nghiên cứu tình hình kháng quinolone trên các chủng vi khuẩn đường ruột tại thành phố hồ chí minh

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát

Xác định và mô tả tính kháng với Quinolones của những chủng vi khuẩn đường ruột ( E.coli và K.pneumoniae) đang lưu hành tại TP.HCM

Muùc tieõu cuù theồ

 Thu thập các chủng vi khuẩn đường ruột (E.coli và K.pneumoniae) phân lập được tại bệnh viện ruột (E.coli và K.pneumoniae) thu thập được

 Xác định tỉ lệ kháng với kháng sinh nhóm Quinolones và Cephalosporin thế hệ 3 trên một số chủng vi khuẩn đường ruột (E.coli và K.pneumoniae) phân lập tại bệnh viện.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu đề tài : đề tài được thực hiện từ tháng 05 / 2008 đến tháng 01 / 2009

 Địa điểm nghiên cứu : đề tài được thực hiện tại phòng Sinh học phân tử Viện Pastuer TP.HCM

 Đề tài được hợp tác nghiên cứu lấy mẫu với Bệnh viện Nhi Đồng 2 TP.HCM.

TỔNG QUAN

GIỚI THIỆU VỀ CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

E coli là nhóm trực khuẩn gram âm, dài hay ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy Một số di dộng, một số không di động Một số có nang Vi khuẩn không sinh bào tử

Vi khuẩn kỵ khí tùy ý là những vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiện có hoặc không có oxy Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng là 37 độ C, nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 10 đến 46 độ C Chúng có thể phát triển dễ dàng trên môi trường EMB và MacConkey.

E.coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit Để phân biệt E.coli với vi khuẩn đường ruột khác, dùng thử nghiệm IMViC (Indol, Methyl red, Voges – Proskauer, Citrat)

_ Indol : trong môi trường có tryptophane, E.coli tiết men tryptophanase sẽ ly giải thành indol Để nhận diện indol, nhỏ vào vài giọt thuốc thử Kovacs Hợp chất indol và thuốc thử tạo ra màu đỏ (indol +)

_ Methyl red : trong môi trường có glucose, E.coli tạo nồng độ H + cao (pH < 4,5) Cho thuốc thử Methyl red vào, môi trường có màu đỏ (MR +)

_ Voges Proskauer : tùy loại enzyme của vi khuẩn, mà quá trình lên men glucose tạo ra sản phẩm cuối cùng khác nhau Một trong những sản phẩm này là aceton, sẽ tạo ra phức hợp màu đỏ với thuốc thử α – naphthol và KOH E.coli có phản ứng VP âm tính (VP -)

_ Citrate : trong môi trường Simmons citrat, nguồn Carbon duy nhất là citrat Vi khuẩn sử dụng citrat làm kiềm hóa môi trường và đổi môi trường từ màu lục sang xanh lơ E.coli có phản ứng citrat âm tính

Vi khuẩn có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H, được chia thành các type huyết thanh khác nhau

Hình 2 : Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

_ K.pneumoniae là một trực khuẩn Gram âm

_ K.pneumoniae không có khả năng di động

_ Có vỏ lớn (kích thước vỏ có thể gấp 2 – 3 lần tế bào vi khuẩn) nên có khả năng ức chế thực bào, thường xếp thành đôi

_ K.pneumoniae phát triển dễ dàng trên các loại môi trường nuôi cấy thông thường Khuẩn lạc thường có màu tím, kích thước khoảng 3 - 4 mm, dạng

S, tuy nhiên có khi gặp một số khuẩn lạc dạng R

_ Trên môi trường MC tạo khuẩn lạc dạng M, khóm hồng, tròn, lồi, nhầy và kích thước lớn hơn dạng S

_ Lên men nhiều loại đường có sinh hơi như: glucose, lactose… _ Các phản ứng dương tính [ + ]: catalase, citrate, VP

_ Các phản ứng âm tính [ - ]: H 2 S, Oxidase, Ornithin decarboxylase 2.4 Kháng nguyên và độc tố :

_ Có hơn 70 type kháng nguyên Các kháng thể kháng vỏ tạo ra miễn dịch đặc hiệu

_ Dựa vào kháng nguyên O, được chia thành 5 nhóm

_ Dựa vào kháng nguyên K, vi khuẩn chia thành 80 type huyết thanh khác nhau

THUỐC KHÁNG SINH

_ Thuốc kháng sinh là những chất có tác động chống lại sư sống của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa

_ Kháng sinh là một chất do vi nấm hoặc vi khuẩn tạo ra, hoăc do bán tổng hợp (như Ampicillin, Amikacin), có khi là chất hóa học tổng hợp (như

Chloramphenicol, Isoniazid, các Quinolon) có tác dụng điều trị đặc hiệu với liều thấp do ức chế một số quá trình sống của vi sinh vật

Kháng sinh có tác dụng đặc hiệu, tức một kháng sinh chỉ tác động lên một loại vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định Điều này có nghĩa là thuốc kháng sinh có hoạt tính khác nhau đối với các loại vi khuẩn khác nhau.

Kháng sinh có cơ chế tác dụng đa dạng như làm thay đổi hình dạng vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein và ngăn cản hình thành vách tế bào Tuy nhiên, một số vi khuẩn đã trở nên kháng với kháng sinh do khả năng tạo ra các enzyme phá hủy kháng sinh hiệu quả.

_ Một số kháng sinh có hoạt phổ rộng, nghĩa là chúng có hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau, một số có hoạt phổ hẹp thì chỉ có hoạt tính đối với một hay một số ít loại vi khuẩn

_ Kháng sinh (antibiotic) có nguồn gốc từ thuật ngữ antibiosis được sử dụng lần đầu tiên bởi Willemin (1889) dùng để chỉ sự tiêu diệt một vài vật thể sống bởi một vật thể sống khác, có thể tổng hợp bằng phương pháp hóa học, có thể trích từ động vật, thực vật hay vi sinh vật

_ Ngày nay, đã có hơn 4000 kháng sinh tiết ra từ nấm và vi khuẩn, hơn

30000 kháng sinh bán tổng hợp và trên 100 kháng sinh được dùng trong y học Kháng sinh còn được dùng trong bảo quản thức ăn, bảo vệ cây trồng, chế biến thức ăn gia súc và trong thú y

2 Sự kháng thuốc kháng sinh [ 1 ]

2.1 Nguồn gốc của việc kháng thuốc

2.1.1 Nguồn gốc không do di truyền :

Vi khuẩn nhân lên là điều kiện tiên quyết để kháng sinh phát huy tác dụng Nếu vi khuẩn ngừng nhân lên do bất kỳ lý do nào, chúng có thể trở nên kháng thuốc Tuy nhiên, các thế hệ sau đó vẫn có khả năng lấy lại độ nhạy cảm.

_ Vi khuẩn mất thụ thể đặc biệt dành cho thuốc

_ Phần lớn các vi khuẩn kháng thuốc là do thay đổi về mặt di truyền và là hậu quả của quá trình chọn lọc kháng sinh

_ Đề kháng do nhiễm sắc thể: do đột biến ngẫu nhiên của một đoạn gen kiểm soát tính nhạy cảm đối với một loại thuốc kháng sinh Sự có mặt của thuốc được xem là một cơ chế chọn lọc, ức chế vi khuẩn nhạy cảm và tạo thuận lợi cho vi khuẩn đột biến kháng thuốc phát triển Đột biến nhiễm sắc thể thông thường là do thay đổi cấu trúc thụ thể dành cho thuốc

_ Đề kháng ngoài nhiễm sắc thể: yếu tố R là một lớp của plasmid mang những gen kháng một đến nhiều loại kháng sinh và những kim loại nặng Các gen này kiểm soát những enzym phá hủy thuốc

_ Vi khuẩn sản xuất enzyme để phá hủy hoạt tính của thuốc

_ Vi khuẩn làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

_ Điểm gắn của thuốc có cấu trúc bị thay đổi

_ Vi khuẩn thay đổi biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

_ Enzyme hoạt tính của vi khuẩn bị thay đổi

Vi khuẩn kháng một loại thuốc nào đó cũng có thể kháng một loại thuốc khác có cùng cơ chế tác động Thường gặp ở những thuốc có thành phần hóa học gần giống nhau, nhưng cũng có thể tìm thấy ở những thuốc không có sự liên hệ về cấu trúc hóa học

Vấn đề kháng thuốc trong nhiễm khuẩn có thể giảm thiểu bởi : _ Duy trì liều lượng trong mô đủ cao để ức chế cả những vi khuẩn ban đầu lẫn những vi khuẩn đột biến bước đầu

_ Sử dụng đồng thời hai loại thuốc không có phản ứng chéo Mỗi loài sẽ làm giảm thiểu những chủng đột biến đối với loài kia

_ Tránh không cho vi khuẩn quen với thuốc có giá trị đặc biệt bằng cách hạn chế sử dụng

Men β-lactamase phổ rộng được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1983 ở Châu Âu, vào năm 1988 ở Mỹ và hơn 130 loại đã được phát hiện trên khắp thế giới vào năm 2000, hiện nay đã lên tới hơn 200 loại ESBLs Sự phát triển rộng rãi của các chủng sinh men ESBLs là do sau một thời gian sử dụng các kháng sinh β-lactamase phổ rộng thế hệ mới như Carboxypenicillins, Ureidopenicillins, Cephalosporins thế hệ hai và ba để điều trị bệnh làm xuất hiện các chủng đột biến kháng thuốc bằng cách sinh men ESBLs

Các men ESBLs chủ yếu được tìm thấy ở E.coli và K.pneumoniae, chúng cũng được tìm thấy ở Proteus spp , Providencia spp , các loại vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và cả ởû Pseudomonase aeruginosa Các men này thủy phân tất cả kháng sinh β-lactamase trừ Carbapenems và Cephamycins, nhạy cảm với hợp chất kháng sinh β-lactamase chất ức chế men (Amoxicillin / Clavulanic Acid) [ 17 ]

Gần đây, nhiều nhóm men ESBLs mới được phát hiện nhiều ở họ vi khuẩn đường ruột bao gồm: PER-1, PER-2, VEB-1, GES-1, BES-1, CTX-M, TOHO Nhóm CTX-M là một nhóm gen ESBLs mới nằm trên plasmid, lan truyền nhanh, tác động mạnh đối với Cefotaxime, men ESBLs nhóm CTX-M đã được phát hiện chủ yếu ở các chủng Salmonella typimurium, E.coli, K.pneumoniae [ 11 ]

GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG SINH QUINOLONE

Những năm 1960, Acid Nalidixic là Quinolones đầu tiên được đưa vào sử dụng trong điều trị lâm sàng Nó chỉ có tác dụng gây chết trên vi khuẩn Gram ( - ), đặc biệt cho họ Enterobacteriaceae Đối với vi khuẩn Gram (+), phổ hoạt động của Acid Nalidixic bị giới hạn và dược lực còn yếu

Vào những năm 1970, Quinolones nhóm 2 hoặc Quinolones phổ rộng: Norfloxacin, Ciprofloxacin, … có gắn thêm phân tử Fluorine tại C 6 và nhóm Piperazin ở C 7 phát triển mạnh Những kháng sinh Quinolones thế hệ 3 có nhóm O-CH 3 có khả năng ngăn chặn phát triển sự kháng là kháng sinh có phổ hoạt động rộng, dược lực học mạnh, ít tác dụng phụ Các kháng sinh thuộc thế hệ 3, được giới thiệu vào sử dụng lâm sàng những năm 1980 và 1990

CH 3 Acid Nalidixic (Nhóm I) Norfloxacin (Nhóm II)

Ciprofloxacin (Nhóm II) Ofloxacin (*racemic mixture)

Hình 4 : Cấu trúc hóa học vài kháng sinh họ Quinolone

Bảng 1: Phân loại kháng sinh họ Quinolone

Nhóm kháng sinh Phân nhóm kháng sinh Tên thương mại

Nalidixic Acid Wintomylon Oxolinic Acid Uroxin Piromidic Pcid Panacid Pipemidic Pcid Dolcol Thế hệ thứ nhất

Ciproxin Enoxacin Enroxil, Penetrex Fleroxacin Megalone, Roquinol Lomefloxacin Maxaquin

Quinabic, Janacin Ofloxacin Floxin, Oxaldin, Tarivid

Balofloxacin Baloxin Gatifloxacin Tequin, Zymar Grepafloxacin Raxar

Levofloxacin Cravit, Levaquin Moxifloxacin Avelox,Vigamox Pazufloxacin Pasil, Pazucross

Temafloxacin Omniflox Thế hệ thứ ba

Gemifloxacin Factive Sitafloxacin Gracevit Trovafloxacin Trovan Thế hệ thứ tư

3 Cơ chế tác động của kháng sinh họ Quinolone

Hoạt động của Quinolones là ức chế 2 enzyme: DNA gyrase (topoisomerase II) và DNA topoisomerase IV của vi khuẩn những enzyme cần thiết cho việc tổng hợp DNA vi khuẩn thông qua sự kiểm soát giai đoạn tháo xoắn của DNA nhiễm sắc thể Sự tương tác của Quinolones với phức hợp enzyme - DNA sẽ ức chế sự tổng hợp DNA do ngăn chặn quá trình hình thành cheû ba sao cheùp

Mỗi enzyme có 2 tiểu phần tồn tại ở dạng tetra - protein Topoisomerase

II có tiểu đơn vị gyrA và gyrB Topoisomerase IV có tiểu đơn vị parC và parE

Topoisomerase IV cần thiết cho quá trình tách bộ nhiễm sắc thể, tạo ra tế bào

“chị em” (daughter cells) Trong khi đó, DNA gyrase (topoisomerase II) có nhiệm vụ tháo dạng siêu xoắn, hủy bỏ xoắn dương, gắn vào phân tử DNA và cắt 1 trong 2 mạch, hình thành xoắn âm, tạo thuận lợi cho sao chép và phiên mã của DNA Quá trình này thực hiện bằng năng lượng ATP tự do [ 12 ]

Hình 5 : Cơ chế hoạt động của Fluoroquinolone

4 Cơ chế kháng kháng sinh Quinolone chính của vi khuẩn

Từng được coi là hoàn toàn do đột biến nhiễm sắc thể, kháng Quinolone hiện được biết đến với hai cơ chế chính: thay đổi tính thẩm thấu thuốc (giảm hấp thụ thuốc qua đột biến gen cấu trúc, điều hòa kênh porin, đột biến hệ thống bơm màng) và thay đổi đích đến (đột biến vùng quy định tính kháng).

Quinolone (QRDRs) của gen gyrA-gyrB (topoisomerase II ) hoặc parC-parE (topoisomerase IV ) [ 12 ]

Gần đây, 2 cơ chế kháng định vị trên plasmid đã được mô tả Cơ chế đầu tiên được mô tả năm 1998 bởi Martinez-Martinez trong chủng K.pneumoniae (được phân lập 1994) mà có thể chuyển tính kháng thấp với Quinolone vào trong E.coli hay vi khuẩn gram âm khác Gen kháng Quinolones trên plasmid được đặt tên là qnr Gen này mã hóa cho một protein dài 218 amino-acid, qnr (sau này được đổi tên thành qnrA) qnrA bảo vệ DNA gyrase của E.coli khỏi bị ức chế bởi Ciprofloxacin Mới đây,thêm 2 protein qnr đã được xác định (qnrB và qnrS) cũng như một số gen khác thuộc nhóm này (qnrA1 đến qnrA6, qnrB1 đến qnrB5, qnrS1 và qnrS2) Những protein này được tìm thấy trong nhiều loại vi khuẩn và mang những cấu trúc thích hợp cho sự tương tác giữa các protein [ 12 ]

QnrA rất linh động, định vị trên plasmid và tiếp hợp với phổ ký chủ rộng Cấu trúc gen thành phần có thể giải thích cho khả năng di chuyển giữa các plasmid khác nhau và liên quan tới những gen kháng kháng sinh khác Môi trường di truyền của gen qnrB và qnrS vẫn chưa được xác định

Cơ chế kháng thứ hai : Gen trên plasmid mã hóa cho một loại enzym thuộc nhóm aminoglycoside acetyltransferase (được đặt tên là aac(6’)-1b-cr, chịu trách nhiệm cho tính kháng Ciprofloxacin) mà có khả năng acetyl hóa Fluoroquinolones Giống như qnr, aac(6’)-1b-cr tạo ra tính kháng thấp với Quinolones nhưng sẽ kết hợp với qnrA tạo nên tính kháng Ciprofloxacin [13 ] Ở khía cạnh ngược lại, những yếu tố quyết định này dường như làm gia tăng nồng độ Quinolone cần thiết cho việc ngăn cản sự chọn lọc các thể đột biến kháng Quinolone Bởi vì các Quinolone là những chất cảm ứng mạnh, góp phần tạo đột biến cảm ứng Quinolone nên người ta cho rằng plasmid mang những yếu tố quyết định tính kháng Quinolone có thể mở rộng khung chọn lọc Đột biến thuận lợi cho sự gia tăng tần suất của đột biến nhiễm sắc thể bổ sung và dẫn đến sự biểu hiện của tính kháng ở mức độ cao có ý nghĩa về mặt lâm sàng

Sự phân bố rộng rãi của gen qnr cho thấy rằng gen này có thể có các yếu tố quyết định như giữa các loài Enterobacteriaceae, thường liên kết với các loại β-lactamase phổ rộng khác nhau.

Hình 6 : Cơ chế kháng Fluoroquinolone

Sự biểu hiện rộng rãi của qnr tạo nên 2 câu hỏi: nguồn gốc của gen qnr và lý do vì sao mà chúng phổ biến Những báo cáo gần đây đã chỉ ra rằng thể mang của các gene qnr có thể thuộc về môi trường Sự biểu hiện của gene qnr từ các thể mang này dường như chắc chắn có liên quan đến việc sử dụng rộng rãi các Fluoroquinolones, kể cả ở người và lĩnh vực thú y Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về sự tồn tại của những lượng rất nhỏ các Fluoroquinolones trong đất và nước Sự tồn tại này có thể dẫn đến các điều kiện hỗ trợ cho tính kháng Quinolone qua trung gian plasmid và sau đó làm gia tăng các đột biến nhiễm sắc thể Việc sử dụng rộng rãi các Fluoroquinolones làm duy trì áp suất chọn lọc và cùng với sự đồng chuyển các gene kháng khác có thể dẫn đến sự gia tăng của những chủng đa kháng trong bệnh viện và trong cộng đồng

5.1 Tình hình kháng ở Việt Nam

Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo nghiên cứu của bệnh viện Thống Nhất từ 2002 -2005, tỉ lệ K.pneumoniae kháng Ciprofloxacin là 47,8 - 64,8 %, E.coli kháng Ciprofloxacin là 42,4 - 55,1 %, kháng Norfloxacin là 51,2 - 62,1

Vi khuẩn kháng Quinolones thường kháng đồng thời với Cephalosporin thế hệ ba (C3G) Tỉ lệ vi khuẩn kháng tại thành phố Hồ Chí Minh, theo một số khảo sát gần đây của Trung tâm Bệnh Nhiệt Đới từ

2002 - 2004, chủng vi khuẩn đường ruột mang gen β-lactamase phổ rộng kháng đồng thời với Quinolones (Ofloxacin) là 56,9 % [10]

Từ kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong năm

2007 của bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng cho thấy, nhóm Quinolone được sử dụng 8168 liều chiếm 10,64 % tổng số lượng kháng sinh dùng trong bệnh viện Trong đó Ciprofloxacine (60,06 %), Acid Nalidixic (31,66 %), Ofloxacine (6,3 %) còn lại là các kháng sinh khác (1,97 %) Kháng sinh nhóm Quinolone được dùng chủ yếu trong những trường hợp bệnh về tiết niệu,đường ruột, hô hấp Đó cũng là như bệnh do nhóm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae gaây ra [ 8 ]

Kết quả kháng sinh đồ 9 tháng đầu năm 2007 của một số vi khuẩn như sau:

Biểu đồ 1 : Tình hình kháng một số kháng sinh của E.coli và K.pneumoniae ở bệnh viện Hoàn Mỹ Đà Nẵng

Như trên biểu đồ cho thấy E.coli và K.pneumoniae có tỉ lệ kháng rất cao với Ciprofloxacin ( E.coli: 55,5 % và K.pneumoniae: 33,3 %) [ 8 ] Điều này phản ánh đúng thực tế sử dụng không thích hợp các kháng sinh trong điều trị bệnh ở nước ta

5.2 Tình hình kháng trên thế giới

 Vi khuẩn kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, không chỉ ở các nước đang phát triển mà còn ở các nước phát triển Hiện nay, năng suất sản xuất thuốc kháng sinh trên thế giới rất nhanh nhưng khả năng đột biến của vi khuẩn để thích nghi với môi trường có kháng sinh có vẻ còn nhanh hơn Điều này cũng dẫn đến tình hình kháng Quinolones ngày càng tăng Đã có rất nhiều nơi trên thế giới nguyên cứu về tình hình kháng Quinolones và phát hiện ra các nhóm gen kháng Quinolones

Hình 7 : Tình hình kháng Fluoroquinolone tại Châu Âu năm 2008

 Theo dữ liệu từ Ủy Ban Bảo Vệ Sức Khỏe tại Anh Quốc và Xứ Wales (hình 7 ) cho thấy tình hình kháng Fluoroquinolone ở một số nước thuộc châu Âu có tỷ lệ kháng Fluoroquinolone khá cao Có quốc gia tỷ lệ này tăng lên trên 50 % Đây là những con số đáng báo động về tình hình kháng

 Ngoài ra, một báo cáo của Hàn Quốc nghiên cứu từ 07 / 2005 đến

08 / 2006 cho thấy trên 202 mẫu nước tiểu ( 143 mẫu E.coli, 59 mẫu K.pneumoniae) cho kết quả 41 / 202 ( 20,3 % ) mẫu mang qnrB dương trong đó E.coli chieám 8 / 143 ( 5,6 % ), K.pneumoniae chieám 33 / 59 ( 55,9 % ) [ 14 ]

CÁC PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU KHÁNG THUỐC

1 Phương pháp phát hiện kiểu hình kháng thuốc

1.1 Phương pháp kháng sinh đồ

Nguyên tắc : Một lượng kháng sinh nhất định từ đĩa giấy có đường kính và dộ dày nhất định sẽ khuếch tán trên thạch và ức chế vi khuẩn mọc xung quanh đĩa kháng sinh và tạo thành vòng vô khuẩn

Tùy theo mức độ nhạy cảm hay kháng của vi khuẩn với kháng sinh mà sẽ tạo ra vòng kháng khuẩn với đường kính khác nhau Theo tiêu chuẩn của NCCLS (Hoa Kỳ), có ba mức độ là nhạy cảm (S), trung gian (I) và đề kháng (R) [ 15 ]

Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ cho ta thấy kiểu hình kháng thuốc một cách tương đối, thường dùng để kiểm tra trước khi thực hiện kĩ thuật sinh học phân tử

1.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế được sự phát triển của vi khuẩn, do đó sẽ thể hiện mức độ kháng thuốc của chủng thử nghiệm

Cách thực hiện: Kháng sinh bột được pha loãng ở các nồng độ khác nhau (từ thấp đến cao) trong các hộp thạch được dùng làm môi trường để cấy vi khuaồn leõn

Kết quả MIC tương ứng với nồng độ kháng sinh thấp nhất trong hộp thạch mà chủng thử nghiệm không mọc được

2 Kĩ thuật sinh học phân tử (kĩ thuật PCR) :

Nguyên tắc : PCR là một phương pháp tạo dòng in vitro nhằm thu nhận một số lượng lớn bản sao của một trình tự xác định Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính của DNA polymerase là: DNA polymerase có khả năng tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn với sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đọan DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đọan DNA nằm giữa hai moài [7]

Trong nghiên cứu kháng thuốc, PCR được sử dụng để xác định các gen kháng thuốc có ở các chủng thử nghiệm

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng cách nhuộm Ethidium bromide, điện di trên gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312nm)

Hình 8 : Các bước của phản ứng PCR

2 Mồi bắt cặp với DNA

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

_ Máy đọc kết quả kháng sinh đồ

_ Máy đo độ đục Mac Farland

_ Ống nghiệm _ Đĩa petri _ Tube Nunc _ Pipet _ Dung dịch Mac Farland 0,5 _ Kẹp

 Chủng chuẩn có mang các gen mục tiêu để làm chứng dương

 Chủng vi khuẩn đường ruột (E.coli, K.pneumoniae) kháng Cephalosporin thế hệ 3 được phân lập từ các bệnh phẩm tại phòng xét nghiệm vi sinh của bệnh viện Nhi Đồng 2

 BHIA ( Brain hear infusion Agar ) : môi trường thạch dinh dưỡng để nuôi cấy phân lập các vi khuẩn thông thường

 BHI ( Brain hear infusion broth ): : môi trường dung dịch dinh dưỡng để nuôi cấy phân lập các vi khuẩn thông thường

 MHA ( Mueller Hilton Agar ) : môi trường để làm kháng sinh đồ cho các vi khuẩn thông thường như: Saphylococci, họ vi khuẩn đường ruột,

Các chủng vi khuẩn kháng thuốc nhận từ labo Vi sinh của bệnh viện được:

• Định danh lại theo các phương pháp cổ điển: trực khuẩn Gram [-] , sử dụng các phản ứng sinh hóa kinh điển KIA, citrate, H2S, indol, di động và thử nghiệm oxidase [ 6 ]

Bảng 2: Cách đọc kết quả một số phản ứng sinh hóa Đọc kết quả STT Phản ứng sinh hóa

5 Sinh hơi Có khí Không có khí

6 Indol Đỏ lớp trên Vàng lớp trên

7 Di động Hơi đục Trong

8 Citrate Xanh biển Xanh lá

Bảng 3: Hệ thống định danh một số trực khuẩn Gram [ - ]

Vi khuẩn Glucose Lactose H 2 S Gas Indol Di động Citrate Oxidase

Ký hiệu: ( + ) : dương tính ( +/- ) : đa số dương, một số âm

( - ) : âm tính ( -/+ ) : đa số âm, một số dương

• Cấy tăng sinh trong môi trường BHI để tiến hành các thử nghiệm

• Bảo quản chủng ở – 80 O C, nitơ lỏng và trong thạch trứng 4 O C

2 Thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh

2.1/ Thử nghiệm kháng sinh đồ

 Môi trường: BHI (Bio-Rad), MHA (Bio-Rad)

 Các đĩa kháng sinh (Bio-Rad) được sử dụng:

2 Amox-Acide clavulanique 20/10 àg (AMC)

 Chuẩn bị môi trường MHA, hấp tiệt trùng cho vào đĩa petri có đường kính 90 mm và độ dày của thạch là 4 mm

 Vi khuẩn được cấy vào môi trường BHI (hoặc môi trường BHIA dạng đĩa), ủ ở 37 0 C qua đêm

 Pha loãng chủng vi khuẩn với nước muối sinh lí 0,85 % đến độ đục chuẩn tương đương độ đục chuẩn 0,5 McFarland (1 – 2 x 10 8 CFU / ml)

 Dùng tăm bông thấm dung dịch pha loãng có chứa chủng vi khuẩn phết lên trên mặt thạch MHA, xoay tròn đĩa, quết điều tay để vi khuẩn phân bố điều trên mặt thạch, để khô mặt thạch trong 3 - 5 phút

 Đặt các đĩa kháng sinh lên bề mặt môi trường thạch (sử dụng dụng cụ chuyên dùng cho đặt đĩa kháng sinh, nên khoảng cách giữa các đĩa kháng sinh và số lượng kháng sinh là khoảng 30 cm)

 Sau 16 -18 h, đọc kết quả nhờ máy đọc Osiris

Hình 9 : Quy trình thực hiện thử nghiện kháng sinh đồ

Trải mầm cấy lên mặt thạch baèng taêm boâng Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch Đo đường kính vòng vô khuaồn

Lấy khuẩn lạc cuûa chuûng mọc qua đêm

Hòa các khuẩn lạc vào 5 ml nước muối sinh lyự voõ truứng Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng máy Osiris

2.1.3/ Sơ đồ đặt kháng sinh trên đĩa:

Hình 10 : Sơ đồ kháng sinh trên đĩa Đánh giá kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ dựa vào đường kính vòng vô khuẩn với ba mức độ là nhạy cảm (S), trung gian (I) và đề kháng (R) theo bảng tiêu chuẩn của CASFM năm 2008 đối với họ vi khuẩn đường ruột [ 16 ]

2.2/ Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC):

 Môi trường: BHI (Bio-Rad),MHA (Bio-Rad)

Chuẩn bị đĩa môi trường:

 Cho 20ml môi trường MHA vào mỗi ống nghiệm lớn, đem hấp khử trùng, sau đó để nguội đến khoảng 45 – 50 0 C

 Cho kháng sinh đã tính toán ở các nồng độ được pha loãng bậc 2 vào,

AN CIP lắc đều Sau đó đổ ống môi trường đã có kháng sinh ra đĩa để môi trường khô

Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường BHI, ủ 37 0 C qua đêm

 Pha loãng chủng đã tăng sinh trong nước muối sinh lí đến độ đục chuẩn 0,5 McFarland (1 – 2 x 10 8 CFU / ml), lắc đều

 Hỳt 200 àl chủng đó pha loóng vào trong miếng plate, mỗi chủng một giếng

 Dùng thiết bị làm MIC có gắn sẵn bàn đinh để cấy chủng từ miếng plate vào trong đĩa môi trường

 Ủ đĩa đã cấy chủng ở 37 0 C qua đêm

Hình 11 : Thiết bị làm MIC

 Kết quả MIC là nồng độ kháng sinh thấp nhất ức chế được sự phát trieồn cuỷa vi khuaồn

3 Tách chiết DNA bằng phương pháp Boiling

 Lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm vào tube eppendorf safe-lock

 Ly taâm 6000 rpm trong 10 phuùt

 Hút bỏ phần dịch nổi

Miếng plate dùng để nhỏ chủng đã pha loãng

 Rửa bằng 1ml ED, ly tâm 6000 rpm trong 10 phút, bỏ dịch nổi

 Đặt tube vào protoir nổi, đun trong Bain Marie 10 phút

(Chú ý: Quấn paraffin quanh nắp để tránh bật nắp)

 Ly taâm 6000 rpm trong 10 phuùt

 Thu dịch nổi, bảo quản -20 0 C

 Đây là DNA chiết xuất thô dùng làm PCR

4.1/ Thành phần phản ứng PCR đơn : (tổng thể tớch: 25 àl)

 Men Taq ADN Polymerase : 0,2 àl

 Cặp mồi phát hiện gen aac_6’_1b, ESBL(ctx, cmy, shv, tem) :

• Moài xuoõi (20àM/ml) : 1 àl

• Mồi ngược (20àM/ml) : 1 àl

 Nước cất vụ trựng cho đủ 25 àl

4.2/ Thành phần phản ứng multi PCR : (tổng thể tớch: 50àl)

 Men Taq ADN Polymerase : 0,3 àl

 Các cặp mồi phát hiện gen QnrA,B,S

• Moài xuoõi (20àM/ml) : 1 àl

• Mồi ngược (20àM/ml): 1 àl

 Nước cất vụ trựng cho đủ 50 àl

4.3/ Chương trình PCR được thực hiện như sau:

55 o C - 60 o C 1 phút 30 chu kỳ (tùy cặp mồi nhiệt độ này có thể thay đổi)

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng cách điện di trên gel agarose 1,2 - 1,5

Sử dụng phương pháp điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV có bước sóng 312 nm để xác định độ dài đoạn ADN Chiều dài đoạn ADN được so sánh với các vạch trên thang ADN chuẩn để xác định kích thước của chúng Kết quả điện di được ghi lại bằng máy chụp hình gel GelDoc (Bio-Rad).

Hình 12 : Thang DNA và máy đọc gel

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

I Kết quả khảo sát các mẫu cấy dương và cấy âm

Bảng 4: Tỷ lệ phân bố kết quả cấy

Theo thống kê tại bệnh viện Nhi Đồng 2 từ tháng 06/05/2008 đến tháng 18/08/2008, có 2850 mẫu Trong đó cấy dương là 658 (chiếm tỷ lệ 23 %), và cấy âm là 2192 (chiếm tỷ lệ 77 %)

II Kết quả khảo sát tần suất vi khuẩn đường ruột phân lập:

Bảng 5: Tần suất vi khuẩn đường ruột phân lập

658 Tổng mẫu dương VKĐR Không phải

Tổng số 658 mẫu cấy dương: VKĐR chiếm tỷ lệ 35% với231mẫu, khoâng phải VKĐR chiếm tỷ lệ 65%

III Kết quả khảo sát các mẫu:

Bảng 6: Tỷ lệ phân bố kết quả mẩu:

Trong 231 mẩu cấy vi khuẩn đường ruột chúng tôi thu được 53 mẫu ( E.coli và K.pneumoniae) kháng C3G bao gồm : vi khuẩn E.coli ( 45,3 % ) và

IV Kết quả khảo sát kháng sinh đồ:

Bảng 7: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn đường ruột thu nhận

Kết quả kháng sinh đồ chỉ ra tỷ lệ kháng thuốc cao ở các chủng vi khuẩn đường ruột được thử nghiệm, tất cả các chủng này đều đa kháng.

Hình 13 : Kết quả kháng sinh đồ

V Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của kháng sinh (MIC)

 Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số kháng sinh ta thấy nhiều chủng vi khuẩn đường ruột kháng rất mạnh với ít nhất 1 trong số 5 kháng sinh thử nghiệm (Cefotaxime, Ceftazidime, Gentamycine, Amikacine, Ciprofloxacine )

 Dựa vào kết quả, chúng ta có thể đánh giá sơ bộ về tính nguy cấp của tình trạng kháng kháng sinh rất mạnh của các chủng vi khuẩn đường ruột ở Tp.HCM, và nguy cơ lan truyền gen qnr Điều này càng chứng tỏ sự mới mẻ và khả năng lan truyền nhanh chóng của gen này

Hình 14 : Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Biểu đồ 3 : Kết quả MIC của các chủng

Bảng 8: Kết quả kháng sinh đồ và MIC

KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ (mm) KẾT QUẢ MIC (mm)

CTX ATM FOX FEP CAZ AMC GM T NAL CIP AN AMX SXT IPM CTX CAZ GM CIP AN

KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ (mm) KẾT QUẢ MIC (mm) STT Chủng

CTX ATM FOX FEP CAZ AMC GM T NAL CIP AN AMX SXT IPM CTX CAZ GM CIP AN

KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ (mm) KẾT QUẢ MIC (mm) STT Chủng

CTX ATM FOX FEP CAZ AMC GM T NAL CIP AN AMX SXT IPM CTX CAZ GM CIP AN

VI Tần suất phân bố một số nhóm gen:

Trong số 53 chủng vi khuẩn đường ruột đạt yêu cầu thì chúng tôi đã làm phản ứng multi PCR để xác định 3 gen qnrA, qnrB và qnrS với 53 chủng Kết quả 22 / 53 (42 %) chủng cho kết quả:

Biểu đồ 4 : Tỉ lệ gen kháng nhóm qnr

Hình 15 : Kết quả PCR nhóm qnr

Gieáng 11: HCM 180 Gieáng 12: HCM 181 Gieáng 13: HCM 182 Gieáng 14: HCM 183 Gieáng 15: HCM 184 Gieáng 16: HCM 185 Gieáng17: HCM 186 Gieáng 18: HCM 187 Gieáng 19: HCM 188 Gieáng 20: HCM 189

So sánh với kích thước thang tương ứng và các chứng dương trên hình dieọn di:

Các chủng HCM 172, CMH 173, HCM 179, HCM 184 dương tính với cặp mồi qnrB

Các chủng HCM 183, CMH 185, HCM 186, HCM 189 dương tính với cặp mồi qnrS

Một kết quả nghiên cứu của Hàn Quốc thực hiện từ 07 / 2005 đến

08 / 2006 trên 202 mẫu nước tiểu thì 41 / 202 (20,3 %) mang qnrB dương [ 14 ]

Tỷ lệ kháng 42% cho thấy đây không phải là một con số nhỏ mà là một con số đáng báo động cho 1 nhóm kháng sinh mới có phổ sử dụng rộng rãi hieọn nay

Trong số 53 chủng vi khuẩn đường ruột chúng tôi đã làm phản ứng PCR để xác định nhóm aac (6’)_Ib với 53 chủng Kết quả :

PCR ủụn gen aac (6’)_Ib (476 bp): 18 /53 (33,9%)

Biểu đồ 5 : Tỉ lệ gen kháng nhóm aac (6’)_Ib

Hình 16 : Kết quả PCR nhóm aac (6’)_Ib

Gieáng 7: HCM 203 Gieáng 8: HCM 204 Gieáng9: HCM 205 Gieáng 10: HCM 206 Gieáng 11: PCR (-)

So sánh với kích thước thang tương ứng và chứng dương trên hình diện di: các chủng HCM 194, HCM 195, HCM 197, HCM 204, HCM 205, HCM

206 dương tính với cặp mồi aac (6’)_Ib

Theo một báo cáo của Mỹ nguyên cứu xác định về nhóm gen aac (6’)_ Ib trong các năm 1999, 2000, 2001 và 2004 cho kết quả dương

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 với aac (6’)_Ib là: 15 / 47 (32 %) E.coli, 17 / 106 (16 %) K.pneumoniae và

Với 53 chủng vi khuẩn đường ruột chúng tôi đã làm trên,chúng tôi đem tổng kết kết quả thì có 12 chủng mang cả 2 gen qnr và aac (6’)_Ib Vậy 12 / 53 (22,6 %) chủng mang 2 gen

Biểu đồ 6 : Tỉ lệ gen kháng nhóm qnr và aac (6’)_Ib

Bảng 9: Kết quả chủng mang cả 2 gen qnr và aac (6’)_Ib multiPCR_Qnr A, B, S KSD MIC

STT Code labo Tên Chủng

Dựa trên những kết quả thu được với 42% chủng mang gen qnr dương và 34 % chủng mang gen aac (6’)_Ib Số chủng đồng thời mang gen qnr dương đồng thời mang gen aac (6’)_Ib dương thì ta có 12 / 22 (54,54 %) Điều này thể hiện gen aac (6’)_Ib mang tính kháng thấp nhưng nếu kết hợp với gen qnr sẽ tạo tính kháng với Cprofloxacin

Để xác định những nhóm chủng mang gen qnr có mang nhóm gen β-lactamase phổ rộng (ESBLs), các nhà nghiên cứu đã đem những chủng vi khuẩn đường ruột có kết quả dương tính với gen qnr đi xét nghiệm thêm về sự có mặt của nhóm gen ESBLs.

(+) với nhóm gen qnr làm tiếp các phản ứng với nhóm ESBLs Kết quả thu được là:

PCR ủụn gen tem (1079 bp) : 10 / 22 (45,45%)

PCR ủụn gen shv (857 bp) : 22/ 22(100%)

PCR ủụn gen cmy1 (1136 bp) : 0 / 22(0%)

PCR ủụn gen cmy2 (1130 bp) :0 / 22(0%)

PCR ủụn gen CTX_M1 (865 bp) :11 / 22(50%)

PCR ủụn gen CTX_M2 (865 bp) :0 / 22(0%)

PCR ủụn gen CTX_M8 (608 bp) : 0 / 22(0%)

PCR ủụn gen CTX_M9 (869 bp) : 10 / 22(45,45%)

So sánh với kích thước thang tương ứng và chứng dương trên hình diện di: các chủng HCM 159, HCM 173, HCM 183 dương tính với cặp mồi

Từ những kết quả thu nhận được ở trên cho thấy có sự liên qua giữa những nhóm mang gen qnr và nhóm ESBLs Hầu hết những chủng mang gen qnr đều có mang thêm một hay nhiều gen thuộc nhóm ESBLs

Bảng 10: Kết quả PCR multiPCR_Qnr A, B, S Beta-lactamases

Vim Per Veb Ges Kpc 1 2 8 9 1 2

13 HCM_164 + + + + multiPCR_Qnr A, B, S Beta-lactamases

Vim Per Veb Ges Kpc 1 2 8 9 1 2

27 HCM_181 multiPCR_Qnr A, B, S Beta-lactamases

Vim Per Veb Ges Kpc 1 2 8 9 1 2

41 HCM_195 + + + + + + multiPCR_Qnr A, B, S Beta-lactamases

Vim Per Veb Ges Kpc 1 2 8 9 1 2