trần quang huy xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất 5 6 dehydrokavain dk và dihydro 5 6 dehydrokavain ddk trong bột riềng ấm nhật bản alpinia zerumbet bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng c

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN QUANG HUY

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HOẠT

CHẤT 5,6-DEHYDROKAVAIN (DK) VÀ DIHYDRO-5,6-DEHYDROKAVAIN (DDK) TRONG BỘT RIỀNG ẤM NHẬT

BẢN (Alpinia zerumbet) BẰNG KỸ THUẬT

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

CHẤT 5,6-DEHYDROKAVAIN (DK) VÀ DIHYDRO-5,6-DEHYDROKAVAIN (DDK) TRONG BỘT RIỀNG ẤM NHẬT

BẢN (Alpinia zerumbet) BẰNG KỸ THUẬT

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Lâm Hồng 2 ThS Lê Hồng Dũng

Nơi thực hiện: 1 Viện Dinh dưỡng Quốc gia 2 Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Trải qua một thời gian thực hiên đề tài với nhiều cố gắng và nỗ lực, tôi đã hoàn thành đề tài với kết quả tôt đẹp Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ đến từ thầy cô giáo, các anh chị nghiên cứu viên, gia đình và bạn bè

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS

Nguyễn Lâm Hồng và ThS Lê Hồng Dũng vì đã dành ra thời gian quý báu để hướng

dẫn, chỉ bảo tôi một cách tận tình trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin trận trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên ở khoa Hóa phần tích – Kiểm nghiệm thuốc đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Thị Cúc cùng toàn thể các anh chị cán

bộ nhân viên tại Khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dưỡng Quốc gia đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập và nghiên cứu tại khoa

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và bạn bè của tôi, những người đã luôn ở bên động viên chia sẻ mọi việc trong cuộc sống cũng như trong công việc Sự đồng hành của họ đã tạo ra động lực to lớn cho tôi trong suốt những năm tháng học tập và nghiên cứu

Dù đã có nhiều cố gắng khi tiến hành khóa luận, tuy nhiên có thể vẫn còn những sai sót và hạn chế Tôi rất mong nhận được những ý kiến đóng góp và sửa đổi từ các thầy cô

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Trần Quang Huy

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

1.2.Tổng quan về hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và dehydrokavain (DDK) 7

1.3.Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.3.1.Nguyên tắc và cấu tạo hệ thống HPLC 11

1.3.2.Kỹ thuật HPLC với detector mảng diod quang (photodiode array detector – PDA) 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1.Nguyên vật liệu và thiết bị 13

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.2.Chất chuẩn 13

2.1.3.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 13

2.1.4.Dung môi, hóa chất 13

2.1.5.Thiết bị, dụng cụ 13

2.2.Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1.Xây dựng phương pháp phân tích 14

2.3.5.Phương pháp xử lý kết quả 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1.Khảo sát lựa chọn các điều kiện sắc ký HPLC 21

3.1.1.Khảo sát lựa cột sắc ký 21

3.1.2.Khảo sát lựa chọn pha động 21

3.1.3.Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện 22

3.1.4.Tổng kết khảo sát điều kiện sắc ký 23

3.2.Khảo sát quy trình xử lý mẫu 23

3.2.1.Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu 23

3.2.2.Khảo sát lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết mẫu 24

3.2.3.Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm mẫu 25

3.2.4.Khảo sát lựa chọn nhiệt độ siêu âm mẫu 26

3.2.5.Khảo sát lựa chọn số lần chiết mẫu 27

3.2.6.Điều kiện xử lý mẫu 27

3.3.Thẩm định phương pháp 28

3.3.1.Đánh giá độ ổn định hệ thống 28

3.3.2.Đánh giá độ đặc hiệu 28

3.3.3.Khoảng tuyến tính 30

3.3.4.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 31

3.3.5.Độ lặp lại và độ chính xác trung gian 32

3.3.6.Độ đúng của phương pháp (độ thu hồi) 33

3.4.Ứng dụng phương pháp trong phân tích mẫu thực tế 35

3.4.1.Ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu bột Riềng ấm353.4.2.Ứng dụng phương pháp để đánh giá hai hoạt chất DK và DDK trong cây riềng nếp (Alpinia galanga) 35

3.5.Bàn luận 36

3.5.1.Về phương pháp xử lý mẫu 36

3.5.2.Về phương pháp phân tích 37

3.5.3.Về kết quả phân tích trên mẫu thực tế 37

3.5.4.Về phân tích hai hoạt chất DK và DDK trong cây riềng nếp (Alpinia galanga) 37

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38

KẾT LUẬN 38

ĐỀ XUẤT 39

Tài liệu tham khảo 40

PHỤ LỤC

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống cAMP Cyclic adenosine monophosphate Amp vòng

COA Certificate of Analysis Chứng nhận phân tích DDK Dihydro-5,6-dehydrokavain

DK 5,6-Dehydrokavain DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl GC/MS Gas Chromatography/Mass

Spectroscopy

Hệ thống sắc ký khí quang

phổ khối GDPH Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase Enzym GDPH trong chuyển

hóa lipid

HIV Human Immuno-deficiency Virus Virus gây suy giảm miễn dịch

ở người HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MeOH Methanol

PDA Photodiode Array Detector Detector mảng diod quang RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối TLTK Tài liệu tham khảo

tt/tt Thể tích/ thể tích UV-VIS UltraViolet-Visible Spectroscopy Quang phổ tử ngoại - khả kiến

2

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm của DK và DDK Bảng 1.2 So sánh hiệu quả các dung môi chiết với DK và DDK Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích DK và DDK

Bảng 1.4 Hàm lượng DK và DDK trong các bộ phận của cây riềng ấm Bảng 2.1 Dãy nồng độ đường chuẩn

Bảng 3.1 Hàm lượng DK và DDK có trong mẫu thử khi xử lý với 3 quy trình Bảng 3.2 Hàm lượng DK và DDK có trong mẫu thử khi xử lý với các tỷ lệ dung môi Bảng 3.3 Kết quả độ ổn định hệ thống

Bảng 3.4 Kết quả khoảng tuyến tính của DK Bảng 3.5 Kết quả khoảng tuyến tính của DDK Bảng 3.6 Kết quả LOD và LOQ

Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian Bảng 3.9 Kết quả độ đúng DK

Bảng 3.10 Kết quả độ đúng DDK Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu thực tế

3

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cây riềng ấm Hình 1.2 Bột lá riềng ấm và viên thực phẩm chức năng từ cây riềng ấm Hình 1.3 Cấu tạo hệ thống HPLC

HÌnh 1.4 Cấu tạo detector PDA Hình 3.1 Kết quả khảo sát cột sắc ký Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động A và B Hình 3.3 Phổ hấp thụ của DK

Hình 3.4 Phổ hấp thụ của DDK Hình 3.1 Biểu đồ so sánh hiệu quả xử lý mẫu của 3 quy trình xử lý Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 5 tỷ lệ dung môi Hình 3.3 Biểu đồ so sánh hiệu quả siêu âm 5 phút, 10 phút và 15 phút Hình 3.4 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 4 mốc nhiệt độ Hình 3.5 Biểu đồ so sánh hiệu quả khi chiết mẫu với số lần khác nhau Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn DK (343nm) và DDK (280nm) Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng ở 343nm và 280nm

Hình 3.8 Chồng phổ DK của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn so với mẫu chuẩn Hình 3.9 Chồng phổ DDK của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn so với mẫu chuẩn Hình 3.10 Phổ hấp thụ của pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chuẩn

DDK (280nm) trên hai mẫu thân rễ riềng nếp

4

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, con người đang có xu hướng tìm đến những sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên, đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật

Cây Riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) từ lâu đã được người dân các nước

như Nhật Bản, Trung Quốc, Philipines…sử dụng trong các bài thuốc dân gian Cây Riềng ấm Nhật Bản có chứa các hoạt chất có tác dụng dược lý như các flavonoid, tannin, kavapyron và terpenoid [8] Bột cây riềng ấm Nhật Bản có thể được sử dụng làm nguyên liệu cho các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng giúp kiểm soát cân nặng, ngăn ngừa lão hóa Trung tâm y học Makise Clinic & Makise Lifeup Laboratary, Nhật Bản đã nghiên cứu quy trình trồng với quy mô lớn và sản xuất ra các sản phẩm từ cây riềng ấm (Jipang Ginger) tại vùng đảo Okinawa (hình 1.2)

Nhận thấy tiềm năng của cây Riềng ấm Nhật Bản, Viện Nghiên cứu phát triển Vùng đã nghiên cứu tuyển chọn giống, vùng nguyên liệu và thí nghiệm trên quy mô nhỏ tại Việt Nam Từ nguồn dược liệu này, Viện Nghiên cứu phát triển Vùng đã tạo ra bột riềng ấm làm nguyên liệu cho nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe với tác dụng kiểm soát cân nặng và ngăn ngừa lão hóa Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho bột riềng ấm được sản xuất từ nguồn dược liệu ở Việt Nam là rất cần thiết Trước hết, cần phải có phương pháp phân tích hai hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong mẫu bột riềng ấm

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, khóa luận tốt nghiệp “Xây dựng và thẩm định

phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và

Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet) bằng

kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” đã được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật

5,6-Bản (Alpinia zerumbet) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2 Ứng dụng phương pháp vào thực tế để định lượng hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong một số mẫu bột riềng ấm Nhật Bản

(Alpinia zerumbet) được trồng tại Việt Nam

5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Riềng ấm Nhật Bản (Alpinia zerumbet)

Phân loại thực vật học của cây Riềng ấm (Alpinia zerumbet):

Bộ: Bộ Gừng (Zingiberales) Họ: Gừng (Zingiberaceae) Phân họ: Alpinioideae Chi: chi Riềng (Alpinia) Loài: A Zerumbet Tên khoa học: Alpinia Zerumbet (Pers)

Hình 1.1a Cây riềng ấm

Hình 1.1b Hoa của cây riềng ấm Hình 1.1c Quả của cây riềng ấm

Hình 1.1 Cây riềng ấm

Cây riềng ấm (còn có các tên tiếng Việt khác như riềng đẹp; sẹ nước; gừng ấm;

thảo đậu khấu; đại thảo khấu) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), chi Riềng (Alpinia), có

nguồn gốc từ Đông Á Riềng ấm là cây thảo cao khoảng 2 - 3m Rễ to, mập Lá cây có phiến to, dài 25 - 70cm, rộng khoảng 6 - 10cm, cuống lá dài 2 - 5mm, mép cao 1,2cm Cụm hoa ở ngọn, rủ xuống, dài 20 - 40cm, trục đầy lông; lá bắc con dài 20 - 30mm làm thành bao trắng, chóp; hồng; đài cao 2cm; cánh hoa 2,5cm, môi dài 3,5cm, vàng có sọc đỏ; nhị dài khoảng 25mm; bầu vàng, đầy lông Quả to, đường kính 2cm, đỏ, có lông Cây Riềng ấm ra hoa vào khoảng tháng 3 đến tháng 4, có quả vào tháng 7 đến tháng 10 [4]

Cây riềng ấm phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Trung Quốc và Việt Nam Ở Việt Nam cây mọc rải rác ở các tỉnh phía Bắc qua các tỉnh miền Trung vào đến Tây Ninh và Bà Rịa - Vũng Tàu Cây mọc hoang trong rừng ở những nơi ẩm và mát [4]

Cây riềng ấm từ lâu đã được sử dụng như một loại gia vị và một loại thuốc cổ truyền ở một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippines, Malaysia… điều trị các

6 chứng bệnh liên quan đến tim mạch, trị bệnh đau bụng hay đắp lên vết thương chống viêm nhiễm [22], [23]

Các nghiên cứu cho thấy cây riềng ấm có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý như flavonoid, tannin, kavapyron và terpenoid [7], trong đó các kavapyron trong cây riềng ấm đang được các nhà khoa học quan tâm

Cây riềng ấm có tác dụng chống oxi hóa và chống lão hóa tốt Nghiên cứu của Pham Thi Be Tu [18] cho thấy tinh dầu chiết từ lá cây riềng ấm có đặc tính chống oxi hóa mạnh khi được thử nghiệm với các tác nhân oxi hóa như 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH); muối diamoni 2,2ʹ-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) (ABTS); oxit nitric; oxy nhóm đơn và xanthyn oxidase Tinh dầu chiết từ lá cây riềng ấm còn có khả năng chống lại hắc tố và enzyme lão hóa, chẳng hạn như collagenase, tyrosinase, hyaluronidase và elastase

Tác dụng chống béo phì của cây riềng ấm cũng đã được nghiên cứu trong các nghiên cứu trước đó Thử nghiệm trên tế bào mỡ 3T3-L1 cho thấy cây riềng ấm với các hoạt chất nhóm kavalacton có tiềm năng rất lớn trong việc chống béo phì [20] Ngoài ra các nghiên cứu còn cho thấy cây riềng ấm có tác dụng kháng virus [7] và ngăn ngừa sự lây lan của tế bào ung thư [10], [24]

Đã có quan điểm đưa ra rằng cây riềng ấm góp phần kéo dài tuổi thọ của người dân tại Okinawa, Nhật Bản – nơi được biết đến là vùng có tuổi thọ trung bình rất cao [17] Hiện nay ở Nhật Bản đã có nhiều thực phẩm chức năng từ cây riềng ấm (hình 1.2) Tuy nhiên, do vấn đề khí hậu và địa lý, cây riềng ấm chỉ có thể sinh trưởng ở vùng Okinawa ở Nhật Bản Các chuyên gia từ Nhật Bản nhận thấy điều kiện tự nhiên ở Việt Nam phù hợp với cây riềng ấm, qua đó viện Nghiên cứu và phát triển Vùng đã tiến hành nghiên cứu về cây riềng ấm trồng tại Việt Nam nhằm phát triển nguyên liệu bột dược liệu riềng ấm để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe

Hình 1.2 Bột lá riềng ấm và viên thực phẩm chức năng từ cây riềng ấm

5,6-Dehydrokavain (DK) Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) Công

thức cấu tạo

Công thức: C14H12O3 Công thức:C14H14O3

Tên gọi [12], [13]

- Danh pháp IUPAC:

4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]pyran-2-one - Danh pháp khác:

+ 5,6-Dehydrokavain + Desmethoxyyangonin + 5,6-Dehydrokawain

- Danh pháp IUPAC: 4-methoxy-6-(2-phenylethyl)pyran-2-one - Danh pháp khác:

+ Dihydro-5,6-dehydrokavain + 7,8-Dihydro-5,6-dehydrokawain + 5,6-Dehydro 7,8-dihydrokavain Tính

chất vật lý [12], [13]

- Dạng bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt

- Phân tử lượng: 228,24 g/mol - XlogP3-AA: 2,8

- Tan trong nước, methanol - Nhiệt độ nóng chảy: 138 - 140℃

- Dạng bột kết tinh màu trắng - Phân tử lượng: 230,26 g/mol - XlogP-AA: 2,7

- Tan trong nước, methanol - Nhiệt độ nóng chảy: 96-97℃ [23]

5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) thuộc nhóm kavalacton Kavalacton là một nhóm các hợp chất lacton ban đầu được tìm thấy trong cây kava Ngoài DK và DDK, một số hợp chất thuộc nhóm kavalacton khác phải kể đến như kavain, yagonin, methysticin… [11] Dựa trên cấu trúc pyron trong phân tử, các kavalacton được phân loại thành các nhóm từ A đến D phụ thuộc vào sự hiện diện hoặc vắng mặt của liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Cụ thể, các kavalacton thuộc nhóm A đều không có liên kết đôi ở hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Ngược lại, các kavalacton thuộc nhóm B chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 7, 8; còn nhóm C có liên kết chưa bão hòa ở cả

8 hai vị trí 5, 6 và 7, 8 Các kavalacton nhóm D chỉ có liên kết chưa bão hòa ở vị trí 5, 6 Theo đó, DK là một kavalacton thuộc nhóm C, còn DDK thuộc nhóm D [23]

1.2.2 Tác dụng dược lý của hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và

Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK)

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của các kavalacton tìm có trong các lại thực vật, đặc biệt là hai hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong cây riềng ấm

Các nghiên cứu hiện đại cho thấy rằng hai hoạt chất DK và DDK có khả năng chống béo phì [17], [19], [20] Cụ thể, các hợp chất này làm tăng giải phóng cAMP và glycerol nội bào, ức chế tích lũy lipid và giảm hàm lượng chất béo trung tính Hơn nữa, chúng ức chế GPDH và lipase tuyến tụy và không có hoạt tính gây độc tế bào có thể đo lường được đối với tế bào mỡ 3T3-L1 trong ống nghiệm Nhìn chung, các kết quả cho thấy DK và DDK có tiềm năng mạnh mẽ trong vai trò chống béo phì [20]

DK và DDK còn có khả năng kháng virus HIV và virus cúm [7] DK và DDK làm ức chế men tích hợp (HIV-1 integrase) - loại men cần thiết để đưa DNA của vi rút HIV vào DNA của tế bào chủ Với virus cúm, chúng ức chế hoạt động của kháng nguyên bề mặt neuraminidase (NA), ngăn chặn quá trình phóng thích virus từ các tế bào bị nhiễm sang tế bào khỏe mạnh, từ đó hạn chế sự lây lan và phát triển của bệnh [7]

Đặc biệt, nghiên cứu của Walter và cộng sự [10] cho thấy DK có khả năng kháng ung thư thông qua việc ức chế mạnh các tế bào glioblastoma (u nguyên bào thần kinh đệm) và tác dụng vừa phải trên tất cả các dòng tế bào khối u khác Nghiên cứu của Yen Thi‐Kim Nguyen [24] sử dụng phương pháp MTT đã chỉ ra rằng DK đã giảm đáng kể việc di chuyển và xâm chiếm của tế bào MDA ‐ MB ‐ 231; từ đó có tác dụng chống xâm lấn và chống di căn các tế bào ung thư

1.2.3 Một số phương pháp phân tích hoạt chất 5,6-Dehydrokavain (DK) và

Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK)

1.2.3.1 Dung môi chiết mẫu

Dựa theo tính chất lý hóa của DK và DDK, các nghiên cứu thường lựa chọn dung môi chiết mẫu là các dung môi thân nước như nước, methanol, aceton Nghiên cứu của Tran Dang Xuan [23] cho thấy sự khác biệt về khả năng chiết DK và DDK của các dung môi đối với đối tượng nghiên cứu là rễ cây kava, từ đó có thể xem xét áp dụng những dung môi đó trong việc chiết mẫu bột riềng ấm

9

Bảng 1.2 So sánh hiệu quả các dung môi chiết với DK và DDK

Hoạt chất Lượng chiết được (mg/g dung môi chiết)

Nước Acetone Chloroform Methanol Ethanol Hexane DK 6,7 21,0 7,6 4,3 2,1 2,7 DDK 22,9 27,1 4,7 4,7 2,1 1,9

1.2.3.2 Phương pháp phân tích DK và DDK trong mẫu

Các tài liệu khoa học đã công bố trước đây có một số phương pháp phân tích Dehydrokavain và Dihydro-5,6-dehydrokavain

5,6-Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích DK và DDK

STT Đối tượng

nghiên cứu

Kỹ thuật phân

tích

Điều kiện phân tích Dung môi

chiết mẫu TLTK

1 Cây riềng ấm

(Alpinia

zerumbet)

HPLC/UV-VIS

Điều kiện sắc ký không được nêu rõ

Methanol, Hexan, Chlorofrom Nước

[14]

2 Cây riềng ấm

(Alpinia

zerumbet)

HPLC - PDA

-Cột C8 Inertsil® (35 µm, 4,6 × 150 mm), nhiệt độ cột: 35℃

- Pha động: chế độ đẳng dòng A – B: 50 - 50 +Pha động A: MeOH 100%

+Pha động B: Acid acetic 1%/H2O

- Thể tích tiêm mẫu: 10µl - Tốc độ dòng: 1mL/phút - Bước sóng:

+DK: 343nm +DDK: 280nm

Alpinia zezumbet

PDA

HPLC Pha động: acetonitril (31% tt/tt) pH = 2,3

- Tốc độ dòng:1,0 mL/phút, chạy đẳng dòng

- Cột: LiChrospher 60 RP select B

Phương pháp chiết lỏng-lỏng và SPE Nước nóng 4 Rễ cây Piper

methysticum HPLC

- Cột TSK gel ODS-100Z (15 µm, 0,46cm; i.d 5µm)

Phương pháp chiết

[7], [20]

10 Lá và thân rễ

cây riềng ấm

Alpinia zezumbet

Lá và cành cây giọt sành

Pavetta indica

-Pha động: 0,1% acid acetic và MeOH, chạy gradient -Tốc độ: 0,8 mL/phút - Bước sóng: 280nm

lỏng-lỏng và SPE Nước nóng MeOH

DAD

HPLC Cột: Shim-pack GIS C18 (250 × 4.6mm, 5µm ODS) -Pha động: acetonitril/H2O: 50/50, chạy đẳng dòng -Tốc độ: 1,0 mL/phút -Thể tích tiêm: 10 µl -Bước sóng: 343nm

[24]

5 Thân rễ, lá tươi

cây Alpinia

speciosa

HPLC/UV-VIS

-Cột pha đảo Megapak sil C18 (10 × 250 mm, 10 µm) -Pha động: H2O/MeOH : 30/70

-Tốc độ: 3 mL/phút - Bước sóng: 280nm

Nước nóng, [16]

6 Thân rễ cây

Alpinia speciosa và Angelica pubescens

HPLC/UV-VIS

-Cột: Nucheosil 5C8 (250 × 4 mm, 5 pm)

-Pha động: acetonitril : H2O : diethylamin (50 : 50 : 0,1); Ph = 3 ( điều chỉnh bằng acid orthophosphoric) -Tốc độ: 1 mL/phút - Bước sóng: 281nm

[15]

7 Viên con nhộng chứa chiết xuất từ cây kava

GC/MS

-Cột mao quản HP-5MS (30m x 0,25 mm với màng 0,25 µm)

-Chương trình nhiệt độ: 40°C trong 4 phút, sau đó tăng lên 275°C với tốc độ 8°C/phút

-Khí mang là Heli -Nhiệt độ kim phun: 280°C -Lưu lượng lọc: 50mL/phút -Năng lượng điện tử đặt ở 70 eV và điện áp 1529V -Tốc độ quét dữ liệu 9 lần/giây, phạm vi m/z là 50-600

[21]

11 DK và DDK là hai hoạt chất chính có hàm lượng khá cao trong cây riềng ấm [23] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng DK và DDK có mặt trong tất cả các bộ phận của cây riềng ấm, bao gồm lá, thân, thân rễ, hoa và hạt [23] Tuy nhiên, hàm lượng DK và DDK ở mỗi bộ phận của cây không giống nhau Một nghiên cứu ở Nhật Bản cho thấy sự khác biệt về hàm lượng của DK và DDK trong một số bộ phận của cây riềng ấm (bảng 1.4) [23]

Bảng 1.4 Hàm lượng DK và DDK trong các bộ phận của cây riềng ấm

Hoạt chất Hàm lượng (mg/g tính theo khối lượng tươi)

Lá Thân Thân rễ 5,6-Dehydrokavain 10,0 20,0 100,0 Dihydro-5,6-dehydrokavain 410,0 80,0 350,0

Hàm lượng của DK và DDK ở trong lá và thân rễ cao hơn nhiều so với các bộ phận khác Giả thiết đặt ra rằng DK và DDK có vai trò nhất định trong cơ chế ức chế cảm nhiễm của cây riềng ấm, giúp chúng ức chế sự phát triển của các loài thực vật khác trong vùng lân cận và mở rộng quần thể của nó trong hệ sinh thái thực vật [23] Ngoài ra, hàm lượng DK và DDK trong cây có thể khác nhau phụ thuộc vào nguồn giống, địa điểm trồng và thời gian thu hoạch trong năm [23]

Tóm lại, trong cây riềng ấm, hai hoạt chất 5,6 dehydrokavain (DK) và

dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) là hai hoạt chất chính có hàm lượng cao DK và DDK góp

phần quan trọng trong các tác dụng dược lý của cây riềng ấm Với việc sản xuất bột riềng ấm từ nguồn dược liệu tại Việt Nam để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe ngăn ngừa lão hóa và kiểm soát cân nặng, việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về hàm lượng DK và DDK trong bột riềng ấm là cần thiết Chính vì thế, yêu cầu cấp

bách là tiến hành đề tài ‘xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hai hoạt chất DK và DDK trong bột riềng ấm Nhật Bản”

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.1 Nguyên tắc và cấu tạo hệ thống HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến sự phân bố của chúng giữa hai pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà có những kỹ thuật sắc ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký đồng phân quang học

12 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Hệ thống cấp pha động, bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột và pha tĩnh, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu

Hình 1.4 Cấu tạo detector PDA

13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là hai hoạt chất 5,6-dehydrokavain (DK) và dehydrokavain (DDK) trong cây riêng ấm

dihydro-5,6-Đối tượng mẫu phân tích được lựa chọn là các mẫu bột riềng ấm được gửi từ công ty CPHC Thực phẩm Châu Á và được mã hóa từ 1C đến 5C

2.1.2 Chất chuẩn

Chất chuẩn DK: Desmethoxyyangonin 89184 (PhytoLab, Đức), hàm lượng hoạt

chất 97%, bảo quản ở 2-8 oC

Chất chuẩn DDK: 5,6-Dehydro 7,8-dihydrokavain 84467 (PhytoLab, Đức), hàm

lượng hoạt chất 100%, bảo quản ở 2-8 oC 2.1.3 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm: cân chính xác khoảng 10,0mg chất chuẩn DK vào

trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH

Dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm: cân chính xác khoảng 12,0mg chất chuẩn DDK

vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH

Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian: Hút 10,00mL dung dịch chuẩn gốc DK

97ppm và 20,00mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức 100,0mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta có chuẩn hỗn hợp DK 9,7ppm và DDK 24ppm

Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: từ dung dịch chuẩn hỗn hợp, pha dãy dung

dịch chuẩn làm việc có nồng độ DK từ 0,097ppm đến 9,7ppm, nồng độ DDK từ 0,24ppm đến 24ppm

2.1.4 Dung môi, hóa chất

Các dung môi được sử dụng là: Nước cất; methanol (MeOH); acetone; nước khử ion 18Ω; Methanol (MeOH) của Merk - Đức; acetonitril (ACN) của Merk - Đức

2.1.5 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài: hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance Waters 2695; cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5µm, 150x4,6mm); máy ly tâm lạnh Universal 32R Hettich (Đức); bể rửa siêu âm Elmasonic S120H (Đức); tủ sấy Bider ED53 (Đức), cân phân tích Mettler Toledo ME 204T/00 (d = 0,1 mg; max 120g); cân phân tích Mettler Balance XSR105DU (d = 0,01mg; max

14 120g), tủ HOT 37W; máy xay Philips 600W, máy lắc vortex DAIHAN Scientific VM-10

Các dụng cụ được sử dụng bao gồm: ống falcon 50mL; bình định mức chính xác 10mL, 20mL, 100mL; micropipet 1000µL, 5000µL; Pipet Pasteur; vial sẫm màu chạy sắc ký lỏng; màng lọc PTFE 0,45 µm (Mỹ); cốc có mỏ, ống đong và các dụng cụ thủy tinh khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hoạt chất dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong bột riềng ấm Nhật

5,6-Bản (Alpinia zerumbet) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các nội

dung sau: - Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phân tích: khảo sát lựa chọn cột sắc ký, khảo sát lựa chọn pha động và khảo sát lựa chọn bước sóng phân tích

- Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu và các điều kiện của quy trình xử lý mẫu: khảo sát lựa chọn tỷ lệ dung môi, khảo sát lựa chọn thời gian chiết mẫu, khảo sát lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu và khảo sát lựa chọn số lần chiết mẫu

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Sau khi xây dựng được phương pháp phân tích, tiến hành thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu sau dựa theo các tài liệu tham khảo bao gồm: Độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu (độ chọn lọc), khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (limit of detection-LOD) và giới hạn định lượng (limit of quantitation-LOQ), độ chính xác (độ lặp lại), độ đúng (độ thu hồi)

2.2.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành định lượng hoạt chất chất dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong một số mẫu bột riềng ấm Nhật Bản được trồng tại Việt Nam

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để tiến hành định tính hoạt chất chất dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) trong mẫu thân rễ và lá của

5,6-cây riềng nếp Việt Nam (Alpinia galanga)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Quy trình xử lý mẫu

Sau khi tham khảo các tài liệu khoa học, dựa trên tình hình thực tế tại cơ sở, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn một quy trình xử lý mẫu trong các quy trình sau:

15

- Quy trình 1:

Bột riềng ấm đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL

+ 30mL MeOH Vortex, siêu âm 15 phút với nhiệt độ 40℃ (1) Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2) Thêm 30mL MeOH vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) Thêm 2 lần

(tương ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi MeOH

Lọc qua màng lọc 0,45µm, cho vào vial và chạy HPLC

- Quy trình 2:

Bột riềng ấm đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL

+ 30mL Aceton Vortex, siêu âm 15 phút với nhiệt độ 40℃ (1) Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2) Thêm 30mL Aceton vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 2 lần (tương

ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi Aceton

Lọc qua màng lọc 0,45µm, cho vào vial và chạy HPLC

- Quy trình 3:

Bột riềng ấm đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào bình nón 100mL

+ 30mL H2O Đun sôi cách thủy 20 phút (1) Để lắng, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2) Thêm 30mL H2O vào bình nón rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 2 lần

(tương ứng với 3 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi H2O

Lọc qua màng lọc 0,45µm, cho vào vial và chạy HPLC

16 Sau khi lựa chọn được quy trình xử lý mẫu, tiến hành khảo sát lựa chọn các điều kiện cho quy trình xử lý mẫu đó

2.3.2 Điều kiện sắc ký phân tích

Trong nghiên cứu này, phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector PDA (HPLC-PDA) đã được sử dụng Mẫu phân tích được xử lý và đưa vào phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng

Điều kiện sắc ký được tham khảo từ các tài liệu trước đó, sau đó lựa chọn điều kiện tối ưu thông qua khảo sát cột C8 và C18; khảo sát các pha động Acetonitril-Acid acetic 1% 50:50 (tt/tt) và MeOH-H2O 70:30 (tt/tt)

Kết quả sắc ký được thể hiện qua phần mềm của hệ thống HPLC

Cách xác định: Chuẩn bị 1 mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ gần với nồng độ hoạt

chất có trong mẫu thử Tiêm lặp lại 6 lần Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần tiêm sắc ký

Độ phù hợp hệ thống được đánh giá thông qua sự lặp lại của thời gian lưu và diện tích pic của các chất phân tích trong mẫu chuẩn

+ Chuẩn gốc DK 97ppm: cân chính xác 10,0mg chất chuẩn DK vào trong bình

định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH

17

+ Dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm: cân chính xác 12,0mg chất chuẩn DDK

vào trong bình định mức 100,0mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH

+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian: Hút chính xác 10,00mL dung dịch chuẩn

gốc DK 97ppm và 20,00mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức 100,0mL, định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta có chuẩn hỗn hợp DK 9,7ppm và DDK 24ppm

+ Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: Hút chính xác 2,50mL dung dịch chuẩn

hỗn hợp trung gian vào bình định mức 10,00mL, định mức đến vạch bằng dung

môi MeOH, ta có mẫu chuẩn hỗn hợp làm việc DK 2,425ppm và DDK 6ppm

- Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,1g bột dược liệu vào ống falcon 50mL, tiến

hành xử lý mẫu theo quy trình xử lý mẫu đã khảo sát ở mục 3.2.6

- Mẫu thử thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 0,1g bột dược liệu vào ống falcon

50mL, tiến hành xử lý mẫu như quy trình đã khảo sát, thêm chính xác 0,7mL chuẩn gốc DK 97ppm và 2,5mL chuẩn gốc DDK 120ppm vào bình định mức, lắc đều trước khi lọc cho vào vial

Tiến hành chạy sắc kí trên 4 mẫu trên, so sánh các pic trên sắc kí đồ thu được

- Các thành phần khác trong bột dược liệu phải được tách hoàn toàn khỏi hoạt chất chính với Rs ≥ 1,5

- Hoạt chất chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có phổ trùng với phổ của chất chuẩn (chồng phổ cho hệ số Match ≥ 0,998)

- Pic của hoạt chất chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử và thử thêm chuẩn phải có purity angle < purity threshold

18 Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc từ dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian DK 9,7ppm và DDK 24ppm với các nồng độ sau:

Bảng 2.1 Dãy nồng độ đường chuẩn

Dung dịch chuẩn C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 Nồng độ DK (ppm) 0,097 0,485 0,97 1,455 2,425 4,85 9,7 Nồng độ DDK (ppm) 0,24 1,2 2,4 3,6 6,0 12,0 24,0 Cách pha các dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc như sau:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp C7 là dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian

- Hút chính xác 5,00mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C6

- Hút chính xác 2,50mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C5

- Hút chính xác 1,50mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C4

- Hút chính xác 1,00mL dung dịch chuẩn C7 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C3

- Hút chính xác 5,00mL dung dịch chuẩn C3 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C2

- Hút chính xác 1,00mL dung dịch chuẩn C3 vào bình định mức 10,00mL, định

mức đến vạch bằng dung môi MeOH, ta được dung dịch chuẩn hỗn hợp C1

Yêu cầu:

- Hệ số tương quan R của đường chuẩn phải có giá trị > 0,998 - Độ chệch (%) tại nồng độ nhỏ nhất của khoảng tuyến tính (gần LOQ) không quá

20%, độ chệch tại các nồng độ còn lại trên khoảng tuyến tính không quá 15%

2.3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ

không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử

mà ta có thể định lượng được theo phương pháp đã xây dựng với độ chính xác và độ đúng thích hợp

Cách xác định: LOD, LOQ được xác định dựa vào tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N)

Thêm chuẩn với nồng độ giảm dần vào mẫu trắng và xác định giá trị S/N tương ứng LOD là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 3 lần nhiễu đường nền

19 (S/N=3), LOQ là giá trị nồng độ mà tại đấy tín hiệu đo lớn hơn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N=10), thường xác định giá trị LOQ dựa trên giá trị LOD qua công thức:

LOQ = 3 x LOD

2.3.3.5 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian

• Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại diễn tả độ chụm của các kết quả của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn

Cách xác định:

Tiến hành xử lý mẫu và phân tích 6 mẫu thử riêng biệt trên cùng một mẫu bột dược liệu C1 và tính toán độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử Hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử được tính theo công thức:

trong đó: Spic là diện tích pic của hoạt chất trên sắc ký đồ của mẫu thử (mAU.s)

a và b lần lượt là hệ số góc và hệ số chắn của đường chuẩn D là độ pha loãng mẫu thử (tính theo mL)

m là khối lượng cân mẫu thử (g) H% là hàm ẩm của mẫu thử

Yêu cầu:

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không được vượt quá 2,7%(RSD≤ 2,7%) đối với

chất phân tích có hàm lượng trong mẫu trong khoảng 0,1%-1% theo AOAC 2016 [6]

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của 12 mẫu không được vượt quá 4,0% (RSD ≤

4,0%) đối với chất phân tích có hàm lượng trong mẫu nằm trong khoảng 0,1% - 1% theo AOAC 2016 [6]

2.3.3.6 Độ đúng Cách tiến hành:

%HL=

(Spic-b) x D

x 100% a x m x H% x1000

20 Thêm vào mẫu bột riềng ấm (đã biết trước nồng độ hoạt chất DK và DDK) một lượng chính xác chất chuẩn DK và DDK để thu được mẫu ở 3 mức nồng độ 50%, 100%, 150% so với hàm lượng hoạt chất có trong mẫu thử khảo sát (mỗi mức nồng độ làm 6 mẫu):

- Mẫu thêm chuẩn 50%: Cân chính xác khoảng 0,025g mẫu bột riềng ấm đã đồng nhất vào ống falcon 50mL, thêm chính xác 0,35mL dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm và 1,25mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào ống falcon, tiến hành chiết mẫu theo quy trình chiết mẫu đã khảo sát

- Mẫu thêm chuẩn 100%: Cân chính xác khoảng 0,05g mẫu bột riềng ấm đã đồng nhất vào ống falcon 50mL, thêm chính xác 0,7mL dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm và 2.5mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào ống falcon, tiến hành chiết mẫu theo quy trình chiết mẫu đã khảo sát

- Mẫu thêm chuẩn 150%: Cân chính xác khoảng 0,1g mẫu bột riềng ấm đã đồng nhất vào ống falcon 50mL, thêm chính xác 0,7mL dung dịch chuẩn gốc DK 97ppm và 2.5mL dung dịch chuẩn gốc DDK 120ppm vào ống falcon, tiến hành chiết mẫu theo quy trình chiết mẫu đã khảo sát

Độ thu hồi được tính theo công thức:

% Độ thu hồi = Lượng chuẩn tìm được (mg) X 100%

Lượng chuẩn thêm vào (mg)

Sử dụng phương pháp để tiến hành định tính và định lượng sơ bộ hoạt chất dehydrokavain (DK) và Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) mẫu lá và thân rễ của cây Riềng nếp (mẫu thu thập trên địa bàn Hà Nội), nhằm bước đầu khảo sát tìm nguồn dược liệu có chứa hai hoạt chất DK và DDK tại Việt Nam

5,6-2.3.5 Phương pháp xử lý kết quả

Kết quả phân tích được xử lý bằng phần mềm Empower của hãng Waters Các kết quả được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel

Hình 3.1 Kết quả khảo sát cột sắc ký

Cột C18 (Rs ~1,7) có khả năng tách hai chất tốt hơn cột C8 (Rs~1,2) Do đó lựa chọn cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5µm, 150x4,6mm) để sử dụng trong phương pháp

3.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động

Tiến hành khảo sát hai pha động: - Acetonitril-Acid acetic 1% 50:50– pha động A - MeOH-H2O 70:30 – pha động B

Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ DK là 9,7ppm và DDK là 24ppm Điều kiện máy HPLC với cột Agilent 5 HC C18(2) (5µm, 150x4,6mm) và điều kiện cố định: nhiệt độ cột 35,0℃, tốc dộ dòng 1,0mL/phút, bước sóng phát hiện 300nm Tiến hành chạy HPLC mẫu chuẩn hỗn hợp với 2 pha động Kết quả được thể hiện qua hình 3.2

22 Pha động A Pha động B

Hình 3.2 Kết quả khảo sát pha động A và B

Cả hai pha động đều có khả năng tách hai hoạt chất DK và DDK tốt (Rs của pha động A ~ 1,8; Rs của pha động B ~ 2,0), tuy nhiên pha động B cho thời gian lưu của hai chất ngắn hơn Do đó lựa chọn pha động B là MeOH–H2O 70:30 (tt/tt) làm pha động sắc ký trong phương pháp này

3.1.3 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện

Điều kiện máy HPLC với cột Agilent 5 HC C18(2) (5µm, 150x4,6mm) và điều kiện cố định: nhiệt độ cột 35,0℃, pha động MeOH-H2O 70:30 (tt/tt) tốc dộ dòng 1,0mL/phút Tiến hành quét phổ cho phổ hấp thụ của chuẩn DK và chuẩn DDK như hình 3.4 và 3.4

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của DK

Hình 3.4 Phổ hấp thụ của DDK

23 Kết quả cho thấy DK có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 343nm, nhưng tại khoảng bước sóng 280nm thì lại có độ hấp thụ cực tiêu Phổ hấp thụ của DDK cho thấy DDK có cực đại hấp thụ ở bước sóng ~280nm (281,2nm), tuy nhiên tại bước sóng 343nm thì độ hấp thụ của DDK lại là cực tiểu Do đó lựa chọn bước sóng phát hiện cho DK là 343nm và bước sóng phát hiện cho DDK là 280nm

3.1.4 Tổng kết khảo sát điều kiện sắc ký

Thông qua khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện sắc ký cho phương pháp phân tích như sau:

- Pha tĩnh: cột sắc ký Agilent 5 HC C18(2) (5µm, 150x4,6mm) - Pha động: dung dịch MeOH-H2O tỉ lệ 70:30 (tt/tt)

- Thể tích tiêm: 10µL - Tốc độ dòng: 1,0mL/phút - Bước sóng phát hiện: + DK: 343nm

+ DDK: 280nm

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu được tiến hành trên mẫu thử bột riềng ấm

có mã 1C có hàm ẩm là H%=5,9%

3.2.1 Khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu

Tiến hành xử lý mẫu với 3 quy trình đã nêu ở mục 2.3.1, mỗi quy trình làm lặp lại 3 lần (n=3) Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4 Kết

quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng DK và DDK có trong mẫu thử khi xử lý với 3 quy trình

Mẫu thử

Hàm lượng (mg/g)

Trung bình ± SD (mg/g)

Hàm lượng (mg/g)

Trung bình ± SD (mg/g) Quy trình 1

24

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh hiệu quả xử lý mẫu của 3 quy trình xử lý

Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK chiết từ mẫu khi xử lý bằng quy trình 2 và quy trình 1 gần như tương đương nhau, quy trình 3 thấp hơn hẳn so với hai quy trình còn lại Đối với DDK, hàm lượng DDK chiết từ quy trình 3 là cao nhất, quy trình 1 thấp hơn không đáng kể, quy trình 3 thấp hơn hẳn hai quy trình còn lại Do đó lựa chọn quy trình 1 và tiến hành khảo sát tối ưu hóa các điều kiện chiết mẫu

3.2.2 Khảo sát lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết mẫu

Tiến hành khảo sát 5 tỷ lệ dung môi chiết mẫu: MeOH-H2O 30:70; MeOH-H2O 50:50; MeOH-H2O 70:30; MeOH 100% và H2O 100% Mỗi tỷ lệ dung môi làm lặp lại

3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4 Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.2

Trung bình ± SD (mg/g)

Hàm lượng (mg/g)

Trung bình ± SD (mg/g) MeOH-H2O 3:7

25 MeOH 100%

Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 5 tỷ lệ dung môi

Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK chiết từ mẫu khi xử lý bằng dung môi MeOH-H2O 3:7, MeOH-H2O 5:5 không có sự khác biệt và cao hơn hàm lượng DK chiết được với các tỷ lệ dung môi còn lại Đối với DDK, hàm lượng DDK chiết bằng dung môi H2O 100%, MeOH-H2O 3:7, có sự khác biệt không đáng kể, và đều cao hơn các tỷ lệ dung môi còn lại Do đó lựa chọn dung môi MeOH-H2O 30:70 để xử lý mẫu

3.2.3 Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm mẫu

Tiến hành khảo sát 3 mốc thời gian siêu âm mẫu trong 1 lần chiết: 5 phút, 15 phút, 30 phút Mỗi mốc thời gian làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1

trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4

Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.3 sau và phụ lục 1

26

Hình 3.3 Biểu đồ so sánh hiệu quả siêu âm 5 phút, 10 phút và 15 phút

Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK và DDK khí mẫu được chiết ở 3 mốc thời gian khác nhau không đáng kể Do đó lựa chọn thời gian siêu âm trong một lần chiết là 5 phút

3.2.4 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ siêu âm mẫu

Tiến hành khảo sát 4 mốc nhiệt độ siêu âm mẫu: ~28℃ (nhiệt độ phòng), 40℃, 50℃, 60℃ Mỗi nhiệt độ siêu âm làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1

trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4

Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.4 và phụ lục 2

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh hiệu quả chiết mẫu của 4 mốc nhiệt độ

Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK khi siêu âm ở nhiệt độ phòng là thấp nhất, 3 nhiệt độ còn lại khác nhau không đáng kể Đối với DDK, hàm lượng DDK khi siêu âm với nhiệt độ 50℃ là cao nhất Do đó lựa chọn nhiệt độ siêu âm là 50℃

27

3.2.5 Khảo sát lựa chọn số lần chiết mẫu

Tiến hành khảo sát xử lý mẫu với 1 lần chiết, 2 lần chiết và 3 lần chiết Mỗi 1 lần chiết, 2 lần chiết và 3 lần chiết làm lặp lại 3 lần (n=3) Xử lý mẫu theo quy trình 1 trong

mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4

Kết quả phân tích được thể hiện trong hình 3.5 và phụ lục 3

Hình 3.5 Biểu đồ so sánh hiệu quả khi chiết mẫu với số lần khác nhau

Từ kết quả trên cho thấy, hàm lượng DK và DDK khi chiết mẫu lặp lại 2 lần và 3 lần khác nhau không đáng kể và đều cao hơn so với chiết mẫu 1 lần Ngoài ra, khi lọc lấy bã sau 2 lần chiết, tiến hành chiết bã và phân tích thì không còn phát hiện DK và DDK trong bã (phụ lục 3) Do đó lựa chọn chiết mẫu lặp lại 2 lần

3.2.6 Điều kiện xử lý mẫu

Sau khi khảo sát các điều kiện xử lý mẫu, phương pháp xử lý đối với mẫu bột riềng ấm được tổng kết lại như sau:

Bột riềng ấm đã đồng nhất Cân chính xác khoảng 0,1g bột vào ống falcon 50mL + 30mL dung môi MeOH 30%

Vortex, siêu âm 5 phút với nhiệt độ 50℃ (1) Ly tâm, gạn dịch chiết vào bình định mức 100mL (2) Thêm 30mL MeOH 30% vào ống falcon rồi lặp lại bước (1) và (2) thêm 1 lần

(tương ứng với 2 lần chiết) Gộp dịch chiết, định mức vừa đủ đến 100mL bằng dung môi MeOH (có thể pha loãng đến nồng độ thích hợp để tín hiệu của mẫu thử nằm trong

khoảng tuyến tính) Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiến hành chạy sắc ký HPLC

Thời gian lưu (phút)

Diện tích pic Spic (mAU.s) 1 5,130 369389 4,262 144542 2 5,128 371184 4,259 144955 3 5,134 370038 4,263 144559 4 5,132 369779 4,261 144202 5 5,136 371399 4,263 144283 6 5,138 369509 4,265 145099 Trung

bình 5,133 370216.3 4,262 144606.7 SD ~0,0 865.2 ~0,0 357.4

Kết quả trên cho thấy đối với hoạt chất DK, thời gian lưu của 6 lần tiêm có RSD là 0,1<1,0%, diện tích pic của 6 lần tiêm có RSD là 0,2% <2,0% Đối với hoạt chất DDK, thời gian lưu của 6 lần tiêm có RSD là ~0,0<1,0%, diện tích pic của 6 lần tiêm có RSD là 0,2% <2,0% Kết luận là hệ thống có độ ổn định phù hợp đối với cả 2 hoạt chất DK và DDK

29 DK (bước sóng 343nm) DDK (bước sóng 280nm)

Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn DK (343nm) và DDK (280nm)

Ở sắc ký đồ mẫu trắng không phát hiện pic của hai hoạt chất DK ở bước sóng 343nm và DDK ở bước sóng 280nm (hình 3.6)

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng ở 343nm và 280nm

Đối với DK, trên sắc ký đồ của mẫu thử (tR=5,142) và mẫu thử thêm chuẩn (tR=5,165) xuất hiện pic tại thời gian lưu trùng với pic chuẩn DK trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (tR=5,130) Độ tinh khiết của pic hoạt chất trên mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn đều đạt

Mẫu thử và mẫu chuẩn Mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn

Hình 3.8 Chồng phổ DK của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn so với mẫu chuẩn

Đối với DDK, trên sắc ký đồ của mẫu thử (tR=4,268) và mẫu thử thêm chuẩn (tR=4,280) xuất hiện pic tại thời gian lưu trùng với pic chuẩn DK trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn (tR=4,263) Độ tinh khiết của pic hoạt chất trên mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn đều đạt

30 Mẫu thử và mẫu chuẩn Mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn

Hình 3.9 Chồng phổ DDK của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn so với mẫu chuẩn

Do vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu

3.3.3 Khoảng tuyến tính

Tiến hành chuẩn bị các mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ DK từ 0,097ppm –

9,7ppm, nồng độ DDK từ 0,24ppm – 24ppm theo như mục 2.3.3.3 Tiến hành chạy sắc

ký dãy các mẫu chuẩn hỗn hợp trên, ta có kết quả được thể hiện trong bảng 3.4, bảng 3.5 và phụ lục 6

Bảng 3.4 Kết quả khoảng tuyến tính của DK

STT Nồng độ

(ppm)

Diện tích pic (mAu.s)

Nồng độ tính theo đường

chuẩn (ppm)

Độ chệch (%)

Giới hạn độ

chệch (%) C1 0,097 18106 0,09 -2,9 20 C2 0,485 75817 0,48 -0,2 15 C3 0,97 146141 0,96 -1,1 15 C4 1,455 229129 1,52 4,4 15 C5 2,425 358602 2,39 -1,3 15 C6 4,85 716680 4,81 -0,8 15 C7 9,7 1442693 9,72 0,2 15

Phương trình hồi quy tuyến

tính

Hệ số tương quan R2= 0,9999 hay R=0,9999

Nồng độ tính theo đường

chuẩn (ppm)

Độ chệch (%)

Giới hạn độ

chệch (%) C1 0,24 8331 0,27 13,3 20 C2 1,2 29885 1,16 -3,1 15 C3 2,4 57635 2,31 -3,8 15 C4 3,6 91547 3,71 3,1 15 C5 6 146853 6,00 -0,1 15 C6 12 291940 11,99 -0,1 15 C7 24 534357 22,01 -8,3 15

Phương trình hồi quy tuyến

tính

Hệ số tương quan R2= 0,9998 hay R=0,9999

Đối với DK, trong khoảng nồng độ từ 0,097ppm đến 9,7ppm có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của chất nghiên cứu với hệ số tương quan R= 0,9999 >0.998 và độ chệch ở mỗi mốc nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép

Đối với DDK, trong khoảng nồng độ từ 0,24ppm đến 24ppm có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của chất nghiên cứu với hệ số tương quan R=0,9999 >0.998 và độ chệch ở mỗi mốc nồng độ đều nằm trong giới hạn cho phép

Vậy phương pháp đạt yêu cầu về khoảng tuyến tính đối với cả DK và DDK

3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa vào tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N) Từ nồng độ thấp nhất của đường chuẩn, tiến hành thêm chuẩn giảm dần nồng độ và phát hiện thấy tại mức nồng độ DK là 0,02425ppm xấp xỉ 0,025ppm, tỉ lệ S/N ≈ 3 Đối với DDK, tại mức nồng độ 0,06ppm phát hiện thấy tỉ lệ S/N ≈ 3 Giá trị LOQ dựa trên giá trị LOD qua công thức:

LOQ = 3 x LOD

y = 24202x + 1748.7R² = 0.9998

0100000200000300000400000

32 Kết quả được thể hiện qua bảng 3.6 và phụ lục 7

Bảng 3.6 Kết quả LOD và LOQ

STT Hoạt chất Giới hạn phát hiện (mg/g) Giới hạn định lượng (mg/g)

(g)

Thể tích định mức

(mL)

5,6-Dehydrokavain

(DK)

dehydrokavain

Dihydro-5,6-(DDK) Diện tích

pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg/g) 1 0,1029 100,0 186376 1,20 136605 5,45 2 0,0995 100,0 178781 1,19 130583 5,38 3 0,1036 100,0 192674 1,24 142316 5,64 4 0,1029 100,0 187509 1,21 137284 5,47 5 0,1021 100,0 185871 1,21 135372 5,44 6 0,1024 100,0 187019 1,21 135406 5,43

33

Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian

Chất phân tích STT

Khối lượng cân (g)

Thể tích định mức (mL)

Diện tích pic (mAU.s)

Hàm lượng (mg/g)

Trung bình (n=12)

RSD (%) (n=12)

Dehydrokavain

5,6-(DK)

1 0,1012 100,0 182161 1,20

1,21 1,1

2 0,1010 100,0 182115 1,20 3 0,1009 100,0 183689 1,21 4 0,1002 100,0 184577 1,22 5 0,1007 100,0 182973 1,21 6 0,1015 100,0 186882 1,23

Trung bình (n=6) 1,21

RSD (%) (n=6) 1,0

dehydrokavain

Dihydro-5,6-(DDK)

1 0,1012 100,0 132538 5,37

5,44 1,5

2 0,1010 100,0 131175 5,33 3 0,1009 100,0 134395 5,46 4 0,1002 100,0 134741 5,52 5 0,1007 100,0 131577 5,36 6 0,1015 100,0 133580 5,40

Trung bình (n=6) 5,41

RSD (%) (n=6) 1,3

Đối với DK, RSD độ lặp lại của phương pháp là 1,2% <2,7%, RSD độ chính xác trung gian của phương pháp là 1,1% <4,0% Đối với DDK, RSD độ lặp lại của phương pháp là 1,6% < 2,7%, RSD độ chính xác trung gian của phương pháp là 1,5% < 4,0% Phương pháp đạt yêu cầu về độ lặp lại đối với cả DK và DDK theo AOAC 2016

3.3.6 Độ đúng của phương pháp (độ thu hồi)

Nồng độ hoạt chất trong mẫu thử C1 đã được xác định:

Hoạt chất Nồng độ (mg/g) 5,6-Dehydrokavain (DK) 1,21

Dihydro-5,6-dehydrokavain (DDK) 5,44

Chuẩn bị và tiến hành phân tích các mẫu thử thêm chuẩn như mục 2.3.3.6 Kết

quả đánh giá độ thu hồi được thể hiện trong bảng sau 3.9 và 3.10

34

Bảng 3.9 Kết quả độ đúng DK

STT

Mức nồng độ

Khối lượng cân mẫu

thử (mg)

Lượng chuẩn

thêm vào (mg)

Diện tích pic

thêm chuẩn (mAU.s)

Lượng chuẩn tìm lại (mg)

Độ thu hồi (%)

Độ thu hồi trung bình

(%)

RSD (%)

1 50%

0,0260 0,035 98982 0,0328 96,5

97,1 0,5

2 0,0258 0,035 98985 0,0330 97,3 3 0,0266 0,035 100573 0,0331 97,6 4

100%

0,0512 0,07 193127 0,0661 97,3

97,6 0,6

5 0,0506 0,07 192080 0,0661 97,3 6 0,0497 0,07 191415 0,0667 98,2 7

150%

0,1013 0,07 284308 0,0674 99,3

99,1 0,3

8 0,1002 0,07 281833 0,0670 98,7 9 0,0994 0,07 280949 0,0674 99,3

Bảng 3.10 Kết quả độ đúng DDK

STT

Mức nồng độ

Khối lượng cân mẫu

thử (mg)

Lượng chuẩn

thêm vào (mg)

Diện tích pic

thêm chuẩn (mAU.s)

Lượng chuẩn tìm lại

(mg)

Độ thu hồi (%)

Độ thu hồi trung bình

(%)

RSD (%)

1 50%

0,0260 0,15 71591 0,1480 98,7

98,5 0,6

2 0,0258 0,15 71458 0,1485 99,0 3 0,0266 0,15 72062 0,1467 97,8 4

100%

0,0512 0,3 139692 0,2931 97,7

98,7 0,9

5 0,0506 0,3 140013 0,2977 99,2 6 0,0497 0,3 138774 0,2974 99,1 7

150%

0,1013 0,3 206154 0,2968 98,9

97,6 1,2

8 0,1002 0,3 203487 0,2917 97,2 9 0,0994 0,3 202030 0,2900 96,7

35 Đối với DK, độ thu hồi của các mẫu ở 3 mức nồng độ 50%, 100% và 150% so với nồng độ trong mẫu thử đều nằm trong khoảng 95,0%-105,0% Đối với DDK, độ thu hồi của các mẫu ở 3 mức nồng độ 50%, 100% và 150% so với nồng độ trong mẫu thử đều nằm trong khoảng 95,0%-105,0%

Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng theo AOAC 2016

3.4 Ứng dụng phương pháp trong phân tích mẫu thực tế

3.4.1 Ứng dụng phương pháp trong phân tích các mẫu bột Riềng ấm

Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để phân tích hàm lượng hai hoạt chất DK và DDK trong 5 mẫu bột cây riềng ấm (mẫu được gửi từ công ty CPHC Thực phẩm Châu Á, đã được mã hóa) Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.11

Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu thực tế

STT Mẫu Hàm ẩm (%) Hàm lượng DK

(mg/g)

Hàm lượng DDK (mg/g)

3.4.2 Ứng dụng phương pháp để đánh giá hai hoạt chất DK và DDK trong cây riềng

nếp (Alpinia galanga)

Ứng dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để phân tích hai hoạt chất DK và DDK trong cây riềng nếp nhằm mục đích tìm kiếm nguồn dược liệu chứa hai hoạt chất này ở Việt Nam Đối tượng mẫu nghiên cứu là thân rễ và lá của 2 mẫu cây riềng nếp thu thập được trên địa bàn Hà Nội

Mẫu thân rễ và lá được mã hóa thành TRRN1 (thân rễ riềng nếp 1), LRN1 (lá riềng nếp 1), TRRN2 (thân rễ riềng nếp 2) và LRN2 (lá riềng nếp 2) Mẫu được xử lý

với quy trình 1 trong mục 2.3.1 Chạy sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký đã được chọn ở mục 3.1.4 Kết quả sắc ký được thể hiện trong phụ lục 12

Tại bước sóng 343nm, trên sắc ký đồ của cả 2 mẫu thân rễ và 2 mẫu lá cây riềng nếp đều không có xuất hiện pic tại khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của DK trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn