22 3.1.3 Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ..... Nghiên cứu “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid pr
TỔNG QUAN
Tổng quan về Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ)
1.1.1 Về vị trí phân loại
Cốt toái bổ có tên khoa học là Drynaria bonii H Christ, thuộc họ Dương xỉ
(Polypodiaceae) hay còn được gọi dưới các tên Tắc kè đá, Ráng bay, Hộc quyết, Hầu khương, Hồ tôn khương, Thân khương, Tổ phượng, Tổ rồng, Tổ diều, Co tạng tó, Co in tó [7]
1.1.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố
Cây Cốt toái bổ mọc bám thành mảng trên các hốc đá, trên thân cây gỗ ở rửng kýn thường xanh ẩm Cây sống lâu năm, có thân rễ mọc bò,dày, mọng nước, có lông dạng vảy cứng màu vàng nâu, vảy hình ngọn giáo Có 2 loại lá: loại lá bất thụ là lá ở gốc có tác dụng hứng mùn, hình thận hay hình trái xoan, không cuống màu nâu, mép nguyên lượn sóng; loại lá hữu thụ - sinh sản có cuống dài 10 – 20 cm, phiến lá dài 25 -
40 cm, rộng 15- 20cm màu lục sẫm, chẻ lông chim thành 7- 9 thùy hình trái xoan – ngọn giáo, mép uốn lượn Các túi bào tử rất nhỏ, xếp hai hàng giữa gân phụ mặt duới lá, bào tử vàng nhạt, hình trái xoan [4] (Hình 1.1)
Hình 1.1 Cây Cốt toái bổ - Drynaria bonii H Christ
Tại Việt Nam, D bonii phân bố rộng rãi ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh,… qua các tỉnh Tây Nguyên tới Đồng Nai, Kiên Giang (Phú Quốc) Loài này còn được tìm thấy ở Trung Quốc và Lào [2, 4]
Cốt toái bổ sinh sản bằng bào tử, sinh trưởng chậm, phát tán nhờ gió và nước mưa Mùa có sinh sản tháng 5 đến tháng 8 [2]
Thân rễ - Rhizoma Drynariae - đã phơi hay sấy khô của cây cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) Việc thu hái dược liệu này có thể diễn ra quanh năm, nhưng thường là vào tháng 4 đến tháng 8, 9 Hái về, bỏ sạch đất cát, loại trừ các lá là dùng được Nếu dùng khô thì sau khi rửa sach đất cát, hoặc phơi khô ngay, hoặc phơi sau khi đồ cho chín để dễ bảo quản Muốn hết lông, người ta đốt nhẹ cho cháy hết lông nhỏ phủ trên thân rễ [4] Đoạn thân rễ tương đối thẳng, ít phân nhánh, dài 5 cm đến 17 cm, rộng 0,6 cm đến 1 cm Lông dạng vẩy màu vàng nâu dễ rụng, để lộ thân rễ màu vàng nâu hoặc nâu nhạt Chất dai Mặt cắt màu vàng [2, 4]
Trong cây Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ), thành phần hóa học chính bao gồm các phenolic, các terpenoid, saponin Ngoài ra còn có steroid, tanin, đường, vitamin,…[8, 30, 32, 36-38] [30, 32, 36-38, 8]
Các phenolic là thành phần quan trọng trong Cốt toái bổ, bao gồm: acid protocatechuic (PA), protocatechualdehyd, chrysophanol, nobiletin, isoliquiritigenin, rutin, nicotiflorin, linocaffein, kaempferol, drynaether A, 4'-hydroxy-7- methoxyflavan,…[37, 38]
Các terpenoid được phân lập từ Cốt toái bổ, bao gồm: 24-metylencycloartan-3β- ol, triphyllol,…[8, 32].[32, 8]
Nghiên cứu về hàm lượng flavonoid tổng số và hàm lượng saponin tổng số của loài Drynaria bonii thu tại Lạng Sơn cho thấy: hàm lượng flavonoid tổng số trong mẫu nghiên cứu là 0,60±0,03% và hàm lượng saponin tổng số đạt 3,71±0,06% [30]
1.1.5 Tác dụng theo Y học cổ truyền
Theo Y học cổ truyền, Cốt toái bổ có vị đắng, tính ôn và không độc, quy vào hai kinh can và thận Dược liệu có khả năng bổ thận, trị đau xương, hành huyết khứ ứ, làm thuốc hòa hoãn, sát trùng đỡ đau Dùng chữa dập xương, đau xương, bong gân, sai khớp, ù tai, răng đau, thận hư Những người âm hư, huyết hư đều không dùng được [4]
Dùng uống trong hay đắp ngoài Liều dùng hàng ngày là 6 đến 12g, dùng ngoài không có liều lượng Có thể dùng dưới hình thức thuốc sắc hay ngâm rượu, hoặc giã đắp lên vết thương [4]
Trong nghiên cứu năm 2020, Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất đã phân lập được từ thân rễ D bonii trên tế bào MG63 Kết quả chỉ ra rằng các hợp chất 24-methylen-cycloartan-3β-ol, triphyllol và AP
4 kích thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63 là 8,49%; 11,18% và 7,68% tương ứng ở các nồng độ 100 μg/mL [36] Đây là báo cáo đầu tiên về tác dụng tăng sinh tế bào của các hợp chất phân lập được từ D bonii đối với các tế bào như nguyên bào xương.
Tổng quan về AP
1.2.1 Tính chất Vật lý và Hóa học
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của AP
Tên khoa học được biết đến của acid protocatechuic (PA) là acid 3,4- dihydroxybenzoic AP có công thức phân tử là C7H6O4 và khối lượng phân tử là 154,12 g/mol [50] Ở điều kiện thường, AP là chất rắn màu trắng, bị biến màu khi tiếp xúc với không khí Nhiệt độ nóng chảy là 221 o C Tan trong nước, methanol, ethanol, ether Độ tan trong nước là 1,8g/L ở 14 o C và 271g/L ở 80 o C Hệ số phân bố dầu nước logP = 0,84 [50]
Trong cấu trúc phân tử AP có nhóm chức -OH phenol và nhóm chức carboxylic nên AP thể hiện tính acid Các giá trị pKa của acid là 4,48; 8,83; 12,6 [50]
1.2.2.1 Tác dụng bảo vệ xương
Nghiên cứu của Phạm Thị Nhật Trịnh cho thấy AP kých thích sự tăng sinh của tế bào nguyên bào xương MG63 là 7,68% tương ứng ở nồng độ 100 μg/ml [36] Xi-yao
Li và cộng sự [41] cho thấy AP ức chế sự biệt hóa tế bào xương và kích thích quá trình tự chết theo chương trình ở các tế bào xương trưởng thành
1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa
AP dễ bị oxy hóa thành dạng quinon Tính chất hóa học này thể hiện tiềm năng chống oxy hóa của hợp chất này Jun Liu và cộng sự [23] đã chế tạo màng Chitosan gắn
AP Kết quả của họ cho thấy đây là một loại màng tiềm năng để chống oxy hóa cho thực phẩm
Suresh R Naik và cộng sự [22] thí nghiệm trên chuột nhắt và cho thấy kết quả giảm đau, kháng viêm đáng kể của AP Kết quả này hứa hẹn một loại thuốc giảm đau, kháng viêm mới đầy tiềm năng như AP sẽ được đưa vào sử dụng trong tương lai
Nghiên cứu của Mei-chin Yin và cộng sự [24] cho thấy khả năng kháng
Staphylococcus aureus kháng methicillin, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumanni của AP
1.2.3 Các phương pháp xử lý mẫu dược liệu áp dụng trong việc phân tích AP
AP chứa nhóm hydroxy và carboxylic nên nó tương đối phân cực và hòa tan được vào trong nước Tuy nhiên, nước mặc dù là dung môi rẻ tiền và an toàn nhưng nó không phải là dung môi phù hợp nhất để chiết AP nói riêng và các hợp chất phenolic nói chung ra khỏi nền mẫu thực vật Hỗn hợp của nước với các dung môi hữu cơ khác như methanol, ethanol, aceton, acetonitril hay DMSO ở các tỷ lệ khác nhau [25, 31, 44] được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi do khả năng hòa tan tốt cũng như có đặc tính lý học phù hợp với các kĩ thuật chiết xuất hiện có trong phòng thí nghiệm Các biến số như pH, nhiệt độ, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ giữa khối lượng mẫu – thể tích dung môi cũng đóng vai trò rất quan trọng đến hiệu quả của quá trình chiết [25]
Có rất nhiều kĩ thuật chiết xuất khác nhau đã được sử dụng để giải phóng AP ra khỏi nền mẫu Ngành công nghiệp chiết xuất trên thế giới đã phát triển các kĩ thuật hiện đại như chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (UAE), chiết xuất có hỗ trợ vi sóng (MAE), chiết xuất có sự hỗ trợ của siêu âm/vi sóng (UMAE), Chiết xuất enzyme có sự hỗ trợ của siêu âm (UAEE), chiết xuất enzyme có hỗ trợ vi sóng (MAEE), chiết xuất bằng dung môi tăng tốc (ASE), chiết với chất lỏng siêu tới hạn (SFE), chiết xuất với nước cận tới hạn (SCWE), chiết xuất với áp xuất thủy tĩnh cao (HHPE), chiết xuất với sự có mặt của Cyclodextrin, [31, 44] Tuy vậy, lựa chọn kĩ thuật chiết xuất nào cũng cần phải xem xét đến tính khả thi khi áp dụng vào phòng thí nghiệm đang vận hành, tính sẵn có của thiết bị hay dung môi Nhìn chung, ở quy mô phòng thí nghiệm, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, chiết soxhlet là phổ biến hơn cả Dược điển Trung Quốc 2020 sử dụng phương pháp chiết siêu âm để định lượng AP trong Cibotium barometz [15] Katarzyna Szewczyk và cộng sự đã so sánh các phương pháp như chiết soxhlet, chiết siêu âm, chiết bằng dung môi tăng tốc để lựa chọn phương pháp chiết phù hợp nhất trong việc phân tích AP và các acid phenolic khác có trong các loài Impatien [35] Kết quả là phương pháp chiết siêu âm được lựa chọn
Do tính phức tạp của nền mẫu, các chất hữu cơ khác trong thực vật có thể gây ra sự ảnh hưởng lớn đối với quá trình phân tích AP Bước làm sạch nền mẫu trong một số trường hợp là cần thiết trước khi phân tích bằng HPLC hay GC [42, 43] Ngoài ra, bước làm sạch này có thể giúp làm giàu mẫu, tăng độ nhạy của phương pháp phân tích và rất thích hợp cho các phân tích vết hoặc siêu vết Mặc dù vậy, việc phân tích sắc ký (LC hay GC), nếu chương trình sắc ký là đủ tốt để tách AP ra khỏi các chất khác, đạt độ phân giải mong muốn thì có thể bỏ qua bước này Ngoài ra các kĩ thuật sắc ký mới nổi hiện nay như sắc ký cột song song hay sắc ký hai chiều có thể giải quyết được toán này [39] Chiết lỏng – lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE) là hai phương pháp làm sạch mẫu được sử dụng nhiều nhất [25, 31] Ngoài LLE hay SPE còn một số phương pháp khác như chưng cất và chiết xuất đồng thời (SDE) [34], vi chiết pha rắn (SPME) [16],
1.2.4 Các phương pháp phân tích AP
1.2.4.1 Phương pháp sắc ký a Định tính AP trong dược liệu bằng TLC
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kĩ thuật phân tích nhanh, trực quan, được áp dụng rộng rãi trong phân tích định tính, đặc biệt là đối với dược liệu Trong hầu hết các chuyên luận về dược liệu của Dược điển Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông hay Đài Loan,… đều sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để định tính
Bảng 1.1 Một số phương pháp định tính AP trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng Đối tượng phân tích Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK Định tính
Cibotium barometz, sử dụng AP làm chất đối chiếu
2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: Chloroform – Ethyl acetat – Methanol – Acid acetic (12:2:1:0,8)
- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 2%
- Quan sát dưới ánh sáng thường
Cibotium barometz, sử dụng AP và aldehyd protocatechuic
2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô cắn, hòa tan cắn bằng dung dịch acid chlohydric 22,4%,
- Pha tĩnh: HPTLC silica gel F254 (2-10 àm)
- Pha động: n-Hexan - Ethyl acetat - Acid acetic băng (5:5:0,1)
7 làm chất đối chiếu sau đó chiết lỏng - lỏng với diethyl ether, lấy lớp diethyl ether
- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid (2,5gam hòa tan trong 50mL ethanol
- Quan sát dưới ánh sáng thường Định tính
Cibotium barometz, sử dụng AP và aldehyd protocatechuic làm chất đối chiếu
2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: Chloroform – Ethyl acetat – Toluen – Acid formic (5:6:3:1)
- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 5% trong ethanol
- Quan sát dưới ánh sáng thường
Cibotium barometz, sử dụng dược liệu chuẩn và
AP làm chất đối chiếu.
2g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: Toluen – Dichloromethan – Ethyl acetat – Acid formic (3:5:6:1)
- Dẫn xuất hóa: Sắt (III) chlorid 5% trong ethanol
- Quan sát dưới ánh sáng thường
Litchi chinensis, sử dụng dược liệu chuẩn và
AP làm chất đối chiếu
1g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: Toluen – Dichloromethan – Ethyl acetat – Acid formic (3:5:6:1)
- Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm
Organium vulgare, sử dụng dược liệu chuẩn và
AP làm chất đối chiếu
1g bột dược liệu được chiết siêu âm với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: Dichloromethan – Aceton – Acid formic (15:3:2)
- Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm và 365nm
1g bột dược liệu được chiết siêu âm - Pha tĩnh: Silicagel F254 [29]
8 uniflora, sử dụng dược liệu chuẩn và
AP làm chất đối chiếu với methanol, dịch chiết được cô đến còn 1mL làm dịch chấm sắc ký
- Pha động: n-Hexan – Ethyl acetat – Acid formic (5:5:0,2)
- Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm
Nghiên cứu dấu vân tay sắc ký của hai loài Drynaria fortunei và
Drynaria baronii, sử dụng AP làm chất đối chiếu
1g bột dược liệu được chiết nóng bằng methanol, dịch chiết được cô đến cắn, hòa tan cắn bằng nước, sau đó chiết lỏng lỏng bằng ethyl acetat, lấy lớp ethyl acetat
- Pha động: ethyl acetate – acid acetic băng – acid formic – nước (100:11:11:26)
- Dẫn xuất hóa: thuốc thử NP
- Quan sát dưới ánh sáng UV 366nm
Từ các tài liệu về định tính AP trong dược liệu bằng TLC, có thể thấy phương pháp chiết được sử dụng chủ yếu là chiết siêu âm với MeOH, thời gian chiết trung bình 30min, số lần chiết: 1 lần Một số tài liệu còn tiến hành thêm bước làm sạch dịch chiết bằng chiết lỏng – lỏng với diethyl ether hoặc ethyl acetat
Hầu hết các tài liệu đều sử dụng bản mỏng TLC silicagel F254, ngoài ra còn sử dụng bản HPTLC silica gel F254 (2-10 àm) Đối với phõn tớch định tớnh, bản TLC được sử dụng phổ biến và giá thành rẻ hơn bản HPTLC
Về pha động, các tài liệu sử dụng các hệ dung môi khác nhau, điểm chung của các hệ dung môi này đều chứa thành phần acid (acid formic, acid acetic) Việc này làm thay đổi pH pha động, có thể giúp giảm “kéo đuôi”, dẫn đến vết sắc nét hơn, ít khuếch tán hơn, đồng thời làm thay đổi đáng kể tỷ lệ lưu giữ và đôi khi thay đổi thứ tự di chuyển của các thành phần mẫu [1] Hơn nữa, AP là một chất điện ly, pha động có tính acid sẽ làm giảm khả năng ion hóa, cải thiện đáng kể sự phân tích sắc ký [1] Để phát hiện AP trong mẫu thử và chuẩn, một số tài liệu sử dụng đèn UV 254nm, một số lại dẫn xuất hóa bằng cách phun/ nhúng vào thuốc thử, sau đó quan sát dưới ánh sáng thường hoặc UV 365nm Các thuốc thử được sử dụng như sắt (III) chlorid 5% trong ethanol, sắt (III) chlorid 2% - kali ferricyanid 1% (1:1), NP Việc dẫn xuất hóa có thể giúp phát hiện vết trực quan hơn nhưng có nhược điểm là tốn hóa chất, thời gian phân tích lâu hơn Một số hóa chất độc hại với môi trường và sức khỏe người phân tích Phát hiện bằng soi đèn UV cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện
9 b Một số phương pháp định lượng AP trong dược liệu bằng HPLC
Bên cạnh TLC là kĩ thuật được áp dụng phổ biến để định tính dược liệu thì HPLC đã từ lâu trở thành một công cụ định lượng đầu tay trong bất kì nghiên cứu nào Có rất nhiều công trình nghiên cứu định lượng AP trong dược liệu sử dụng HPLC Xu hướng mới trong phân tích các hợp chất phenolic là sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) cũng như sắc ký lỏng hai chiều (2D-LC) [45] Tùy thuộc vào nền mẫu khác nhau mà từng kĩ thuật được áp dụng cụ thể với detector thích hợp Do cấu trúc AP có chứa vòng benzen nên detector UV được dùng phổ biến nhất để phân tích chất này Ngoài ra, để cải thiện giới hạn định lượng cũng như tăng độ nhạy trong việc xác định, trong một số trường hợp người ta còn sử dụng detector ECD [48] hay MS [21]
Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích AP trong dược liệu bằng HPLC Đối tượng phân tích Xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK
Dược liệu Cẩu tích (Cibotium barometz)
- Dung môi chiết: methanol – acid acetic 1% (70:30)
- Phương pháp chiết: siêu âm 30min
- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV
- Pha động: acetonitril – acid acetic 1% (5:95)
- Bước sóng phát hiện: UV 260nm
- Phương pháp chiết: chiết hồi lưu 30min
- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV
- Pha động: kênh A: MeOH, kênh
B acid phosphoric 0,2%, rửa giải theo chế độ gradient
- Bước sóng phát hiện: UV 260nm
- Phương pháp chiết: siêu âm 30min
- Kỹ thuật sử dụng: HPLC – UV
- Pha động: kênh A: ACN, kênh B acid phosphoric 0,1%, rửa giải theo chế độ gradient
- Bước sóng phát hiện: UV 260nm
Cao chiết vỏ đậu phộng
Cao chiết vỏ đậu phộng được hòa tan vào nước, thêm chuẩn nội acid β-
- Kĩ thuật sử dụng: HPLC - DAD
Tình hình nghiên cứu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) tại Việt Nam
Dược điển Việt Nam đã có chuyên luận về Cốt toái bổ, trong đó quy định hai loài sử dụng là Drynaria fortunei, Drynaria bonii [7] Tuy nhiên trong chuyên luận Cốt toái bổ chưa có chỉ tiêu định lượng còn chỉ tiêu định tính sử dụng dược liệu chuẩn đối chiếu
Về loài Drynaria fortunei, các Dược điển như Trung Quốc, Hồng Kông đều yêu cầu sử dụng naringin làm chất đối chiếu và yêu cầu định lượng hoạt chất này [15, 9] Nghiên cứu của chúng tôi về thành phần hóa học của hai dược liệu này cho thấy D fortunei có hai thành phần chính là naringin, AP, trong khi loài D bonii thành phần chính là AP và hầu như không có (hoặc có rất ít) thành phần naringin
Hình 1.3 Sắc ký đồ D fortinei và D bonii
(1-mẫu D fortunei; 2-mẫu D bonii; 3-naringin; 4-p-hydroxybenzoic; 5- AP)
Tại Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào về định tính, định lượng AP trong loài D bonii.
Sự cần thiết tiến hành nghiên cứu
Việt Nam có nguồn dược liệu Cốt toái bổ tương đối phong phú Song trải qua hàng chục năm khai thác liên tục, môi trường sống của vùng phân bố bị thu hẹp, nên trữ lượng cây đã bị suy giảm nhiều, hiện nay thường chỉ thấy các quần thể nhỏ, chất lượng cá thể kém, còi cọc, thân rễ kém phát triển Hiện diện tích rừng nguyên sinh ngày càng giảm, cùng với nạn thu hái tận diệt loài này để làm thuốc ngày càng phổ biến khiến Cốt toái bổ đang đứng trước nguy cơ bị tiêu diệt Hiện tại, cây thuốc này đã bị suy giảm nhiều và chỉ còn lại một vài quần thể ở khu Bảo tồn tự nhiên Na Hang (Tuyên Quang), Ngọc Linh (Kon Tum) [5] Do có giá trị kinh tế cao, các loài trong chi Drynaria thường xuyên bị khai thác quá mức Hai loài Drynaria fortunei (Kunze ex Mett.) J Sm., D bonii H Christ đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (2007) [3] và Danh lục đỏ cây thuốc
Việt Nam (2019) [6] để khuyến cáo bảo vệ
Trước nguy cơ đe dọa về số lượng loài và chất lượng dược liệu thì việc bảo tồn và nhân giống Cốt toái bổ đang thu hút được nhiều sự quan tâm [49] Song, việc trồng và phát triển dược liệu luôn luôn phải gắn với công tác đảm bảo chất lượng dược liệu Dược điển Việt Nam V chưa có chỉ tiêu định lượng cho loài D bonii, chỉ tiêu định tính mới chỉ dựa trên dược liệu chuẩn đối chiếu Do vậy, tiến hành xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng cho loài D bonii là hết sức cần thiết
Cốt toái bổ là dược liệu được sử dụng rộng rãi, từ lâu đời đã được dùng để điều trị các chứng bệnh đau nhức xương khớp [2, 4] AP đã được chứng minh với tác dụng bảo vệ xương khớp [36,41], chống viêm [23], chống oxy hóa [22], kháng khuẩn [24]
14 Dược điển Trung Quốc 2020, Dược điển Hồng Kông 2018, Dược điển Đài Loan 2019 đã có nhiều chuyên luận sử dụng AP là chất đánh dấu hóa học và yêu cầu định lượng hoạt chất này [9, 15, 26-29] Những điều này cho thấy sự có mặt và hàm lượng của AP đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát chất lượng của một số dược liệu Vì vậy, đối với loài Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) có thể coi AP như hoạt chất chính, quyết định tác dụng, đóng vai trò như chất chỉ điểm, “marker” trong tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu Việc định tính, định lượng AP có ý nghĩa lớn trong phát triển các sản phẩm thuốc, sản phẩm bảo vệ sức khỏe từ Cốt toái bổ
Phương pháp định tính bằng TLC có ưu điểm nhanh, trực quan, dễ dàng thực hiện, được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các chuyên luận về dược liệu của Dược điển Trên thế giới đã có nghiên cứu về xác định dấu vân tay sắc ký của hai loài Cốt toái bổ là Drynaria fortunei và Drynaria baronii [40] đối chiếu với AP, tuy nhiên giá trị Rf trên sắc ký đồ khá cao (Rf = 0,95), không phù hợp để định tính Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp định tính AP trong Cốt toái bổ để thu được kết quả tối ưu nhất
Phương pháp HPLC – UV đã được áp dụng rộng rãi để phân tích các hoạt chất chính có trong dược liệu Thiết bị HPLC kết nối với máy dò UV-VIS đang ngày càng phổ biến hơn không chỉ ở các cơ sở nghiên cứu khu vực nhà nước mà còn được đầu tư ở các phòng kiểm tra chất lượng thuộc các nhà máy sản suất dược phẩm, thực phẩm Chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây một quy trình định lượng AP trong Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) bằng phương pháp HPLC-UV một cách tối ưu, đơn giản, tiết kiệm để có thể áp dụng thường quy trong phân tích
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là phần thân rễ của loài D bonii Mẫu được thu hái vào 12/05/2022 tại Chi Lăng, Lạng Sơn Mẫu được xác định đúng tên khoa học, đúng bộ phận bởi Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (xem Phụ lục 1) Mẫu sau khi thu hái được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C, để nguội và bảo quản trong túi nilon kýn để phục vụ quá trình nghiên cứu
Hình 2.1 Dược liệu Cốt toái bổ (Drynaria bonii) dùng trong nghiên cứu
Một số mẫu Cốt toái bổ được thu thập tại Mỹ Đức – Hà Nội, Thanh Hóa, Đồng Nai, Đắk Nông, Quảng Ninh, Phú Thọ
Chất chuẩn AP của hãng Chemfaces, Trung Quốc, CAS 99-50-3, Lot No: CFS202201, độ tinh khiết 98,4%
Dung môi tinh khiết dùng cho HPLC: MeOH (Merck), ACN (Merck), nước cất hai lần đã qua deion Dung môi dùng trong chiết xuất, sắc ký lớp mỏng: MeOH, EtOH, n-hexan, toluen, ethyl acetat, diethyl ether, acid acetic băng
Hệ thống HPLC-DAD của hãng Shimadzu (Nhật Bản); hệ thống HPTLC với bộ phân tiêm mẫu bán tự động của CAMAG
Các thiết bị khác bao gồm bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L; bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức); tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức); cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ); cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sỹ), d
= 0,01mg; đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp); bộ dụng cụ chiết hồi lưu gồm bếp đun bình cầu (Daihan), sinh hàn thẳng
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm như: bình gạn, bình nón, bình định mức, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm, mao quản…
Bản mỏng pha thuận tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (silica gel, 0,25 mm, Merck); cột sắc ký C18 của hãng Agilent, kých thước cột 250 x 4,6 mm, kých thước hạt
5 àm, tiền cột tương ứng.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu phương pháp định tính bằng TLC
Tiến hành nghiên cứu phương pháp định tính AP trong Cốt toái bổ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Qua các tài liệu tham khảo [9, 15, 40], chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình xử lý mẫu gồm: chiết siêu âm với MeOH, chiết siêu âm với MeOH kết hợp chiết lỏng – lỏng với diethyl ether, ethyl acetat Khối lượng dược liệu dùng cho mỗi lần khảo sát là 2g Ba quy trình xử lý mẫu được nghiên cứu dưới đây:
Quy trình 1: cân 2g bột Dược liệu cho vào bình nón dung tích 250mL, thêm 50mL MeOH Chiết siêu âm 30 phút Lọc, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL MeOH làm dịch chấm sắc ký
Quy trình 2: cân 2g bột Dược liệu cho vào bình nón dung tích 250mL, thêm 50mL MeOH Chiết siêu âm 30 phút Lọc, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 10mL hỗn hợp acid hydrochloric đặc – nước (1:9) Chuyển dịch hòa tan vào bình gạn dung tích 100mL Lắc 3 lần, mỗi lần 3 phút với 10mL diethyl ether Gộp các dịch diethyl ether, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL MeOH làm dịch chấm sắc ký
Quy trình 3: xử lý giống như quy trình 2, nhưng thay diethyl ether bằng ethyl acetat
Hệ dung môi pha động được nghiên cứu là n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (7:6:4:2) AP được pha trong methanol với nồng độ khoảng 1mg/mL, thể tích chấm cố định là 3μL Đánh giá quy trình xử lý mẫu thông qua giá trị Rf của AP ( giá trị tối ưu là 0,3 – 0,7), đồng thời vết của AP có cường độ hấp thụ mạnh, tách rõ vết, không bị kéo vệt
Sau quy trình khảo sát quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định tính, bao gồm các chỉ tiêu: Độ đặc hiệu: tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch bao gồm: mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu thử, mẫu chuẩn (dung dịch AP 1mg/mL) Phương pháp định tính đạt yêu cầu về độ đặc hiệu khi:
✓ Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện vết tương ứng với vết chính trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn
✓ Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết trùng với vết trên sắc ký đồ dụng dịch chuẩn Chồng phổ của hai pic cho hệ số match > 0,990, pic của mẫu thử có độ tinh khiết > 0,990
LOD: tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn đến nồng độ mà tại đó không còn thấy rõ vết trên sắc ký đồ LOD là nồng độ mà ngay trước đó còn thấy rõ vết
2.2.2 Nghiên cứu phương pháp định lượng
2.2.2.1 Khảo sát điều kiên sắc ký
Tiến hành chuẩn bị các mẫu cho khảo sát điều kiện sắc ký, bao gồm:
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1g mẫu thử cho vào bình nón có nút mài dung tích 100mL Thêm chính xác 25mL ethanol 70% Chiết siêu âm trong 60 phút, để yên 10 phút, lọc vào bình định mức 25mL, định mức bằng ethanol 70%, lắc đều Lọc qua màng 0,45μL thu được dịch chạy sắc ký
Mẫu chuẩn: dung dịch AP có nồng độ khoảng 25μg/mL Điều kiện sắc ký:
Khảo sát bước sóng phát hiện
Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải
2.2.2.2 Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu
Xây dựng đường chuẩn dùng cho nghiên cứu: chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn AP với khoảng nồng độ từ 1,5 – 800 μg/ml
Khảo sát dung môi chiết: MeOH, EtOH và hỗn hợp với nước theo các tỉ lệ khác nhau
Khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết
Khảo sát tỉ lệ thể tích dung môi / khối lượng dược liệu và số lần chiết
2.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng AP trong dược liệu Cốt toái bổ bằng HPLC-DAD theo hướng dẫn của ICH và AOAC 2016 a Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic Tính thích hợp của hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối
18 RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu có RSD ≤ 1,0%, diện tích pic có RSD ≤ 2,0% b Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích sắc ký dung dịch chuẩn AP, dung dịch thử Cốt toái bổ và mẫu trắng với điều kiện phân tích đã lựa chọn Ghi lại các thông số thời gian lưu và diện tích pic Thời gian lưu của pic tương ứng với AP trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải tương đương nhau Pic trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu Tín hiệu pic của chất định phân tích trong nền mẫu thử phải đạt độ tinh khiết pic lớn hơn 0,99 c Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N=3
Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N
Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích; N: Nhiễu đường nền
Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất còn xác định được bằng sắc ký Xác định tỷ lệ S/N d Đường chuẩn – khoảng tuyến tính Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị R2 và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ) Yêu cầu: 0,99 ≤ R 2 ≤ 1; Δ ≤ 15% e Độ lặp lại Độ lặp lại trong ngày: tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng Độ lặp lại khác ngày (độ chính xác trung gian): bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác và phân tích trên cùng hệ thống HPLC Tiến hành định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu dược liệu và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, theo AOAC, khi đánh giá độ lặp lại, với hàm lượng hoạt chất trên 1% thì RSD% < 2,7%; với hàm lượng hoạt chất trên 0,1% thì RSD% < 3,7%)
Trong đó x i : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i; x : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm;
N : Số lần thử nghiệm f Độ đúng Độ đúng: độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Trong nghiên cứu này, độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM
Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính
3.1.1 Lựa chọn pha động cho định tính AP trong CTB
Nghiên cứu tiến hành khảo sát ba hệ pha động gồm toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (5:4:1, tt/tt) (hệ A); n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (9:5:4:1, tt/tt) (hệ B); n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (7:6:4:2, tt/tt) (hệ C) Kết quả (Hình 3.1) cho thấy với pha động n-hexan – toluen – ethyl acetat – acid acetic băng (7:6:4:2, tt/tt) AP được phân tách tốt khỏi các thành phần khác của dịch chiết CTB với Rf hợp lý (khoảng 0,4) nên pha động này được lựa chọn cho phép định tính AP trong CTB.
Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát các hệ dung môi pha động
3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Xử lý mẫu như quy trình trong mục 2.2.1 và tiến hành sắc ký các mẫu trên với hệ dung môi n-Hexan – Toluen – Ethyl acetat – Acid acetic băng (7:6:4:2) Chúng tôi thu được kết quả dưới đây:
Hình 3.2 Sắc ký đồ các mẫu được xử lý theo quy trình trong mục 2.1.1
T1 – quy trình 1, T2 – quy trình 2, T3 – quy trình 3, T4 – chuẩn acid protocatehuic
Nhận xét: trên sắc ký đồ các dung dịch thử, quy trình 3 cho vết của AP hiện rõ và tách ra khỏi các vết khác Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đề xuất quy trình định tính AP trong dược liệu Cốt toái bổ như sau:
Dung môi khai triển: n-Hexan – Toluen – Ethyl acetat – Acid acetic (7:6:4:2) Dung dịch thử: Cân 2g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài dung tích 250mL, thêm 50mL methanol (TT), siêu âm trong 30 phút Lọc Cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 10mL hỗn hợp acid hydrochloric đặc – nước (1:9) Chuyển dịch hòa tan vào bình gạn dung tích 100mL, lắc 3 lần, mỗi lần 3 phút với 10mL ethyl acetat Gộp các dịch ethyl acetat, cô cách thủy tới cắn Hòa tan cắn bằng 1mL methanol thu được dịch chấm sắc ký
Dung dịch đối chiếu: dung dịch AP 1mg/mL
Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 5μL dung dịch thử, 3μL dung dịch đối chiếu Triển khai sắc ký xong, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng UV 254nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết với giá trị Rf trùng với vết trên sắc ký đồ dung dịch đối chiếu
3.1.3 Thẩm định phương pháp định tính
Tiến hành chuẩn bị các mẫu sau:
Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn AP 1mg/mL
Mẫu thử: tiến hành xử lý mẫu như quy trình phân tích ở mục 3.2.2
Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu
1- mẫu trắng, 2 – mẫu thử, 3 – mẫu chuẩn
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không có vết với giá trị Rf tương ứng với vết của AP trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn
Chồng phổ của aicd protocatechuic trên sắc ký đồ dung dịch thử và chuẩn cho hệ số match > 0,996 Độ tinh khiết pic thử và chuẩn > 0,999
=> phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu về độ đặc hiệu để định tính AP trong dược liệu Cốt toái bổ
Hình 3.4 Sắc ký đồ các mẫu được quét bằng TLC – scanner, bước sóng phát hiện
Hình 3.5 Chồng phổ của AP trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và thử với bước sóng quét từ 210nm – 450nm
3.1.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD)
Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn AP và chấm liên tiếp trên bản mỏng sắc ký đến khi không nhìn thấy rõ vết
Hình 3.6 Sắc ký đồ đánh giá LOD Bảng 3.1 Đánh giá LOD phương pháp định tính
=> phương pháp định tính AP có LOD là 50ng/vết
3.1.3 Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để xác nhận sự có mặt của AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ Kết quả thu được trong hình dưới đây:
Hình 3.7 Sắc ký đồ các mẫu dược liệu Cốt toái bổ
QN – Quảng Ninh; ĐN – Đắk Nông; TH – Thanh Hóa; AP – acid protocatechuic
Kết quả: Các mẫu Cốt toái bổ thu tại Quảng Ninh, Đắk Nông, Thanh Hóa đều cho thấy có sự xuất hiện của AP.
Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng
3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
Qua các nghiên cứu, các tác giả đều lựa chọn cột pha đảo RP-HPLC để định lượng AP Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn cột C18 của hãng Agilent, kớch thước cột 250 x 4,6 mm, kớch thước hạt 5 àm để định lượng AP trong CTB
3.2.1.2 Bước sóng hấp thụ cực đại của chất nghiên cứu Để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của AP, chúng tôi tiến hành quét phổ UV- VIS của dung dịch chuẩn AP Kết quả thu được như Hình 3.8
Hình 3.8 Phổ UV – VIS của chất chuẩn AP
27 Kết quả cho thấy, AP có phổ UV với các cực đại hấp thụ tại 207nm, 256 nm và
292 nm Một số tài liệu nghiên cứu lựa chọn bước sóng 254 nm để định lượng AP [15, 9] Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn bước sóng 254 nm để định lượng AP trong dược liệu Cốt toái bổ
3.2.1.3 Khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải
Thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động có thể ảnh hưởng tới những vẫn đề sau trong phép sắc ký: Độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu của chất phân tích, hiệu lực cột tách, độ phân giải của chất phân tích
Quy trình xử lý mẫu được thực hiện như trong mục 2.2.2.1
Bảng 3 2 Các chương trình gradient khảo sát Điều kiện 1
(MeOH-Nước, v=1 ml/phút) Điều kiện 2 (MeOH-acid formic 0,1%, v= 1 ml/phút) Điều kiện 3 (ACN- acid formic 0,1%, v= 1 ml/phút)
30 Kết thúc 30 Kết thúc 40 Kết thúc
Các điều kiện sắc ký được cố định như sau:
Tốc độ dòng: 1 ml/phút Thể tích tiêm: 10μL
Bước sóng phát hiện: 254nm Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện rửa giải (Bảng 3.2) Kết quả thu được như Bảng 3.3 và Hình 3.9
28 Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 3 Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC khảo sát thành phần pha động và chương trình rửa giải
Bảng 3.3 Các thông số sắc ký của pic AP ứng với các điều kiện khảo sát
Thông số Thời gian lưu (phút)
Hệ số kéo đuôi (Yêu cầu: > 0,8 và <
2,0) Độ phân giải (Rs) (yêu cầu > 1,5)
Số đĩa lý thuyết Điều kiện 1 2,55 - - - Điều kiện 2 6,68 1,65 1,43 23251 Điều kiện 3 10,79 1,01 1,99 37672
Kết quả thu được cho thấy với điều kiện 3, tín hiệu của chất chuẩn AP cân đối, tách tốt trên nền mẫu thử với thời gian lưu khoảng 10 phút, phù hợp để phân tích định lượng trên nền mẫu dược liệu Chúng tôi lựa chọn điều kiện 3 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo để xây dựng phương pháp định lượng AP trong dược liệu Cốt toái bổ
=> Điều kiện phân tích HPLC-DAD được lựa chọn như sau:
+ Pha động: Kênh A: acid formic 0,1%, kênh B: ACN
+ Chương trình rửa giải gradient:
Thời gian (phút) acid formic 0,1% (%) Acetonitril (%)
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút
+ Bước sóng phát hiện: 254 nm
3.2.2 Xây dựng đường chuẩn tiến hành nghiên cứu Để xây dựng đường chuẩn dùng cho quá trình định lượng, tiến hành chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn AP với khoảng nồng độ từ 1,5 – 800 μg/ml Từ kết quả phân tích, lựa chọn khoảng nồng độ tuyến tính là 6,25 – 200 μg/ml (đáp ứng yêu cầu R 2 > 0,99 và độ chệch Δ giữa giá trị nồng độ chất định phân thực tế và nồng độ chất định phân tính lại từ đường chuẩn là dưới 15%) Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.4 và Hình 3.9
Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của AP
Nồng độ (àg/ml) S pic (mAU.s) Δ (%)
Hình 3.10 Đường chuẩn AP 3.2.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
3.2.3.1 Khảo sát dung môi chiết
Nhằm lựa chọn được dung môi chiết xuất phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát các dung môi: methanol, ethanol và hỗn hợp của 2 dung môi này với nước ở một số tỷ lệ khác nhau Hiệu quả chiết của từng dung môi được đánh giá thông qua hàm lượng AP trong mẫu Kết quả thu được như Bảng 3.5 y = 58930x - 55969 R² = 0.9997
Khoảng nồng độ 6,25 - 200 àg/ml
Nồng độ AP (àg/mL)
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Khối lượng mẫu thử (gam)
AP Diện tích pic Hàm lượng (%)
Ghi chú: điều kiện cố định gồm có khối lượng mẫu thử: 1 gam; chiết siêu âm trong 1 giờ; độ ẩm mẫu thử = 10,01%; thể tích dung môi chiết = 25 ml; thể tích bình định mức = 25mL
Với dung môi chiết là ethanol 70%, hàm lượng AP xác định được trong mẫu thử là cao nhất, đạt 0,058% Từ kết quả trên, nhóm nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết là ethanol 70% cho các khảo sát tiếp theo
3.2.3.2 Khảo sát phương pháp chiết
Từ các tài liệu tham khảo nghiên cứu về định lượng AP trong dược liệu, chúng tôi nhận thấy có hai phương pháp chiết thường được sử dụng là chiết siêu âm và chiết hồi lưu cách thủy Với mục tiêu lựa chọn phương pháp chiết tối ưu, chúng tôi khảo sát hai phương pháp chiết này
Tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết khác nhau gồm chiết siêu âm và chiết hồi lưu, trong khoảng thời gian khảo sát từ 15-120 phút Tiến hành phân tích HPLC theo điều kiện đã khảo sát trong mục 3.2.1 và tính hàm lượng trung bình của AP Kết quả thu được như Bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết
TT Phương pháp – thời gian chiết
Khối lượng mẫu thử (gam)
AP Diện tích pic Hàm lượng (%)
Ghi chú: điều kiện cố định gồm có khối lượng mẫu thử: 1 gam; độ ẩm mẫu thử = 10,01%; thể tích dung môi chiết = 25 ml; thể tích bình định mức = 25mL; dung môi chiết: EtOH 70%
Nhận xét: hàm lượng của AP trong mẫu thử thu được bằng phương pháp chiết siêu âm lớn hơn rõ rệt so với phương pháp chiết hồi lưu Kết quả khảo sát thời gian chiết siêu âm cho thấy, khi tăng thời gian chiết siêu âm từ 15 – 60 phút thì hàm lượng AP xác định được trong dung dịch mẫu thử đều tăng dần và ổn định trong khoảng thời gian chiết siêu âm từ 60-120 phút Từ kết quả thu được, nhóm nghiên cứu lựa chọn thời gian chiết siêu âm là 60 phút
3.2.3.3 Khảo sát tỉ lệ khối lượng dược liệu/ thể tích dung môi và số lần chiết
Tiến hành khảo sát tỷ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung môi chiết và số lần chiết Kết quả được trình bày trong Bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tỷ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung môi chiết và số lần chiết
Tỷ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung môi chiết (g/ml)
Ghi chú: điều kiện cố định gồm có khối lượng mẫu thử: 1 gam; độ ẩm mẫu thử
= 10,01%; dung môi chiết: EtOH 70%; phương pháp chiết: siêu âm; thời gian chiết:
Kết quả thu được cho thấy ứng với tỷ lệ khối lượng dược liệu/thể tích dung môi chiết là 1 gam mẫu thử/25 ml dung môi chiết và số lần chiết là 1 lần, hàm lượng AP trong mẫu thử xác định được đạt 0,054%
Từ các kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu, đề xuất được quy trình xử lý mẫu dược liệu Cốt toái bổ như sau:
Cân chính xác 1 g bột mẫu thử (đã xác định độ ẩm) vào bình tam giác dung tích
100 ml Thêm 25 ml ethanol 70% Tiến hành chiết siêu âm trong 60 phút Để yên 10 phút, lọc vào bình định mức 25 ml, bổ sung đến vạch mức bằng ethanol 70%, lắc đều, thu được dung dịch mẫu thử Lọc mẫu thử qua màng lọc 0,45 àm thu được dung dịch mẫu thử dùng cho phân tích HPLC
3.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích
Bàn luận
3.3.1 Về xây dựng phương pháp định tính
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng phương pháp định tính
AP trong dược liệu Cốt toái bổ mà trước đó Việt Nam chưa có nghiên cứu nào
Hệ dung môi pha động được lựa chọn đảm bảo khả năng tách tốt AP ra khỏi nền mẫu với hệ số Rf phù hợp dùng để định tính (khoảng 0,4)
Ba quy trình xử lý mẫu đã được nghiên cứu cho phép thử định tính, quy trình 1 tham khảo của Dược điển Trung Quốc 2020 [15], quy trình 2 có tham khảo của dược điển Hồng Kông 2019 [9], quy trình 3 tiến hành như quy trình 2 nhưng thay diethyl ether bằng ethyl acetat
Dược điển Hong Kong sử dụng diethyl ether cho chiết lỏng - lỏng khi định tính
AP trong Cẩu tích, tuy nhiên khi chúng tôi sử dụng dung môi này để xử lý dịch chiết Cốt toái bổ thì vết của AP không hiện rõ so với khi xử lý bằng ethyl acetat Điều này có thể giải thích do hàm lượng các chất thân dầu trong Cốt toái bổ cao, hạn chế khả năng phân bố của AP vào pha diethy ether Ethyl acetat là dung môi có độ phân cực mạnh hơn diethyl ether nên hạn chế khả năng phân bố của các hợp chất thân dầu và tăng khả
39 năng phân bố của AP vào pha này Hơn nữa, sử dụng ethyl acetat có độ an toàn cao hơn do diethyl ether có nguy cơ gây cháy nổ, ảnh hưởng tới sự an toàn của người phân tích
Phương pháp định tính đã xây dựng sử dụng các thiết bị, vật liệu, dung môi sẵn có trong phòng thí nghiệm Bản mỏng silicagel tráng sẵn hiện nay được sử dụng phổ biến, giá thành rẻ hơn nhiều so với bản HPTLC
Thẩm định phương pháp định tính AP trong Cốt toái bổ đạt yêu cầu về độ đặc hiệu và phương pháp có LOD là 50ng/vết Áp dụng phương pháp định tính đã xây dựng để khảo sát các mẫu dược liệu thu tại Quảng Ninh, Đắk Nông, Thanh Hóa Kết quả cho thấy AP đều có mặt tại 3 mẫu này
3.3.2 Về xây dựng phương pháp định lượng
3.3.2.1 Về quy trình xử lý mẫu
AP là hoạt chất chính trong dược liệu Cốt toái bổ Hoạt chất này đã được nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng dược lý Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng phương pháp định lượng AP trong Cốt toái bổ đầu tiên tại Việt Nam
Các dung môi được nghiên cứu cho quá trình xử lý mẫu bao gồm: methanol, ethanol và hỗn hợp của 2 dung môi này với nước ở một số tỷ lệ khác nhau Kết quả thu được cho thấy, khi sử dụng dung môi chiết là ethanol/nước có tỷ lệ dung môi hữu cơ 60-80% thì hàm lượng AP xác định được cao hơn khi sử dụng các hỗn hợp ethanol/nước ở các tỷ lệ khác, và cao hơn so với sử dụng hỗn hợp methanol/nước Với dung môi chiết là ethanol 70%, hàm lượng AP xác định được trong mẫu thử là cao nhất Ethanol có giá thành rẻ, ít độc đối với người phân tích Đồng thời thể tích dung môi dùng cho chiết xuất nhỏ (25mL), tránh gây lãng phí
Phương pháp chiết mẫu là chiết siêu âm Hàm lượng của AP trong mẫu thử thu được bằng phương pháp chiết siêu âm lớn hơn rõ rệt so với phương pháp chiết hồi lưu Điều này có thể dự đoán là do phản ứng alkyl hóa của AP tạo thành các dẫn xuất do trong mẫu dược liệu Cốt toái bổ có các acid hữu cơ Siêu âm là phương pháp chiết phổ biến trong phân tích dược liệu với ưu điểm chiết nhanh, trang thiết bị đơn giản,
Quy trình xử lý mẫu đơn giản không cần qua nhiều công đoạn phức tạp gây thất thoát mẫu cũng như thời gian chiết ngắn (1 giờ), phù hợp với công tác đảm bảo chất lượng dược liệu
3.3.2.2 Về xây dựng chương trình sắc ký và thẩm định phương pháp phân tích
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách và phát hiện chất phân tích trong HPLC như loại cột sử dụng, chương trình dung môi,…
Loại cột sử dụng trong nghiên cứu là cột C18 Đây là loại pha tĩnh được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm phân tích
40 Chương trình dung môi đảm bảo khả năng tách AP ra khỏi các pic khác trên sắc ký đồ với thời gian lưu phù hợp để tiến hành phân tích định lượng Điều kiện sắc ký được khảo sát hoàn toàn có thể được lựa chọn làm chương trình sắc ký vân tay đối với dược liệu Cốt toái bổ
3.3.2.4 Về thẩm định phương pháp phân tích
Phương pháp định lượng AP trong Cốt toái bổ đã được tiến hành thẩm định theo những tiêu chí của ICH và AOAC
Kết quả cho thấy phương pháp có độ phù hợp hệ thống với RSD diện tích pic nhỏ hơn 2% và RSD thời gian lưu nhỏ hơn 1% (bảng 3.8) Đồng thời phương pháp có độ đặc hiệu cao (hệ số match giữa phổ của AP trên sắc ký đồ dung dịch thử và chuẩn lớn hơn 0,99)
Phương pháp định lượng được xây dựng có khoảng tuyến tính rộng (6,25 - 200μg/mL); LOD 1,01μg/mL, LOQ 3,32μg/mL (Bảng 3.9)
Kết quả trên bảng 3.10 cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại Độ đúng được đánh giá ở các mức nồng độ 30%, 60%, 90% với độ thu hồi và RSD đạt yêu cầu của AOAC (Bảng 3.11)
3.3.2.5 Về kết quả định lượng một số mẫu cốt toái bổ thu tại Việt Nam
Phương pháp định lượng được xây dựng đã được áp dụng để xác định hàm lượng
AP trong một số mẫu dược liệu Cốt toái bổ thu tại Việt Nam
Kết quả (Bảng 3.12) cho thấy có sự khác biệt lớn về hàm lượng AP trong 10 mẫu dược liệu Cốt toái bổ thu tại các vùng khác nhau (khoảng từ 0,008 – 0,053%) Trong đó, mẫu thu tại Lạng Sơn có hàm lượng AP cao nhất (0,053%), mẫu thu ở Phú Thọ có hàm lượng AP thấp nhất (0,008%) Sự khác biệt này có thể do một số yếu tố khách quan như điều kiện môi trường sống, thu hái, bảo quản,…
Phương pháp định lượng được xây dựng hoàn toàn có thể được áp dụng thường quy để kiểm tra dược liệu Cốt toái bổ (Drynaria bonii H Christ) lưu hành trên thị trường
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau:
1 Đã xây dựng được phương pháp định tính AP trong dược liệu Cốt toái bổ như sau: