphyllol,…[8, 32].[32, 8]

24-metylencycloartan-3β-Nghiên cứu về hàm lượng flavonoid tổng số và hàm lượng saponin tổng số của

loài Drynaria bonii thu tại Lạng Sơn cho thấy: hàm lượng flavonoid tổng số trong mẫu

nghiên cứu là 0,60±0,03% và hàm lượng saponin tổng số đạt 3,71±0,06% [30]

1.1.5 Tác dụng theo Y học cổ truyền

Theo Y học cổ truyền, Cốt toái bổ có vị đắng, tính ôn và không độc, quy vào hai kinh can và thận Dược liệu có khả năng bổ thận, trị đau xương, hành huyết khứ ứ, làm thuốc hòa hoãn, sát trùng đỡ đau Dùng chữa dập xương, đau xương, bong gân, sai khớp, ù tai, răng đau, thận hư Những người âm hư, huyết hư đều không dùng được [4]

Dùng uống trong hay đắp ngoài Liều dùng hàng ngày là 6 đến 12g, dùng ngoài không có liều lượng Có thể dùng dưới hình thức thuốc sắc hay ngâm rượu, hoặc giã đắp lên vết thương [4]

1.1.6 Tác dụng dược lý

Trong nghiên cứu năm 2020, Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự đã nghiên cứu tác

dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất đã phân lập được từ thân rễ D bonii trên tế bào

MG63 Kết quả chỉ ra rằng các hợp chất 24-methylen-cycloartan-3β-ol, triphyllol và AP

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của AP

Tên khoa học được biết đến của acid protocatechuic (PA) là acid dihydroxybenzoic AP có công thức phân tử là C7H6O4 và khối lượng phân tử là 154,12 g/mol [50]

3,4-Ở điều kiện thường, AP là chất rắn màu trắng, bị biến màu khi tiếp xúc với không khí Nhiệt độ nóng chảy là 221oC Tan trong nước, methanol, ethanol, ether Độ tan trong nước là 1,8g/L ở 14oC và 271g/L ở 80oC Hệ số phân bố dầu nước logP = 0,84 [50]

Trong cấu trúc phân tử AP có nhóm chức -OH phenol và nhóm chức carboxylic nên AP thể hiện tính acid Các giá trị pKa của acid là 4,48; 8,83; 12,6 [50]

1.2.2 Tác dụng dược lý

1.2.2.1 Tác dụng bảo vệ xương

Nghiên cứu của Phạm Thị Nhật Trịnh cho thấy AP kých thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63 là 7,68% tương ứng ở nồng độ 100 μg/ml [36] Xi-yao Li và cộng sự [41] cho thấy AP ức chế sự biệt hóa tế bào xương và kích thích quá trình tự chết theo chương trình ở các tế bào xương trưởng thành

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa

AP dễ bị oxy hóa thành dạng quinon Tính chất hóa học này thể hiện tiềm năng chống oxy hóa của hợp chất này Jun Liu và cộng sự [23] đã chế tạo màng Chitosan gắn AP Kết quả của họ cho thấy đây là một loại màng tiềm năng để chống oxy hóa cho thực phẩm

5

1.2.2.3 Tác dụng chống viêm

Suresh R Naik và cộng sự [22] thí nghiệm trên chuột nhắt và cho thấy kết quả giảm đau, kháng viêm đáng kể của AP Kết quả này hứa hẹn một loại thuốc giảm đau, kháng viêm mới đầy tiềm năng như AP sẽ được đưa vào sử dụng trong tương lai

1.2.2.4 Tác dụng kháng khuấn

Nghiên cứu của Mei-chin Yin và cộng sự [24] cho thấy khả năng kháng

Staphylococcus aureus kháng methicillin, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumanni của AP

1.2.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu áp dụng trong việc phân tích AP

AP chứa nhóm hydroxy và carboxylic nên nó tương đối phân cực và hòa tan được vào trong nước Tuy nhiên, nước mặc dù là dung môi rẻ tiền và an toàn nhưng nó không phải là dung môi phù hợp nhất để chiết AP nói riêng và các hợp chất phenolic nói chung ra khỏi nền mẫu thực vật Hỗn hợp của nước với các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, aceton, acetonitril hay DMSO ở các tỷ lệ khác nhau [25, 31, 44] được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi do khả năng hòa tan tốt cũng như có đặc tính lý học phù hợp với các kĩ thuật chiết xuất hiện có trong phòng thí nghiệm Các biến số như pH, nhiệt độ, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ giữa khối lượng mẫu – thể tích dung môi cũng đóng vai trò rất quan trọng đến hiệu quả của quá trình chiết [25]

Có rất nhiều kĩ thuật chiết xuất khác nhau đã được sử dụng để giải phóng AP ra khỏi nền mẫu Ngành công nghiệp chiết xuất trên thế giới đã phát triển các kĩ thuật hiện đại như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE), chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm/vi sóng (UMAE), Chiết xuất enzyme có sự hỗ trợ của siêu âm (UAEE), chiết xuất enzyme có hỗ trợ vi sóng (MAEE), chiết xuất bằng dung môi tăng tốc (ASE), chiết với chất lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết xuất với nước cận tới hạn (SCWE), chiết xuất với áp xuất thủy tĩnh cao (HHPE), chiết xuất với sự có mặt của Cyclodextrin, [31, 44] Tuy vậy, lựa chọn kĩ thuật chiết xuất nào cũng cần phải xem xét đến tính khả thi khi áp dụng vào phòng thí nghiệm đang vận hành, tính sẵn có của thiết bị hay dung môi Nhìn chung, ở quy mô phòng thí nghiệm, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, chiết soxhlet là phổ biến hơn cả Dược điển Trung Quốc 2020 sử dụng phương pháp

chiết siêu âm để định lượng AP trong Cibotium barometz [15] Katarzyna Szewczyk và

cộng sự đã so sánh các phương pháp như chiết soxhlet, chiết siêu âm, chiết bằng dung môi tăng tốc để lựa chọn phương pháp chiết phù hợp nhất trong việc phân tích AP và

các acid phenolic khác có trong các loài Impatien [35] Kết quả là phương pháp chiết

siêu âm được lựa chọn

6

Do tính phức tạp của nền mẫu, các chất hữu cơ khác trong thực vật có thể gây ra sự ảnh hưởng lớn đối với quá trình phân tích AP Bước làm sạch nền mẫu trong một số trường hợp là cần thiết trước khi phân tích bằng HPLC hay GC [42, 43] Ngoài ra, bước làm sạch này có thể giúp làm giàu mẫu, tăng độ nhạy của phương pháp phân tích và rất thích hợp cho các phân tích vết hoặc siêu vết Mặc dù vậy, việc phân tích sắc ký (LC hay GC), nếu chương trình sắc ký là đủ tốt để tách AP ra khỏi các chất khác, đạt độ phân giải mong muốn thì có thể bỏ qua bước này Ngoài ra các kĩ thuật sắc ký mới nổi hiện nay như sắc ký cột song song hay sắc ký hai chiều có thể giải quyết được toán này [39] Chiết lỏng – lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) là hai phương pháp làm sạch mẫu được sử dụng nhiều nhất [25, 31] Ngoài LLE hay SPE còn một số phương pháp khác như chưng cất và chiết xuất đồng thời (SDE) [34], vi chiết pha rắn (SPME) [16],

1.2.4 Các phương pháp phân tích AP

1.2.4.1 Phương pháp sắc ký a Định tính AP trong dược liệu bằng TLC

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kĩ thuật phân tích nhanh, trực quan, được áp dụng rộng rãi trong phân tích định tính, đặc biệt là đối với dược liệu Trong hầu hết các chuyên luận về dược liệu của Dược điển Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông hay Đài Loan,… đều sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính

Bảng 1.1 Một số phương pháp định tính AP trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng Đối tượng

Định tính

Cibotium barometz, sử

dụng AP làm chất đối chiếu

2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Silicagel G - Pha động: Chloroform – Ethyl acetat – Methanol – Acid acetic (12:2:1:0,8)

- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 2% - Kali ferricyanid 1% (1:1)

- Quan sát dưới ánh sáng thường

[15]

Định tính

Cibotium barometz, sử

dụng AP và aldehyd

protocatechuic

2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô cắn, hòa tan cắn bằng dung dịch acid chlohydric 22,4%,

- Pha tĩnh: HPTLC silica gel F254 (2-10 µm)

- Pha động: n-Hexan - Ethyl acetat -

Acid acetic băng (5:5:0,1)

[9]

7

làm chất đối chiếu

sau đó chiết lỏng - lỏng với diethyl ether, lấy lớp diethyl ether

- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid (2,5gam hòa tan trong 50mL ethanol

- Quan sát dưới ánh sáng thường Định tính

Cibotium barometz, sử

dụng AP và aldehyd

protocatechuic làm chất đối chiếu

2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Silicagel F254 - Pha động: Chloroform – Ethyl acetat – Toluen – Acid formic (5:6:3:1)

- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 5% trong ethanol

- Quan sát dưới ánh sáng thường

[26]

Định tính

Cibotium barometz, sử

dụng dược liệu chuẩn và AP

làm chất đối chiếu

2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Silicagel F254 - Pha động: Toluen – Dichloromethan – Ethyl acetat – Acid formic (3:5:6:1)

- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 5% trong ethanol

- Quan sát dưới ánh sáng thường

[26]

Định tính

Litchi chinensis, sử

dụng dược liệu chuẩn và AP làm chất đối chiếu

1g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Silicagel F254 - Pha động: Toluen – Dichloromethan – Ethyl acetat – Acid formic (3:5:6:1)

- Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm

[27]

Định tính

Organium vulgare, sử

dụng dược liệu chuẩn và AP làm chất đối chiếu

1g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha tĩnh: Silicagel F254 - Pha động: Dichloromethan – Aceton – Acid formic (15:3:2) - Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm và 365nm

[28]

Định tính

Prinsepia

1g bột dược liệu được chiết siêu âm - Pha tĩnh: Silicagel F254 [29]

8

uniflora, sử

dụng dược liệu chuẩn và AP làm chất đối chiếu

với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký

- Pha động: n-Hexan – Ethyl acetat –

Acid formic (5:5:0,2) - Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm

Nghiên cứu dấu vân tay sắc ký của hai

loài Drynaria fortunei và

Drynaria baronii, sử dụng AP làm chất đối chiếu

1g bột dược liệu được chiết nóng bằng methanol, dịch chiết được cô đến cắn, hòa tan cắn bằng nước, sau đó chiết lỏng lỏng bằng ethyl acetat, lấy lớp ethyl acetat

- Pha tĩnh: Silicagel 60 F 254 (Merck)

- Pha động: ethyl acetate – acid acetic băng – acid formic – nước (100:11:11:26)

- Dẫn xuất hóa: thuốc thử NP - Quan sát dưới ánh sáng UV 366nm

[40]

Từ các tài liệu về định tính AP trong dược liệu bằng TLC, có thể thấy phương pháp chiết được sử dụng chủ yếu là chiết siêu âm với MeOH, thời gian chiết trung bình 30min, số lần chiết: 1 lần Một số tài liệu còn tiến hành thêm bước làm sạch dịch chiết bằng chiết lỏng – lỏng với diethyl ether hoặc ethyl acetat

Hầu hết các tài liệu đều sử dụng bản mỏng TLC silicagel F254, ngoài ra còn sử dụng bản HPTLC silica gel F254 (2-10 µm) Đối với phân tích định tính, bản TLC được sử dụng phổ biến và giá thành rẻ hơn bản HPTLC

Về pha động, các tài liệu sử dụng các hệ dung môi khác nhau, điểm chung của các hệ dung môi này đều chứa thành phần acid (acid formic, acid acetic) Việc này làm thay đổi pH pha động, có thể giúp giảm “kéo đuôi”, dẫn đến vết sắc nét hơn, ít khuếch tán hơn, đồng thời làm thay đổi đáng kể tỷ lệ lưu giữ và đôi khi thay đổi thứ tự di chuyển của các thành phần mẫu [1] Hơn nữa, AP là một chất điện ly, pha động có tính acid sẽ làm giảm khả năng ion hóa, cải thiện đáng kể sự phân tích sắc ký [1]

Để phát hiện AP trong mẫu thử và chuẩn, một số tài liệu sử dụng đèn UV 254nm, một số lại dẫn xuất hóa bằng cách phun/ nhúng vào thuốc thử, sau đó quan sát dưới ánh sáng thường hoặc UV 365nm Các thuốc thử được sử dụng như sắt (III) chlorid 5% trong ethanol, sắt (III) chlorid 2% - kali ferricyanid 1% (1:1), NP Việc dẫn xuất hóa có thể giúp phát hiện vết trực quan hơn nhưng có nhược điểm là tốn hóa chất, thời gian phân tích lâu hơn Một số hóa chất độc hại với môi trường và sức khỏe người phân tích Phát hiện bằng soi đèn UV cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện

9

b Một số phương pháp định lượng AP trong dược liệu bằng HPLC

Bên cạnh TLC là kĩ thuật được áp dụng phổ biến để định tính dược liệu thì HPLC đã từ lâu trở thành một công cụ định lượng đầu tay trong bất kì nghiên cứu nào Có rất nhiều công trình nghiên cứu định lượng AP trong dược liệu sử dụng HPLC Xu hướng mới trong phân tích các hợp chất phenolic là sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) cũng như sắc ký lỏng hai chiều (2D-LC) [45] Tùy thuộc vào nền mẫu khác nhau mà từng kĩ thuật được áp dụng cụ thể với detector thích hợp Do cấu trúc AP có chứa vòng benzen nên detector UV được dùng phổ biến nhất để phân tích chất này Ngoài ra, để cải thiện giới hạn định lượng cũng như tăng độ nhạy trong việc xác định, trong một số trường hợp người ta còn sử dụng detector ECD [48] hay MS [21]

Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích AP trong dược liệu bằng HPLC Đối tượng

Dược liệu Cẩu

tích (Cibotium barometz)

- Dung môi chiết: methanol – acid acetic 1% (70:30) - Phương pháp chiết: siêu âm 30min

- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV - Pha tĩnh: C18

- Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (5:95)

- Bước sóng phát hiện: UV 260nm

[15, 26]

Dược liệu Litchi chinensis

- Dung môi chiết: ethanol 50%

- Phương pháp chiết: chiết hồi lưu 30min

- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV - Pha tĩnh: C18

- Pha động: kênh A: MeOH, kênh B acid phosphoric 0,2%, rửa giải theo chế độ gradient

- Bước sóng phát hiện: UV 260nm

[27]

Dược liệu

Organium vulgare

- Dung môi chiết: methanol 50% - Phương pháp chiết: siêu âm 30min

- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV - Pha tĩnh: C18

- Pha động: kênh A: ACN, kênh B acid phosphoric 0,1%, rửa giải theo chế độ gradient

- Kĩ thuật sử dụng: HPLC - DAD - Pha tĩnh: cột C18 (4,6 × 12,5 mm, 5μm)

[18]

10

resorcylic, chiết lỏng – lỏng lần lượt với dichlomethan (giữ lại lớp nước) và ethyl acetat (lấy lớp ethyl acetat) Lớp ethyl acetat được cô đến cắn, hòa tan trong 1mL methanol làm dịch chạy sắc ký

- Pha động: kênh A (acid formic 1% trong nước), kênh B (acid formic 1% trong acetonitril), rửa giải theo chế độ gradient

- Bước sóng phát hiện: UV 250nm - Kết quả AP có thời gian lưu tR = 8,6min, khoảng tuyến tính 0,8 – 4ppm, LOD = 0,2ppm, LOQ = 0,5ppm

26 loài nấm khác nhau

3,0g nấm được ngâm lạnh trong 30mL aceton – nước (80:20) ở -16oC trong 24h, sau đó siêu âm 2 lần trong 15min

- Kĩ thuật sử dụng: HPLC – DAD - Pha tĩnh: Intertsil ODS-3 reverse phase C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 µm)

- Pha động: kênh A (acid formic 0,5% trong nước), kênh B (acid formic 0,5% trong methanol), rửa giải theo chế độ gradient

- Bước sóng phát hiện: 280nm - Kết quả: AP có thời gian lưu tR = 6,87min, khoảng tuyến tính 0,01 – 1mg/L, LOD = 0,021µg/L, LOQ = 0,063µg/L

[14]

Dược liệu

Melissa officinalis

- Dung môi chiết: MeOH – nước (80:20)

- Phương pháp chiết: Soxhlet 1h

- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV - Pha tĩnh: Alltima C18–Rocket - Pha động: kênh A: ACN, kênh B acid formic 0,074M, rửa giải theo chế độ gradient

- Bước sóng phát hiện: UV 254nm - Kết quả: AP có LOD = 0,01μg/mL

[13]

11

Dược liệu

Eleutherococcus senticosus

- Dung môi chiết: MeOH

- Phương pháp chiết: hồi lưu 1h

- Làm sạch nền mẫu: SPE C18

- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV - Pha tĩnh: C18

- Pha động: MeOH – acid phosphoric 0,001M (23:77)

- Bước sóng phát hiện: UV 265nm

[46]

Trong các tài liệu tham khảo định lượng bằng HPLC, AP được chiết ra từ nền mẫu dược liệu bằng các phương pháp khác nhau như chiết siêu âm, chiết hồi lưu, chiết soxhlet, ngâm lạnh Dung môi được sử dụng chủ yếu là MeOH, EtOH hoặc hỗn hợp của các dung môi này với nước Thời gian chiết trung bình là 30 phút đến 1 giờ và có khi kéo dài tới 24 giờ

Pha tĩnh là cột C18 được sử dụng phổ biến nhất Về pha động, các dung môi được sử dụng là MeOH, ACN, nước Acid formic, acid phosphoric là hai acid phổ biến được thêm vào pha động Sử dụng pha động có tính acid giúp làm tăng tỉ lệ tồn tại dưới dạng phân tử của AP, do đó đảm bảo thời gian lưu của AP trên sắc ký đồ phù hợp để định lượng

Để phát hiện, định lượng AP trong mẫu thử và mẫu chuẩn, các tài liệu đều sử dụng đầu dò UV đặt tại các bước sóng 250nm, 254nm, 260nm, 265nm, 280nm Với mỗi dược liệu khác nhau thì ảnh hưởng của nền mẫu cũng khác nhau, do vậy cần xác định bước sóng UV để định lượng cho phù hợp Thiết bị HPLC kết nối với đầu dò UV ngày càng phổ biến, có độ nhạy cao, khoảng làm việc rộng đang chứng tỏ vai trò thiết yếu của nó trong công tác phân tích, kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm tử dược liệu [1]

c Phương pháp sắc ký khí

AP nói riêng và các acid phenolic nói chung đều có nhiệt độ sôi cao do liên kết hydro của nhóm -OH phenol và nhóm carboxylic Mục đích của việc dẫn xuất hóa là tăng khả năng hóa hơi cũng như tăng độ nhạy so với các phương pháp thông thường khác được sử dụng Tuy nhiên, sự phức tạp của nền mẫu thực vật ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quá trình dẫn xuất hóa, do vậy mà các quy trình làm sạch nền mẫu cần được áp dụng Nghiên cứu của Antonella Canini và cộng sự [12] tiến hành phân tích dịch

chiết lá Carica papaya, làm sạch nền mẫu bằng chiết lỏng – lỏng (LLE) với diethyl

ether, dẫn xuất hóa với hỗn hợp N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (BSTFA) - trimethylchlorosilane (TMCS) 1% trong pyrydin (50mL, 1:1), phát hiện với đầu dò khối phổ ở chế độ chọn lọc ion (SIM) Kết quả là AP được phát hiện với thời gian lưu tR = 11,02min tương ứng với mảnh có m/z = 370 (dẫn xuất trimethylsilan)

12

Tuy nhiên, phân tích bằng sắc ký khí khá phức tạp, đòi hỏi phải trải qua bước làm sạch và dẫn xuất hóa Do vậy thời gian phân tích sẽ lâu hơn đáng kể và không phù hợp để áp dụng phân tích thường quy

1.2.4.2 Phương pháp điện di

Điện di mao quản đã được nghiên cứu để định lượng các hoạt chất có trong dược liệu Điều quan trọng trong CE là kiểm soát pH do pH ảnh hưởng tới tỉ lệ ion/phân tử và qua đó ảnh hưởng tới linh độ điện di của chất phân tích Đối với các phân tử có kých thước nhỏ và trọng lượng phân tử thấp như AP, điện di mao quản vùng (CZE), sắc ký điện động mixen (MEKC) và điện sắc ký mao quản (CEC) là 3 kĩ thuật phù hợp nhất và đã được áp dụng để phân tích AP [11, 20, 47] Tuy nhiên, so với sắc ký thì điện di có độ lặp lại kém hơn, kiểm soát pH dung dịch điện ly nền khó khăn hơn, cần yêu cầu “tay nghề” phân tích cao hơn Ứng dụng của điện di ngày nay chủ yếu ở phân tích các hợp chất ion, đồng phân quang học và các đại phân tử (peptid, protein, acid nucleic,…)

1.2.4.3 Các phương pháp khác

Ngoài sắc ký và điện di, việc phân tích AP còn sử dụng một số phương pháp khác như phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS), phương pháp điện hóa,… Việc đo độ hấp thụ của một dung dịch chứa AP và nhiều thành phần khác không có ý nghĩa xác định hàm lượng riêng của chất này Phân tích Folin – Ciocalteu mang lại thông tin về hàm lượng phenolic tổng số và quy đổi theo acid gallic [43]

Các cảm biến dựa trên phát hiện điện hóa có độ nhạy cao, sử dụng các cảm biến là vật liệu nanocompozit [33], polymer in dấu phân tử [19] và đặc biệt là các enzym sinh học (tyrosinase, perosidasse,…) hay cảm biến sinh học kết hợp mô thực vật và vi sinh vật – gọi chung là các biosensors – đang là những hướng nghiên cứu đầy triển vọng và đã được áp dụng thành công để phân tích AP [17, 43] Để thực hiện được các phương pháp này yêu cầu tính sẵn có của trang thiết bị, vật liệu, chuyên môn của người phân tích Đây sẽ là rào cản lớn để áp dụng chúng trong phân tích thường quy

1.3 Tình hình nghiên cứu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) tại Việt Nam

Dược điển Việt Nam đã có chuyên luận về Cốt toái bổ, trong đó quy định hai loài

sử dụng là Drynaria fortunei, Drynaria bonii [7] Tuy nhiên trong chuyên luận Cốt toái

bổ chưa có chỉ tiêu định lượng còn chỉ tiêu định tính sử dụng dược liệu chuẩn đối chiếu

Về loài Drynaria fortunei, các Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông đều yêu cầu sử

dụng naringin làm chất đối chiếu và yêu cầu định lượng hoạt chất này [15, 9] Nghiên

cứu của chúng tôi về thành phần hóa học của hai dược liệu này cho thấy D fortunei có hai thành phần chính là naringin, AP, trong khi loài D bonii thành phần chính là AP và

hầu như không có (hoặc có rất ít) thành phần naringin

13

Hình 1.3 Sắc ký đồ D fortinei và D bonii

(1-mẫu D fortunei; 2-mẫu D bonii; 3-naringin; 4-p-hydroxybenzoic; 5- AP)

Tại Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào về định tính, định lượng AP trong

loài D bonii

1.4 Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu

Việt Nam có nguồn dược liệu Cốt toái bổ tương đối phong phú Song trải qua hàng chục năm khai thác liên tục, môi trường sống của vùng phân bố bị thu hẹp, nên trữ lượng cây đã bị suy giảm nhiều, hiện nay thường chỉ thấy các quần thể nhỏ, chất lượng cá thể kém, còi cọc, thân rễ kém phát triển Hiện diện tích rừng nguyên sinh ngày càng giảm, cùng với nạn thu hái tận diệt loài này để làm thuốc ngày càng phổ biến khiến Cốt toái bổ đang đứng trước nguy cơ bị tiêu diệt Hiện tại, cây thuốc này đã bị suy giảm nhiều và chỉ còn lại một vài quần thể ở khu Bảo tồn tự nhiên Na Hang (Tuyên Quang), Ngọc Linh (Kon Tum) [5] Do có giá trị kinh tế cao, các loài trong chi Drynaria thường

xuyên bị khai thác quá mức Hai loài Drynaria fortunei (Kunze ex Mett.) J Sm., D bonii H Christ đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (2007) [3] và Danh lục đỏ cây thuốc

Việt Nam (2019) [6] để khuyến cáo bảo vệ

Trước nguy cơ đe dọa về số lượng loài và chất lượng dược liệu thì việc bảo tồn và nhân giống Cốt toái bổ đang thu hút được nhiều sự quan tâm [49] Song, việc trồng và phát triển dược liệu luôn luôn phải gắn với công tác đảm bảo chất lượng dược liệu

Dược điển Việt Nam V chưa có chỉ tiêu định lượng cho loài D bonii, chỉ tiêu định tính

mới chỉ dựa trên dược liệu chuẩn đối chiếu Do vậy, tiến hành xây dựng chỉ tiêu định

tính, định lượng cho loài D bonii là hết sức cần thiết

Cốt toái bổ là dược liệu được sử dụng rộng rãi, từ lâu đời đã được dùng để điều trị các chứng bệnh đau nhức xương khớp [2, 4] AP đã được chứng minh với tác dụng bảo vệ xương khớp [36,41], chống viêm [23], chống oxy hóa [22], kháng khuẩn [24]

14

Dược điển Trung Quốc 2020, Dược điển Hồng Kông 2018, Dược điển Đài Loan 2019 đã có nhiều chuyên luận sử dụng AP là chất đánh dấu hóa học và yêu cầu định lượng hoạt chất này [9, 15, 26-29] Những điều này cho thấy sự có mặt và hàm lượng của AP đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát chất lượng của một số dược liệu Vì vậy, đối

với loài Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) có thể coi AP như hoạt chất chính, quyết

định tác dụng, đóng vai trò như chất chỉ điểm, “marker” trong tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu Việc định tính, định lượng AP có ý nghĩa lớn trong phát triển các sản phẩm thuốc, sản phẩm bảo vệ sức khỏe từ Cốt toái bổ

Phương pháp định tính bằng TLC có ưu điểm nhanh, trực quan, dễ dàng thực hiện, được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các chuyên luận về dược liệu của Dược điển Trên thế giới đã có nghiên cứu về xác định dấu vân tay sắc ký của hai loài Cốt toái

bổ là Drynaria fortunei và Drynaria baronii [40] đối chiếu với AP, tuy nhiên giá trị Rf

trên sắc ký đồ khá cao (Rf = 0,95), không phù hợp để định tính Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp định tính AP trong Cốt toái bổ để thu được kết quả tối ưu nhất

Phương pháp HPLC – UV đã được áp dụng rộng rãi để phân tích các hoạt chất chính có trong dược liệu Thiết bị HPLC kết nối với máy dò UV-VIS đang ngày càng phổ biến hơn không chỉ ở các cơ sở nghiên cứu khu vực nhà nước mà còn được đầu tư ở các phòng kiểm tra chất lượng thuộc các nhà máy sản suất dược phẩm, thực phẩm Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây một quy trình định lượng AP trong Cốt toái bổ

(Drynaria bonii H Christ) bằng phương pháp HPLC-UV một cách tối ưu, đơn giản, tiết

kiệm để có thể áp dụng thường quy trong phân tích

Hình 2.1 Dược liệu Cốt toái bổ (Drynaria bonii) dùng trong nghiên cứu

Một số mẫu Cốt toái bổ được thu thập tại Mỹ Đức – Hà Nội, Thanh Hóa, Đồng Nai, Đắk Nông, Quảng Ninh, Phú Thọ

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu phương pháp định tính bằng TLC

Tiến hành nghiên cứu phương pháp định tính AP trong Cốt toái bổ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Qua các tài liệu tham khảo [9, 15, 40], chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu gồm: chiết siêu âm với MeOH, chiết siêu âm với MeOH kết hợp chiết lỏng – lỏng với diethyl ether, ethyl acetat Khối lượng dược liệu dùng cho mỗi lần khảo sát là 2g Ba quy trình xử lý mẫu được nghiên cứu dưới đây:

Quy trình 1: cân 2g bột Dược liệu cho vào bình nón dung tích 250mL, thêm 50mL MeOH Chiết siêu âm 30 phút Lọc, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL MeOH làm dịch chấm sắc ký

Quy trình 2: cân 2g bột Dược liệu cho vào bình nón dung tích 250mL, thêm 50mL MeOH Chiết siêu âm 30 phút Lọc, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 10mL hỗn hợp acid hydrochloric đặc – nước (1:9) Chuyển dịch hòa tan vào bình gạn dung tích 100mL Lắc 3 lần, mỗi lần 3 phút với 10mL diethyl ether Gộp các dịch diethyl ether, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL MeOH làm dịch chấm sắc ký

Quy trình 3: xử lý giống như quy trình 2, nhưng thay diethyl ether bằng ethyl acetat

Hệ dung môi pha động được nghiên cứu là n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (7:6:4:2) AP được pha trong methanol với nồng độ khoảng 1mg/mL, thể tích chấm cố định là 3μL

Đánh giá quy trình xử lý mẫu thông qua giá trị Rf của AP ( giá trị tối ưu là 0,3 – 0,7), đồng thời vết của AP có cường độ hấp thụ mạnh, tách rõ vết, không bị kéo vệt

Sau quy trình khảo sát quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định tính, bao gồm các chỉ tiêu:

Độ đặc hiệu: tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch bao gồm: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu thử, mẫu chuẩn (dung dịch AP 1mg/mL) Phương pháp định tính đạt yêu cầu về độ đặc hiệu khi:

LOD: tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn đến nồng độ mà tại đó không còn thấy rõ vết trên sắc ký đồ LOD là nồng độ mà ngay trước đó còn thấy rõ vết

2.2.2 Nghiên cứu phương pháp định lượng

2.2.2.1 Khảo sát điều kiên sắc ký

Tiến hành chuẩn bị các mẫu cho khảo sát điều kiện sắc ký, bao gồm:

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1g mẫu thử cho vào bình nón có nút mài dung tích 100mL Thêm chính xác 25mL ethanol 70% Chiết siêu âm trong 60 phút, để yên 10 phút, lọc vào bình định mức 25mL, định mức bằng ethanol 70%, lắc đều Lọc qua màng 0,45μL thu được dịch chạy sắc ký

Mẫu chuẩn: dung dịch AP có nồng độ khoảng 25μg/mL Điều kiện sắc ký:

Khảo sát bước sóng phát hiện Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải

2.2.2.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu

Xây dựng đường chuẩn dùng cho nghiên cứu: chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn AP với khoảng nồng độ từ 1,5 – 800 μg/ml

Khảo sát dung môi chiết: MeOH, EtOH và hỗn hợp với nước theo các tỉ lệ khác nhau

Khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết Khảo sát tỉ lệ thể tích dung môi / khối lượng dược liệu và số lần chiết

2.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng AP trong dược liệu Cốt toái bổ bằng HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH và AOAC 2016

a Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính thích hợp của hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối

c Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3

Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=10

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N: Nhiễu đường nền Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký Xác định tỷ lệ S/N

d Đường chuẩn – khoảng tuyến tính

Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ) Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1; Δ ≤ 15%

RSD

x

=

19 ()21

1

ii

xxSD

N

=

−=

−



Trong đó

xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i;

x : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm; N : Số lần thử nghiệm

f Độ đúng

Độ đúng: độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Trong nghiên cứu này, độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

Tiến hành: thêm vào nền mẫu dược liệu Cốt toái bổ (đã được xác định hàm lượng AP) một lượng chính xác chất chuẩn AP ở ba mức thêm chuẩn khác nhau Sau đó tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn, phân tích sắc ký HPLC-DAD và xác định lượng chất chuẩn AP đã thêm vào theo thực nghiệm Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức:

xCCR

C

−=

Trong đó: R: độ thu hồi (%) Ctc: Nồng độ (hoặc khối lượng) chất phân tích xác định được trong mẫu thử thêm chuẩn;

Cn: Nồng độ (hoặc khối lượng) chất phân tích xác định được trong mẫu thử không thêm chuẩn;

Cx: Nồng độ (hoặc khối lượng) chất chuẩn thêm vào (theo lý thuyết) Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng 0,01% là 90 – 107%, hàm lượng 0,1% là: 95,0 – 105,0%

20

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): (SD×100)/X Tương quan hồi quy tuyến tính: Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = aC +b, trong đó a là hệ số góc (hàm SLOPE); b là hệ số chắn (hàm INTERCEPT); R là hệ số tương quan R (hàm CORREL)

Hàm lượng AP trong mẫu thử được tính toán theo công thức:

V: Thể tích dung môi chiết mẫu (ml) m: Khối lượng mẫu thử (g)

B: Độ ẩm của mẫu thử (%)

21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính

3.1.1 Lựa chọn pha động cho định tính AP trong CTB

Nghiên cứu tiến hành khảo sát ba hệ pha động gồm toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (5:4:1, tt/tt) (hệ A); n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng

(9:5:4:1, tt/tt) (hệ B); n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (7:6:4:2, tt/tt)

(hệ C) Kết quả (Hình 3.1) cho thấy với pha động n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid

acetic băng (7:6:4:2, tt/tt) AP được phân tách tốt khỏi các thành phần khác của dịch chiết CTB với Rf hợp lý (khoảng 0,4) nên pha động này được lựa chọn cho phép định tính AP trong CTB

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát các hệ dung môi pha động

3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Xử lý mẫu như quy trình trong mục 2.2.1 và tiến hành sắc ký các mẫu trên với

hệ dung môi n-Hexan – Toluen – Ethyl acetat – Acid acetic băng (7:6:4:2) Chúng tôi

thu được kết quả dưới đây:

T C

22

Hình 3.2 Sắc ký đồ các mẫu được xử lý theo quy trình trong mục 2.1.1

T1 – quy trình 1, T2 – quy trình 2, T3 – quy trình 3, T4 – chuẩn acid protocatehuic

Nhận xét: trên sắc ký đồ các dung dịch thử, quy trình 3 cho vết của AP hiện rõ và tách ra khỏi các vết khác Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đề xuất quy trình định tính AP trong dược liệu Cốt toái bổ như sau:

Pha tĩnh: Silica gel G

Dung môi khai triển: n-Hexan – Toluen – Ethyl acetat – Acid acetic (7:6:4:2)

Dung dịch thử: Cân 2g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài dung tích 250mL, thêm 50mL methanol (TT), siêu âm trong 30 phút Lọc Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 10mL hỗn hợp acid hydrochloric đặc – nước (1:9) Chuyển dịch hòa tan vào bình gạn dung tích 100mL, lắc 3 lần, mỗi lần 3 phút với 10mL ethyl acetat Gộp các dịch ethyl acetat, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL methanol thu được dịch chấm sắc ký

Dung dịch đối chiếu: dung dịch AP 1mg/mL Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 5μL dung dịch thử, 3μL dung dịch đối chiếu Triển khai sắc ký xong, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết với giá trị Rf trùng với vết trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu

3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính

3.1.2.1 Độ đặc hiệu

Tiến hành chuẩn bị các mẫu sau:

23

Mẫu trắng: MeOH Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn AP 1mg/mL Mẫu thử: tiến hành xử lý mẫu như quy trình phân tích ở mục 3.2.2