Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng .... Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần
TỔNG QUAN
Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là những mảnh đa giỏc, hỡnh đĩa rất nhỏ, đường kớnh 2 – 4 àm, khụng có nhân Tiểu cầu được sinh ra từ mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) trong tủy xương rồi vào máu [8]
1.1.1 Cấu trúc của tiểu cầu
Màng tiểu cầu là các glycoprotein (trong đó GPIb, GPIIb và GPIIIa đóng vai trò chính trong hiện tượng kết dính) và các phospholipid (có yếu tố III tiểu cầu – hoạt hóa quá trình đông máu) GPIb là protein xuyên màng, liên kết với yếu tố von Willebrand, là bước đầu tiên trong hoạt động cầm máu của tiểu cầu GPIIb/IIIa là protein màng, hoạt động phụ thuộc Ca ++ , liên kết với fibrinogen giúp tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu Mặt ngoài màng là nơi có các yếu tố đông máu hấp thụ vào [9]
Hệ thống các hạt đặc hiệu
Các hạt đặc chứa các chất kích hoạt tiểu cầu như ADP, ATP, Ca ++ , serotonin, histamin và epinephrine Các hạt alpha gồm có các protein kết dính (yếu tố von Willebrand, thrombospondin, fibronectin), các yếu tố tăng trưởng tiểu cầu (PDGH – platelet derived growth factor), các yếu tố đông máu và tiêu sợi huyết (fibrinogen, yếu tố V), trong tiểu cầu còn có một hệ thống co gồm có actin và myosin [10], [11]
Hệ thống vi ống và vi sợi
Các vi ống nằm sát dưới màng tiểu cầu, bao quanh tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích Các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, đóng vai trò là kho dự trữ Ca ++ , đồng thời là nơi tổng hợp cyclooxigenase và prostaglandin của tiểu cầu Và các vi sợi bản chất là các sợi actin tham gia vào tạo giả túc của tiểu cầu [10], [12]
Hệ thống các kênh mở là hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường vào trong tế bào chất
4 của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi bị hoạt hóa [13]
Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mạc bị phá vỡ, các tổ chức dưới nội mạc như collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), màng nền, vi sợ được bộc lộ Lúc này hiện tượng dính và ngưng tập tiểu cầu xảy ra [14]
Khả năng bám dính của tiểu cầu:
Bình thường tiểu cầu không dính vào thành mạch máu do một số chất ức chế dính của tiểu cầu như prostaglandin nhưng khi thành mạch bị tổn thương tiểu cầu lập tức được hoạt hóa và dính vào nơi bị tổn thương Tiểu cầu sẽ tiếp xúc với yếu tố Willebrand, vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu [15] vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với
GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [13]
Khả năng ngưng tập (aggregation) của tiểu cầu:
Tiểu cầu có khả năng kết dính với nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu gọi là ngưng tập tiểu cầu Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin,… các chất này được gọi là “chất kích hoạt” tiểu cầu Trong đó, ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [13] Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP: bình thường các tiểu cầu không ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự thoái hoá ATP thành ADP Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngoài vào) thì phản ứng này bị ức chế, do đó gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập Hiện nay vai trò của phospholipid màng (cụ thể là acid arachidonic (AA) đã được chứng minh tham gia vào sự ngưng tập tiểu cầu nhờ sự
5 tương tác giữa các yếu tố kích tập với phospholipid màng và các men như cyclo- oxigenase và thromboxan synthetase [14]
Hình 1.1 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP (- -: ức chế, ngăn cản)
Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [13]
Khả năng chế tiết của tiểu cầu:
Với sự có mặt của collagen hoặc thrombin hoạt hóa sẽ dẫn đến tăng chế tiết của các hạt tiểu cầu bao gồm ADP, serotonin, fibrinogen, men lysosom, beta- thromboglobulin, heparin, collagen và thrombin hoạt hóa quá trình tổng hợp prostaglandin tiểu cầu Ngoài tác dụng làm tăng tính thấm thành mạch các hạt tiểu
Adrenosin Xâm nhập vào tiểu cầu và trở thành ATP
Tiểu cầu bị ngưng tập
6 cầu còn có tác dụng làm tăng thấm mạch, hoạt hóa protein C, tạo thromboxan A2 và prostacyclin Từ đây một chuỗi phản ứng, bao gồm tăng thấm mạch, giảm Ca ++ , ức chế ngưng tập tiểu cầu sẽ xảy ra [14]
Khi tiểu cầu đến khu vực mạch máu bị tổn thương, chúng được kích hoạt bởi một loạt chất chủ vận bao gồm ADP, thrombin, thromboxanes… tương tác với các thụ thể xuyên màng [16] Kết quả quá trình hoạt động chuyển hóa trong nồng độ cao của Ca ++ bào tương và phosphoryl hóa các protein bề mặt mang lại thay đổi hình dạng tiểu cầu, giải phóng các chất trong hạt α và hạt đặc, kích thích phospholipase A2 và giải phóng thromboxan A2 (TXA2), cảm ứng bề mặt gây đông máu và kích hoạt thụ thể GPIIb/IIIa TXA2 được tổng hợp bởi tiểu cầu kích hoạt từ acid arachidonic thông qua con đường cyclooxigennase (COX), sau khi hình thành TXA2 khuếch tán qua màng tế bào và kích hoạt tiểu cầu khác Ở các tiểu cầu TXA2 liên kết với các thụ thể, cặp đôi với G-protein (Gq , G12 , hoặc G13) tất cả đều kích hoạt phospholipase C Enzym này chuyển hóa phosphoinositid màng, ví dụ phosphatidylinositol 4,5- biphosphat (PIP2) thành tín hiệu truyền tin thứ hai inositoltrisphosphat (IP3) và diacylglycerol (DAG) DAG kích hoạt protein kinase C nội bào (PKC) gây phosphoryl hóa protein, làm tăng hoạt tính Ca ++ , IP3 làm tăng nồng độ Ca ++ từ hệ thống các ống dày đặc vào bào tương [17], [18] ADP được giải phóng từ tiểu cầu và hồng cầu, tiểu cầu trình diện ít nhất hai thụ thể của ADP là P2Y12 và P2Y1 chúng kết cặp với Gq và Gi tương ứng Hoạt hóa của P2Y12 ức chế adenyl cyclase làm giảm AMP vòng (cAMP: cyclic adenosin monophosphat), hoạt hóa P2Y1 là nguyên nhân của sự gia tăng Ca ++ nội bào Thụ thể P2Y12 là thụ thể chính để khuếch đại và duy trì hoạt hóa của tiểu cầu đáp ứng với ADP Thrombin nhanh chóng được tạo ra tại các điểm tổn thương của mạch máu từ prothrombin, là trung gian tạo fibrin [13]
1.1.4 Các thuốc chống kết tập tiểu cầu
Thuốc chống kết tập tiểu cầu làm giảm khả năng kết tập tiểu cầu, ức chế quá trình hình thành huyết khối [16] Các loại thuốc chống kết tập tiểu cầu thường được sử dụng được trình bày dưới đây
1.1.4.1 Thuốc ức chế COX – aspirin
Thuốc ức chế enzym cyclooxigenase (COX), dẫn đến ức chế tổng hợp prostaglandin, thromboxan và các sản phẩm khác như prostacyclin của cyclooxigenase Có hai loại enzym COX: COX-1 thường được tìm thấy trong các mô tế bào bình thường của cơ thể (COX-1 duy trì bình thường niêm mạc dạ dày; chức năng thận và tiểu cầu) trong khi COX-2 chủ yếu thấy ở vị trí viêm, bị kích thích tăng tạo prostaglandin do các cytokin và trung gian hóa học của quá trình viêm Cơ chế ức chế enzym COX của aspirin khác biệt hẳn so với các thuốc chống viêm không steroid khác Aspirin gắn cộng trị với cả hai loại COX dẫn đến ức chế không đảo ngược hoạt tính của enzym này, do đó thời gian tác dụng của aspirin liên quan đến tốc độ vòng chuyển hóa của cyclooxigenase [3] Aspirin ức chế enzym COX-1 ngăn chặn sự chuyển hóa arachidonic acid do đó ức chế tổng hợp prostaglandin G2 và prostaglandin H2, ức chế tổng hợp TXA2, tiểu cầu không ngưng tập được [16] So với giả dược, điều trị bằng aspirin đã được báo cáo làm giảm 44% nguy cơ nhồi máu cơ tim (MI) trên bệnh nhân dự phòng tiên phát [19] Aspirin làm giảm nguy cơ xảy ra biến cố tim mạch: bệnh nhân có tiền sử đột quị, thiếu máu cục bộ, đau thắt ngực ổn định và làm giảm tỷ lệ tử vong trên bệnh nhân đau thắt ngực ổn định [20], [21]
1.1.4.2 Thuốc đối kháng thụ thể P2Y12
Clopidogrel, prasugrel, ticagrelor và cangrelor là dẫn chất thienopyridin, chất ức chế thụ thể adenosin diphosphat (ADP receptor) Cơ chế của nhóm thuốc đối kháng thụ thể P2Y12 không giống như aspirin [22]
Đại cương về đông máu
1.2.1 Sinh lý quá trình đông máu Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể khi có chảy máu [9] Đông máu là sự thay đổi trạng thái vật lý của máu do sự biến đổi của một protein hoà tan thành một gen rắn (sợi huyết) Sự biến chuyển này nhằm hạn chế sự mất máu ở nơi có tổn thương thành mạch, giữ được sự toàn vẹn cho mạch máu [13]
1.2.1.1 Các yếu tố hoạt hóa quá trình đông máu Đông máu là quá trình tác động lẫn nhau của thành mạch máu, tế bào máu và các protein huyết tương [14], [36], [37] Nội mạc và lớp dưới nội mạc huyết quản: khi có tổn thương thành mạch lớp dưới nội mạc tiếp xúc với máu sẽ hoạt hóa tiểu cầu và các yếu tố tiếp xúc Tiểu cầu có các yếu tố đông máu và chứa các phospholipid màng, khi được hoạt hóa tích điện âm tạo ra một bề mặt tiếp xúc có khả năng gắn vào nhiều yếu tố đông máu [14], [37] Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải protein được gọi là các zymogen ở dạng không hoạt động Hầu hết các yếu tố đông máu và chống đông máu đều do gan sản xuất, ngoại trừ yếu tố III, IV và VIII Các protein này trải qua một quá trình sửa đổi sau dịch mã cho phép chúng liên kết với Ca ++ , các cation hóa trị hai khác và tham gia vào quá trình đông máu [38], [39] Danh pháp của các protein tham gia vào quá trình đông máu khá phức tạp và được Ủy ban danh pháp quốc tế (1954) đặt tên cho các yếu tố đó bằng các chữ số La mã Tuy nhiên về sau đã có sự thay đổi: một số yếu tố đã bị bỏ đi (như các yếu tố III,
IV, VI) vì không tương ứng với một protein riêng biệt nào Bên cạnh đó, một số yếu tố đông máu được phát hiện gần đây (ví dụ như prekallikrein, HMWK) không được chỉ dấu bằng số La mã Yếu tố V và VIII còn được gọi là yếu tố không bền vì hoạt tính đông máu của chúng không bền trong máu [14], [37], [39]
Yếu tố tổ chức (tissue factor, thromplastin mô) có hầu hết ở trong tổ chức và mạch máu, tạo ra lớp vỏ bọc quanh mạch máu nhưng không tiếp xúc với máu do lớp nội mạc, khi có tổn thương, yếu tố tổ chức được giải phóng, tiếp xúc với máu khởi
11 động con đường đông máu ngoại sinh [14], [37], [39] Ion calci tạo thuận lợi cho các protein phụ thuộc vitamin K kết hợp với phospholipid Ngoài ra, ion calci cần thiết cho hoạt tính của yếu tố XIII hoạt hóa, ổn định của yếu tố V và phức hệ yếu tố von Willebrand-VIII [14], [37], [39]
1.2.1.2 Các chất ức chế sinh lý quá trình đông máu
Các chất ức chế sinh lý quá trình đông máu giúp điều hòa hoạt động đông máu, ngăn nguy cơ huyết khối và tắc mạch Chất ức chế đông máu được chia thành hai nhóm chính [10], [14], [37] và đặc điểm của các chất ức chế đông máu được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Đặc điểm các chất ức chế đông máu
Chất ức chế Nơi tổng hợp Chức năng
Nhóm 1: Các chất ức chế của serin protease
Alpha2-Macro Globulin Đồng yếu tố heparin
Tế bào gan Ức chế thrombin Xa, IXa, XIa, XIIa, kallikrein Ức chế thrombin, kallikrein, Xia Ức chế thrombin, kallikrein Ức chế thrombin Ức chế kallikrein, XIa, XIIa
Tế bào gan với sự có mặt của vitamin K
- PC là một tiền men của serin protease, khi được hoạt hóa gây bất hoạt yếu tố Va, VIIIa qua tác dụng tiêu protein
- PS là đồng yếu tố của PC, tác dụng ức chế PC phát huy mạnh hơn khi có mặt PS
- Thrombomodulin cùng với thrombin tham gia hoạt hóa protein C
(Ghi chú: a: đã được hoạt hóa)
Quá trình đông máu diễn qua ba giai đoạn: hình thành phức hợp prothrombinase; hình thành thrombin; và giai đoạn hình thành fibrin [40] được trình bày dưới đây
Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase Đông máu được chia thành hai con đường: nội sinh và ngoại sinh được mô tả trong hình 1.2 dưới đây
Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương
- Con đường đông máu ngoại sinh Đây là con đường có sự tham gia của đa số các yếu tố đông máu và theo quy luật diễn tiến mở rộng, do vậy mà rất cơ bản và bền vững Năm protein (yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, kininogen trọng lượng phân tử cao, kallikrein trọng lượng phân tử cao (HMWK) là những yếu tố quyết định chính quá trình hoạt hoá và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu Khi thành mạch bị tổn thương, các sợi collagen được bộc lộ Bề mặt các sợi cơ này mang điện tích âm sẽ gắn và cố định các yếu tố XII,
13 prekallikrein, HMWK, yếu tố XI vào Ngay sau khi gắn, các yếu tố này được hoạt hoá để tạo yếu tố XIIa, tiếp đó là sự tác động của XIIa để chuyển XI, XIa, nhờ có XIa mà yếu tố IX, IXa Yếu tố X được hoạt hóa với sự tham gia của một phức hợp bao gồm yếu tố XIa, đồng yếu tố VIIIa, ion Ca ++ và phospholipid của tiểu cầu Giai đoạn này còn có sự hiệp lực của con đường đông máu ngoại sinh Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym lên yếu tố X mà còn có khả năng hoạt hóa yếu tố VII [40]
- Con đường đông máu nội sinh
Khi máu bị tổn thương hoặc tiếp xúc với bề mặt lạ làm hoạt hóa tiểu cầu và yếu tố XII thành XIIa Yếu tố XIIa cùng ion Ca ++ hoạt hóa yếu tố XI, XI thành XIa và IXa Tiểu cầu giải phóng phospholipid cùng với IXa, ion Ca ++ , VIIIa (hoạt hóa bởi thrombin) tham gia hoạt hóa yếu tố X thành Xa [10], [14] Sau khi yếu tố X được hoạt hóa qua con đường đông máu nội sinh hoặc ngoại sinh, cùng với Ca ++ , phospholipid tiểu cầu, Va (hoạt hóa bởi thrombin) tạo thành phức hợp prothrombinase Hai con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh không tách biệt hoàn toàn mà có mối quan hệ chặt chẽ và tác động qua lại lẫn nhau Khi xảy ra một quá trình đông máu, đặc biệt là trong bệnh lý cả hai con đường đông máu đều được khởi động nếu đủ điều kiện Con đường đông máu ngoại sinh có tác động khá mạnh lên con đường nội sinh vì chúng đều hoạt hóa yếu tố IX và X [14]
Giai đoạn II: Hình thành thrombin
Thromboplastin hoạt hoá (phức hợp prothrombinase) nội sinh và ngoại sinh tác động chuyển prothrombin thành thrombin Thrombin đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng của quá trình đông máu Tác động men của nó ảnh hưởng đến nhiều cơ chất và can thiệp vào nhiều khâu của quá trình đông máu với mục đích chủ yếu là tạo thành fibrin Nó chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hoá yếu tố XIII để ổn định sợi huyết Nó cũng tự làm tăng tốc độ hình thành của bản thân, hoạt hoá yếu tố VIII và yếu tố V nhằm làm gia tăng sự hình thành yếu tố Xa bằng cả hai con đường nội sinh và ngoại sinh Hơn nữa thrombin tác động lên tế bào bằng cách cố định lên tế bào và hoạt hóa chúng như hoạt hóa tiểu cầu Thrombin kích thích tế bào nội mạc sản xuất ra prostacyclin ức chế chất hoạt hóa plasminogen do nội mạch sản xuất và tăng sự
14 phát triển tế bào do nội tiết tố sinh trưởng đặc hiệu Nó cũng cố định lên tế bào sợi non (fibroblast) và kích thích chúng tăng sinh [40]
Giai đoạn III: Hình thành fibrin
Thrombin thủy phân fibrinogen thành các fibrin đơn phân Như vậy, fibrinogen được chuyển thành fibrin monomer Với sự thay đổi về điện tích, xuất hiện các lực hút tĩnh điện fibrin monomer thành fibrin polymer Yếu tố XIII được hoạt hóa bởi thrombin và có ion Ca ++ đã làm ổn định fibrin polymer nhờ các liên kết đồng hóa trị giữa các sợi fibrin Mạng lưới fibrin được hình thành và ổn định bao bọc lấy các tế bào máu tạo nên cục máu đông, có khả năng bịt vết thương ở thành mạch làm ngưng chảy máu [41], [42]
1.2.3 Các thuốc chống đông máu
Các thuốc chống đông máu ức chế hình thành cục máu đông thông qua tác động lên các yếu tố đông máu Dựa theo đường dùng phân loại thuốc chống đông thành hai loại: thuốc chống đông đường tiêm và thuốc chống đông đường uống [43], [44]
1.2.3.1 Thuốc chống đông đường tiêm
Heparin có tác dụng chống đông máu nhanh cả in vitro và in vivo [45]
- Heparin không phân đoạn (unfractionated heparin – UFH)
Heparin không phân đoạn được chiết xuất từ phổi bò hoặc niêm mạc ruột lợn [44] Bản chất heparin là một phân tử phức tạp gồm hơn 300 polysaccharid khác nhau, có trọng lượng phân tử 60000 – 100000 dalton Trong huyết tương có antithrombin III là một globin làm mất hiệu lực của thrombin và các yếu tố IX, X, XI, XII đã hoạt hóa Heparin tạo phức với antithrombin III, phức này thúc đẩy mạnh phản ứng antithrombin – thrombin và cả phản ứng antithrombin với các yếu tố đông máu IX,
X, XI, XII gấp 1000 lần so với khi không có mặt heparin [43], [46] UFH có hiệu quả chống đông nhanh (trong vòng vài phút), thải trừ chủ yếu qua gan, không có dạng bào chế đường uống Trong xét nghiệm, heparin làm kéo dài thời gian chảy máu, thời gian prothrombin (PT), thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần (aPTT)… [46]
- Heparin phân tử lượng thấp
Heparin phân tử lượng thấp được bào chế bằng cách khử polymer của heparin không phân đoạn Kết quả của quá trình khử polymer là các chuỗi mucopolysaccharid ngắn, có trọng lượng phân tử trung bình 4000 – 5000 dalton Mặc dù khác nhau về độ dài chuỗi mucopolysaccharid so với heparin không phân đoạn, tất cả LMWH đều có một vùng có 5 phân tử đường đặc hiệu Nhờ vùng này, LMWH có hoạt tính kháng
Tổng quan về cây dong riềng
1.3.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố
Chi Canna bao gồm 8-10 loài hoang dã và hơn 1000 giống lai [52] và là chi duy nhất trong họ Cannaceae với mười chín loài thực vật có hoa Đã có 2 lần sửa đổi về chi Canna bởi các nhà thực vật học trong những năm gần đây, thứ nhất là của
Maas (ở Hà Lan), và thứ hai là của Tanaka (ở Nhật Bản) [53], [54]
Chi: Canna Tên khoa học: Canna edulis Ker Gawl
Tên gọi khác: dong riềng, dong riềng làm miến
Dong riềng là cây thân thảo, có rễ ngầm, phân nhánh, sinh ra những thân khí sinh mọc đứng cao đến 1,5m thường có màu xanh hoặc xanh xen tím, thân gồm những đốt kéo dài tiếp phần củ Bên ngoài thân được cấu tạo bởi lớp biểu bì gồm những tế bào dẹt, bên dưới có những bó cương mô xếp thành những bó tròn có tác dụng chống đỡ cho cây, giúp cây khỏi bị đổ, trong cùng là những bó libe, mạch gỗ và nhu mô
Hình 1.3 Một số hình ảnh cây dong riềng
Rễ cây dong riềng thường phình to thành củ phân nhiều nhánh và chứa nhiều tinh bột, nằm trong đất Lá dong riềng có dạng bản to, khi trưởng thành mép hơi gợn sóng, lá có màu xanh lục bóng hoặc màu xanh xen tím đỏ Hoa dong riềng xếp thành
18 cụm, cụm hoa thiết diện hình tam giác có từ 6-8 đốt mỗi đốt có hai hoa, đốt dưới cùng và trên cùng có một hoa Cấu tạo của hoa gồm có ba lá đìa hình cánh rời nhau, ba cánh hoa dài thon cuộn theo chiều dài, hoa đỏ nở hoàn toàn có màu đỏ Hoa có 5 nhị đực, ngoài có ba nhị, vòng trong có hai nhị Quả của cây dong riềng thuộc dạng quả nang, hình trứng ngược, kích thước khoảng 3cm trên quả nang có nhiều gai mềm Hạt của cây dong riềng có màu đen, hình tròn có đường kính 3,5-5mm [55]
Hình 1.4 Đặc điểm thực vật loài Canna edulis Ker Gawl [56]
(Ghi chú: 1, 2, 3 Toàn cây; 4, 5, 6, 7, Củ, cụm củ và rễ cây; 8, Thân cây) 1.3.1.2 Phân bố
Canna edulis có nguồn gốc từ vùng Andean của Nam Mỹ và việc sử dụng nó có niên đại khoảng 2500 năm trước Công nguyên Củ cây dong riềng là một trong những nguồn cho tinh bột phong phú nhất, và nó có năng suất tương đương hoặc cao hơn khoai tây, sắn hoặc ngô [57], [58] Cây dong riềng là cây nông nghiệp bộ phận dùng là củ, cây dễ trồng và cho năng suất thu hoạch cao Cây được trồng chủ yếu ở Nam Mỹ, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc và Việt Nam [59] Cây dong riềng (Canna edulis) được người Pháp giới thiệu và đưa vào trồng ở Việt Nam từ đầu thế kỷ 19,
Cây dong riềng là cây trồng dài ngày, chịu hạn tốt, chịu rét khá, có thể trồng quanh năm Cây dong riềng có thể trồng trên rất nhiều loại đất, kể cả các vùng đất nghèo dinh dưỡng, năng suất củ tươi có thể đạt từ 45 - 60 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 13,36- 16,4% [60] Cây dong riềng được trồng ở rất nhiều nơi, dong riềng được coi là cây nông nghiệp thế mạnh tại tỉnh Bắc Kạn, Tam Đường tỉnh Lai Châu [60], [61], [62]
Năm 2004, Young Sook Yun và cộng sự đã phân lập được ba phenylpropanoid sucrose esters mới là 3-O-p-coumaroyl-6-O-feruloyl-β-D-fructofuranosyl 6-O- acetyl-α-D-glucopyranoside (C33H38O17); 3,6-di-O-p-coumaroyl-β-D- fructofuranosyl 6-O-acetyl-α-D-glucopyranoside (C32H36O16) và 6-O-p-coumaroyl- β-D-fructofuranosyl α-D-glucopyranoside bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, hợp chất mới được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat của phần dưới mặt đất cây dong riềng, cùng với bốn phenylpropanoids là caffeic acid, rosmarinic acid, caffeoyl-4 ′ -hydroxiphenyllactic acid và salvianolic acid B [63]
Năm 2010, Juan Zhang và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học và đặc tính của chất xơ sau khi chiết xuất tinh bột từ củ cây dong riềng thu được 54,84% chất xơ và chất xơ không tan chiếm phần lớn, bằng phương pháp AOAC cho thấy trong chất xơ có xyloglucan, arabinoxilan, glucuronoxilan, pectin và ligin [64]
Năm 2011, Zhang và cộng sự bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập từ phân đoạn nước của phần dưới mặt đất cây dong riềng Canna edulis một hợp chất mới đặt tên là chất 1 là 4-(3-(3,4-dihydroxiphenyl)acryloyl)-6-hydroxi-1-methoxi-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-2-carboxilic acid cùng với mười hợp chất đã biết gồm: acid rosmarinic (2), acid salvianolic B (3), acid ferulic (4), acid caffeic (5), acid 1- caffeoylquinic (6), acid 3-caffeoylquinic (7), acid 4-caffeoylquinic (8), acid 5- caffeoylquinic (9), acid salicylic và acid gallic (10), cấu trúc hóa học của chất và hợp chất đã được phân lập được tổng hợp trong hình 1.5 dưới đây Và trong nghiên cứu kết quả cho thấy Canna edulis có hàm lượng tannin đậm đặc [65]
Hình 1.5 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Canna edulis
Năm 2011, Juan Zhang và cộng sự đã xác định hàm lượng pectin có nhiều trong phần dưới mặt đất Canna edulis bằng phương pháp trắc quang, kết quả nghiên cứu cho thấy pectin tan tốt trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng [66]
Năm 2012, kết quả nghiên cứu của Tanmayee Mishra và cộng sự cho thấy trong chiết xuất từ các phân đoạn phần dưới mặt đất cây dong riềng có chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, phenol, proanthocyanid, glycosid [67]
Hoạt chất arabinoxilan cũng được Zhang và cộng sự phân lập từ phần dưới mặt đất cây dong riềng và chứng minh tác dụng ức chế enzym lipase và pepsin năm
Năm 2017, trong nghiên cứu của Fan Xie và cộng sự đã xác định được lignin từ phần bã sau điều chế tinh bột củ dong riềng và cho thấy tiềm năng của lignin trong bệnh đái tháo đường typ 2 [69] Ở Việt Nam, năm 2020, tác giả Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự lần đầu tiên phân lập 7 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của phần thân dưới cây Canna edulis Bảy hợp chất phân đã được phân lập đó là: 5-hydroxi-6-methyl-2H-pyran-2-one (C6H6O3) (1); 4,5-dihydroxi-6-methyl-2H-pyran-2-one (C6H6O4) (2); (Z,E)-[2-(3,4-
21 dihydroxiphenyl)ethenyl]3-(3,4-dihydroxiphenyl)-2-propenoat (C17H14O16) (3); (2E)-3- (4-hydroxi-3-methoxiphenyl)-2-propenoic acid (C10H10O4) (4); (2E)-3-(3,4- dihydroxiphenyl)-2-propenoic acid (5); 4-(2-hydroxiethyl)-1,2-benzenediol (C8H10O3) (6); 1H-indole-3-carboxaldehyde (C9H7NO) (7) [59]
Hình 1.6 Cấu trúc các chất phân lập từ phân đoạn n-hexan phần dưới mặt đất cây dong riềng
Năm 2021, tác giả Lê Hồng Luyến cũng nhóm nghiên cứu lần đầu tiên phân lập được 6 hợp chất từ phân đoạn n-hexan của phần dưới mặt đất cây dong riềng, cấu trúc hóa học của các hợp chất đã được xác định bằng phương pháp phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Các hợp chất được phân lập là 24-Methylenecycloartan-3β- ol; β-sitosteryl-3β-glucopyranosid-6-O-palmitat (Sitoindoside I); (4E,7Z)-2- carboxi-1-O-β-D-glucopyranosyl-3,11-dihydroxitritriaconta-4,7-diene
(Citrulloside); Acid 16β-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic; daucosterol và β-sitosterol [70], cấu trúc của hợp chất được trình bày trong hình 1.6
Năm 2023, Liqiao Lv và công sự đã xác định được 54 thành phần hóa học từ dịch chiết methanol của phần dưới mặt đất cây dong riềng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (UHPLC) Trong đó gồm có 36 acid hữu cơ (trong đó có 6 acid phenolic), ba phenol, sugar, triterpenoid, mười hợp chất hữu cơ chứa Nito và các hợp chất khác [71]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu
Phần thân lá (thân, lá) của cây dong riềng được thu hái ở tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam ở tọa độ 21 o 35’34’’ vĩ Bắc, 105 o 50’39’’ kinh Đông vào tháng 08/2022 và được Tiến sĩ Lê Thị Thanh Hương, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên giám định tên khoa học Canna edulis Ker Gawl Mẫu được rửa sạch phần thân lá để loại bỏ bùn đất, cắt thành từng đoạn nhỏ rồi phơi khô Sau đó, sấy mẫu dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 40 o C trong 12 giờ và nghiền thành bột thô Khối lượng bột thô thu được là 5,5 kg Bảo quản bột thô ở trong thùng kín, nhiệt độ 25 o C đến khi chiết xuất
2.1.1.2 Cao toàn phần, các dịch chiết phân đoạn và các chất phân lập tiềm năng
Bột thô cây dong riềng sau đó được ngâm chiết, siêu âm ở nhiệt độ 40 o C trong ethanol 96% 2 lần (Lần một ngâm với 37 L ethanol 96% siêu âm 4 lần mỗi lần 30 phút Lần hai ngâm với 20 L ethanol siêu âm 4 lần mỗi lần 30 phút) Quay cất dịch chiết ethanol ở nhiệt độ 55 o C đến khô thu được 637 g cao tổng Hòa tan cao toàn phần bằng nước cất và chiết phân lớp lần lượt với 1,6 L n-hexan và 1,6 L ethyl acetat Cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khối lượng không đổi thu được cặn chiết tương ứng, là cao n-hexan (144 g) và phân đoạn nước (493 g) từ phân đoạn nước tiếp tục lắc với ethyl acetat 1,6 L x 2 lần thu hồi dung môi thu được cao phân đoạn ethyl acetat (23,9 g) và còn lại là phân đoạn nước Từ phân đoạn ethyl acetat của phần thân lá cây dong riềng, các hợp chất tinh khiết được tiến hành phân lập, định danh (không trình bày trong công trình này) Các chất phân lập và xác định cấu trúc bởi TS Nguyễn Thị Minh Hằng, Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để thực hiện nghiên cứu thông tin Các chất phân lập được mã hóa CEAE1, CEAE2,CEAE3 là sản phẩm của đề tài mã số THTEXS.04/22.24
Qui trình chiết cao toàn phần và các phân đoạn, các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng được thể hiện ở hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần, các phân đoạn, phân lập chất từ phần thân lá cây dong riềng
Vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Máu và huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh
Nghiên cứu tác dụng chống đông máu, chống tập kết tiểu cầu sử dụng huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh
Tiêu chuẩn lựa chọn: Người tình nguyện khỏe mạnh, 20-25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không sử dụng ma túy và không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin
Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng máu lớn hơn
450 mL trong vòng 28 ngày trước
Bột cây dong riềng 5,5 kg
- Chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (37L x 4 lần) và siêu âm (30 phút x 4 lần) -Thu hồi dung môi
Cao phân đoạn n-hexan 144 g Phân đoạn nước 493g
- Lắc với n-hexan (1,6 lít x 2 lần)
Cao phân đoạn ethyl acetat 23,9 g Phân đoạn nước
- Lắc với ethyl acetat (1,6L x 2 lần)
Chất CEAE1 Chất CEAE2 Chất CEAE3
Qui trình lấy mẫu: Tình nguyện viên được lấy máu vào buổi sáng và nhịn ăn
12 giờ trước khi lấy máu Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20 gauge Máu tĩnh mạch được thu thập và cho vào các ống natri citrat (3,2%), sau đó ly tâm với tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) và 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP)
Qui trình lấy máu được thực hiện bởi bác sỹ và điều dưỡng có chuyên môn Địa điểm lấy máu: Khoa Khám bệnh và điều trị ngoại trú, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Đề tài được thực hiện theo việc lấy mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh Do đó, cần tuân thủ theo hiệp ước Helsinki và hướng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tượng nghiên cứu là con người Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức, đề tài đã tiến hành thu thập máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh Người tham gia nghiên cứu được biết lý do, mục đích của nghiên cứu, các lợi ích, cũng như rủi ro của nghiên cứu và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu Người tình nguyện có quyền từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không chịu sự ràng buộc nào
Quyết định phê duyệt của Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học số 02/2020/CN-HĐĐĐ (Phụ lục 01)
2.2.2 Hóa chất và thuốc thử
- Dimethyl sulfoxid nguyên chất (DMSO 100%) (Sigma-Aldrich, Merck, Germany)
- Ethanol 96% (Xilong Scientific Co., Ltd, China)
- n-hexan (Xilong Scientific Co., Ltd, China)
- Ethyl acetat (Xilong Scientific Co., Ltd, China)
- Dimethyl sulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, USA.)
- Ascorbic và trolox (Sigma-Aldrich, Merck, Germany)
- Heparin (natri) 5000 IU/mL (nơi sản xuất Belarus, số đăng ký: VN-18524-
14, số lô: 010122, hạn sử dụng: 03/01/2025)
- Aspirin (Aspegic 100mg) (nơi sản xuất Pháp, số đăng ký: VN-4609-07, số lô: EM0359, hạn sử dụng: 04/2023)
- Bộ kit PT (Thromborel® S Reagent, Marburg, Germany)
- Bộ kit aPTT (Dade Actin® P, Marburg, Germany)
- Bộ kit TT (Thromboclotin® Reagent1, Marburg, Germany)
- Máy li tâm (Centrifuge Eppendoft 5810 R)
- Máy đo thời gian PT, TT và APTT: Máy ACL-TOP 750 LAS của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ)
- Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu (CHRONO-LOG 530 VS)
- Máy đọc đĩa SpectraMax iD5
- Ống nghiệm chống đông sodium citrat (Việt Nam)
- Microtube thể tích 1,5 mL (Eppendorf)
- Micropipet cỏc loại 1-10 àL; 20-200 àL; 100-1000àL (Eppendorf, Germany)
Nội dung và thiết kế nghiên cứu
Để thực hiện ba mục tiêu đã đề ra, đề tài nghiên cứu gồm các nội dung sau:
Thực hiện mục tiêu số 1: Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ cây dong riềng:
- Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần và các phân đoạn cây dong riềng băng phương pháp đo quang
- Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng
Thực hiện mục tiêu số 2: Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro cao toàn phần, các phân đoạn và chất phân lập từ cây dong riềng:
- Đánh giá tác dụng chống đông máu của cao toàn phần và các phân đoạn từ cây dong riềng thông qua xác định các chỉ số PT, aPTT và TT bằng máy xét nghiệm ACL TOP 750 LAS
- Đánh giá tác dụng chống đông máu của các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng thông qua xác định các chỉ số PT, aPTT và TT bằng máy xét nghiệm ACL TOP 750 LAS
Thực hiện mục tiêu số 3: Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ cây dong riềng:
- Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần và các phân đoạn từ cây dong riềng bằng phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH và/hoặc ABTS +
- Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng bằng phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH và/hoặc ABTS +
Sơ đồ tóm tắt thiết kế nghiên cứu được trình bày trong hình 2.2 dưới đây
Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Phần thân lá mặt đất cây dong riềng
Cao toàn phần và các phân đoạn Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro Đánh giá tác dụng chống NTTC của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn bằng phương pháp đo quang Đánh giá tác dụng chống đông máu của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn thông qua xác định PT, aPTT và
TT Đánh giá khả năng thu dọn gốc tự do của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn đánh giá bằng thử nghiệm DPPH, ABTS +
Chọn phân đoạn tiềm năng để phân lập chất Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của chất phân lập Đánh giá tác dụng chống đông máu của chất phân lập Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của chất phân lập
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng
Sử dụng phương pháp đo quang của Born (1962) để đo độ ngưng tập tiểu cầu trên máy CHRONO-LOG 530 VS [79] Đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng máy, khi cho chất kích tập ADP hoặc collagen vào huyết tương giàu tiểu cầu làm cho tiểu cầu bị hoạt hóa và kết tụ lại với nhau thành hạt, làm thay đổi mật độ đo quang Mức độ kết tập tiểu cầu được tính bằng cách đo chiều cao tối đa trên đường cơ sở mà đường cong kết tập đạt được sau khi kích thích
Thờm lần lượt vào cuvet cú sẵn 450 àl PRP 50àl húa chất tương ứng cụ thể như sau DMSO 1%, aspirin (0,1 mg/mL) hoặc ticagrelor 0,002 mg/mL; cao toàn phần, dịch chiết phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn nước và phân đoạn n-hexan từ cây dong riềng ở nồng độ thử 2 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL và các chất sạch nồng độ thử lần lượt là 2 mg/mL; 1 mg/mL; 0,5 mg/mL và ủ trong 3 phút ở 37C
- Chứng âm: Huyết tương nghèo tiểu cầu + dung dịch DMSO 1%
- Chứng dương: Huyết tương giàu tiểu cầu + dung dịch aspirin 0,1 mg/mL hoặc ticagrelor 0,002 mg/mL
- Các mẫu thử: Huyết tương giàu tiểu cầu + dung dịch cao toàn phần, các phân đoạn hoặc các chất phân lập được từ cây dong riềng với các nồng độ 2 – 1 – 0,5 mg/mL
Lặp lại thí nghiệm 3 lần ở mỗi nồng độ Sơ đồ mô tả cách tiến hành thí nghiệm được trình bày trong hình 2.3 dưới đây
Hình 2.3 Qui trình xác định phần trăm ngưng tập tiểu cầu
Thông số đánh giá Độ ngưng tập tiểu cầu là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng của tiểu cầu cũng như đánh giá phần nào hiệu quả của thuốc chống kết tập tiểu cầu Đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng máy khi cho chất kích tập ADP hoặc collagen vào huyết tương giàu tiểu cầu làm cho tiểu cầu bị hoạt hóa và tập trung lại với nhau thành các
Ly tâm 500 vòng/phút x 10 phút Máu người tình nguyện được cho vào ống chống đông natri citrate 3.2%
Huyết tương giàu tiểu cầu
Máy đo ngưng tập tiểu cầu Huyết tương nghèo tiểu cầu
Ly tâm 3000 vòng/phút x 10 phút
450 àL PRP có bi từ +
Thờm chất kớch tập: 5 àL ADP hoặc 1 àL collagen vào PRP
34 hạt làm thay đổi mật độ quang Mức độ kết tập tiểu cầu được tính bằng cách đo chiều cao tối đa trên đường cơ sở mà đường cong kết tập đạt được sau khi kích thích [36], [80]
Ba chỉ số là phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu, diện tích dưới đường cong (AUC) và độ dốc (S) luôn được các nhà lâm sàng quan tâm trong việc đánh giá chức năng tiểu cầu của người bệnh và rất có giá trị trong phân loại các dạng bệnh lý tiểu cầu [81]
- Phần trăm ngưng tập tiểu cầu (độ ngưng tập tiểu cầu) ở các ống PRP bằng cách so sánh lượng ánh sáng truyền qua các ống này so với ống chứng PPP (lượng ánh sáng truyền qua ống chứng PPP được coi là 100%)
- Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu (%I) của các mẫu thử được tính theo công thức sau:
Trong đó: X: Sự ngưng tập tiểu cầu của chứng âm
Y: Sự ngưng tập tiểu cầu của chất thử
- Diện tích dưới đường cong (AUC) là chỉ số thể hiện mức độ ngưng tập tiểu cầu tính từ thời điểm sau khi tiểu cầu biến dạng đến khi tiểu cầu ngưng tập tối đa [81]
- Độ dốc (S), đường cong ngưng tập tiểu cầu là chỉ số đánh giá giai đoạn đầu của quá trình ngưng tập, giai đoạn tiểu cầu được hoạt hóa [81]
2.4.3 Đánh giá tác dụng chống đông của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng
Thời gian đông máu in vitro được đo bằng máy ACL-TOP 750 LAS theo nguyên lý đo quang (phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ), dựa theo mô hình của
- Nguyên lý đo thời gian prothrombin (PT): Chống đông máu bằng natri citrat 3,2 % máu sẽ phát động quá trình đông máu theo con đường ngoại sinh và được phục hồi với sự có mặt của thromboplastin Khảo sát thời gian đông máu khi cho thừa
35 thromboplastin calci vào huyết tương, đánh giá ngoại sinh (PT) thông qua các yếu tố như II, V, VII, X [84]
- Nguyên lý đo thromboplastin từng phần hoạt hóa (aPTT): Là xét nghiệm thời gian hồi phục calci của huyết tương nghèo tiểu cầu mà trong đó có sẵn cephalin và kaolin Đây là xét nghiệm giúp đánh giá các yếu tố đông máu theo con đường nội sinh (XII, XI, X, IX, VIII, V, II, I) và các yếu tố tiếp xúc [14]
- Nguyên lý đo thời gian thrombin (thrombin time – TT): TT là xét nghiệm thăm dò giai đoạn sau cùng của quá trình đông máu (giai đoạn tạo fibrin ngoại trừ yếu tố XIII) [14]
Lấy 20 mL máu tĩnh mạch toàn phần từ người tình nguyện khỏe mạnh, cho vào các ống chống đông có chứa natri citrate 3,2%
Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/10 phút để thu huyết tương
Thu huyết tương vào ống facol vô khuẩn
Sử dụng micro pipet lấy 450 àL huyết tương nghốo tiểu cầu (PPP) cho vào mỗi ống nghiệm sạch, vô khuẩn
Thờm lần lượt vào mỗi ống 50 àL húa chất gồm: DMSO 10%; heparin hoặc cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ cây dong riềng và ủ ở 37C trong vòng 5 phút:
- Chứng õm: 450 àL PPP và 50 àL dung dịch DMSO 10%
- Chứng dương: 450 àL PPP và 50 àL dung dịch heparin (0,2 UI/mL hoặc 2 IU/mL)
- Mẫu thử: 450 àL PPP và 50 àL cao toàn phần, cỏc phõn đoạn và cỏc hợp chất phân lập từ cây dong riềng với các nồng độ 2 mg/mL; 1 mg/mL; 0,5 mg/mL theo thiết kế
Tiến hành đo các chỉ số PT, aPTT và TT bằng máy ALC-TOP 750 LAS Lặp lại thí nghiệm 3 lần ở mỗi nồng độ
Thời gian đông máu nội sinh đánh giá qua thông số aPTT (giây), thời gian đông máu ngoại sinh đánh giá qua thông số PT (giây) và thời gian thrombin qua thông số TT (giây)
2.4.4 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần, các phân đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng
2.4.4.1 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH
Xử lý số liệu
Dữ liệu thu thập được sẽ được biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD: độ lệch chuẩn) Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 23.0 sử dụng phân tích one-way ANOVA, dùng hậu kiểm Turkey Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng
3.1.1 Ảnh hưởng của cao toàn phần và các phân đoạn từ phần thân lá cây dong riềng đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập collagen
Độ ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần và các phân đoạn Độ ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần và các phân đoạn từ phần thân lá cây dong riềng với chất kích tập collagen được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây
Bảng 3.1 Độ ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần và các phân đoạn với chất kích tập collagen
Mẫu thử Nồng độ thử mg/mL Độ ngưng tập tiểu cầu (%)
(Ghi chú: Kết quả được biểu diễn dưới dạng Mean ± SD; DMSO 1% được sử dụng làm chứng âm; aspirin 0,1 mg/mL được sử dụng làm chứng dương; *: p