nguyễn thị thu nghiên cứu hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu chống đông máu và chống oxi hóa của phần thân lá cây dong riềng canna edulis ker gawl

Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng .... Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU, CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ CHỐNG OXI HÓA CỦA PHẦN THÂN LÁ CÂY

DONG RIỀNG (CANNA EDULIS KER GAWL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU, CHỐNG ĐÔNG MÁU VÀ CHỐNG OXI HÓA CỦA PHẦN THÂN LÁ CÂY

DONG RIỀNG (CANNA EDULIS KER GAWL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Nguyễn Thùy Dương

2 TS Nguyễn Thị Vân Anh

HÀ NỘI - 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin phép được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS Nguyễn Thùy Dương – Giảng viên Bộ môn Dược lý Dược lâm sàng Trường

Đại học Dược Hà Nội và TS Nguyễn Thị Vân Anh – Giảng viên Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình

chỉ bảo và luôn quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội và Ban Giám đốc Viện Huyết học trung ương đã tạo điều kiện giúp em có thể thực hiện các thí nghiệm trong đề tài nghiên cứu này

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học và các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy luôn nhiệt huyết đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập

Để hoàn thành luận văn này, em xin chân thành cảm ơn đề tài mã số

THTEXS.04/22.24 được tài trợ bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Cuối cùng, em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, quan tâm và hỗ trợ em mọi mặt trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng 10 năm 2023

Học viên

Nguyễn Thị Thu

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Sinh lý học tiểu cầu 3

1.1.1 Cấu trúc của tiểu cầu 3

1.1.2 Chức năng tiểu cầu 4

1.1.3 Hoạt hóa tiểu cầu 6

1.1.4 Các thuốc chống kết tập tiểu cầu 7

1.2 Đại cương về đông máu 10

1.2.1 Sinh lý quá trình đông máu 10

1.2.3 Các thuốc chống đông máu 14

1.3 Tổng quan về cây dong riềng 16

1.3.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố 16

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.1.1 Dược liệu nghiên cứu 26

2.1.1.2 Cao toàn phần, các dịch chiết phân đoạn và các chất phân lập tiềm năng 26

2.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 27

2.2.1 Máu và huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh 27

2.2.2 Hóa chất và thuốc thử 28

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 29

2.2.4 Dụng cụ nghiên cứu 29

2.3 Nội dung và thiết kế nghiên cứu 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân

đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng 32

2.4.3 Đánh giá tác dụng chống đông của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng 34

2.4.4 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần, các phân đoạn và các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng 36

2.4.4.1 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH 36

2.4.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do ABTS.+ 37

2.5 Xử lý số liệu 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng 39

3.1.1 Ảnh hưởng của cao toàn phần và các phân đoạn từ phần thân lá cây dong riềng đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập collagen 39

3.1.2 Ảnh hưởng của cao toàn phần và các phân đoạn đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập ADP 45

3.1.3 Ảnh hưởng của các hợp chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập collagen 52

3.1.4 Ảnh hưởng của các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng đối với sự ngưng tập tiểu cầu khi sử dụng chất kích tập ADP 56

3.2 Đánh giá tác dụng chống đông máu của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập 61

3.2.1 Đánh giá tác dụng chống đông máu của cao toàn phần và các phân đoạn từ phần thân lá cây dong riềng 61

3.2.2 Đánh giá tác dụng chống đông máu của các chất phân lập 63

3.3 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập 64

3.3.1 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao toàn phần và các phân đoạn từ phần thân lá cây dong riềng 64

3.3.2 Tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro và khả năng trung hòa gốc tự do ABTS.+ của các chất phân lập từ phần thân lá cây dong riềng 65

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 67

4.1 Về tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần, các phân

đoạn và các chất phân lập 67

4.2 Về tác dụng chống đông máu in vitro cao toàn phần của cây dong riềng,

các phân đoạn và chất phân lập 714.3 Về tác dụng chống oxi hóa của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập 73KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76Phụ lục 01

Phụ lục số 02TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

(activated Partial Thromboplastin Time)

(Area under the curve)

(Half maximal inhibitory concentration)

(International Normalized Ratio)

(International Sensitivity Index)

MeOH Methanol

(Myocardial Infaction)

(National Institutes of Health Stroke Scale)

(High molecular weight kininogen)

(Percutaneous coronary intervention)

(Partial thromboplastin time)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Độ ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần và các phân đoạn với chất kích tập collagen

39

Bảng 3.2 Diện tích dưới đường cong (AUC) của thí nghiệm ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập collagen của các cao toàn phần và các phân đoạn

tập tiểu cầu với chất kích tập collagen của các hợp chất phân lập

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của các chất phân lập lên các thông số PT, aPTT và TT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.6 Cấu trúc các chất phân lập từ phân đoạn n-hexan phần dưới mặt đất cây dong riềng

21

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần, các phân đoạn, phân lập chất từ phần thân lá cây dong riềng

27

Hình 3.1 Phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của cao toàn phần và các phân đoạn với chất kích tập collagen

ĐẶT VẤN ĐỀ

Huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới vào năm 2010, trung bình cứ bốn người chết thì có một người tử vong do huyết khối [1] Huyết khối có thể dẫn đến các tình trạng nguy hiểm như suy tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột quị hoặc huyết khối tĩnh mạch sâu, phù phổi tắc nghẽn [2] Để phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối tắc mạch, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu được coi là liệu pháp điều trị lý tưởng Bên cạnh tác dụng điều trị, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu có tác dụng không mong muốn như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu [3] Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục các loại thuốc mới đặc biệt là thuốc chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu là vô cùng cần thiết Xác định được các con đường sinh hoá liên quan đến hoạt hoá đông máu và ngưng tập tiểu cầu đã đưa đến việc tìm kiếm các thuốc chống huyết khối mới có ít tác dụng không mong muốn hơn luôn được các nhà khoa học quan tâm Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên là một ứng viên tiềm năng để sử dụng nghiên cứu [4], [5]

Dong riềng là một loại cây thân rễ dễ trồng, cho năng suất cao, được trồng chủ

yếu ở Nam Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan và Việt Nam Một số nghiên cứu

đã chứng minh hàm lượng phenol và flavonoid của C edulis có tác dụng chống ung

thư, chống oxi hóa và chống viêm [6] Hiện nay, theo danh mục thực vật Việt Nam

có 5 loài: C edulis Ker Gawl., C generalis Bail., C glauca L., C indica L, C

sylvestris Rosc Một số loài Canna đã được dân gian sử dụng để chữa bệnh viêm loét

dạ dày, đau nhức xương, tức ngực và đặc biệt có sử dụng trong điều trị các bệnh tim mạch Năm 2018, TS Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự đã xác định dịch chiết phân đoạn ethyl acetat từ phần dưới mặt đất cây dong riềng có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu ở cả ba nồng độ thử là 4 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL tốt hơn nhiều so với cao toàn phần và phân đoạn nước Dịch chiết ethyl acetat ở nồng độ 4 mg/mL có tác dụng kéo dài thời gian đông máu với PT và aPTT [7]

Nhận thấy các nghiên cứu liên quan đến phần thân lá còn tương đối hạn chế, do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu và chống oxi hóa của phần thân lá cây

dong riềng Từ đó, sử dụng kết quả nghiên cứu để chọn ra phân đoạn có tác dụng tốt nhất để định hướng phân lập chất có tiềm năng, hướng tới khả năng ứng dụng trong

điều trị và phòng ngừa các bệnh huyết khối Đề tài “Nghiên cứu hoạt tính chống

ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu và chống oxi hóa của phần thân lá cây dong

riềng (Canna edulis Ker Gawl.)” được thực hiện với mục tiêu sau:

1 Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần, các

phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng

2 Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro của cao toàn phần của cây dong

riềng, các phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng

3 Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao toàn phần của cây dong riềng,

các phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu

Tiểu cầu là những mảnh đa giác, hình đĩa rất nhỏ, đường kính 2 – 4 µm, không có nhân Tiểu cầu được sinh ra từ mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) trong tủy xương rồi vào máu [8]

1.1.1 Cấu trúc của tiểu cầu

Màng tiểu cầu là các glycoprotein (trong đó GPIb, GPIIb và GPIIIa đóng vai trò chính trong hiện tượng kết dính) và các phospholipid (có yếu tố III tiểu cầu – hoạt hóa quá trình đông máu) GPIb là protein xuyên màng, liên kết với yếu tố von Willebrand, là bước đầu tiên trong hoạt động cầm máu của tiểu cầu GPIIb/IIIa là

tập tạo thành đinh cầm máu Mặt ngoài màng là nơi có các yếu tố đông máu hấp thụ vào [9]

histamin và epinephrine Các hạt alpha gồm có các protein kết dính (yếu tố von Willebrand, thrombospondin, fibronectin), các yếu tố tăng trưởng tiểu cầu (PDGH – platelet derived growth factor), các yếu tố đông máu và tiêu sợi huyết (fibrinogen, yếu tố V), trong tiểu cầu còn có một hệ thống co gồm có actin và myosin [10], [11]

Các vi ống nằm sát dưới màng tiểu cầu, bao quanh tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích Các ống dày đặc là khối vật

nơi tổng hợp cyclooxigenase và prostaglandin của tiểu cầu Và các vi sợi bản chất là

các sợi actin tham gia vào tạo giả túc của tiểu cầu [10], [12]

Hệ thống các kênh mở là hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường vào trong tế bào chất

của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi bị hoạt hóa [13]

1.1.2 Chức năng tiểu cầu

Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mạc bị phá vỡ, các tổ chức dưới nội mạc như collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), màng nền, vi sợ được bộc lộ Lúc này hiện tượng dính và ngưng tập tiểu cầu xảy ra [14]

Bình thường tiểu cầu không dính vào thành mạch máu do một số chất ức chế dính của tiểu cầu như prostaglandin nhưng khi thành mạch bị tổn thương tiểu cầu lập tức được hoạt hóa và dính vào nơi bị tổn thương Tiểu cầu sẽ tiếp xúc với yếu tố Willebrand, vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu [15] vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [13]

Tiểu cầu có khả năng kết dính với nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu gọi là ngưng tập tiểu cầu Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như ADP, thrombin,

chất này được gọi là “chất kích hoạt” tiểu cầu Trong đó, ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [13] Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP: bình thường các tiểu cầu không ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự thoái hoá ATP thành ADP Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngoài vào) thì phản ứng này bị ức chế, do đó gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập Hiện nay vai trò của phospholipid màng (cụ thể là acid

tương tác giữa các yếu tố kích tập với phospholipid màng và các men như oxigenase và thromboxan synthetase [14]

cyclo-Hình 1.1 Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP (- -: ức chế, ngăn cản)

Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [13]

Với sự có mặt của collagen hoặc thrombin hoạt hóa sẽ dẫn đến tăng chế tiết của các hạt tiểu cầu bao gồm ADP, serotonin, fibrinogen, men lysosom, beta-thromboglobulin, heparin, collagen và thrombin hoạt hóa quá trình tổng hợp prostaglandin tiểu cầu Ngoài tác dụng làm tăng tính thấm thành mạch các hạt tiểu

Adrenosin Xâm nhập vào tiểu cầu và trở

thành ATP

ADP ADP ngoại lai

(-)

Năng lượng

Tiểu cầu bị ngưng tập

PhosphataseAdenylakinase

(-)

cầu còn có tác dụng làm tăng thấm mạch, hoạt hóa protein C, tạo thromboxan A2 và

chế ngưng tập tiểu cầu sẽ xảy ra [14]

1.1.3 Hoạt hóa tiểu cầu

Khi tiểu cầu đến khu vực mạch máu bị tổn thương, chúng được kích hoạt bởi một loạt chất chủ vận bao gồm ADP, thrombin, thromboxanes… tương tác với các thụ thể xuyên màng [16] Kết quả quá trình hoạt động chuyển hóa trong nồng độ cao

tiểu cầu, giải phóng các chất trong hạt α và hạt đặc, kích thích phospholipase A2 và giải phóng thromboxan A2 (TXA2), cảm ứng bề mặt gây đông máu và kích hoạt thụ thể GPIIb/IIIa TXA2 được tổng hợp bởi tiểu cầu kích hoạt từ acid arachidonic thông qua con đường cyclooxigennase (COX), sau khi hình thành TXA2 khuếch tán qua màng tế bào và kích hoạt tiểu cầu khác Ở các tiểu cầu TXA2 liên kết với các thụ thể,

Enzym này chuyển hóa phosphoinositid màng, ví dụ phosphatidylinositol 4,5-

diacylglycerol (DAG) DAG kích hoạt protein kinase C nội bào (PKC) gây

thống các ống dày đặc vào bào tương [17], [18] ADP được giải phóng từ tiểu cầu và

hoạt hóa của tiểu cầu đáp ứng với ADP Thrombin nhanh chóng được tạo ra tại các điểm tổn thương của mạch máu từ prothrombin, là trung gian tạo fibrin [13]

1.1.4 Các thuốc chống kết tập tiểu cầu

Thuốc chống kết tập tiểu cầu làm giảm khả năng kết tập tiểu cầu, ức chế quá trình hình thành huyết khối [16] Các loại thuốc chống kết tập tiểu cầu thường được sử dụng được trình bày dưới đây

1.1.4.1 Thuốc ức chế COX – aspirin

Thuốc ức chế enzym cyclooxigenase (COX), dẫn đến ức chế tổng hợp prostaglandin, thromboxan và các sản phẩm khác như prostacyclin của cyclooxigenase Có hai loại enzym COX: COX-1 thường được tìm thấy trong các mô tế bào bình thường của cơ thể (COX-1 duy trì bình thường niêm mạc dạ dày; chức năng thận và tiểu cầu) trong khi COX-2 chủ yếu thấy ở vị trí viêm, bị kích thích tăng tạo prostaglandin do các cytokin và trung gian hóa học của quá trình viêm Cơ chế ức chế enzym COX của aspirin khác biệt hẳn so với các thuốc chống viêm không steroid khác Aspirin gắn cộng trị với cả hai loại COX dẫn đến ức chế không đảo ngược hoạt tính của enzym này, do đó thời gian tác dụng của aspirin liên quan đến tốc độ vòng chuyển hóa của cyclooxigenase [3] Aspirin ức chế enzym COX-1 ngăn chặn sự chuyển hóa arachidonic acid do đó ức chế tổng hợp prostaglandin G2 và prostaglandin H2, ức chế tổng hợp TXA2, tiểu cầu không ngưng tập được [16] So với giả dược, điều trị bằng aspirin đã được báo cáo làm giảm 44% nguy cơ nhồi máu cơ tim (MI) trên bệnh nhân dự phòng tiên phát [19] Aspirin làm giảm nguy cơ xảy ra biến cố tim mạch: bệnh nhân có tiền sử đột quị, thiếu máu cục bộ, đau thắt ngực ổn định và làm giảm tỷ lệ tử vong trên bệnh nhân đau thắt ngực ổn định [20], [21]

1.1.4.2 Thuốc đối kháng thụ thể P2Y12

Clopidogrel, prasugrel, ticagrelor và cangrelor là dẫn chất thienopyridin, chất ức chế thụ thể adenosin diphosphat (ADP receptor) Cơ chế của nhóm thuốc đối kháng

Clopidogrel là tiền chất (prodrug) với tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu phụ thuộc vào chuyển hóa ở gan thành chất chuyển hóa thiol có hoạt tính Clopidogrel là một chất ức chế thụ thể adenosin diphosphat (ADP receptor), chất chuyển hóa có hoạt tính

thụ thể ADP trên bề mặt tiểu cầu, do đó sẽ ức chế sự gắn của ADP vào thụ thể và dẫn tới ức chế hoạt hóa phức hợp glycoprotein GPIIb/IIIa tiểu cầu, phức hợp này cần thiết để gắn fibrinogen tiểu cầu làm ức chế kết tập tiểu cầu Clopidogrel còn ức chế giải phóng hạt đặc (chứa ADP, calci và serotonin) tiểu cầu qua trung gian ADP và hạt alpha (chứa fibrinogen và thrombospondin), các hạt này chứa các chất có tác dụng tăng cường ngưng tập tiểu cầu [3]

Ticlopidin, dẫn chất thienopyridin, là thuốc ức chế ngưng tập tiểu cầu, làm suy giảm chức năng tiểu cầu bằng cách gây trạng thái giống như nhược tiểu cầu Ticlopidin cần qua sinh chuyển hóa in vivo để thành chất chuyển hóa Chất chuyển

chặn hoạt hóa phức hợp thụ thể, do đó làm giảm ngưng tập tiểu cầu [3] Ticlopidin có hiệu quả tương tự như aspirin trong việc ngăn ngừa huyết khối, nhưng có nhiều tác dụng không mong muốn hơn Tác dụng không mong muốn nghiêm trọng của việc sử dụng ticlopidin có liên quan đến huyết học, 2,1% người dùng bị giảm bạch cầu trung tính, 0,9% người dùng bị giảm bạch cầu trung tính nặng, một số trong đó có khả năng gây tử vong [23]

tiếp, có chọn lọc và liên kết thuận nghịch, ngăn chặn sự hoạt hóa và kết tập tiểu

ra Ticagrelor cũng làm tăng mức adenosine nội sinh cục bộ bằng cách ức chế chất vận chuyển nucleosid [24] Theo hướng dẫn của Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ và Hiệp hội Đột quị Hoa Kỳ năm 2019, aspirin được khuyến cáo sử dụng để điều trị bệnh nhân đột quị nhẹ (NIHSS ≤ 5) hoặc có nguy cơ cao thiếu máu cục bộ Mặc dù việc sử dụng ticagrelor vẫn còn hạn chế trong lĩnh vực đột quị tuy nhiên ticagrelor dường như là một lựa chọn thay thế hợp lý ở những bệnh nhân đột quị có chống chỉ định với aspirin [25]

1.1.4.3 Thuốc ức chế receptor GPIIb/IIIa

Các thuốc ức chế receptor GPIIb/IIIa có tác dụng chống kết tập tiểu cầu như abciximab, eptifibat, tirofiban đã được FDA phê duyệt sử dụng trong điều trị hội chứng mạch vành cấp (ACS) hoặc can thiệp động mạch vành qua da (PCI) và bệnh nhân PCI có đặt stent nội mạch [26] Hiện nay, theo (ACC)/ (AHA) khuyến cáo sử dụng thuốc ức chế GP IIb/IIIa trong ACS khi bệnh nhân bị dị ứng hoặc không thể

aspirin (loại IIa) [27], [28], [29]

Abciximab, một kháng thể đơn dòng được chỉ định để ngăn ngừa các biến cố tắc mạch, hỗ trợ điều trị chống đông máu phối hợp điều trị với heparin và aspirin ở bệnh nhân được PCI và ở những bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định, có kế hoạch tiến hành PCI [26] Không giống như các thuốc ức chế GPIIb/IIIa khác, abciximab ngoài tác dụng chống kết tập tiểu cầu còn có tác dụng chống viêm không phụ thuộc receptor GPIIb/IIIa có thể gắn với thụ thể vitronectin (αvβ3) và thụ thể Mac-1 trên bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính [30], [31]

Eptifibatid là một heptapeptid, được tìm thấy trong mạch vòng tổng hợp có chứa sáu axit amin, bao gồm một cystein amid và một gốc mercaptopropionyl (desamino cysteinyl), là một chất ức chế kết tập tiểu cầu và thuộc nhóm RGD (arginin-glycin-aspartat) [32] Eptifibatid đặc hiệu và ái lực cao với GPIIb/IIIa, thời gian bán hủy trong huyết tương ngắn và khởi phát nhanh, tác dụng chống kết tập tiểu cầu có khả năng đảo ngược sau khi ngừng truyền thuốc [33]

Tirofiban là một chất đối kháng không peptid của receptor GPIIb/IIIa, thuốc có tác dụng chống kết tập tiểu cầu, tirofiban là chất đối kháng cạnh tranh có ái lực với receptor GPIIb/IIIa cao hơn eptifibatid nhưng thấp hơn abciximab [32] Tirofiban được FDA phê duyệt sử dụng phối hợp với heparin và aspirin trong ACS và nong mạch vành [26] Tirofiban được sử dụng trên toàn cầu cho bệnh nhân mắc hội chứng

đọng mạch vành cấp tính (ACS) hoặc trải qua can thiệp động mạch vành qua da (PCI) [34] Theo các thử nghiệm lâm sàng trước đây, tirofiban có khả năng dung nạp, an toàn và hiệu quả được sử dụng để điều trị đột quị do thiếu máu cục bộ, đặc biệt đối với những bệnh nhân hẹp do xơ vữa động mạch [35]

1.2 Đại cương về đông máu

1.2.1 Sinh lý quá trình đông máu

Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể khi có chảy máu [9] Đông máu là sự thay đổi trạng thái vật lý của máu do sự biến đổi của một protein hoà tan thành một gen rắn (sợi huyết) Sự biến chuyển này nhằm hạn chế sự mất máu ở nơi có tổn thương thành mạch, giữ được sự toàn vẹn cho mạch máu [13]

1.2.1.1 Các yếu tố hoạt hóa quá trình đông máu

Đông máu là quá trình tác động lẫn nhau của thành mạch máu, tế bào máu và các protein huyết tương [14], [36], [37] Nội mạc và lớp dưới nội mạc huyết quản: khi có tổn thương thành mạch lớp dưới nội mạc tiếp xúc với máu sẽ hoạt hóa tiểu cầu và các yếu tố tiếp xúc Tiểu cầu có các yếu tố đông máu và chứa các phospholipid màng, khi được hoạt hóa tích điện âm tạo ra một bề mặt tiếp xúc có khả năng gắn vào nhiều yếu tố đông máu [14], [37] Phần lớn các yếu tố đông máu là tiền chất của các enzym phân giải protein được gọi là các zymogen ở dạng không hoạt động Hầu hết các yếu tố đông máu và chống đông máu đều do gan sản xuất, ngoại trừ yếu tố III, IV và VIII Các protein này trải qua một quá trình sửa đổi sau dịch mã cho phép chúng

[39] Danh pháp của các protein tham gia vào quá trình đông máu khá phức tạp và được Ủy ban danh pháp quốc tế (1954) đặt tên cho các yếu tố đó bằng các chữ số La mã Tuy nhiên về sau đã có sự thay đổi: một số yếu tố đã bị bỏ đi (như các yếu tố III, IV, VI) vì không tương ứng với một protein riêng biệt nào Bên cạnh đó, một số yếu tố đông máu được phát hiện gần đây (ví dụ như prekallikrein, HMWK) không được chỉ dấu bằng số La mã Yếu tố V và VIII còn được gọi là yếu tố không bền vì hoạt tính đông máu của chúng không bền trong máu [14], [37], [39]

Yếu tố tổ chức (tissue factor, thromplastin mô) có hầu hết ở trong tổ chức và mạch máu, tạo ra lớp vỏ bọc quanh mạch máu nhưng không tiếp xúc với máu do lớp

động con đường đông máu ngoại sinh [14], [37], [39] Ion calci tạo thuận lợi cho các protein phụ thuộc vitamin K kết hợp với phospholipid Ngoài ra, ion calci cần thiết cho hoạt tính của yếu tố XIII hoạt hóa, ổn định của yếu tố V và phức hệ yếu tố von Willebrand-VIII [14], [37], [39]

1.2.1.2 Các chất ức chế sinh lý quá trình đông máu

Các chất ức chế sinh lý quá trình đông máu giúp điều hòa hoạt động đông máu, ngăn nguy cơ huyết khối và tắc mạch Chất ức chế đông máu được chia thành hai nhóm chính [10], [14], [37] và đặc điểm của các chất ức chế đông máu được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc điểm các chất ức chế đông máu Chất ức chế Nơi tổng hợp Chức năng

Nhóm 1: Các chất ức chế của serin protease

Antithrombin III

Alpha1-Anti trypsin Alpha2-Macro Globulin Đồng yếu tố heparin Chất ức chế C1

Tế bào gan

Tế bào gan Tế bào gan Tế bào gan Tế bào gan

Ức chế thrombin Xa, IXa, XIa, XIIa, kallikrein

Ức chế thrombin, kallikrein, Xia Ức chế thrombin, kallikrein Ức chế thrombin

Ức chế kallikrein, XIa, XIIa

Tế bào nội mạc

- PC là một tiền men của serin protease, khi được hoạt hóa gây bất hoạt yếu tố Va, VIIIa qua tác dụng tiêu protein

- PS là đồng yếu tố của PC, tác dụng ức chế PC phát huy mạnh hơn khi có mặt PS

thrombin tham gia hoạt hóa protein C

(Ghi chú: a: đã được hoạt hóa)

1.2.2 Cơ chế đông máu

Quá trình đông máu diễn qua ba giai đoạn: hình thành phức hợp prothrombinase; hình thành thrombin; và giai đoạn hình thành fibrin [40] được trình bày dưới đây

Đông máu được chia thành hai con đường: nội sinh và ngoại sinh được mô tả trong hình 1.2 dưới đây

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình đông máu huyết tương

- Con đường đông máu ngoại sinh Đây là con đường có sự tham gia của đa số các yếu tố đông máu và theo quy luật diễn tiến mở rộng, do vậy mà rất cơ bản và bền vững Năm protein (yếu tố XII, prekallikrein, yếu tố XI, kininogen trọng lượng phân tử cao, kallikrein trọng lượng phân tử cao (HMWK) là những yếu tố quyết định chính quá trình hoạt hoá và ức chế giai đoạn tiếp xúc đông máu Khi thành mạch bị tổn thương, các sợi collagen được

prekallikrein, HMWK, yếu tố XI vào Ngay sau khi gắn, các yếu tố này được hoạt hoá để tạo yếu tố XIIa, tiếp đó là sự tác động của XIIa để chuyển XI, XIa, nhờ có XIa mà yếu tố IX, IXa Yếu tố X được hoạt hóa với sự tham gia của một phức hợp bao

này còn có sự hiệp lực của con đường đông máu ngoại sinh Yếu tố IXa không chỉ giới hạn tác dụng enzym lên yếu tố X mà còn có khả năng hoạt hóa yếu tố VII [40]

- Con đường đông máu nội sinh Khi máu bị tổn thương hoặc tiếp xúc với bề mặt lạ làm hoạt hóa tiểu cầu và yếu

thrombin) tham gia hoạt hóa yếu tố X thành Xa [10], [14] Sau khi yếu tố X được

phospholipid tiểu cầu, Va (hoạt hóa bởi thrombin) tạo thành phức hợp prothrombinase Hai con đường đông máu nội sinh và ngoại sinh không tách biệt hoàn toàn mà có mối quan hệ chặt chẽ và tác động qua lại lẫn nhau Khi xảy ra một quá trình đông máu, đặc biệt là trong bệnh lý cả hai con đường đông máu đều được khởi động nếu đủ điều kiện Con đường đông máu ngoại sinh có tác động khá mạnh lên con đường nội sinh vì chúng đều hoạt hóa yếu tố IX và X [14]

Thromboplastin hoạt hoá (phức hợp prothrombinase) nội sinh và ngoại sinh tác động chuyển prothrombin thành thrombin Thrombin đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng của quá trình đông máu Tác động men của nó ảnh hưởng đến nhiều cơ chất và can thiệp vào nhiều khâu của quá trình đông máu với mục đích chủ yếu là tạo thành fibrin Nó chuyển fibrinogen thành fibrin, hoạt hoá yếu tố XIII để ổn định sợi huyết Nó cũng tự làm tăng tốc độ hình thành của bản thân, hoạt hoá yếu tố VIII và yếu tố V nhằm làm gia tăng sự hình thành yếu tố Xa bằng cả hai con đường nội sinh và ngoại sinh Hơn nữa thrombin tác động lên tế bào bằng cách cố định lên tế bào và hoạt hóa chúng như hoạt hóa tiểu cầu Thrombin kích thích tế bào nội mạc sản xuất ra prostacyclin ức chế chất hoạt hóa plasminogen do nội mạch sản xuất và tăng sự

phát triển tế bào do nội tiết tố sinh trưởng đặc hiệu Nó cũng cố định lên tế bào sợi non (fibroblast) và kích thích chúng tăng sinh [40]

Thrombin thủy phân fibrinogen thành các fibrin đơn phân Như vậy, fibrinogen được chuyển thành fibrin monomer Với sự thay đổi về điện tích, xuất hiện các lực hút tĩnh điện fibrin monomer thành fibrin polymer Yếu tố XIII được hoạt hóa bởi

giữa các sợi fibrin Mạng lưới fibrin được hình thành và ổn định bao bọc lấy các tế bào máu tạo nên cục máu đông, có khả năng bịt vết thương ở thành mạch làm ngưng chảy máu [41], [42]

1.2.3 Các thuốc chống đông máu

Các thuốc chống đông máu ức chế hình thành cục máu đông thông qua tác động lên các yếu tố đông máu Dựa theo đường dùng phân loại thuốc chống đông thành hai loại: thuốc chống đông đường tiêm và thuốc chống đông đường uống [43], [44]

1.2.3.1 Thuốc chống đông đường tiêm

Heparin có tác dụng chống đông máu nhanh cả in vitro và in vivo [45]

- Heparin không phân đoạn (unfractionated heparin – UFH) Heparin không phân đoạn được chiết xuất từ phổi bò hoặc niêm mạc ruột lợn [44] Bản chất heparin là một phân tử phức tạp gồm hơn 300 polysaccharid khác nhau, có trọng lượng phân tử 60000 – 100000 dalton Trong huyết tương có antithrombin III là một globin làm mất hiệu lực của thrombin và các yếu tố IX, X, XI, XII đã hoạt hóa Heparin tạo phức với antithrombin III, phức này thúc đẩy mạnh phản ứng antithrombin – thrombin và cả phản ứng antithrombin với các yếu tố đông máu IX, X, XI, XII gấp 1000 lần so với khi không có mặt heparin [43], [46] UFH có hiệu quả chống đông nhanh (trong vòng vài phút), thải trừ chủ yếu qua gan, không có dạng bào chế đường uống Trong xét nghiệm, heparin làm kéo dài thời gian chảy máu, thời gian prothrombin (PT), thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần (aPTT)… [46]

- Heparin phân tử lượng thấp Heparin phân tử lượng thấp được bào chế bằng cách khử polymer của heparin không phân đoạn Kết quả của quá trình khử polymer là các chuỗi mucopolysaccharid ngắn, có trọng lượng phân tử trung bình 4000 – 5000 dalton Mặc dù khác nhau về độ dài chuỗi mucopolysaccharid so với heparin không phân đoạn, tất cả LMWH đều có một vùng có 5 phân tử đường đặc hiệu Nhờ vùng này, LMWH có hoạt tính kháng Xa cao hơn nhiều so với hoạt tính kháng thrombin (với tỷ lệ dao động từ 2 – 4 lần tùy theo thuốc), trong khi UFH có hoạt tính kháng cả Xa và thrombin Bởi vậy tác dụng chống đông máu của LMWH giảm đi nhiều LMWH không làm thay đổi nhiều thời gian thromboplastin hoạt hóa từng phần [14], [43] Trong đó, UFH có tác dụng tương đương trên thrombin và yếu tố Xa, còn LMWH tác động chủ yếu lên Xa, ít ảnh hưởng trên thrombin [43]

Fondaparinux là một pentasaccharid tổng hợp, có tác dụng ức chế chọn lọc yếu tố Xa thông qua liên kết antithrombin III Fondaparinux được sử dụng để dự phòng và điều trị huyết khối tĩnh mạch sâu (DVT), huyết khối tĩnh mạch (VTE), thuyên tắc phổi (PE), đau thắt ngực không ổn định hoặc nhồi máu cơ tim [47], [48] Fondaparinux có sinh khả dụng tuyệt đối 100% dưới da, tác dụng tức thì, thời gian bán hủy dài (17-21 giờ), bài tiết qua thận và ít tác dụng không mong muốn hơn khi so sánh với thuốc chống đông đường uống [47]

Lepirudin, desirudin, bivalirudin, argatropan là các thuốc chống đông máu đường tiêm có tác dụng ức chế thrombin Các thuốc này gắn trực tiếp lên thrombin, bất hoạt thrombin dẫn đến ức chế quá trình đông máu [42]

1.2.3.2 Thuốc chống đông đường uống

Các dẫn xuất coumarin và indandion còn gọi là các thuốc chống đông kháng vitamin K Các dẫn xuất 4-hydroxi coumarin gồm: dicumarol, warfarin, ethyl bicoumacetat, phenprocoumon Các dẫn xuất indandion gồm: phenyl-indandion,

fluorophenyl-indandion, clophenindion Tác dụng và cơ chế: Các dẫn xuất coumarin

và indandion có cấu trúc gần giống vitamin K, ức chế cạnh tranh enzym

epoxid-reductase, làm cản trở việc khử vitamin K-expoxid thành vitamin K cần cho sự carboxil hóa các chất tiền yếu tố đông máu II, VII, IX, X thành các yếu tố II, VII, IX, X có hoạt tính để tham gia vào quá trình đông máu Vì thuốc kháng lại tác dụng của

vitamin K, tác động trên các yếu tố đông máu ở gan nên thuốc chỉ có tác dụng in vivo

[43], [45] Mặc dù là thuốc quan trọng trong dự phòng và điều trị huyết khối, hiệu quả và an toàn của các thuốc chống đông kháng vitamin K chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm cả các yếu tố liên quan đến di truyền hay tương tác với thức ăn và các thuốc khác dẫn đến hạn chế của nhóm thuốc này [50]

Rivaroxaban và apixaban là thuốc chống đông thế hệ mới, chất ức chế trực tiếp, có tính chọn lọc cao, thuốc ức chế trực tiếp yếu tố Xa, việc ức chế yếu tố Xa làm gián đoạn các con đường nội sinh và ngoại sinh của quá trình đông máu, từ đó giảm hình thành thrombin và sự phát triển của huyết khối Rivaroxaban và apixaban không ức chế thrombin [51] Do liều dùng cố định, không cần theo dõi thường xuyên bằng xét nghiệm, ít tương tác thuốc – thuốc, thuốc – thức ăn, ít ảnh hưởng bởi cá thể hơn warfarin, các thuốc chống đông thế hệ mới đang dần thay thế warfarin và các thuốc chống đông kháng vitamin K trong các chỉ định điều trị trên lâm sàng [50]

Dabigatran là một chất ức chế mạnh trực tiếp, cạnh tranh và có tính chất thuận nghịch với thrombin (yếu tố II hoạt hóa hay IIa) ở dạng tự do hoặc liên kết với fibrin Sự ức chế yếu tố IIa ngăn chặn quá trình hình thành các cục máu đông Dabigatran etexilat là tiền thuốc, sau khi uống, được hấp thu nhanh chóng và chuyển hóa thành dabigatran, nhờ sự thủy phân qua xúc tác của esterase, có mặt trong huyết tương và ở gan [51]

1.3 Tổng quan về cây dong riềng

1.3.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố

Chi Canna bao gồm 8-10 loài hoang dã và hơn 1000 giống lai [52] và là chi

duy nhất trong họ Cannaceae với mười chín loài thực vật có hoa Đã có 2 lần sửa đổi

về chi Canna bởi các nhà thực vật học trong những năm gần đây, thứ nhất là của

Maas (ở Hà Lan), và thứ hai là của Tanaka (ở Nhật Bản) [53], [54]

Phân loại thực vật: Giới: Plantae

Phân giới: Tracheobiont

Tên gọi khác: dong riềng, dong riềng làm miến

1.3.1.1 Đặc điểm thực vật

Dong riềng là cây thân thảo, có rễ ngầm, phân nhánh, sinh ra những thân khí sinh mọc đứng cao đến 1,5m thường có màu xanh hoặc xanh xen tím, thân gồm những đốt kéo dài tiếp phần củ Bên ngoài thân được cấu tạo bởi lớp biểu bì gồm những tế bào dẹt, bên dưới có những bó cương mô xếp thành những bó tròn có tác dụng chống đỡ cho cây, giúp cây khỏi bị đổ, trong cùng là những bó libe, mạch gỗ và nhu mô

Hình 1.3 Một số hình ảnh cây dong riềng

Rễ cây dong riềng thường phình to thành củ phân nhiều nhánh và chứa nhiều tinh bột, nằm trong đất Lá dong riềng có dạng bản to, khi trưởng thành mép hơi gợn sóng, lá có màu xanh lục bóng hoặc màu xanh xen tím đỏ Hoa dong riềng xếp thành

cụm, cụm hoa thiết diện hình tam giác có từ 6-8 đốt mỗi đốt có hai hoa, đốt dưới cùng và trên cùng có một hoa Cấu tạo của hoa gồm có ba lá đìa hình cánh rời nhau, ba cánh hoa dài thon cuộn theo chiều dài, hoa đỏ nở hoàn toàn có màu đỏ Hoa có 5 nhị đực, ngoài có ba nhị, vòng trong có hai nhị Quả của cây dong riềng thuộc dạng quả nang, hình trứng ngược, kích thước khoảng 3cm trên quả nang có nhiều gai mềm Hạt của cây dong riềng có màu đen, hình tròn có đường kính 3,5-5mm [55]

Hình 1.4 Đặc điểm thực vật loài Canna edulis Ker Gawl [56]

(Ghi chú: 1, 2, 3 Toàn cây; 4, 5, 6, 7, Củ, cụm củ và rễ cây; 8, Thân cây) 1.3.1.2 Phân bố

Canna edulis có nguồn gốc từ vùng Andean của Nam Mỹ và việc sử dụng nó

có niên đại khoảng 2500 năm trước Công nguyên Củ cây dong riềng là một trong những nguồn cho tinh bột phong phú nhất, và nó có năng suất tương đương hoặc cao hơn khoai tây, sắn hoặc ngô [57], [58] Cây dong riềng là cây nông nghiệp bộ phận dùng là củ, cây dễ trồng và cho năng suất thu hoạch cao Cây được trồng chủ yếu ở

Nam Mỹ, Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc và Việt Nam [59] Cây dong riềng (Canna

edulis) được người Pháp giới thiệu và đưa vào trồng ở Việt Nam từ đầu thế kỷ 19,

Cây dong riềng là cây trồng dài ngày, chịu hạn tốt, chịu rét khá, có thể trồng quanh năm Cây dong riềng có thể trồng trên rất nhiều loại đất, kể cả các vùng đất nghèo dinh dưỡng, năng suất củ tươi có thể đạt từ 45 - 60 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 13,36- 16,4% [60] Cây dong riềng được trồng ở rất nhiều nơi, dong riềng được coi là cây nông nghiệp thế mạnh tại tỉnh Bắc Kạn, Tam Đường tỉnh Lai Châu [60], [61], [62]

1.3.3 Thành phần hóa học

Năm 2004, Young Sook Yun và cộng sự đã phân lập được ba phenylpropanoid

sucrose esters mới là 3-O-p-coumaroyl-feruloyl-β-D-fructofuranosyl

6-O-p-coumaroyl-β-D-fructofuranosyl α-D-glucopyranoside bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, hợp chất mới được phân lập từ phân đoạn ethyl acetat của phần dưới mặt đất cây dong riềng, cùng với bốn phenylpropanoids là caffeic acid, rosmarinic acid,

Năm 2010, Juan Zhang và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học và đặc tính của chất xơ sau khi chiết xuất tinh bột từ củ cây dong riềng thu được 54,84% chất xơ và chất xơ không tan chiếm phần lớn, bằng phương pháp AOAC cho thấy trong chất xơ có xyloglucan, arabinoxilan, glucuronoxilan, pectin và ligin [64]

Năm 2011, Zhang và cộng sự bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập từ

phân đoạn nước của phần dưới mặt đất cây dong riềng Canna edulis một hợp chất

mới đặt tên là chất 1 là 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene-2-carboxilic acid cùng với mười hợp chất đã biết gồm: acid rosmarinic (2), acid salvianolic B (3), acid ferulic (4), acid caffeic (5), acid 1-caffeoylquinic (6), acid 3-caffeoylquinic (7), acid 4-caffeoylquinic (8), acid 5-caffeoylquinic (9), acid salicylic và acid gallic (10), cấu trúc hóa học của chất và hợp chất đã được phân lập được tổng hợp trong hình 1.5 dưới đây Và trong nghiên cứu

4-(3-(3,4-dihydroxiphenyl)acryloyl)-6-hydroxi-1-methoxi-kết quả cho thấy Canna edulis có hàm lượng tannin đậm đặc [65]

Hình 1.5 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Canna edulis

Năm 2011, Juan Zhang và cộng sự đã xác định hàm lượng pectin có nhiều

trong phần dưới mặt đất Canna edulis bằng phương pháp trắc quang, kết quả nghiên

cứu cho thấy pectin tan tốt trong dịch dạ dày và ruột mô phỏng [66]

Năm 2012, kết quả nghiên cứu của Tanmayee Mishra và cộng sự cho thấy trong chiết xuất từ các phân đoạn phần dưới mặt đất cây dong riềng có chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, phenol, proanthocyanid, glycosid [67]

Hoạt chất arabinoxilan cũng được Zhang và cộng sự phân lập từ phần dưới mặt đất cây dong riềng và chứng minh tác dụng ức chế enzym lipase và pepsin năm 2013 [68]

Năm 2017, trong nghiên cứu của Fan Xie và cộng sự đã xác định được lignin từ phần bã sau điều chế tinh bột củ dong riềng và cho thấy tiềm năng của lignin trong bệnh đái tháo đường typ 2 [69]

Ở Việt Nam, năm 2020, tác giả Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự lần đầu tiên

phân lập 7 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của phần thân dưới cây Canna edulis

Bảy hợp chất phân đã được phân lập đó là: 5-hydroxi-6-methyl-2H-pyran-2-one

(Z,E)-[2-(3,4-dihydroxiphenyl)ethenyl]3-(3,4-dihydroxiphenyl)-2-propenoat (C17H14O16) (3);

Hình 1.6 Cấu trúc các chất phân lập từ phân đoạn n-hexan phần dưới mặt đất

cây dong riềng

Năm 2021, tác giả Lê Hồng Luyến cũng nhóm nghiên cứu lần đầu tiên phân

lập được 6 hợp chất từ phân đoạn n-hexan của phần dưới mặt đất cây dong riềng, cấu

trúc hóa học của các hợp chất đã được xác định bằng phương pháp phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân Các hợp chất được phân lập là 24-Methylenecycloartan-3β-

(4E,7Z)-2-carboxi-1-O-β-D-glucopyranosyl-3,11-dihydroxitritriaconta-4,7-diene (Citrulloside); Acid 16β-hydro-19-al-ent-kauran-17-oic; daucosterol và β-sitosterol [70], cấu trúc của hợp chất được trình bày trong hình 1.6

Năm 2023, Liqiao Lv và công sự đã xác định được 54 thành phần hóa học từ dịch chiết methanol của phần dưới mặt đất cây dong riềng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (UHPLC) Trong đó gồm có 36 acid hữu cơ (trong đó có 6 acid phenolic), ba phenol, sugar, triterpenoid, mười hợp chất hữu cơ chứa Nito và các hợp chất khác [71]

Năm 2023, kết quả nghiên cứu của Mamoru Tanaka và cộng sự đã cho thấy trong tinh bột điều chế từ củ cây dong riềng có hàm lượng kháng tinh bột (resistant starch – RS) (77,8%) và amylose (39,7%) cao hơn nhiều so với khoai tây, lúa mì, ngô…[72]

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý

Một số nghiên cứu tác dụng dược lý Canna edulis được trình bày dưới đây

Kết quả được báo cáo trong bài báo nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự (2020) đã chứng minh tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn ethyl acetat từ phần dưới mặt đất cây dong riềng tốt nhất so với cao tổng và phân đoạn nước với cả hai chất kích tập ADP và collagen tại cả ba nồng độ thử là 4 – 2 – 1 mg/mL Trong đó, tại nồng độ 1 mg/mL với chất kích tập ADP, phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn ethyl acetat cao nhất 97% (p < 0,05) Bên cạnh đó, tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của ba chất phân lập từ phân đoạn ethyl acetat của phần dưới mặt đất cây dong riềng cũng được chứng minh, với chất (Z,E)-[2-(3,4-dihydroxiphenyl)ethenyl] 3-(3,4-dihydroxiphenyl)-2-propenoat có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu tốt nhất, phần trăm ức chế ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập collagen tại nồng độ thử 0,1 mg/mL là 96,0% (p < 0,05) [59]

Tác dụng chống đông máu phần dưới mặt đất cây dong riềng đã được nhóm tác giả Nguyễn Thị Vân Anh và công sự (2020) chứng minh Cụ thể, dịch chiết phân đoạn ethyl acetat từ phần dưới mặt đất cây dong riềng tại hai nồng độ 4 mg/mL và 2 mg/mL kéo dài PT và aPTT (p < 0,05) Tại nồng độ 4 mg/mL, phân đoạn ethyl acetat có tác dụng kéo dài PT với 36,8 s và aPTT với 113,83 s; tại nồng độ 2 mg/mL phân

Điều này có ý nghĩa tác dụng chống đông máu của phân đoạn ethyl acetat phụ thuộc vào liều (hệ số tương quan r > 0,97) [59]

Năm 2011, nghiên cứu của Tanmayee Mishra và cộng sự đã cho thấy tác dụng chống oxi hóa của phần dưới mặt đất cây dong riềng với hàm lượng lớn hợp chất polyphenolic bằng phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH dịch chiết

570 𝜇𝑔/𝑚𝐿 và 600 𝜇𝑔/𝑚𝐿 Kết quả cho thấy tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết nóng tốt hơn so với dịch chiết lạnh [73]

Năm 2020, nghiên cứu của tác giả Vân Anh và cộng sự cho thấy phân đoạn ethyl acetat từ phần dưới mặt đất cây dong riềng có tác dụng chống oxi hóa tốt nhất thể

toàn phần, phân đoạn n-hexan và phân đoạn nước [59]

Năm 2018, tác giả Robby Najini và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu in vivo trên

30 chuột cái Wisstar được chia thành 6 nhóm thử, nhóm I chuột được cho uống nước, nhóm II được cho ăn 0,5 natri carboximethyl cellulose, nhóm III, IV và V cho ăn tinh bột củ cây dong riềng và nước ở liều tương ứng là 250, 500, 1000 mg/kg, nhóm VI được cho uống sucralfate liều 360 mg/kg, trong 14 ngày Ngày thứ 14, chuột từ nhóm II – VI được cho uống ethanol 96% 1 mL/200g trong 1 tiếng 24 tiếng sau chuột được mổ bụng lấy ruột để phân tích kết quả, kết quả cho thấy nhóm III, IV, V có tác dụng làm giảm chỉ số loét dạ dày tá tràng tốt nhất so với các nhóm còn lại, nhóm V có tỉ lệ bảo vệ cao nhất lên đến 75% Nhóm V có vùng chảy máu nhỏ nhất (0,77 %) so với nhóm VI (2,05%), III (15,38%) và IV (8,86%) Bên cạnh đó, flavonoid từ tinh bột củ cây dong riềng được tách bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy tác dụng chống lại các gốc tự do và giảm xuất huyết đường tiêu hóa [74]

Năm 2023, kết quả nghiên cứu in vivo của Mamoru Tanaka và cộng sự thử nghiệm

trên 24 con chuột cái BALB/c 6 tuần tuổi được chia làm 3 nhóm thử trong đó nhóm

chứng, nhóm cho ăn 3,16% và nhóm cho ăn 6,32% tinh bột củ cây dong riềng trong

nghiền, lá lách được cắt ra, tế bào lympho lá lách được tách ra và xử lý theo thiết kế

thí nghiệm Kết quả cho thấy tinh bột củ Canna edulis có 77,8% kháng tinh bột, 39,7

% amylose cao nhất so với hàm lượng các tinh bột củ như khoai tây, gừng Tổng

lượng IgA nhóm ăn nhiều tinh bột củ Canna edulis (1,5 ng/mL) cao hơn nhóm chứng (1,1 ng/mL), p < 0,05; tổng lượng IgM ở nhóm ăn ít tinh bột củ Canna edulis (595 ng/mL) cao hơn nhóm chứng và nhóm ăn nhiều tinh bột củ Canna edulis (p < 0,05)

Kết quả đo nồng độ IgA trong huyết thanh, thấy IgA ở nhóm chuột ăn nhiều tinh bột

củ Canna edulis (38 𝜇𝑔/mL) cao hơn nhóm chứng (25 𝜇𝑔/mL), p < 0,05 Có thể thấy

tinh bột củ cây dong riềng có tiềm năng làm tăng khả năng miễn dịch [72]

Nghiên cứu của tác giả N Mahmudah và công sự năm 2018 đã chứng minh tác dụng tiềm năng phòng và điều trị ung thư đại trực tràng, thí nghiệm thử trên 30 chuột Wistar đực chia thành 5 nhóm trong đó nhóm chứng, nhóm chứng dương mô hìnhAzoximethane (AOM)/Dextran Sodium Sulfate (DSS), nhóm được điều trị bằng 5% tinh bột củ cây dong riềng, nhóm được điều trị bằng 10% tinh bột củ cây dong riềng và nhóm được điều trị bằng 20% tinh bột củ cây dong riềng, nhóm chứng dương được tiêm tĩnh mạch liều 10 mg/kg, 2% DSS trong 14 ngày kết quả thấy rằng nhóm chuột sử dụng 10% tinh bột củ cây dong riềng có khác biệt đáng kể so với chứng dương (p = 0,02) [75]

Tinh bột từ phần dưới mặt đất cây dong riềng cho thấy tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự như metformin, giảm đáng kể đường huyết, giảm kháng insulin, tăng dung nạp glucose và giảm tổn thương bệnh lý Ngoài ra, phần dưới mặt đất cây dong riềng giảm đáng kể trọng lượng cơ thể và rối loạn lipid máu ở chuột béo phì [76], [77], [78] Năm 2017, F Xie và cộng sự đã cho thấy lignin phân lập từ tinh bột củ cây dong riềng cho thấy khả năng ức chế α-D-glucosidate cao hơn acarbose với nồng

 Tác dụng khác Ở Việt Nam, không chỉ là cây nông nghiệp cho sản lượng cao mà cây dong riềng còn được sử dụng trong y học cổ truyền để chữa nhiều bệnh khác nhau như giảm đau khớp, tiêu chảy, viêm gan và các bệnh tim mạch Ngoài ra, cây dong riềng còn được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa viêm và hạ sốt [70] Ở Trung Quốc, cây dong riềng được sử dụng là bài thuốc cổ truyền để điều trị kiết lỵ, tiêu chảy, viêm gan vàng cấp tính, metrorrhagia, bệnh bạch cầu, kinh nguyệt không đều [71]

Các nghiên cứu đã công bố thường tập trung vào tinh bột củ hoặc phần dưới mặt đất cây dong riềng, nhận thấy rằng các nghiên cứu liên quan đến phần thân lá của cây dong riềng còn tương đối hạn chế Chính vì vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tiếp theo phần thân lá cây dong riềng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Phần thân lá (thân, lá) của cây dong riềng được thu hái ở tỉnh Thái Nguyên,

được Tiến sĩ Lê Thị Thanh Hương, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên giám

định tên khoa học Canna edulis Ker Gawl Mẫu được rửa sạch phần thân lá để loại

bỏ bùn đất, cắt thành từng đoạn nhỏ rồi phơi khô Sau đó, sấy mẫu dược liệu trong tủ

2.1.1.2 Cao toàn phần, các dịch chiết phân đoạn và các chất phân lập tiềm năng

ethanol 96% 2 lần (Lần một ngâm với 37 L ethanol 96% siêu âm 4 lần mỗi lần 30 phút Lần hai ngâm với 20 L ethanol siêu âm 4 lần mỗi lần 30 phút) Quay cất dịch

bằng nước cất và chiết phân lớp lần lượt với 1,6 L n-hexan và 1,6 L ethyl acetat Cất loại dung môi dưới áp suất giảm đến khối lượng không đổi thu được cặn chiết tương ứng, là cao n-hexan (144 g) và phân đoạn nước (493 g) từ phân đoạn nước tiếp tục lắc với ethyl acetat 1,6 L x 2 lần thu hồi dung môi thu được cao phân đoạn ethyl acetat (23,9 g) và còn lại là phân đoạn nước Từ phân đoạn ethyl acetat của phần thân lá cây dong riềng, các hợp chất tinh khiết được tiến hành phân lập, định danh (không trình bày trong công trình này) Các chất phân lập và xác định cấu trúc bởi TS Nguyễn Thị Minh Hằng, Trung tâm nghiên cứu và phát triển thuốc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để thực hiện nghiên cứu thông tin Các chất phân lập được mã hóa CEAE1, CEAE2,CEAE3 là sản phẩm của đề tài mã số THTEXS.04/22.24

Qui trình chiết cao toàn phần và các phân đoạn, các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần, các phân đoạn, phân lập chất từ

phần thân lá cây dong riềng 2.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Máu và huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh

Nghiên cứu tác dụng chống đông máu, chống tập kết tiểu cầu sử dụng huyết tương người tình nguyện khỏe mạnh

Tiêu chuẩn lựa chọn: Người tình nguyện khỏe mạnh, 20-25 tuổi, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không sử dụng ma túy và không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin

Tiêu chuẩn loại trừ: Có bất thường về số lượng tiểu cầu tại thời điểm nghiên cứu, mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng máu lớn hơn 450 mL trong vòng 28 ngày trước

Bột cây dong riềng 5,5 kg

Cắn chiết ethanol 637 g

- Chiết với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (37L x 4 lần) và siêu âm (30 phút x 4 lần)

Cao phân đoạn n-hexan 144 g Phân đoạn nước 493g

- Phân tán trong nước - Lắc với n-hexan (1,6 lít x 2 lần)

Cao phân đoạn ethyl acetat 23,9 g Phân đoạn nước

- Lắc với ethyl acetat (1,6L x 2 lần)

Thu hồi dung môi

Chất CEAE1 Chất CEAE2 Chất CEAE3

Thu hồi dung môi

Qui trình lấy mẫu: Tình nguyện viên được lấy máu vào buổi sáng và nhịn ăn 12 giờ trước khi lấy máu Máu tĩnh mạch toàn phần được lấy bằng kim tiêm cỡ 20

gauge Máu tĩnh mạch được thu thập và cho vào các ống natri citrat (3,2%), sau đó ly

tâm với tốc độ 500 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) và 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu huyết tương nghèo tiểu cầu (PPP)

Qui trình lấy máu được thực hiện bởi bác sỹ và điều dưỡng có chuyên môn Địa điểm lấy máu: Khoa Khám bệnh và điều trị ngoại trú, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương

Đề tài được thực hiện theo việc lấy mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh Do đó, cần tuân thủ theo hiệp ước Helsinki và hướng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tượng nghiên cứu là con người Sau khi được sự đồng ý và chấp thuận của hội đồng đạo đức, đề tài đã tiến hành thu thập máu lấy từ người tình nguyện khỏe mạnh Người tham gia nghiên cứu được biết lý do, mục đích của nghiên cứu, các lợi ích, cũng như rủi ro của nghiên cứu và ký đồng thuận tham gia nghiên cứu Người tình nguyện có quyền từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không chịu sự ràng buộc nào

Quyết định phê duyệt của Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học số 02/2020/CN-HĐĐĐ (Phụ lục 01)

- Heparin (natri) 5000 IU/mL (nơi sản xuất Belarus, số đăng ký: 14, số lô: 010122, hạn sử dụng: 03/01/2025)

VN-18524 Aspirin (Aspegic 100mg) (nơi sản xuất Pháp, số đăng ký: VNVN-18524 4609VN-18524 07, số lô: EM0359, hạn sử dụng: 04/2023)

- Collagen (P/N 385) (Chronolog Corp., USA) - ADP (P/N 384) (Chronolog Corp., USA) - Bộ kit PT (Thromborel® S Reagent, Marburg, Germany) - Bộ kit aPTT (Dade Actin® P, Marburg, Germany)

- Bộ kit TT (Thromboclotin® Reagent1, Marburg, Germany)

2.2.3 Thiết bị nghiên cứu

- Máy li tâm (Centrifuge Eppendoft 5810 R) - Máy đo thời gian PT, TT và APTT: Máy ACL-TOP 750 LAS của hãng IL

(Instrumentation Laboratory - Mỹ) - Máy đo độ ngưng tập tiểu cầu (CHRONO-LOG 530 VS) - Máy đọc đĩa SpectraMax iD5

2.2.4 Dụng cụ nghiên cứu

- Ống nghiệm chống đông sodium citrat (Việt Nam) - Đầu côn (Greetmed, China)

- Microtube thể tích 1,5 mL (Eppendorf) - Micropipet các loại 1-10 µL; 20-200 µL; 100-1000µL (Eppendorf,

Germany) - Đĩa 96 giếng (Biologix, Mỹ)

2.3 Nội dung và thiết kế nghiên cứu

Để thực hiện ba mục tiêu đã đề ra, đề tài nghiên cứu gồm các nội dung sau:

của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ cây dong riềng:

- Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần và các

phân đoạn cây dong riềng băng phương pháp đo quang

- Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của các chất phân lập từ

phân đoạn tiềm năng

phần, các phân đoạn và chất phân lập từ cây dong riềng: