TỔNG QUAN 5pd 1.1 Tổng quan về cây Riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet)
Tổng quan về hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-
Bảng 1.1 Đặc điểm của DK và DDK
5,6-Dehydrokavain (DK) Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK)
+ Dihydro-5,6-dehydrokavain + 7,8-Dihydro-5,6-dehydrokawain + 5,6-Dehydro 7,8-dihydrokavain
- Dạng bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt
- Dạng bột kết tinh màu trắng
5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) thuộc nhóm kavalacton Kavalacton là một nhóm các hợp chất lacton ban đầu được tìm thấy trong cây kava Ngoài DK và DDK, một số hợp chất thuộc nhóm kavalacton khác phải kể đến như kavain, yagonin, methysticin… [11] Dựa trên cấu trúc pyron trong phân tử, các kavalacton được phân loại thành các nhóm từ A đến D phụ thuộc vào sự hiện diện hoặc vắng mặt của liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Cụ thể, các kavalacton thuộc nhóm A đều không có liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Ngược lại, các kavalacton thuộc nhóm
B chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 7, 8; còn nhóm C có liên kết chưa bão hòa ở cả
8 hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Các kavalacton nhóm D chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 5, 6 Theo đó, DK là một kavalacton thuộc nhóm C, còn DDK thuộc nhóm D [23]
1.2.2 Tác dụng dược lý của hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-
Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của các kavalacton tìm có trong các lại thực vật, đặc biệt là hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong cây riềng ấm
Các nghiên cứu hiện đại cho thấy rằng hai hoạt chất DK và DDK có khả năng chống béo phì [17], [19], [20] Cụ thể, các hợp chất này làm tăng giải phóng cAMP và glycerol nội bào, ức chế tích lũy lipid và giảm hàm lượng chất béo trung tính Hơn nữa, chúng ức chế GPDH và lipase tuyến tụy và không có hoạt tính gây độc tế bào có thể đo lường được đối với tế bào mỡ 3T3-L1 trong ống nghiệm Nhìn chung, các kết quả cho thấy DK và DDK có tiềm năng mạnh mẽ trong vai trò chống béo phì [20].
DK và DDK còn có khả năng kháng virus HIV và virus cúm [7] DK và DDK làm ức chế men tích hợp (HIV-1 integrase) - loại men cần thiết để đưa DNA của vi rút HIV vào DNA của tế bào chủ Với virus cúm, chúng ức chế hoạt động của kháng nguyên bề mặt neuraminidase (NA), ngăn chặn quá trình phóng thích virus từ các tế bào bị nhiễm sang tế bào khỏe mạnh, từ đó hạn chế sự lây lan và phát triển của bệnh [7]. Đặc biệt, nghiên cứu của Walter và cộng sự [10] cho thấy DK có khả năng kháng ung thư thông qua việc ức chế mạnh các tế bào glioblastoma (u nguyên bào thần kinh đệm) và tác dụng vừa phải trên tất cả các dòng tế bào khối u khác Nghiên cứu của Yen Thi‐Kim Nguyen [24] sử dụng phương pháp MTT đã chỉ ra rằng DK đã giảm đáng kể việc di chuyển và xâm chiếm của tế bào MDA ‐ MB ‐ 231; từ đó có tác dụng chống xâm lấn và chống di căn các tế bào ung thư
1.2.3 Một số phương pháp phân tích hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và
Dựa theo tính chất lý hóa của DK và DDK, các nghiên cứu thường lựa chọn dung môi chiết mẫu là các dung môi thân nước như nước, methanol, aceton Nghiên cứu của Tran Dang Xuan [23] cho thấy sự khác biệt về khả năng chiết DK và DDK của các dung môi đối với đối tượng nghiên cứu là rễ cây kava, từ đó có thể xem xét áp dụng những dung môi đó trong việc chiết mẫu bột riềng ấm
Bảng 1.2 So sánh hiệu quả các dung môi chiết với DK và DDK
Hoạt chất Lượng chiết được (mg/g dung môi chiết)
Nước Acetone Chloroform Methanol Ethanol Hexane
1.2.3.2 Phương pháp phân tích DK và DDK trong mẫu
Các tài liệu khoa học đã công bố trước đây có một số phương pháp phân tích 5,6- Dehydrokavain và Dihydro-5,6-dehydrokavain
Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích DK và DDK
STT Đối tượng nghiên cứu
Kỹ thuật phân tích Điều kiện phân tích Dung môi chiết mẫu TLTK
UV-VIS Điều kiện sắc ký không được nêu rõ
-Cột C8 Inertsilđ (35 àm, 4,6 × 150 mm), nhiệt độ cột: 35℃
- Pha động: chế độ đẳng dòng A – B: 50 - 50 +Pha động A: MeOH 100%
- Thể tớch tiờm mẫu: 10àl
- Tốc độ dòng: 1mL/phút
Lá và thân rễ cây riềng ấm
- Pha động: acetonitril (31% tt/tt) pH = 2,3
- Tốc độ dòng:1,0 mL/phút, chạy đẳng dòng
Phương pháp chiết lỏng-lỏng và SPE Nước nóng
4 Rễ cây Piper methysticum HPLC - Cột TSK gel ODS-100Z
Lá và thân rễ cây riềng ấm
Lá và cành cây giọt sành
-Pha động: 0,1% acid acetic và MeOH, chạy gradient
- Bước sóng: 280nm lỏng-lỏng và SPE Nước nóng MeOH
-Cột: Shim-pack GIS C18 (250 ì 4.6mm, 5àm ODS) -Pha động: acetonitril/H2O:
-Tốc độ: 1,0 mL/phút -Thể tớch tiờm: 10 àl -Bước sóng: 343nm
Thân rễ, lá tươi cây Alpinia speciosa
-Cột pha đảo Megapak sil C18 (10 ì 250 mm, 10 àm) -Pha động: H2O/MeOH : 30/70
4 mm, 5 pm) -Pha động: acetonitril : H2O : diethylamin (50 : 50 : 0,1);
Ph = 3 ( điều chỉnh bằng acid orthophosphoric) -Tốc độ: 1 mL/phút
Viên con nhộng chứa chiết xuất từ cây kava
-Cột mao quản HP-5MS (30m x 0,25 mm với màng 0,25 àm)
40°C trong 4 phút, sau đó tăng lên 275°C với tốc độ 8°C/phút
-Khí mang là Heli -Nhiệt độ kim phun: 280°C -Lưu lượng lọc: 50mL/phút -Năng lượng điện tử đặt ở
70 eV và điện áp 1529V -Tốc độ quét dữ liệu 9 lần/giây, phạm vi m/z là 50-
DK và DDK là hai hoạt chất chính có hàm lượng khá cao trong cây riềng ấm [23] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng DK và DDK có mặt trong tất cả các bộ phận của cây riềng ấm, bao gồm lá, thân, thân rễ, hoa và hạt [23] Tuy nhiên, hàm lượng DK và DDK ở mỗi bộ phận của cây không giống nhau Một nghiên cứu ở Nhật Bản cho thấy sự khác biệt về hàm lượng của DK và DDK trong một số bộ phận của cây riềng ấm (bảng 1.4) [23]
Bảng 1.4 Hàm lượng DK và DDK trong các bộ phận của cây riềng ấm
Hoạt chất Hàm lượng (mg/g tính theo khối lượng tươi)
Hàm lượng của DK và DDK ở trong lá và thân rễ cao hơn nhiều so với các bộ phận khác Giả thiết đặt ra rằng DK và DDK có vai trò nhất định trong cơ chế ức chế cảm nhiễm của cây riềng ấm, giúp chúng ức chế sự phát triển của các loài thực vật khác trong vùng lân cận và mở rộng quần thể của nó trong hệ sinh thái thực vật [23] Ngoài ra, hàm lượng DK và DDK trong cây có thể khác nhau phụ thuộc vào nguồn giống, địa điểm trồng và thời gian thu hoạch trong năm [23]
Tóm lại, trong cây riềng ấm, hai hoạt chất 5,6 dehydrokavain (DK) và dihydro- 5,6-dehydrokavain (DDK) là hai hoạt chất chính có hàm lượng cao DK và DDK góp phần quan trọng trong các tác dụng dược lý của cây riềng ấm Với việc sản xuất bột riềng ấm từ nguồn dược liệu tại Việt Nam để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ngăn ngừa lão hóa và kiểm soát cân nặng, việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về hàm lượng DK và DDK trong bột riềng ấm là cần thiết Chính vì thế, yêu cầu cấp bách là tiến hành đề tài ‘xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất
DK và DDK trong bột riềng ấm Nhật Bản”.
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.3.1 Nguyên tắc và cấu tạo hệ thống HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến sự phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký đồng phân quang học
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Hệ thống cấp pha động, bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột và pha tĩnh, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
Hình 1.3 Cấu tạo hệ thống HPLC
1.3.2 Kỹ thuật HPLC với detector mảng diod quang (photodiode array detector –
Detector mảng diod quang (PDA) là một loại detector hấp thụ UV-VIS, được dung phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phận tích Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách thành các bước sóng đơn Detector có một hoặc hai mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử kẻ vạch bằng laser (holographic grating) Mỗi diod nhạy ở một bước sóng nhất định Do đó, detector PDA cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau trong cùng một thời điểm và theo dõi đồng thòi nhiều thành phần hấp thụ tại nhiều bước sóng khác nhau
Hình 1.4 Cấu tạo detector PDA
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là hai hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và dihydro-5,6- dehydrokavain (DDK) trong cây riêng ấm Đối tượng mẫu phân tích được lựa chọn là các mẫu bột riềng ấm được gửi từ công ty CPHC Thực phẩm Châu Á và được mã hóa từ 1C đến 5C
Chất chuẩn DK : Desmethoxyyangonin 89184 (PhytoLab, Đức), hàm lượng hoạt chất 97%, bảo quản ở 2-8 o C
Chất chuẩn DDK : 5,6-Dehydro 7,8-dihydrokavain 84467 (PhytoLab, Đức), hàm lượng hoạt chất 100%, bảo quản ở 2-8 o C
2.1.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm : cân chính xác khoảng 10,0mg chất chuẩn DK vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH
Dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm : cân chính xác khoảng 12,0mg chất chuẩn DDK vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH
Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian : Hút 10,00mL dung dịch chuẩn gốc DK
97ppm và 20,00mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức 100,0mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta có chuẩn hỗn hợp DK 9,7ppm và DDK 24ppm
Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc : từ dung dịch chuẩn hỗn hợp, pha dãy dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ DK từ 0,097ppm đến 9,7ppm, nồng độ DDK từ 0,24ppm đến 24ppm
Các dung môi được sử dụng là:
Nước cất; methanol (MeOH); acetone; nước khử ion 18Ω; Methanol (MeOH) của Merk - Đức; acetonitril (ACN) của Merk - Đức
Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài: hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance Waters 2695; cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5àm, 150x4,6mm); máy ly tâm lạnh Universal 32R Hettich (Đức); bể rửa siêu âm Elmasonic S120H (Đức); tủ sấy Bider ED53 (Đức), cân phân tích Mettler Toledo ME 204T/00 (d
= 0,1 mg; max 120g); cân phân tích Mettler Balance XSR105DU (d = 0,01mg; max
14 120g), tủ HOT 37W; máy xay Philips 600W, máy lắc vortex DAIHAN Scientific VM-
Các dụng cụ được sử dụng bao gồm: ống falcon 50mL; bình định mức chính xác 10mL, 20mL, 100mL; micropipet 1000àL, 5000àL; Pipet Pasteur; vial sẫm màu chạy sắc ký lỏng; màng lọc PTFE 0,45 àm (Mỹ); cốc cú mỏ, ống đong và cỏc dụng cụ thủy tinh khác.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích
Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất 5,6- dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các nội dung sau:
- Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phân tích: khảo sát lựa chọn cột sắc ký, khảo sát lựa chọn pha động và khảo sát lựa chọn bước sóng phân tích
- Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu và các điều kiện của quy trình xử lý mẫu: khảo sát lựa chọn tỷ lệ dung môi, khảo sát lựa chọn thời gian chiết mẫu, khảo sát lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu và khảo sát lựa chọn số lần chiết mẫu
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Sau khi xây dựng được phương pháp phân tích, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu sau dựa theo các tài liệu tham khảo bao gồm: Độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu (độ chọn lọc), khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (limit of detection-LOD) và giới hạn định lượng (limit of quantitation-LOQ), độ chính xác (độ lặp lại), độ đúng (độ thu hồi)
2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế Áp dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành định lượng hoạt chất chất 5,6- dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong một số mẫu bột riềng ấm Nhật Bản được trồng tại Việt Nam Áp dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành định tính hoạt chất chất 5,6- dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong mẫu thân rễ và lá của cây riềng nếp Việt Nam (Alpinia galanga)
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Quy trình xử lý mẫu
Sau khi tham khảo các tài liệu khoa học, dựa trên tình hình thực tế tại cơ sở, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn một quy trình xử lý mẫu trong các quy trình sau:
Bột riềng ấm đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL
Vortex, siêu âm 15 phút với nhiệt độ 40℃ (1)
Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2)
Thêm 30mL MeOH vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) Thêm 2 lần
(tương ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi MeOH
Lọc qua màng lọc 0,45àm, cho vào vial và chạy HPLC
Bột riềng ấm đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL
Vortex, siêu âm 15 phút với nhiệt độ 40℃ (1)
Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2)
Thêm 30mL Aceton vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 2 lần (tương ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi Aceton
Lọc qua màng lọc 0,45àm, cho vào vial và chạy HPLC
Bột riềng ấm đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào bình nón 100mL
+ 30mL H2O Đun sôi cách thủy 20 phút (1) Để lắng, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2)
Thêm 30mL H2O vào bình nón rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 2 lần
(tương ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi H2O
Lọc qua màng lọc 0,45àm, cho vào vial và chạy HPLC
16 Sau khi lựa chọn được quy trình xử lý mẫu, tiến hành khảo sát lựa chọn các điều kiện cho quy trình xử lý mẫu đó
2.3.2 Điều kiện sắc ký phân tích
Trong nghiên cứu này, phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA (HPLC-PDA) đã được sử dụng Mẫu phân tích được xử lý và đưa vào phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng Điều kiện sắc ký được tham khảo từ các tài liệu trước đó, sau đó lựa chọn điều kiện tối ưu thông qua khảo sát cột C8 và C18; khảo sát các pha động Acetonitril-Acid acetic 1% 50:50 (tt/tt) và MeOH-H2O 70:30 (tt/tt)
Kết quả sắc ký được thể hiện qua phần mềm của hệ thống HPLC
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích sau khi được khảo sát và chọn ra các điều kiện phù hợp được thẩm định theo tiêu chuẩn của AOAC 2016 với các tiêu chí sau:
2.3.3.1 Độ phù hợp của hệ thống
Tiến hành phép thử độ phù hợp hệ thống để đánh giá độ ổn định của toàn bộ hệ thống máy móc, thiết bị phân tích
Cách xác định: Chuẩn bị 1 mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ gần với nồng độ hoạt chất có trong mẫu thử Tiêm lặp lại 6 lần Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần tiêm sắc ký Độ phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của thời gian lưu và diện tích pic của các chất phân tích trong mẫu chuẩn
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu phải không quá 1,0% (≤ 1,0%)
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của diện tích pic phải không quá 2,0% (≤ 2,0%)
2.3.3.2 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác như tạp chất, chất phân hủy, chất nền…
Chuẩn bị các mẫu sau: mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn:
- Mẫu trắng: dung môi chiết mẫu MeOH 30% (MeOH-H2O tỷ lệ 30:70)
+ Chuẩn gốc DK 97ppm: cân chính xác 10,0mg chất chuẩn DK vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH
17 + Dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm: cân chính xác 12,0mg chất chuẩn DDK vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian: Hút chính xác 10,00mL dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm và 20,00mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức 100,0mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta có chuẩn hỗn hợp
DK 9,7ppm và DDK 24ppm
+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: Hút chính xác 2,50mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta có mẫu chuẩn hỗn hợp làm việc DK 2,425ppm và DDK 6ppm
- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,1g bột dược liệu vào ống falcon 50mL, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã khảo sát ở mục 3.2.6
- Mẫu thử thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 0,1g bột dược liệu vào ống falcon
50mL, tiến hành xử lý mẫu như quy trình đã khảo sát, thêm chính xác 0,7mL chuẩn gốc
DK 97ppm và 2,5mL chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức, lắc đều trước khi lọc cho vào vial
Tiến hành chạy sắc kí trên 4 mẫu trên, so sánh các pic trên sắc kí đồ thu được
- Trên sắc kí đồ của mẫu trắng, không xuất hiện pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất phân tích trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn
- Trên sắc kí đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn, phải có pic xuất hiện tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất phân tích trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn (chênh lệch không quá 1,0%)
- Các thành phần khác trong bột dược liệu phải được tách hoàn toàn khỏi hoạt chất chính với Rs ≥ 1,5
- Hoạt chất chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có phổ trùng với phổ của chất chuẩn (chồng phổ cho hệ số Match ≥ 0,998)
- Pic của hoạt chất chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử và thử thêm chuẩn phải có purity angle < purity threshold
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm, dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm và dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian DK 9,7ppm và DDK 24ppm như mục 2.1.3
18 Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian DK 9,7ppm và DDK 24ppm với các nồng độ sau:
Bảng 2.1 Dãy nồng độ đường chuẩn
Nồng độ DDK (ppm) 0,24 1,2 2,4 3,6 6,0 12,0 24,0 Cách pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc như sau:
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp C7 là dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian
- Hút chính xác 5,00mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C6
- Hút chính xác 2,50mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C5
- Hút chính xác 1,50mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C4
- Hút chính xác 1,00mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C3
- Hút chính xác 5,00mL dung dịch chuẩn C3 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C2
- Hút chính xác 1,00mL dung dịch chuẩn C3 vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C1
- Hệ số tương quan R của đường chuẩn phải có giá trị > 0,998
- Độ chệch (%) tại nồng độ nhỏ nhất của khoảng tuyến tính (gần LOQ) không quá 20%, độ chệch tại các nồng độ còn lại trên khoảng tuyến tính không quá 15%
2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp
Cách xác định: LOD, LOQ được xác định dựa vào tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N)
Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu trắng và xác định giá trị S/N tương ứng LOD là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 3 lần nhiễu đường nền
19 (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N), thường xác định giá trị LOQ dựa trên giá trị LOD qua công thức:
2.3.3.5 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát lựa chọn các điều kiện sắc ký HPLC
3.1.1 Khảo sát lựa cột sắc ký
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp DK và DDK với nồng độ DK 9,7ppm và DDK 24ppm Điều kiện máy HPLC pha động MeOH-H2O 50:50 và điều kiện cố định: nhiệt độ cột 35,0℃, tốc dộ dòng 1,0mL/phút, bước sóng phát hiện 300nm
Tiến hành chạy thử mẫu chuẩn hỗn hợp trên máy HPLC với 2 cột sắc ký:
- Cột sắc ký Inertsil đ C8-3 (5 àm, 4,6 ì 150 mm)
- Cột sắc ký Agilent 5 HC-C18(2) (5àm, 150x4,6mm)
Kết quả được thể hiện qua hình 3.1
Hình 3.1 Kết quả khảo sát cột sắc ký
Cột C18 (Rs ~1,7) có khả năng tách hai chất tốt hơn cột C8 (Rs~1,2) Do đó lựa chọn cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5àm, 150x4,6mm) để sử dụng trong phương phỏp
3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động
Tiến hành khảo sát hai pha động:
- Acetonitril-Acid acetic 1% 50:50– pha động A
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ DK là 9,7ppm và DDK là 24ppm Điều kiện mỏy HPLC với cột Agilent 5 HC C18(2) (5àm, 150x4,6mm) và điều kiện cố định: nhiệt độ cột 35,0℃, tốc dộ dòng 1,0mL/phút, bước sóng phát hiện 300nm Tiến hành chạy HPLC mẫu chuẩn hỗn hợp với 2 pha động Kết quả được thể hiện qua hình 3.2
Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động A và B
Cả hai pha động đều có khả năng tách hai hoạt chất DK và DDK tốt (Rs của pha động A ~ 1,8; Rs của pha động B ~ 2,0), tuy nhiên pha động B cho thời gian lưu của hai chất ngắn hơn Do đó lựa chọn pha động B là MeOH–H2O 70:30 (tt/tt) làm pha động sắc ký trong phương pháp này
3.1.3 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện Điều kiện mỏy HPLC với cột Agilent 5 HC C18(2) (5àm, 150x4,6mm) và điều kiện cố định: nhiệt độ cột 35,0℃, pha động MeOH-H2O 70:30 (tt/tt) tốc dộ dòng 1,0mL/phút Tiến hành quét phổ cho phổ hấp thụ của chuẩn DK và chuẩn DDK như hình 3.4 và 3.4
Hình 3.3 Phổ hấp thụ của DK
Hình 3.4 Phổ hấp thụ của DDK
23 Kết quả cho thấy DK có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 343nm, nhưng tại khoảng bước sóng 280nm thì lại có độ hấp thụ cực tiêu Phổ hấp thụ của DDK cho thấy DDK có cực đại hấp thụ ở bước sóng ~280nm (281,2nm), tuy nhiên tại bước sóng 343nm thì độ hấp thụ của DDK lại là cực tiểu Do đó lựa chọn bước sóng phát hiện cho DK là 343nm và bước sóng phát hiện cho DDK là 280nm
3.1.4 Tổng kết khảo sát điều kiện sắc ký
Thông qua khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện sắc ký cho phương pháp phân tích như sau:
- Pha tĩnh: cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5àm, 150x4,6mm)
- Pha động: dung dịch MeOH-H 2 O tỉ lệ 70:30 (tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,0mL/phút
- Bước sóng phát hiện: + DK: 343nm
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu được tiến hành trên mẫu thử bột riềng ấm có mã 1C có hàm ẩm là H%=5,9%
3.2.1 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu
Tiến hành xử lý mẫu với 3 quy trình đã nêu ở mục 2.3.1, mỗi quy trình làm lặp lại 3 lần (n=3) Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4 Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1
Bảng 3.1 Hàm lượng DK và DDK có trong mẫu thử khi xử lý với 3 quy trình
Hình 3.1 Biểu đồ so sánh hiệu quả xử lý mẫu của 3 quy trình xử lý
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK chiết từ mẫu khi xử lý bằng quy trình 2 và quy trình 1 gần như tương đương nhau, quy trình 3 thấp hơn hẳn so với hai quy trình còn lại Đối với DDK, hàm lượng DDK chiết từ quy trình 3 là cao nhất, quy trình 1 thấp hơn không đáng kể, quy trình 3 thấp hơn hẳn hai quy trình còn lại Do đó lựa chọn quy trình 1 và tiến hành khảo sát tối ưu hóa các điều kiện chiết mẫu
3.2.2 Khảo sát lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết mẫu
Tiến hành khảo sát 5 tỷ lệ dung môi chiết mẫu: MeOH-H2O 30:70; MeOH-H2O 50:50; MeOH-H2O 70:30; MeOH 100% và H2O 100% Mỗi tỷ lệ dung môi làm lặp lại
3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4 Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.2
Bảng 3.2 Hàm lượng DK và DDK có trong mẫu thử khi xử lý với các tỷ lệ dung môi
Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 5 tỷ lệ dung môi
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK chiết từ mẫu khi xử lý bằng dung môi
MeOH-H2O 3:7, MeOH-H2O 5:5 không có sự khác biệt và cao hơn hàm lượng DK chiết được với các tỷ lệ dung môi còn lại Đối với DDK, hàm lượng DDK chiết bằng dung môi H2O 100%, MeOH-H2O 3:7, có sự khác biệt không đáng kể, và đều cao hơn các tỷ lệ dung môi còn lại Do đó lựa chọn dung môi MeOH-H2O 30:70 để xử lý mẫu
3.2.3 Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm mẫu
Tiến hành khảo sát 3 mốc thời gian siêu âm mẫu trong 1 lần chiết: 5 phút, 15 phút, 30 phút Mỗi mốc thời gian làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4
Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.3 sau và phụ lục 1
Hình 3.3 Biểu đồ so sánh hiệu quả siêu âm 5 phút, 10 phút và 15 phút
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK và DDK khí mẫu được chiết ở 3 mốc thời gian khác nhau không đáng kể Do đó lựa chọn thời gian siêu âm trong một lần chiết là 5 phút
3.2.4 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ siêu âm mẫu
Tiến hành khảo sát 4 mốc nhiệt độ siêu âm mẫu: ~28℃ (nhiệt độ phòng), 40℃, 50℃, 60℃ Mỗi nhiệt độ siêu âm làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4
Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.4 và phụ lục 2
Hình 3.4 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 4 mốc nhiệt độ
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK khi siêu âm ở nhiệt độ phòng là thấp nhất, 3 nhiệt độ còn lại khác nhau không đáng kể Đối với DDK, hàm lượng DDK khi siêu âm với nhiệt độ 50℃ là cao nhất Do đó lựa chọn nhiệt độ siêu âm là 50℃
3.2.5 Khảo sát lựa chọn số lần chiết mẫu
Tiến hành khảo sát xử lý mẫu với 1 lần chiết, 2 lần chiết và 3 lần chiết Mỗi 1 lần chiết, 2 lần chiết và 3 lần chiết làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4
Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.5 và phụ lục 3
Hình 3.5 Biểu đồ so sánh hiệu quả khi chiết mẫu với số lần khác nhau
Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK và DDK khi chiết mẫu lặp lại 2 lần và
3 lần khác nhau không đáng kể và đều cao hơn so với chiết mẫu 1 lần Ngoài ra, khi lọc lấy bã sau 2 lần chiết, tiến hành chiết bã và phân tích thì không còn phát hiện DK và DDK trong bã (phụ lục 3) Do đó lựa chọn chiết mẫu lặp lại 2 lần
3.2.6 Điều kiện xử lý mẫu
Sau khi khảo sát các điều kiện xử lý mẫu, phương pháp xử lý đối với mẫu bột riềng ấm được tổng kết lại như sau:
Bột riềng ấm đã đồng nhất
Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL
Vortex, siêu âm 5 phút với nhiệt độ 50℃ (1)
Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2)
Thêm 30mL MeOH 30% vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 1 lần
(tương ứng với 2 lần chiết)
Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi MeOH (có thể pha loãng đến nồng độ thích hợp để tín hiệu của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính) Lọc qua màng lọc 0,45àm và tiến hành chạy sắc ký HPLC
Thẩm định phương pháp
3.3.1 Đánh giá độ ổn định hệ thống
Chuẩn bị một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ DK là 2,5ppm và DDK là 6ppm Tiến hành tiêm mẫu lặp lại 6 lần Kết quả đánh giá thể hiện ở bảng 3.3 và phụ lục 4
Bảng 3.3 Kết quả độ ổn định hệ thống
Lần tiêm Thời gian lưu (phút)
Diện tích pic Spic (mAU.s)
Diện tích pic Spic (mAU.s)
Kết quả trên cho thấy đối với hoạt chất DK, thời gian lưu của 6 lần tiêm có RSD là 0,1