Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời 6 tạp a, b, c, d, e, f của allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CỦA SINH VIÊN XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TẠP A,B,C,D,E,F CỦA ALLOPURINOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số đề tài: 21.T.KD.01 NGUYỄN DUY GIA BẢO THS LỮ THIỆN PHÚC CẦN THƠ – 2022 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG CỦA SINH VIÊN XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TẠP A,B,C,D,E,F CỦA ALLOPURINOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số đề tài : 21.T.KD.01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI ThS Lữ Thiện Phúc Nguyễn Duy Gia Bảo CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG PGS TS Dương Xuân Chữ Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN DUY GIA BẢO Tham gia đề tài: VƯƠNG VINH HƯNG TRƯƠNG LÊ MINH THƯ Cán hướng dẫn: THS LỮ THIỆN PHÚC Cần Thơ - Năm 2022 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Liên mơn Hố phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất Đây nơi học tập, nghiên cứu học hỏi thêm nhiều kiến thức Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy Ths.Ds Lữ Thiện Phúc, thầy người đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần dìu dắt giúp đỡ tơi giải khó khăn śt trình học tập thực nghiên cứu Thầy đã truyền đạt kiến thức đồng thời khơi gợi tơi lịng nhiệt huyết đam mê với nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy PGS.Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ – Trưởng Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, cùng với tập thể thầy giáo Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất đã tận tình bảo, truyền đạy kiến thức kinh nghiệm bổ ích Tơi xin gửi lời cảm ơn đến bạn Vương Vinh Hưng, Trương Lê Minh Thư, bạn cộng đắc lực đã cùng tơi hồn thành nghiên cứu Đồng thời, tơi gửi lời cảm ơn đến anh Ths.Ds Huỳnh Huỳnh Anh Thi - người anh trước đã hướng dẫn bảo tận tình, chia sẻ kinh nghiệm quý báu Tôi cảm ơn đến bạn lớp Dược K43 đã làm nghiên cứu Liên mơn Hố phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, bạn đã giúp đỡ trải qua khoảnh khắc tuyệt vời trình thực nghiên cứu Một lần xin gửi lời cảm ơn lời chúc sức khoẻ đến tất người! ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng nhóm nghiên cứu chúng tơi hướng dẫn Thầy Ths.Ds Lữ Thiện Phúc Các kết quả, số liệu luận văn trung thực chưa cơng bớ cơng trình khác Cần Thơ, ngày 15 tháng 05 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Duy Gia Bảo iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii PHẦN TÓM TẮT ĐỀ TÀI vii PHẦN TỒN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU .xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii DANH MỤC HÌNH ẢNH xiv DANH MỤC BẢNG xvi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan allopurinol 1.1.1 Tính chất vật lý 1.1.2 Tính chất hoá học 1.1.3 Tính chất dược lý 1.2 Tổng quan tạp chất liên quan allopurinol 1.2.1 Tạp chất A 1.2.2 Tạp chất B 1.2.3 Tạp chất C 1.2.4 Tạp chất D 1.2.5 Tạp chất E 1.2.6 Tạp chất Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2-cyanoethyl)amino pyrazol-4carboxylat 10 1.2.7 Tính chất dược lý độc tính tạp allopurinol 11 1.2.8 Giới hạn cho phép tạp chất allopurinol theo Dược điển nước 12 1.3 Kiểm nghiệm tạp chất allopurinol nguyên liệu chế phẩm allopurinol theo Dược điển nước 12 1.3.1 Kiểm nghiệm allopurinol nguyên liệu theo DĐVN V 12 iv 1.3.2 Kiểm nghiệm allopurinol nguyên liệu theo Dược điển Mỹ (USP44) 15 1.3.3 Kiểm nghiệm allopurinol nguyên liệu theo Dược điển Anh (BP 2021) 18 1.4 Tóm tắt cơng trình nghiên cứu định lượng allopurinol tạp chất liên quan 20 1.5 Sắc kí lỏng ghép đầu dị khới phổ hai lần 21 1.5.1 Hệ thớng sắc kí lỏng ghép đầu dị khới phổ hai lần 21 1.5.2 Đầu dị khới phổ ba tứ cục 22 1.5.3 Một số chế độ bắt ion đầu dị khới phổ ba tứ cực 23 1.6 Thẩm định qui trình định lượng tạp thành phẩm nguyên liệu thuốc theo hướng dẫn ICH Q2(R2) 24 Chương ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Chất chuẩn, hóa chất, th́c thử thiết bị 27 2.2.1 Chất chuẩn; hố chất th́c thử; mẫu thử 27 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Chuẩn bị mẫu 29 2.3.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu định lượng đồng thời tạp A, B, C, D, E, F định lượng allopurinol 31 2.3.3 Khảo sát điều kiện sắc kí tới ưu định lượng đồng thời tạp A, B, C, D, E, F định lượng allopurinol 31 2.3.4 Xây dựng thẩm định qui trình định lượng đồng thời tạp allopurinol định lượng allopurinol kỹ thuật LC/MS/MS 32 v 2.3.5 Định lượng đồng thời tạp allopurinol nguyên liệu thành phẩm allopurinol 35 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1 Khảo sát điều kiện khối phổ sắc kí 37 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu 37 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí tới ưu định lượng đồng thời tạp allopurinol định lượng allopurinol 40 3.2 Thẩm định quy trình phân tích định lượng đồng thời tạp A,B,C,D,E,F định lượng allopurinol 41 3.2.1 Tính tương thích hệ thống 41 3.2.2 Tính đặc hiệu-chọn lọc 43 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 45 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 46 3.2.5 Độ 49 3.2.6 Độ xác độ xác trung gian 52 3.3 Ứng dụng qui trình đã thẩm định để định lượng tạp mẫu nguyên liệu thành phẩm allopurinol thị trường 55 Chương BÀN LUẬN 70 4.1 Xây dựng quy trình định lượng 70 4.1.1 Điều kiện khối phổ 70 4.1.2 Điều kiện sắc kí 73 4.2 Thẩm định quy trình định lượng 74 4.2.1 Tính tương thích hệ thống 74 4.2.2 Tính đặc hiệu 74 4.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng 75 4.2.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 75 4.2.5 Độ độ xác 75 vi 4.3 So sánh quy trình định lượng với DĐVN V; Dược điển nước cơng trình cơng bớ 75 4.3.1 Trong nguyên liệu 75 4.3.2 Trong thành phẩm 77 4.4 Ứng dụng qui trình phân tích đã thẩm định mẫu nguyên liệu thành phẩm allopurinol thị trường 78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO xv PHỤ LỤC xviii vii PHẦN TÓM TẮT ĐỀ TÀI I PHẦN MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ ngành công nghiệp dược giới, ngành dược Việt Nam ngày phát triển với 220 nhà máy sản xuất đạt GMP-WHO, GMP-EU, sản xuất thành phẩm, đa phần th́c generic, phổ biến nhóm thuốc kháng viêm, thuốc điều trị bệnh gout, kháng sinh, đái tháo đường, tim mạch Trong nhóm th́c điều trị bệnh gout mãn tính hay tăng acid uric huyết, allopurinol đã Bộ Y tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu lần VII năm 2018, định thường quy điều trị bệnh gout tăng uric huyết thứ phát hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư Hiện nay, ngành công nghiệp dược phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu allopurinol nhập từ cơng ty nước ngồi Do đó, việc kiểm tra chất lượng tạp nguyên liệu thành phẩm trước trình lưu hành yêu cầu bắt buộc quy định DĐVN V; BP 2021; USP 44 Trong tạp chất A, B, C, D, E chứng minh tác dụng lên gen HLAB*5801 gây hội chứng steven Jonhson[8], tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat (tạp F theo USP standard 2022) thuộc nhóm cấu trúc có khả gây ung thư, đột biến gen Tạp A B tạp phân hủy allopurinol cần kiểm nguyên liệu thành phẩm Trong quy trình Dược Điển hành định lượng tạp nhóm tạp đầu dò UV-VIS dãy iod quang, hệ số phân giải tạp thấp, đặc biệt tạp B C Chưa có quy trình tới ưu để định lượng đồng thời tạp thành phẩm allopurinol Hiệp hội hịa hợp q́c tế (ICH) năm 2022 bước đầu hướng dẫn định lượng tạp chất liên quan phương pháp sắc ký lỏng đầu dị khới phổ bước tiến lĩnh vực phân tích chất có hàm lượng viii thấp Xuất phát từ lý trên, đề tài “Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời tạp A,B,C,D,E,F allopurinol phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” lựa chọn để thực Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời tạp A, B, C, D, E, tạp F allopurinol hệ thống sắc ký lỏng ghép đầu dị khới phổ hai lần tứ cực (LC-MS/MS) Ứng dụng quy trình định lượng tạp chất liên quan số nguyên liệu thành phẩm allopurinol thị trường II TĨM TẮT VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Năm 2001, Xiuhua Sun cộng đã ứng dụng kỹ thuật điện di mao quản để định lượng allopurinol chất chuyển hóa đầu dị điện cực (amperometric) với giới hạn phát 10-8 mol/lít [15] Năm 2014, Sajan PG cộng đã xây dựng qui trình định lượng allopurinol tạp A, B, C, D, E kỹ thuật UPLC đầu dò UV Thời gian phân tích đã rút ngắn khoảng 12 phút với giới hạn phát đạt 0,002% đến 0,006% Tuy nhiên qui trình chưa định lượng tạp Ethyl-(E/Z)-3-(2-carbethoxy-2cyanoethyl)amino pyrazol-4-carboxylat có khả gây đột biến gen [11] Hiện chưa có quy trình định lượng đồng thời tạp A,B,C,D,E,F allopurinol nguyên liệu thành phẩm phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC/MS/MS) 71 Dung môi pha mẫu lựa chọn thành phần vừa có khả hịa tan tớt chất phân tích, vừa làm tăng tín hiệu chất đầu dò Kết cho thấy thành phần acetonitril cao làm tăng rõ rệt tín hiệu chất acetonitril làm tăn khả bay pha động Tuy nhiên việc lựa chọn thành phần pha động phụ thuộc vào điều kiện sắc kí, với acetonitril acid formic vừa cho khả ion hóa tớt, vừa phù hợp với chương trình gradient pha động sắc kí Có thể acid formic cung cấp nhiều H+ giúp ion hóa tớt chất phân tích Thể tích phun Thể tích phun ảnh hưởng lớn đến tín hiệu pic Việc tăng thể tích phun làm tăng tín hiệu dễ dàng nhận biết thực nghiệm, nhiên thể tích phun cao, việc bay dung mơi để ion hóa khơng đáp ứng kịp thời làm giảm tín hiệu chất phân tích Với hệ thớng LC-MS/MS thực nghiệm nghiên cứu, nhóm nghiên cứu lựa chọn thể tích phun có dịng LC µL/phút Điều vừa đáp ứng việc thu nhận tín hiệu cao, vừa hạn chế làm bẩn hệ thống Thế mao quản (capilary voltage) Thế mao quản ảnh hưởng trực tiếp đến trình ion hóa ion chất, nên việc lựa chọn mao quản phù hợp quan trọng Nếu sử dụng mao quản cao thì nhiệt độ cao từ mao quản làm tăng trình oxy hoá khử thành phần mẫu dẫn đến mao quản dễ bị ăn mịn lão hố Nếu sử dụng mao quản q thấp thì khơng ion hóa hết chất phân tích dẫn đến tín hiệu thấp Vì vậy, mao quản nhóm dùng để khảo sát 4kV để phân tích tạp vừa tối ưu tín hiệu chất vừa kéo dài tuổi thọ thiết bị Nhiệt độ hóa tốc độ dịng khí hóa 72 Nhiệt độ hóa tớc độ dịng khí hóa phải khảo sát cùng lúc để tránh việc đọng lại dung mơi khơng hóa kịp thời Luồng khí nitơ đặt đồng trục với mao quản giúp hình thành giọt nhỏ đầu mao quản giúp giọt co lại dần giao diện ESI Do nhiệt độ hóa tớc độ dịng khí hóa ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu ion hóa Về bản, đới với tớc độ rửa giải định, tớc độ dịng khí phun phải tới ưu hóa Việc lựa chọn giá trị tớc độ dịng khí nhiệt độ hóa phải phù hợp dựa thông số khác Thế cone (cone voltage) Thế cone sử dụng để hướng ion phân tích vào tứ cực, tách ion từ vùng áp suất khí nguồn ion vào vùng chân không sâu Vì vậy, giá trị cone đặc biệt quan trọng tối ưu tín hiệu ion Thế cone tăng lên dẫn đến vận tốc ion tăng xảy va chạm với khí khác (hơi dung mơi, dịng khí hóa hơi) dẫn đến phân mảnh Vì lựa chọn cone phù hợp làm tăng tín hiệu chất phân tích giảm nhiễu tín hiệu Năng lượng va chạm (collision energy) Năng lượng va chạm thông số quan trọng phân tích MRM Việc lựa chọn lượng thích hợp cho nhiều phân mảnh mục tiêu có tín hiệu ổn định Kết khảo sát cho thấy va chạm cho ion phân mảnh có m/z lớn thì tín hiệu ổn định so với ion có m/z nhỏ vì sử dụng lượng va chạm lớn, ion mẹ dễ dàng vỡ thành mảnh nhỏ Tuy nhiên, sử dụng lượng va chạm cao, ion mẹ vỡ nhiều mảnh ion có phân tử khới vơ cùng nhỏ dẫn đến khó xác định cấu trúc phân mảnh ion 73 4.1.2 Điều kiện sắc kí Q trình phân tích LC - MS/MS gồm hai giai đoạn: tách LC xác định MS/MS Trong nghiên cứu này, kỹ thuật sắc kí lỏng pha đảo đã sử dụng với pha tĩnh C12 Khảo sát pha động tối ưu Trong q trình khảo sát pha động tới ưu, lần lược dung môi acetonitril, acetonitril kết hợp với nước, acetonitril kết hợp với acid formic 0,05% 0,1% nước khảo sát Kết cho thấy sử dụng chất điều chỉnh pH acid formic