phạm thị thu thảo nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống oxi hóa in vitro của lá loài trà hoa vàng camellia chrysantha hu tuyama ở các giai đoạn phát triển

TỔNG QUAN

Tổng quan về Trà hoa vàng

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, Trà hoa vàng (Camellia chrysantha) có vị trí phân loại như sau [41]:

Phân lớp: Sổ (Dillenniidae) Bộ: Trà (Theales)

Họ: Trà (Theaceae) Chi: Trà (Camellia) Tên Việt Nam: Trà hoa vàng

Tên khoa học: Camellia chrysantha (Hu) Tuyama

Tên khác: Kim hoa trà, Trà trường thọ, Trà rừng

Trà hoa vàng là loài có thân gỗ nhỏ, chồi và cành non có lông mịn thưa; cành già màu nâu, nhẵn Lá bao chồi 5 - 9, thường là 6, hình elip, lớn dần từ dưới lên, mặt ngoài màu hồng nhạt; mặt trong màu hồng nhạt hơn, nhẵn, mép nguyên Lá đơn, mọc so le, không có lá kèm Cuống lá tương đối ngắn, dài khoảng 0,6 - 0,7 cm, lõm ở mặt trên Phiến lá (bánh tẻ) hình elip, cứng và dày, dai, dài 11 cm, rộng 5 cm; mặt trên lá có màu xanh thẫm, nhẵn bóng; mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn, thường có nhiều điểm tuyến màu đen; gốc lá hình nêm; mép lá có khía răng cưa, khía răng nông nhỏ, phía gốc lá gần như không có khía, mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá; ngọn lá nhọn, có mũi dài 0,4 - 0,5 cm, gân giữa lộ rõ, lõm sâu ở mặt trên, nổi rõ ở mặt dưới, có 10 - 12 cặp gân bên [6], [8]

Hoa đều, lưỡng tính, mọc đơn độc ở đầu cành hoặc nách lá, màu vàng, đường kính khi nở khoảng 3 cm Cuống hoa rất ngắn, gần như không thấy Lá bắc 6 - 10, có dạng hình móng, xếp thành 2 dãy, phủ lên nhau, lớn dần từ dưới lên trên, kích thước 0,3 - 1,4 cm, mặt ngoài và mặt trong có lông trắng mịn Cánh hoa 10 - 20, các cánh phía trong dính với nhau và dính vào vòng nhị ngoài Bộ nhị nhiều, dính với nhau ở gốc chỉ nhị Các chỉ nhị ở vòng ngoài của bộ nhị dài khoảng 2,4 cm, không có lông; chỉ nhị màu vàng, mang bao phấn 2 ô Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau tạo thành bầu trên 3 ô, có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, nhẵn; vòi nhụy 3, rời, màu vàng [6], [8] Quả nang to 3 cm, vỏ quả dày 3 mm [58]

Thời điểm nở nhiều hoa là tháng 11 âm lịch và kéo dài đến tháng 3 mới tàn Từ tháng 1 đến tháng 3 là khi mà cây ra nhiều lá mới [1]

Loài Camellia chrysantha được tìm thấy lần đầu ở tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc bởi Hu (1965) Trà hoa vàng phân bố chủ yếu ở Tây Nam Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam [48], [49] Hiện nay, Trà hoa vàng đã được du nhập vào Nhật Bản, Úc và Bắc Mỹ [47] Ở Việt Nam Ở Việt Nam, loài C chrysantha được tìm thấy ở Quảng Ninh (Ba Chẽ), Nghệ An (Quế Phong), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình, Đà Lạt, Tuyên Quang, Ba Vì, Hà Nội, Đồng Nai, Thái Nguyên [8], [15]

Phụ thuộc vào vị trí gieo trồng và phân bố dược liệu, Trà hoa vàng được chia thành các loại:

- Trà hoa vàng Ba Chẽ - Trà hoa vàng Quảng Ninh

- Trà hoa vàng Quế Phong - Trà hoa vàng Nghệ An

- Trà hoa vàng Đà Lạt - Trà hoa vàng Lâm Đồng

- Trà hoa vàng Tam Đảo - Trà hoa vàng Vĩnh Phúc

Trong các loại trên, Trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh được ưa chuộng nhất bởi hương vị thơm ngon và hàm lượng lớn những hoạt chất có trong dược liệu [57]

Trà hoa vàng ưa khí hậu nóng ẩm, sinh sống trong các khu rừng ẩm có độ cao dưới

500 m Thường mọc ở nơi đất tơi xốp bên bờ suối có bóng râm, thoát nước tốt

1.1.4 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến

Cũng như các loài Trà hoa vàng khác, lá, hoa và búp Camellia chrysantha được dùng để làm thuốc, trà,… [58]

Trà hoa vàng là một trong những vị thuốc quý bởi có chứa trên 400 thành phần hóa học và không độc hại Các hợp chất đã được xác định trong loài C chrysantha được phân lập chủ yếu trên lá và hoa của loài này Theo nhiều tài liệu được báo cáo, các nhóm chất có mặt trong loài C chrysantha là các polysaccharid, polyphenol, flavonoid, saponin, acid amin và hợp chất dễ bay hơi [28], [46] Ngoài ra, kẽm hữu cơ tự nhiên, selen, molypden, gecmani, mangan, vanadi và các nguyên tố vi lượng khác và vitamin đã được báo cáo là có trong loài C chrysantha [23], [46], [55]

Theo báo cáo của Lin và cộng sự (2010), hàm lượng các thành phần hóa học đã được xác định trong hoa và lá của C chrysantha được phân tích ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng thành phần hóa học trong hoa và lá Camellia chrysantha STT Tên thành phần Hàm lượng trong hoa Hàm lượng trong lá

9 Vitamin C (mg/100 g) 90 Chưa xác định

10 Vitamin E (mg/100 g) 520 Chưa xác định

11 Tổng acid amin tự do (mg/100 g) 80,8 Chưa xác định

Bên cạnh đó, các báo cáo trước đó cũng chỉ ra rằng không phát hiện thấy caffein trong lá và hoa của C chrysantha [36], [40] Điều này cho thấy sự khác biệt lớn của loài

C chrysantha nói riêng, và các loài Trà hoa vàng nói chung đối với nhóm trà xanh thông thường Đó cũng là cơ sở dùng lá và hoa của Trà hoa vàng thay thế cho trà khử caffein hiện tại để có thể tránh được một số tác dụng phụ không mong muốn mà caffein tạo ra, bên cạnh hàm lượng chất chống oxy hóa và lợi ích sức khỏe của chúng

Các hợp chất đã phân lập được từ loài C chrysantha được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Các hợp chất đã được phân lập từ loài C chrysantha

STT Tên hợp chất Bộ phận TLTK

STT Tên hợp chất Bộ phận TLTK

Hợp chất phenol là nhóm các hợp chất hóa học mà trong công thức hóa học có chứa nhóm chức hydroxyl (- OH) gắn với vòng hydrocarbon thơm Các hợp chất này rất phổ biến trong thực vật Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm này mà các tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học thay đổi [5]

Thành phần polyphenol của Trà hoa vàng rất đa dạng, chủ yếu thuộc nhóm flavonoid và tanin Các polyphenol này chiếm từ 20 - 35% trọng lượng trà khô [1] Catechin (15), epicatechin (16), kaempferol (9), isovitexin (8), vitexin (7) và quercetin - 7 - O - β - D - glucopyranoside (2) đã được xác định và định lượng trong lá

C chrysantha bằng phương pháp LC - ESI - MS Hàm lượng catechin và epicatechin chiếm số lượng lớn nhất và thay đổi lần lượt từ 32,23 g/g đến 44,89 g/g và từ 36,93 g/g đến 55,56 g/g [47] Bên cạnh vitexin và quercetin - 7 - O - β - D - glucopyranoside, ba flavonoid glycoside khác, quercetin - 3' - O - β - D - glucopyranoside (4), quercetin - 3

- O - β - D - glucopyranoside (3), và quercetin - 3 - O - rutinose, được phân lập từ dịch chiết ethyl axetat và các phần tan trong nước của hoa C chrysantha thu hái tại Việt Nam [34], [45]

Năm 2018, 10 hợp chất đã được phân lập và xác định trong lá Camellia chrysantha là 3, 4 - methylenedioxy - 3′ - O - methyl - 4′ - O - (6′ - O - acetyl - glucosid) ellagic acid (1’), oleanolic acid (2’), α - spinasteryl - 3 - O - β - D - glycosid (3’), n -

6 dotriacontanol (4’), okicamelliasid (5’), 6 - hydroxy - kaempferol - 3 - O - β - D - glucopyranosid (6’), 3, 4 - O, O - methylidyne - ellagic acid (7’), ellagic acid - 4 - O - β - D - glucopyranosid (8’), 3, 4 - methylenedioxy - 3' - O - methyl - 4' - O - glucosid ellagic acid (9’), p - (hydroxymethyl) phenol 5 - O - β - D - glucopyranosyl (1 → 2) - β

- D - (4 - O - p - coumaryl) - glucopyranosid (10’) Trong đó hợp chất (1’) là một acid ellagic mới có trong lá, hợp chất 4’ - 10’ lần đầu tiên được tìm thấy từ lá cây Camellia chrysantha [32]

Saponin là thành phần được báo cáo là có hàm lượng khá cao trong lá của loài

C chrysantha Theo báo cáo của Zeng và cộng sự, sau khi tinh chế sơ bộ, nồng độ saponin và polyphenol trong trà lần lượt là 23,79 mg/ml và 3,42 mg/ml, cho thấy nồng độ saponin gấp khoảng 7 lần so với polyphenol trong lá của Trà hoa vàng [50] Tuy nhiên đến hiện tại, chưa có saponin nào được công bố là phân lập từ loài C chrysantha

Theo Lin và cộng sự (2013), một polysaccharid tinh khiết đã được phân lập có tên là TPS3 - 1, với trọng lượng phân tử 4,15 x 10 6 u, cho thấy hàm lượng carbohydrat trung tính cao gấp 2 lần acid galacturonic (GalA) [28]

Tổng số acid amin tự do trong hoa C chrysantha là 80,8 mg/100 g Prolin là acid amin có hàm lượng cao nhất trong tổng số acid amin tự do, chiếm 38,7% tổng số acid amin tự do Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra hàm lượng hai vitamin chính trong hoa Trà hoa vàng là vitamin C và vitamin E với giá trị nồng độ lần lượt là 90 mg/100 g và

Năm 2011, Peng và cộng sự tìm thấy trong hoa của C chrysantha hai hợp chất nhóm phytosterol là daucosterol và β - sitosterol [36]

Năm 2012, Zou và cộng sự đã xác định được 61 hợp chất có trong tinh dầu của lá loài C chrysantha bằng phương pháp phân tích sắc ký khí Trong đó, thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất là 2 - (oxo - 18 - alkyl) ethanol, 2 - pentadecan, 1 - iodo - hexadecan [54] Một diarylheptanoid là platyphyllosid đã được phân lập trong lá của C chrysantha Đây là một loại hợp chất không phổ biến, không có trong lá trà xanh thông thường [39] Ngoài ra, một carotenoid là neoxanthin đã được phát hiện trong hoa của loài này, và là yếu tố góp phần tạo ra sắc tố cho hoa Trà hoa vàng [37]

Trà hoa vàng chứa nhiều flavonoid, saponin, polyphenol, acid amin và các nguyên tố vi lượng Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm các đặc tính chống ung thư, chống oxy hóa, hạ lipid máu, hạ đường huyết, chống dị ứng, điều

7 hòa miễn dịch, kháng khuẩn, giải lo âu và chống trầm cảm và đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu

1.1.6.1 Tác dụng chống oxy hóa

Sự khác nhau về thành phần hóa học của lá ở các giai đoạn phát triển

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào so sánh thành phần hóa học của lá Trà hoa vàng

C chrysantha ở các giai đoạn phát triển

Tuy nhiên, năm 2018, Li và cộng sự đã xác định và phân tích các thành phần hóa học chính, hàm lượng và sự thay đổi hàm lượng của lá Camellia nitidissima Kết quả trong lá già, thành phần catechin, flavonoid và anthocyanin lần lượt chiếm 47,17%, 31,20% và 21,63%, còn trong lá non lần lượt chiếm 6,36%, 69,00% và 24,64%

Nghiên cứu cho thấy hàm lượng anthocyanin trong lá non cao hơn lá già Thành phần anthocyanin trong lá C nitidissima là pelargonium - 3 - O - glucoside and cyanidin

- 3 - O - glucoside, trong đó thành phần cyanidin - 3 - O - glucoside là chất tạo ra màu đỏ tím của lá mới C nitidissima [26] Epicatechin là thành phần catechin chính trong

Trà hoa vàng, hàm lượng trong lá già gấp 5,15 lần lá mới Điều này có thể liên quan đến quá trình tổng hợp polyphenol Anthocyanin tổng hợp catechin thông qua anthocyanin reductase Vì vậy, hàm lượng anthocyanin trong lá mới của C nitidissima cao hơn đáng kể so với lá già, trong khi hàm lượng catechin ở lá già cao hơn so với lá non [54] Thành phần flavonoid chính là luteolin - 7 - O - rutinoside và hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá mới cao hơn đáng kể so với lá già, nguyên nhân chủ yếu là do lá mới sinh trưởng và có quá trình trao đổi chất thứ cấp diễn ra mạnh mẽ, dẫn đến hàm lượng anthocyanin và flavonoid trong lá non cao hơn so với lá già [27]

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

Lá tươi của 8 cá thể Trà hoa vàng tại vùng trồng của Công ty Cổ phần Kinh Doanh Lâm Sản Đạp Thanh ở Ba Chẽ, Quảng Ninh đã được xác định tên khoa học là Camellia chrysantha (Hu) Tuyama trong đề tài cấp tỉnh “Nghiên cứu một số thành phần hóa học, tác dụng sinh học và phát triển sản phẩm từ cây trà hoa vàng tại Ba Chẽ, Quảng Ninh”, mã số của mẫu: CA4.1, phiếu giám định 05/2016 (Hình PL1.1, Phụ lục 1)

Các mẫu được thu hái ở 8 cá thể khác nhau vào tháng 2 - 3 năm 2024, được ký hiệu lần lượt là THV.01, THV.02, THV.03, THV.04, THV.05, THV.06, THV.07 và THV.08 Các mẫu lá non, lá bánh tẻ và lá già của từng mẫu lần lượt được thêm các hậu tố “.ln”, “.bt”, “.lg” để phân biệt

Tiêu bản 8 mẫu cá thể Trà hoa vàng được lưu tại Phòng tiêu bản - khoa Dược liệu

- Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các mẫu Trà hoa vàng

Ký hiệu mẫu Người thu mẫu Ngày thu mẫu Nơi thu mẫu Mã số tiêu bản

Xã Đạp Thanh, Ba Chẽ, Quảng Ninh

Mẫu lá Trà hoa vàng được phân thành 3 loại lá theo giai đoạn phát triển là lá non, bánh tẻ và lá già dựa trên đặc điểm của cành mang lá (Hình 2.1):

- Cành mang lá non: Cành có màu đỏ tím, bề mặt nhẵn mịn

- Cành mang lá bánh tẻ: Cành có màu nâu, bề mặt nhẵn, mịn

- Cành mang lá già: Cành có màu nâu, bề mặt sần sùi, hóa bần

Hình 2.1 Cành mang lá Trà hoa vàng

Chú thích: 1 Cành mang lá non 2 Cành mang lá bánh tẻ 3 Cành mang lá già

Lá Trà hoa vàng sau khi thu hái, được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 50 o C và được bảo quản trong túi nilon kín, để trong điều kiện nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng

 Acid gallic (C7H6O5) (Nhà sản xuất: ChemFaces; Số lô: CFS202302; Hàm lượng

 Rutin (C27H30O16) (Nhà sản xuất: ChemFaces; Số lô: CFS202401; Hàm lượng ≥ 98% (C27H30O16) nguyên trạng)

 Cyanidin - 3 - O - glucosid (C21H21O11) (Nhà sản xuất: ChemFaces; Số lô: CFS202401; Hàm lượng ≥ 98% (C21H21O11) nguyên trạng)

Thông tin COA các chất chuẩn xem chi tiết tại Phụ lục 2

 Dung môi chiết: Methanol, Ethanol 96%, Nước

 Dung môi sắc ký: Chloroform, acid formic, acid acetic, aceton, toluen, ethyl acetat, n - butanol, acid sulfuric,…

 Dung môi HPLC: Acetonitril, methanol, acid formic, acid phosphoric, nước cất hai lần dùng cho HPLC

 Hóa chất làm vi phẫu: Dung dịch Javen, dung dịch acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn, nước cất làm tiêu bản

 Hóa chất định tính: Acid chlohydric, anhydrid acetic, NaOH 10%, KOH 10%,

NH4OH 6N, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 10%, TT diazo (mới pha), bột magie kim loại, TT Vanilin, acid sulfuric (H2SO4),…

 Hóa chất định lượng: Natri cacbonat (Na2CO3), Thuốc thử Folin - Ciocalteu (thuốc thử phosphomolybdotungstic), Natri nitrit (NaNO2), Nhôm nitrat (Al(NO3)3),…

 Hóa chất thử tác dụng chống oxy hóa: 2, 2 - diphenyl - 1 - picrylhydrazyl (DPPH), quercetin được mua từ công ty Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA)

- Hóa chất và dung môi đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V

- Bản mỏng tráng sẵn TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck (Đức)

 Ống nghiệm nhỏ, ống nghiệm to, cốc có mỏ (100 ml, 250 ml, 1000 ml), ống đong (10 ml, 500 ml, 1000 ml), bình định mức (10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml,

1000 ml), bình nón (100 ml, 500 ml)

 Pipet chính xác (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml), Pipet chia vạch (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml,

 Phễu lọc, bình triển khai sắc ký

 Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D

 Bể siêu âm DAIHAN Scientific (Hàn Quốc)

 Cân kỹ thuật SATORIUS (Đức), cân phân tích ES225SM-DR Presica/Thụy Sỹ, cân phân tích GR200/Nhật Bản

 Kính hiển vi quang học Leica DM 1000

 Cân xác định hàm ẩm OHAUS (Trung Quốc)

 Máy chấm sắc ký Linomat 5.0

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Shimadzu, Nhật Bản): Buồng cấp dung môi LC - 20AD, buồng ổn nhiệt cho cột CTO - 10AS, cột sắc ký pha đảo C18 Inertsustain GL Sciences (250 x 4,6 mm; 5 μm), đầu dò UV - Vis SPD - M20A

 Máy đo quang HITACHI Nhật Bản

 Máy đo hàm ẩm MF - 50 AND Nhật Bản

 Máy Elisa (Biotek, Mỹ), đĩa elisa 96 giếng (Aptaca - Italia)

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái và vi học của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

- Mô tả, phân tích và so sánh đặc điểm hình thái lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

- Mô tả và so sánh đặc điểm vi phẫu của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

2.2.2 So sánh thành phần hóa học (định tính và định lượng) của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển trên 8 cá thể cây Trà hoa vàng khác nhau 2.2.2.1 So sánh thành phần hóa học của các mẫu của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển trên 8 cá thể cây Trà hoa vàng khác nhau

- Định tính các nhóm chất trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng phản ứng hóa học

- So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.2.2 So sánh thành phần hóa học của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển trên 8 cá thể cây Trà hoa vàng khác nhau bằng phép thử định lượng

- So sánh hàm lượng polyphenol toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng phương pháp đo quang

- So sánh hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng phương pháp đo quang

- So sánh hàm lượng rutin trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.3 Thử tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

Thử tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển gồm mẫu lá non, lá bánh tẻ và lá già của 01 cá thể cây Trà hoa vàng bằng mô hình trung hòa gốc tự do DPPH.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

- Quan sát lá Trà hoa vàng tươi ở ánh sáng thường Mô tả màu sắc, hình dạng, kích thước, thể chất của lá Trà hoa vàng

- So sánh hình thái lá Trà hoa vàng với các đặc điểm:

 Cuống lá: Chiều dài cuống lá, bề mặt cuống lá, màu sắc cuống lá

 Phiến lá: Hình dạng phiến lá, chiều dài, chiều rộng phiến lá, chỉ số phiến lá, hình dạng gốc lá, hình dạng ngọn lá

 Gân lá: Màu sắc gân chính, kiểu gân phụ, kiểu gân mép, chiều dài gân chính trước chia nhánh

2.3.1.2 Mô tả đặc điểm vi phẫu của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

Tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở khoảng 1/3 phiến lá gần gốc, cắt bỏ bớt hai bên, giữ lại phần phiến lá ở mỗi bên gân rộng khoảng 2 mm Các lát cắt mỏng được tẩy

14 và nhuộm theo phương pháp nhuộm kép và lên tiêu bản vi phẫu bằng phương pháp giọt ép [15] Sau đó quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu qua kính hiển vi

2.3.2 So sánh thành phần hóa học của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

Polyphenol tổng và flavonoid là hai thành phần thường xuất hiện cùng nhau trong nhiều dược liệu và được quan tâm bởi các hoạt tính sinh học của chúng, trong đó gây chú ý nhất là tác dụng chống oxi hóa [22] Chính vì vậy, nghiên cứu đã lựa chọn polyphenol và flavonoid làm chỉ tiêu so sánh lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

2.3.2.1 So sánh thành phần hóa học của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển trên 8 cá thể cây Trà hoa vàng khác nhau bằng phép thử định tính a Định tính các nhóm chất trong mẫu lá Trà hoa vàng bằng phản ứng hóa học

Flavonoid và tanin là hai nhóm chất chính thuộc nhóm polyphenol Vì vậy, nghiên cứu tiến hành định tính hai nhóm chất flavonoid và tanin trong lá Trà hoa vàng, trong đó có nhóm catechin [4], [7]

Chuẩn bị dịch chiết: Cân khoảng 5,00 g dược liệu vào bình nón có dung tích 50 ml, thêm 30 ml cồn 90 o , đun sôi cách thủy vài phút Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các phản ứng định tính

- Phản ứng Cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết vào 1 ống nghiệm Thêm một ít bột magie kim loại Sau đó cho thêm vài giọt HCl đậm đặc Để yên vài phút Nếu có sự chuyển màu từ màu vàng sang màu đỏ thì kết luận phản ứng (+)

- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết

Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% sẽ thấy xuất hiện tủa vàng Thêm 1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm

- Phản ứng với kiềm (amoniac): Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc Hơ khô rồi để trên miệng lọ có chứa amoniac đặc Nếu thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên thì kết luận phản ứng dương tính

- Phản ứng tạo phức với muối kim loại FeCl 3 : Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết

Thêm vài giọt FeCl3 5% Quan sát hiện tượng Nếu thấy tủa xanh, nâu xuất hiện thì kết luận phản ứng dương tính

- Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi, để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo (mới pha) Nếu thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch thì kết luận phản ứng dương tính

Chuẩn bị dịch chiết: Cân khoảng 1,0 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất, đun sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính

Lấy 3 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước để làm các phản ứng sau:

- Ống 1: Thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu thấy xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì kết luận phản ứng dương tính

- Ống 2: Thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10% Nếu thấy xuất hiện tủa bông thì kết luận phản ứng dương tính

- Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1% Nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì kết luận phản ứng dương tính

Cân khoảng 0,2 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol, đun cách thủy đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch vanilin 1% và 1 ml dung dịch HCl đậm đặc Nếu thấy xuất hiện màu đỏ đậm thì kết luận phản ứng dương tính b So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

 So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Chuẩn bị dung dịch thử:

Cân khoảng 0,50 g mẫu, làm ẩm bằng methanol, chiết siêu âm với 10 ml methanol trong 30 phút, nhiệt độ 60 o C Lọc lấy dịch, cô dịch lọc đến cắn Hòa tan cắn bằng 2 ml methanol Lọc qua màng lọc 0,45 àg/ml lấy dịch chiết chấm sắc ký Điều kiện sắc ký:

- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút Kích thước bản mỏng: 20 x 10 cm

- Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được tiêm lên bản mỏng bằng máy Linomat 5

- Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 8,0 mm, cách mép dung môi 3,0 mm, Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng 8,0 mm

- Độ dài băng chấm 3,5 mm, khoảng cách giữa các vết là 6,0 mm

- Thể tớch tiờm mẫu: 3 àl

Tham khảo một số nghiên cứu, tiến hành khảo sát 3 hệ pha động

- Hệ 1.1: Ethylacetat : Axit formic : Nước = 8 : 1 : 1

- Hệ 1.2: Chloroform : Aceton : Axit formic = 5 : 5 : 1

- Hệ 1.3: Toluen : Aceton : Acid formic = 9 : 9 : 2

16 Phát hiện vết: Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, UV 254 nm và UV 366 nm Hiện màu bằng thuốc thử Vanilin - H2SO4 pha theo Dược điển Việt Nam V, quan sát ở ánh sáng thường

Lựa chọn hệ dung môi tách được nhiều vết nhất và điều kiện phát hiện tốt nhất để đánh giá kết quả định tính và so sánh sắc ký đồ giữa các mẫu

 So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng HPLC

 Định tính rutin trong lá Trà hoa vàng bằng HPLC

Tiến hành theo phương pháp HPLC (DĐVN V, phụ lục 5.3) [9], tham khảo chuyên luận định lượng Rutin trong Hòe hoa (Sophorae Flos) trong Dược điển Trung Quốc, định lượng rutin trong Hòe hoa [24], lựa chọn và khảo sát lại các thông số (cột sắc ký, pha động và chương trình dung môi, bước sóng phát hiện) để phù hợp với mẫu nghiên cứu Lựa chọn thông số cho pic tách và đẹp chuẩn bị cho quy trình định lượng sau đó

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái và vi học của lá Trà hoa vàng theo giai đoạn phát triển

3.1.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển Đặc điểm hình thái của lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển có những đặc điểm chung như: Lá đơn, mọc so le, cuống lá hình trụ hơi cong, ngắn; phiến lá hình bầu dục chỉ số lá khoảng 2,5 - 3; gốc lá hình nêm (hơi tù), ngọn lá nhọn, mép lá khía răng cưa dày, nhọn; hệ gân hình lông chim gồm 9 - 12 cặp gân bên, gân vấn hợp, nổi rõ ở mặt dưới lá Bên cạnh những đặc điểm chung, lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển khác nhau về thể chất lá, kích thước và đặc biệt là màu sắc phiến lá Chi tiết được thể hiện qua Hình 3.1, Hình 3.2, Hình 3.3, Bảng 3.1

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của lá già

Chú thích: 1 Cành mang lá già; 2, 3 Hình thái lá; 4 Mép lá; 5 Ngọn lá; 6 Mặt dưới lá; 7 Mặt trên lá

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái lá bánh tẻ

Chú thích: 1 Cành mang lá bánh tẻ; 2 Hình thái lá; 3, 4 Mép lá; 5 Mặt trên lá; 6 Mặt dưới lá

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái lá non

Chú thích: 1, 2 Cành mang lá non; 3, 4 Hình thái lá; 5, 6 Mép lá; 7 Mặt dưới lá; 8 Mặt dưới lá

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái lá Trà hoa vàng

TT Đặc điểm so sánh Lá non Bánh tẻ Lá già

1 Cách mọc Lá đơn, mọc so le

2 Thể chất Mềm, phẳng hơn Mềm, dai hơn so với lá già

Cứng, dày, đanh và có bề mặt gồ ghề

Mặt trên màu đỏ tím đến tím đen, nhẵn bóng; mặt dưới nhạt hơn

Mặt trên màu xanh, nhẵn bóng; mặt dưới có màu xanh nhạt, nhẵn

Mặt trên màu xanh thẫm hoặc xanh vàng, nhẵn bóng; mặt dưới màu xanh nhạt, nhẵn

Chiều dài cuống lá 0,3 - 0,8 cm 0,7 - 1,2 cm 0,5 - 0,9 cm

Màu sắc cuống lá Màu tím đỏ Màu xanh hồng Màu xanh vàng

Hình dạng phiến lá Thuôn

Gốc lá Gốc lá hình nêm

Khía răng cưa, khía răng sâu hơn

Mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá

Khía răng cưa, khía răng nông, nhỏ

Mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá

Khía răng cưa, khía răng nông hơn, nhỏ Phía gốc lá gần như không có khía, mật độ khía răng cưa tăng dần về phía ngọn lá

Ngọn lá Ngọn lá nhọn

Gân giữa màu đỏ tím lộ rõ, nổi ở mặt dưới

Gân giữa lộ rõ, nổi rõ ở mặt dưới

Gân giữa màu xanh vàng lộ rõ, nổi rõ ở mặt dưới

3.1.1.2 Mô tả đặc điểm vi phẫu của lá Trà hoa vàng a Lá già và lá bánh tẻ:

Phần gân lá: Lồi cả 2 mặt, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên Từ dưới lên trên gồm các phần: Biểu bì dưới (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ, xếp đều đặn, có phủ một lớp cutin mỏng Mô dày (2) gồm 1 - 3 lớp tế bào hình đa giác, thành dày ở góc, kích thước không đều, xếp sít nhau Mô mềm (3) gồm các lớp tế bào hình đa giác, có vách mỏng, kích thước không đều nhau, sắp xếp lộn xộn để hở nhiều gian bào Mô cứng (5) gồm 2 - 5 lớp tế bào hình đa giác xếp sít nhàu thành cung bao quanh bó libe - gỗ, vách rất dày hóa gỗ bắt màu xanh Bó libe - gỗ lớn ở gân chính, gỗ ở trên, libe phía dưới; libe (6) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước nhỏ, đều, vách mỏng bắt màu hồng; mạch gỗ (7) gồm các tế bào hình đa giác vách dày hóa gỗ bắt màu xanh, xếp thành dãy theo hướng xuyên tâm Nằm rải rác trong mô mềm là thể cứng (4) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng

Phần phiến lá: Biểu bì (a), (d) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, tế bào biểu bì trên (d) lớn hơn tế bào biểu bì dưới (a) Mô giậu (c) gồm các tế bào thuôn dài xếp xít nhau Mô khuyết (d) gồm các lớp tế bào đa giác hoặc tròn, sắp xếp lộn xộn (Hình 3.5) b Lá non:

Vi phẫu lá non có nguyên tắc cấu tạo tương tự lá già và lá bánh tẻ tuy nhiên không quan sát thấy cung mô cứng bao bọc xung quanh bó libe gỗ, mặt khác, trong lá non, thể cứng có số lượng ít hơn và kích thước nhỏ hơn trong lá già và lá bánh tẻ (Hình 3.4)

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá và gân lá Trà hoa vàng

Chú thích: Gân lá 1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày dưới; 3 Mô mềm; 4 Thể cứng; 5 Sợi mô cứng;

6 Gỗ; 7 Libe; 8 Mô dày trên; 9 Biểu bì trên Phiến lá a Biểu bì dưới; b Mô khuyết; c Mô giậu; d Biểu bì trên

A Vi phẫu lá non B Vi phẫu lá già

3.1.2 So sánh thành phần hóa học của các mẫu lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển

3.1.2.1 Định tính các thành phần hóa học trong lá Trà hoa vàng a Định tính các nhóm chất trong mẫu lá Trà hoa vàng bằng phản ứng hóa học Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học cho kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả phản ứng định tính

Phản ứng với chì acetat

Phản ứng với gelatin ĐT nhóm Cate- chin

Chú thích: Phản ứng âm tính: - ; Phản ứng dương tính: +; Phản ứng dương tính rõ: ++; Phản ứng dương tính rất rõ: +++

- Các phản ứng đều dương tính với các mức độ khác nhau, trong đó phản ứng rõ rệt nhất là phản ứng của nhóm catechin Từ đó cho thấy các mẫu lá Trà hoa vàng đều có chứa nhóm flavonoid và tanin, trong đó có nhóm catechin

- Mặt khác, phản ứng định tính cho thấy các mẫu lá non cho kết quả dương tính rõ ràng hơn so với các mẫu lá già và lá bánh tẻ ở phản ứng Cyanidin, từ đó cho dự đoán về hàm lượng flavonoid trong các mẫu lá Trà hoa vàng. b So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

 So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sau khi khảo sát hệ pha động được trình bày ở mục 2.2.2.1 (kết quả được thể hiện ở Phụ lục 4), nghiên cứu đã lựa chọn được hệ dung môi pha động 1.1 cho sắc ký đồ tách được nhiều vết nhất

Tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi 1.1 trên 8 mẫu nghiên cứu Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng thường, bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm nhận thấy sắc ký đồ ở bước sóng 366 quan sát được nhiều vết nhất (Hình 3.5)

Hình 3.5 Sắc ký đồ ở bước sóng 366 nm

Với hệ dung môi 1.1, sắc ký đồ TLC quan sát được các vết sắc ký quan sát được dưới bước sóng 366 nm được thể hiện qua Bảng 3.3 và Bảng 3.4

Bảng 3.3 Đặc điểm sắc ký đồ quan sát dưới bước sóng 366 nm

Vết 1 Vết 2 Vết 3 Vết 4 Vết 5 Vết 6 Vết 7 Vết 8 Vết 9

Vết 1 Vết 2 Vết 3 Vết 4 Vết 5 Vết 6 Vết 7 Vết 8 Vết 9

Bảng 3.4 Đặc điểm sắc ký đồ quan sát dưới bước sóng 366 nm

Chú thích: Trên sắc ký đồ không có vết : - ; Trên sắc ký đồ có hiện vết: +; Trên sắc ký đồ có hiện rõ vết: ++; Trên sắc ký đồ hiện vết đậm: +++

Nhận xét: Phân tích sắc ký đồ của 24 mẫu nghiên cứu cho thấy có sự tương đồng về sự xuất hiện các vết trên 24 mẫu với độ đậm nhạt khác nhau

Từ sắc ký đồ cho thấy:

- Giữa các cá thể, cá thể THV.01 có sự khác biệt so với các cá thể còn lại ở các vết đặc trưng được đánh số thứ tự 1 và 9

- Mặt khác, khi so sánh trên cùng 1 cá thể cho thấy sắc ký đồ của mẫu lá non có sự xuất hiện của các vết được đánh số thứ tự 4, 6, 7, 12, 14 khác so với sắc ký đồ của mẫu lá già, lá bánh tẻ

Tuy nhiên để có thể có kết quả chi tiết và chính xác hơn, cần tiến hành tối ưu hóa điều kiện dung môi, thuốc thử đặc trưng với các nhóm chất và lựa chọn chất chuẩn phù hợp

 So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng HPLC

 Định tính rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Kết quả cho thấy trong cùng điều kiện sắc ký, sắc ký đồ của dung dịch thử cho pic có thời gian lưu TR = 15,183 tương ứng với pic của rutin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn có thời gian lưu TR = 15,124 Đồng thời, khi chồng phổ UV cho kết quả hệ số chồng phổ là 0,9933 > 0,99 (Hình 3.6) Từ đó cho thấy trong các mẫu lá Trà hoa vàng có chứa rutin

Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký đồ và chồng phổ UV của chuẩn Rutin và mẫu thử

 So sánh thành phần hóa học trong các mẫu lá Trà hoa vàng bằng HPLC

Sau khi triển khai HPLC theo chương trình đã khảo sát, nhận thấy trên sắc ký đồ của 24 mẫu nghiên cứu có 9 pic xuất hiện, có thể phân biệt sắc ký đồ của từng mẫu dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện và diện tích của các pic trên sắc ký đồ Trong đó, các mẫu lá non có xu hướng khác biệt hơn so với mẫu lá bánh tẻ và lá già Kết quả chi tiết được thể hiện trong Hình 3.7, Hình 3.8 và Bảng PL3.2, Phụ lục 3

Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ của các mẫu lá Trà hoa vàng

Chú thích 1: Sắc ký đồ của mẫu THV.01

2: Sắc ký đồ của mẫu THV.02 3: Sắc ký đồ của mẫu THV.03 4: Sắc ký đồ của mẫu THV.04

5: Sắc ký đồ của mẫu THV.05 6: Sắc ký đồ của mẫu THV.06 7: Sắc ký đồ của mẫu THV.07 8: Sắc ký đồ của mẫu THV.08

Hình 3.8 So sánh diện tích pic các pic xuất hiện trên sắc ký đồ

Pic 1 Pic 2 Pic 3 Pic 4 Pic 5 Pic 6 Pic 7 Pic 8 Pic 9

Nhận xét: Sắc ký đồ cho thấy

- Các pic 1, 2, 3, 5 và 6 có diện tích pic giảm dần từ lá non, bánh tẻ và lá già

- Pic 7 (đã được xác định là rutin) có diện tích pic tăng từ lá non, bánh tẻ và lá già

- Pic 8 chỉ thấy xuất hiện ở bánh tẻ và lá già

- Các pic 4 và 9 xuất hiện ở tất cả các mẫu và không có quy luật

 Giữa lá bánh tẻ và lá già không có sự nhau nhiều về thành phần mà có sự chênh lệch về hàm lượng

 Giữa lá non và lá bánh tẻ, lá già có sự khác nhau cả về thành phần và hàm lượng các chất

Bàn luận

3.2.1 Về đặc điểm hình thái và vi phẫu

Hình thái lá non có sự khác biệt với lá già và với lá bánh tẻ Từ đó giúp phân biệt dễ dàng trong quá trình thu hoạch, lấy mẫu Dựa vào đặc điểm vi phẫu giúp phân biệt được lá non với lá già, lá bánh tẻ

3.2.2 Về thành phần hóa học

3.2.2.1 Định tính thành phần hóa học

Bằng cách kết hợp các phương pháp định tính bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng và HPLC đã chỉ ra sơ bộ rằng các mẫu lá Trà hoa vàng đều chứa nhóm chất flavonoid và tanin Đồng thời, có sự khác nhau về thành phần và hàm lượng giữa các cá thể và cá mẫu lá non, lá bánh tẻ và lá già trong cùng một cá thể biểu hiện thông qua số vết hiện, độ đậm nhạt của vết, số pic hiện và độ đậm nhạt của pic

Tuy nhiên để có thể có kết quả chi tiết và chính xác hơn, cần tiến hành tối ưu hóa điều kiện dung môi, thuốc thử đặc trưng với các nhóm chất và lựa chọn chất chuẩn phù hợp

3.2.2.2 Định lượng thành phần hóa học a Phương pháp sử dụng

 Định lượng bằng phương pháp đo quang

Trong các nghiên cứu trên thế giới, phương pháp được sử dụng phổ biến để định lượng polyphenol toàn phần và định lượng flavonoid toàn phần thường được định lượng bằng phương pháp đo quang Phương pháp hay được sử dụng là phương pháp đo quang với thuốc thử Folin - Ciocalteu để định lượng polyphenol toàn phần và thuốc thử muối nhôm để định lượng flavonoid toàn phần Các phương pháp này được tiến hành đơn giản, kết quả có thể tin cậy để đánh giá và so sánh chất lượng của dược liệu

Theo thông tin đã tổng quan được và kết quả định tính, nghiên cứu đã sử dụng hai chất chuẩn là acid gallic và rutin để định lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng Hai phương pháp đo quang nghiên cứu xây dựng là hai phương pháp phổ biến, đã được thẩm định lại về bước sóng cực đại, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại của phương pháp nên có độ tin cậy, có thể sử dụng để xác định và so sánh hàm lượng polyphenol toàn phần và flavonoid toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng Để đảm bảo độ tin cậy, tiến hành làm lặp lại mỗi mẫu thử 3 lần và tính giá trị trung bình của 3 lần đo

Trong quá trình khảo sát các dung môi chiết để hàm lượng polyphenol lớn nhất đã cho thấy độ hấp thụ của các dung môi là không có sự khác biệt nhiều nên nghiên cứu vẫn sử dụng mẫu trắng là nước theo TCVN 9745-1:2013 để so sánh các dung môi chiết và định lượng polyphenol toàn phần

Trong quá trình thực hiện phép định lượng flavonoid cho thấy mẫu thử được đem đi đo quang có màu xanh và có độ hấp thụ quang nhất định nên sẽ ảnh hưởng đến kết quả định lượng Chính vì vậy, tham khảo một số tài liệu, nghiên cứu đã tiến hành phép định lượng flavonoid với mẫu trắng là dịch chiết và không có thuốc thử muối nhôm để loại trừ ảnh hưởng của các thành phần tạp có trong dịch chiết

- Định lượng rutin bằng phương pháp HPLC Định lượng rutin bằng phương pháp HPLC cho thấy phương pháp sử dụng có độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính khả năng tách của pic rutin tốt, độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm nằm trong khoảng cho phép (có giá trị RSD < 2%)

So sánh phương pháp HPLC và phương pháp đo quang, nhận thấy phương pháp đo quang tuy đơn giản hơn nhưng có tính lặp lại thấp hơn so với phương pháp định lượng bằng HPLC

Từ kết quả định lượng và sắc ký đồ cho thấy hàm lượng giữa các mẫu có sự chênh lệch đáng kể Các mẫu được thu tại cùng một vườn, ở cùng một độ tuổi, có chiều cao và độ rộng tán tương đương nhau Từ đó cho thấy tầm quan trọng của gen và di truyền tới chất lượng của dược liệu b Kết quả nghiên cứu

 So sánh hàm lượng polyphenol toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng

Từ kết quả định lượng, hàm lượng polyphenol toàn phần có sự khác biệt giữa các mẫu lá Trà hoa vàng và nằm trong khoảng từ 7,61 đến 15,42% (tính theo dược liệu khô tuyệt đối theo acid gallic) Kết quả này phù hợp với các công bố trước đó và nghiên cứu trên 15 loài Camellia ở Lâm Đồng cho kết quả hàm lượng thay đổi từ 5,22 - 30,11% so với khối lượng mẫu khô tuyệt đối tính theo acid gallic [11]

Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng polyphenol toàn phần trong lá non và lá già nhiều hơn đáng kể so với lá bánh tẻ Hiện nay chưa có nghiên cứu nào so sánh hàm lượng polyphenol toàn phần có trong lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển Tuy nhiên khi so sánh hàm lượng polyphenol tổng trong Camellia sinensis cùng họ với C chrysantha, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol trong lá non nhiều hơn trong lá già [10], [13] Để khẳng định chắc chắn kết quả so sánh hàm lượng trong lá Trà hoa vàng ở các giai đoạn phát triển, cần thực hiện với cỡ mẫu lớn hơn để đảm bảo độ tin cậy

 So sánh hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng

Từ kết quả định lượng, hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu lá Trà hoa vàng có sự khác biệt và nằm trong khoảng từ 2,23% đến 10,62% Kết quả tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó của Zhu Hua trên lá loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama tại Trung Quốc (khoảng 9 - 12%) [56]

Kết quả so sánh sơ bộ cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong mẫu lá non nhiều hơn trong lá già và nhiều hơn lá bánh tẻ Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Li và cộng sự năm 2018 khi so sánh hàm lượng flavonoid toàn phần có trong lá của Camellia nitidissima với kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá non (69,00%) cao hơn đáng kể so với lá già (31,20%) [25]

Khi so sánh bằng test T - Student chỉ có thể kết luận hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá non và lá già nhiều hơn trong lá bánh tẻ và chưa thể so sánh sự khác biệt giữa hàm lượng trong mẫu lá non và lá già