khảo sát mức độ methyl hóa tại đảo cpg thuộc vùng promoter của gene rarβ trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung

Hình I.1: Cơ chế xâm nhiễm của HPV kéo dài dẫn đến ung thư cổ tử cung 6 Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme D

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài: :

Khảo sát mức độ methyl hóa tại đảo CpG

thuộc vùng promoter của gene RARβ trên

bệnh nhân ung thư cổ tử cung

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SHPT

GVHD: Th.S LÊ THỊ TRÚC LINH

SVTH: LÊ THỊ THÚY AN

MSSV: 30760662 Khóa:2007-2011

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2011

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành đối với thạc sĩ Lê Thị Trúc Linh, người luôn tràn đầy nhiệt huyết với khoa học đã tận tình và kiên nhẫn hướng dẫn tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Xin cám ơn tiến sĩ Lê Huyền Ái Thúy đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua, dù rất bận rộn nhưng Cô vẫn dành thời gian sữa bài giúp tôi

Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị phòng thí nghiệm sinh học phân tử trường đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài này

Xin cám ơn các quý Thầy Cô trong bộ môn Vi Sinh đã nhiệt tâm truyền thụ những kiến thức quý báo cho chúng tôi làm hành trang bước vào đời

Và tôi cũng cảm ơn tất cả các bạn luôn yêu quý tôi, luôn bên tôi khi tôi gặp khó khăn Cuối cùng, Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và những người thân luôn yêu thương, chăm sóc và động viên con!

Tháng 7 năm 2011

Thúy An

NCBI National Center for Biotechnology Information

Hình I.1: Cơ chế xâm nhiễm của HPV kéo dài dẫn đến ung thư cổ tử cung 6

Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT) 13

Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen 14

Hình I.4: Sự acetyl hóa và deacetyl hóa histone 16

Bảng II.2: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với DcR1-W 28

Bảng II.3: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite của EpiTect bisulfite Kit 29

Bảng II.6: thành phần phản ứng PCR của bộ Kit Việt Á và Fesmantas 32

Bảng II.7: Chu kì nhiệt của phản ứng PCR trong phương pháp MSP 32

Bảng III.1: Phương pháp phân tích và nguồn mẫu sử dụng trong 12 bài báo 35

Bảng III.2: So sánh số liệu tần số methyl hóa của các nghiên cứu khác nhau dựa trên

Bảng III.3: Trình tự và các thông số IDT của hệ thống mồi thiết kế cho các gen

Hình III.1 Vị trí của gene RARβ trên nhiễm sắc thể số 3 37

Hình III.2 khảo sát vị trí các nhân tố phíên mã trên 2 đảo CpG thuộc vùng promter của

Hình III.3: Sơ đồ cấu trúc gen RAR 2, và vị trí bắt cặp của các cặp mồi được thiết kế trên trình tự đảo CpGII đã biến đổi bisulfite trong phương pháp MSP 41

Bảng III.4: Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm 42

Hình III.4: DNA bộ gen của một số mẫu mô và mẫu dịch phết sau tách chiết 44

Hình III.5: Kết quả chạy phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W trên các mẫu bệnh

Bảng III.5: Kết quả kiểm tra trên DNA chứng bằng phương pháp QMSP 46

Hình III.6 : kết quả chạy Real –Time PCR kiểm tra DNA chứng bằng phương pháp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

I.1.1 Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam 2

I.3.1 Cấu trúc và chức năng gene RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta) 17

II.2.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận 25

II.2.2.3 Biến đổi bisulfite bằng Epitect Bisulfite Kit 28

II.2.2.4 Kiểm tra độ đặc hiệu các cặp mồi của gen RARβ bằng phản ứng Q-MSP 30

II.1.2.1 Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG 38

II.1.2.2 Thiết kế - đánh giá mồi 39

III.2.1 Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau tách chiết 42

III.2.2 kiểm tra độ đặc hiệu của mồi methyl và unmethyl gen RARβ bằng Q_MSP 45

Ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến ở phụ nữ đứng thứ hai trên thế giới sau ung thư vú với tỉ lệ nhiễm bệnh và tỉ lệ tử vong khá cao Theo Tổ chức y tế thế giới WHO, ước tính có 529.828 ca ung tư cổ tử cung mới và 275.128 ca tử vong trong năm

2008 và khoảng 86% các trường hợp này xảy ra ở các nước đang phát triển Theo các nghiên cứu ung thư tại Việt Nam, mỗi năm có 5.174 phụ nữ được chẩn đoán ung thư

cổ tử cung và khoảng 2.472 phụ nữ chết vì căn bệnh này

HPV - Human Papilloma Virus là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến Hầu hết các viêm nhiễm đều tự biến mất mà không hề có triệu chứng Tuy nhiên, viêm nhiễm HPV kéo dài sẽ làm tăng nguy cơ xuất hiện các tổn thương tiền ung thư cổ tử cung Nếu không được điều trị, các tổn thương tiền ung thư này sẽ tiến triển thành ung thư cổ tử cung xâm lấn Ung thư cổ tử cung có tỉ lệ mắc bệnh cao, đồng thời tỉ lệ tử vong cao do biểu hiện của bệnh xuất hiện không rõ ràng và khá lâu trung bình là 10-15 năm từ khi có nghịch sản cổ tử cung đến ung thư cổ tử cung Tuy nhiên, nếu bệnh được phát hiện sớm thì người bệnh sẽ có cơ hội chữa khỏi bệnh rất lớn và tiết kiệm một khoản chi phí đáng kể trong quá trình điều trị

Hiện nay, việc tầm soát ung thư cổ tử cung thông thường chỉ bằng các kĩ thuật như Pap smear, soi cổ tử cung, sinh thiết cổ tử cung, kĩ thuật HPV- PCR… nhưng những kĩ thuật này vẫn còn nhiều hạn chế Do đó, việc tìm ra phương pháp nhằm phát hiện sớm bệnh là một nhu cầu cấp thiết Cụ thể là việc sử dụng dấu chuẩn sinh học (biomaker) như là một dấu hiệu đặc trưng cho việc chẩn đoán ung thư cổ tử cung Mặc

dù sự nhiễm HPV kéo dài được coi là yếu tố quan trọng nhất góp phần vào sự phát triển của ung thư cổ tử cung thì các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng sự không

ổn định của vật chất di truyền trong đó có hiện tượng epigenetics cũng là nguyên nhân sâu xa dẫn tới ung thư

(phosphoryl hóa, acetyl hóa và sự methyl hóa), sự methyl hóa DNA và microRNA Những biến đổi này có thể là tiềm năng trong việc phát hiện sớm bệnh ung thư Sự methyl hóa quá mức tại vùng promoter thuộc các gen ức chế khối u và gen có liên quan đến khối u được tìm thấy ở tất cả các mô ung thư Do sự methyl hóa quá mức này ức chế hoặc dừng chức năng phiên mã của gen →biểu hiện gen bất thường → thiết lập nên giai đoạn khởi phát của khối u Điều này cho thấy vai trò của sự methyl hóa trong bệnh ung thư và là một biểu hiện sớm trong bệnh mà dựa vào đó ta có thể thiết lập một marker sinh học phân tử Đặc biệt, hiện tượng methyl hóa quá mức đảo CpG thuộc vùng promoter gây bất hoạt gen ức chế khối u mà các gen ức chế khối u này mã hóa thành những protein đặc biệt có thể phát hiện các đột biến hay tổn thương DNA và đồng thời kích hoạt quá trình phiên mã của hệ thống enzyme sửa chữa DNA Nhưng sự methyl hóa quá mức có thể bất hoạt gen ức chế khối u, sẽ làm gián đoạn hoặc dừng cơ

chế sửa chữa DNA Gen RARβ (retinoic acid receptor, beta ) theo HGNC _ Hugo Gen

Nomenclature Committee; nó là một trong 20 gen ức chế khối u đã được phát hiện

Ngoài chức năng ức chế khối u, gen RARβ còn mã hóa cho thụ thể RARβ có chức năng

quan trọng trong nhân tế bào

Chúng tôi lựa chọn phương pháp MSP (Methylation Specific PCR) để xác định nhanh chóng và chính xác tình trạng methyl hóa tại các vị trí CpG thuộc vùng promoter của các gen khảo sát trong đề tài nghiên cứu này

Chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc

vùng promoter của gene RARβ trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung” với các mục tiêu

sau:

✓ Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của RARβ và mối tương quan về sự

methyl hóa trên gen này với ung thư cổ tử cung

✓ Thiết kế được các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen trong phản ứng MSP Từ đó có thể sử dụng cặp mồi này để đánh giá mức độ methyl

✓ Cung cấp thêm thông tin góp phần cho một đề tài nghiên cứu lớn hơn nhằm xây dựng một hệ thống các gen liên quan đến sự methyl hóa bất thường dẫn đến sự phát sinh và phát triển ung thư nói chung và ung thư cổ tử cung nói riêng, từ đó

có thể chẩn đoán sớm và hỗ trợ cho quá trình điều trị ung thư

Phần I TỔNG QUAN

I.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

I.1.1 Tình hình b ệnh ung thư cổ t ử cung trên th ế gi ớ i và ở Vi ệ t Nam:

Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh ung thư phổ biến, đứng thứ hai sau ung thư vú và chiếm 13% trong các bệnh ung thư xảy ra ở phụ nữ trên thế giới, với

tỉ lệ tử vong cao chiếm 52% trong số người mắc phải căn bệnh này (IARC, Globocan 2008) Theo Tổ chức y tế thế giới WHO (World Health Organization ), ước tính có 529.828 ca ung tư cổ tử cung mới và 275.128 ca tử vong trong năm 2008 và khoảng 86% các trường hợp này xảy ra ở các nước đang phát triển [7] Với khoảng 68.000 trường hợp ở châu Phi; 77.000 trường hợp ở châu Mỹ Latin; 245.000 xảy ra ở Châu Á [22]; đặc biệt là các nước ở miền nam và miền đông Châu Phi, Trung và Nam Mỹ, vùng caribê có tỷ lệ mắc bệnh rất cao Điều này do một phần là thiếu các chương trình truy tìm và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung đối với các đối tượng ít được chăm sóc về y tế Ngoài ra, chất lượng của một số chương trình tầm soát bằng tế bào học cổ tử cung thường chưa đạt yêu cầu [5]

Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế IARC ( International Agency for Research on Cancer), tỉ lệ nhiễm HPV (Human Papilloma Virus) của phụ

nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, nghĩa là cứ khoảng 10 phụ nữ sẽ có 1 người nhiễm HPV Ở Việt nam nếu chỉ tính riêng ung thư cổ tử cung thì số người chết

vì HPV đã cao hơn nhiều so với HIV Trong 10 năm qua đã có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung, cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện sớm Tuy nhiên thực tế ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời [2] Ung thư cổ tử cung là mối e ngại lớn đối với phụ nữ bởi vì hiện nay nó đang là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ hai ở Việt Nam nói chung và đứng đầu ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng Kết quả thống kê của IARC vào năm 2008 cho thấy rằng có 2.472 ca

tử vong trong số 5.174 trường hợp được chẩn đoán ung thư cổ tử cung mới mắc phải tại Việt Nam [7]

I.1.2 Tác nhân gây bệnh:

Tháng 11/1991, hội thảo do Trung Tâm Nghiên Cứu Thế Giới về Ung Thư

(IARC) và Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO) khẳng định Human Papilloma virus (HPV)

là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành và phát triển ung thư cổ tử cung [21] Ngày 6/10/2008, giải Nobel y học 2008 đã được trao cho nhà khoa học Đức Harald zur Hausen (72 tuổi) với công trình phát hiện virus HPV, tác nhân gây bệnh ung thư cổ tử cung HPV là loại virus gây u nhú ở người, chiếm khoảng 70-80% số trường hợp phụ

nữ bị ung thư cổ tử cung Đây là virus rất dễ lây lan và hầu hết mọi phụ nữ đều có nguy

cơ nhiễm virus này và những phụ nữ bị nhiễm HPV thường có nguy cơ bị ung thư cổ

tử cung tăng gấp 2,5-5 lần so với phụ nữ không bị nhiễm

HPV thuộc họ Papillomaviridae HPV được chia làm hai nhóm, nhóm nguy

cơ cao và nguy cơ thấp (về tính gây ung thư): nhóm “nguy cơ thấp” với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thường chỉ gây ra các u lành biểu mô (u nhú gai, mụn cóc ); nhóm “nguy cơ cao” với khả năng xác nhập DNA vào bộ gen của tế bào người, làm rối loạn, sinh sản ác tính gây ra ung thư [5] Nhóm nguy cơ cao có liên quan trực tiếp đến bệnh lý ung thư, chúng được phát hiện có mặt trên 90% các trường hợp ung thư cổ tử cung (ung thư tế bào lát hay ung thư tế bào tuyến), trái lại nhóm nguy cơ thấp thì hiếm gặp trong các trường hợp ung thư Tần suất lưu hành HPV cao trong cộng đồng, ở người bình thường có khả năng từ 6-11%, và 2/3 trường hợp nhiễm HPV thuộc nhóm nguy cơ cao Ngoài ra, người ta còn thấy liên quan của HPV với các ung thư âm đạo,

âm hộ, dương vật, hậu môn hay vùng hầu họng [3]

Hiện nay, có khoảng 100 type HPV Nhóm nguy cơ cao hiện nay vào khoảng 15-18 type, phổ biến nhất là type 16, 18 liên quan đến khoảng 70% các ca ung thư cổ

tử cung Sau HPV 16, 18, các type HPV 45, 31, 33, 52, 58, 35 cũng thường gây ung thư cổ tử cung Những nhóm nguy cơ cao thường gây tình trạng nhiễm virus kéo dài hơn nhóm nguy cơ thấp (nghĩa là thời gian hiện diện virus tại mô của cổ tử cung dài

hơn) nên người ta nghĩ rằng có thể trong nhóm nguy cơ cao, các gen gây ung thư có

hoạt tính mạnh hơn, cũng như có thể khả năng lây lan cao hơn nhóm nguy cơ thấp [3]

I.1.3 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của HPV:

HPV hoạt động chủ yếu nhờ hai gen gây ung thư là E6 và E7, sau khi HPV xâm nhập vào tế bào, E6 và E7 xác nhập vào bộ gen tế bào chủ và điều khiển tổng hợp protein E6, E7, từ đó các protein này tác động vào các gen có vai trò kiểm soát (thường

là ức chế) chu kỳ tế bào dẫn tới: (1) giảm hoặc ngừng quá trình phân chia; (2) kiểm soát sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) [1]

Cụ thể, E6 có thể gắn lên p53, một protein được mã hóa bởi gen Tp53, một

gen ức chế khối u điển hình Protein p53 có thể đồng thời tham gia vào ba quá trình: (1) thúc đẩy sự phiên mã của các gen đích làm dừng chu trình tế bào ở các điểm kiểm soát G1/S và G2/M , (2) kích hoạt hệ thống sửa chữa DNA khi hư hỏng, (3) hoạt hóa một số gen đích mà sản phẩm của chúng dẫn tới con đường “chết theo chương trình của tế bào” (http://en.wikipedia.org/wiki/P53) Việc E6 có thể gắn lên p53 gây mất kiểm soát chu trình tế bào, ngăn chặn con đường chết của tế bào theo chương trình dẫn tới tế bào được tái tạo liên tục và mang theo những DNA hư hỏng

Gen Rb (Retinoblastoma) là một gen ức chế khối u mã hóa cho protein pRb có

vai trò quan trọng trong điều hòa chu trình tế bào E7 gắn lên pRb gây thoái hóa phức hợp pRb-E2F dẫn tới E2F được tự do hoạt hóa phiên mã, tế bào tăng sinh một cách liên tục và tiến triển thành ung thư mà không có bất kỳ cơ chế kiểm soát nào có thể ngăn chặn Từ đó, gây cản trở quá trình phân chia tế bào, dẫn đến các tế bào phát triển hỗn loạn không có sự kiểm soát và phát triển thành các tế bào ung thư của nhóm tế bào bị nhiễm HPV

Trong cổ tử cung, virus HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 loại mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa) Biểu mô lát tầng không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được qui định

sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ được bong ra ngoài Đặc biệt khi

những tổn thương làm giảm sức đề kháng của cơ thể sẽ tạo điều kiện cho virus HPV dễ dàng xâm nhập vào lớp tế bào đáy cổ tử cung vốn nằm sâu bên dưới và được bảo vệ bằng tế bào lát tầng (squamous cells), tại đây HPV có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của một rồi nhiều lớp tế bào sau đó Khi các tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô lát tầng sẽ gây hiện

tượng dị sản nặng hay ung thư tại chỗ (Carcinoma In Situ-CIS), sau đó có khả năng

phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn (Invasive Cervical Cancer-ICC) [2] Tuy nhiên, đối với những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn không có tiếp xúc mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch, và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi

đã nhiễm tự nhiên HPV Mặt khác, trong một số trường hợp sau khi xâm nhập, virus HPV sẽ ẩn nấp tồn tại trong nhiều năm thậm chí hàng chục năm rồi tác động gây biến đổi các tế bào này và biến chúng trở thành các tế bào ác tính và khi đã có biểu hiện bệnh, thời gian sống sẽ rất ngắn, do vậy mà ung thư cổ tử cung có tỉ lệ tử vong rất cao khi phát hiện ở giai đoạn muộn

Hình I.1 : Cơ chế xâm nhiễm của HPV kéo dài dẫn đến ung thư cổ tử cung ( trích từ

I.1.4 Diễn biến của bệnh

Ung thư cổ tử cung thường diễn biến qua nhiều năm Quá trình phát triển của một tế bào bình thường đến ung thư được chia ra làm 4 giai đoạn chính, từ nhẹ đến nặng như sau:

❖ Giai đoạn 1 là bị nhiễm HPV (Human papilloma virus) Phần lớn ung thư vú và ung thư cổ tử cung là do nhiễm HPV, nhưng không phải bất cứ ai bị nhiễm HPV đều có ung thư Trong thực tế, ở độ tuổi đôi mươi (hay khi mới có quan hệ tình dục), có khoảng 60% đến 80% phụ nữ bị nhiễm virus HPV, nhưng sau 12 tháng, 70% trong số này không còn bị nhiễm nữa, và sau 24 tháng chỉ còn 9% tiếp tục

bị nhiễm HPV

❖ Giai đoạn 2 là tiền ung thư Phụ nữ nằm trong tình trạng này vẫn bình thường và vẫn chưa thể gọi là mắc bệnh “ung thư” Chỉ có khoảng 10% phụ nữ bị nhiễm HPV (giai đoạn 1) trở thành tiền ung thư Phần lớn những phụ nữ bị tiền ung thư thường ở độ tuổi 25 đến 29 Nói cách khác, thời gian từ khi bị nhiễm HPV đến tiền ung thư kéo dài từ 5 đến 10 năm

❖ Giai đoạn 3 là ung thư chưa/không di căn Ở giai đoạn này, tế bào có dấu hiệu ung thư nhưng chỉ giới hạn trong cổ tử cung, và do đó điều trị có thể đem lại kết quả khả quan Một số trường hợp ung thư cổ tử cung ở giai đoạn này cũng không phát triển thêm, và một số trường hợp thì bệnh tự nhiên biến mất!

❖ Giai đoạn sau cùng là ung thư di căn, tức là tế bào ung thư xâm lấn sang các cơ phận khác, và đây chính là giai đoạn nguy hiểm nhất của bệnh Phần lớn phụ nữ mắc bệnh trong giai đoạn này là 50 tuổi trở lên, tức sau thời kỳ mãn kinh

Việc phát hiện sớm có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị ung thư vú và ung thư

cổ tử cung Nếu phát hiện ở giai đoạn đầu, cơ hội chữa khỏi bệnh lên tới hơn 80%, ở giai đoạn 2, tỉ lệ này sẽ là 60%, sang giai đoạn 3 khả năng khỏi hẳn sẽ thấp và giai đoạn 4 thì thường việc điều trị chỉ để kéo dài cuộc sống, giảm bớt các triệu chứng đau đớn [33], [34]

I.1.5 Các phương pháp chẩn đoán ung thư cổ tử cung:

I.1.5.1 Xét nghiệm phết tế bào cổ tử cung (Pap’s smear):

Đây là bước đầu tiên trong bộ ba xét nghiệm ung thư cổ tử cung: Pap’s smear, soi cổ tử cung và sinh thiết cổ tử cung Pap’s smear là một xét nghiệm tế bào học để tìm những tế bào bất thường trong lớp biểu mô cổ tử cung Mặc dù phương pháp này

đã giúp ích rất nhiều trong việc chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung do tính đơn giản của nó nhưng cũng còn một số hạn chế Các chất nhầy cùng với mủ, máu, tạp chất bẩn đã làm mờ các tế bào, cùng với việc dàn mỏng không đủ các tế bào có thể chồng lên nhau khiến cho bác sĩ chẩn đoán khó khăn, kết quả có thể bị sai sót.[36]

I.1.5.2 Soi cổ tử cung:

Soi cổ tử cung bắt buộc thực hiện với các bệnh nhân có Pap’s smear bất thường hoặc có những tổn thương bất thường như viêm nhiễm lộ tuyến hay tổn thương

âm đạo, âm hộ… Soi cổ tử cung là một phương pháp kiểm tra bộ phận sinh dục ngoài (âm hộ), âm đạo và cổ tử cung một cách kỹ lưỡng hơn giúp xác định vị trí và mức độ lan tỏa của tổn thương bằng kính hiển vi đặc biệt, đồng thời hướng dẫn cho sinh thiết

cổ tử cung sau này Bên cạnh ưu điểm của phương pháp này là cho hình ảnh rõ ràng, chính xác và nhanh chóng thì do có giá thành cao, tốn kém nên nó ít được áp dụng phổ biến cho toàn dân.[37]

I.1.5.3 Sinh thiết cổ tử cung:

Sinh thiết là phương tiện sau cùng và cho kết quả chính xác hơn trong việc phát hiện sớm ung thư cổ tử cung Sinh thiết cổ tử cung luôn được thực hiện dưới hướng dẫn của máy soi để hạn chế tối đa kết quả âm tính giả do sinh thiết không đúng chỗ Nếu xét nghiệm hay chiếu cổ tử cung phát hiện sự khác thường của cổ tử cung, nhân viên chuyên khoa sẽ phân tích một phần mô từ cổ tử cung để kiểm tra và đánh giá mức độ tổn thương của cổ tử cung.[38]

I.1.5.4 Phương pháp sinh học phân tử HPV-PCR:

Ngày nay nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật PCR cho phép nhận biết chính xác có nhiễm HPV hay không và nhiễm type nào để tìm thấy nguy cơ cao hay thấp có khả năng dẫn đến ung thư cổ tử cung thông qua việc phát hiện DNA của các type HPV nói trên trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân Tuy nhiên, HPV-PCR dương tính không có nghĩa là ung thư cổ tử cung, việc nhận định có nhiễm HPV hay không có nhiễm HPV, nó không nói được tình trạng mô học hay tế bào học của cổ tử cung mà chỉ có thể nói rằng người được thử đang trong tình trạng nhiễm HPV Xét nghiệm HPV-PCR ngày nay được khuyến cáo sử dụng kèm với xét nghiệm Pap’s smear nhằm nâng cao khả năng sàng lọc các trường hợp nghi ngờ, giúp theo dõi bệnh chặt chẽ hơn và có hiệu quả thật sự trong tầm soát ung thư cổ tử cung [2]

I.1.6 Vaccin HPV:

Việc phát triển vaccine ngừa HPV nhằm bất hoạt khả năng tác động của HPV thuộc vào dự phòng bệnh tật cấp sơ khởi Cho đến hiện nay, chủng ngừa ung thư cổ tử cung thực ra là chủng ngừa nhiễm virus HPV, bởi vì có khoảng 80% các trường hợp ung thư cổ tử cung có liên quan với sự nhiễm HPV Hiện tại, đã có hai loại vaccine đã được công nhận tác động và cho phép sử dụng đại trà Do HPV 16, 18 là hai nhóm chủ yếu gây ra >70% các trường hợp ung thư cổ tử cung, các vaccine chủ yếu nhằm tạo miễn dịch với hai nhóm HPV này Cả hai loại vaccine này đang trong quá trình đăng

ký sử dụng tại Việt Nam, đó là:

❖ Vaccine Gardasil: được nghiên cứu và phát triển bởi Công ty Merck & Co Vaccine này phòng ngừa nhiễm bốn type HPV là 6, 11, 16, 18

❖ Vaccine CervarixTM: được nghiên cứu và phát triển bởi Công ty GlaxoSmithKline Biological Vaccine này được dùng để phòng ngừa nhiễm các virus HPV type 16 và 18

Vaccine sử dụng các thành phần gây miễn dịch của virus (virus like particules) có chứa các gen L1, L2 của virus Do đó, khi nhận liều vaccine, hệ thống miễn dịch của cơ thể

sẽ được kích hoạt, từ đó hình thành miễn dịch (qua tế bào và qua dịch thể) với nhóm HPV tương ứng Kháng thể chống HPV và các tế bào miễn dịch với HPV sẽ thâm nhập qua biểu mô cổ tử cung (trụ và lát) và có tác dụng bảo vệ cho lớp tế bào nhạy cảm với HPV tại cổ tử cung Do không sử dụng các yếu tố gây ung thư nên vaccine không gây các thay đổi bất thường trên tế bào cổ tử cung như khi bị nhiễm HPV [3]

Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng vaccine HPV là vaccine thuộc dạng phòng ngừa chứ không phải là vaccine điều trị được bệnh khi đã mắc bệnh, nghĩa là khi đã nhiễm HPV hoặc đã bị bệnh ở cổ tử cung (kể cả tổn thương tiền ung thư và ung thư) Hơn nữa, cho tới nay, chỉ có vaccine cho hai nhóm HPV nguy cơ cao là 16, 18, số trường hợp còn lại sẽ bị bỏ qua nếu chúng ta không có một chương trình tầm soát và điều trị ung thư có hiệu quả Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp hữu hiệu trong chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung đồng thời hỗ trợ cho quá trình điều trị đã trở thành một vấn đề cấp thiết đối với khoa học và y học ngày nay

I.1.7 Điều trị:

Có thể phát hiện sớm ung thư cổ tử cung và được điều trị khỏi bệnh 100% Ngược lại, ở giai đoạn muộn, kết quả điều trị thường không cao Giai đoạn tiền ung thư hoặc ung thư tại chỗ: điều trị bằng cách khoét chóp cổ tử cung bằng dao, bằng vòng đốt điện, bằng Laser, hoặc phẫu thuật lạnh với nitrogen lỏng (thường gọi là đốt lạnh) Các phương pháp này có ưu điểm là thời gian điều trị ngắn, chi phí thấp, ít biến chứng, lành bệnh nhanh Hơn nữa, cổ tử cung còn giữ được nên bệnh nhân vẫn còn có khả năng mang thai Nếu đang có thai, có thể chờ đến sau sinh sẽ điều trị Nếu vùng ung thư đã lan đến kênh cổ tử cung thì khoét chóp để lấy hết được mô bệnh [3] Các trường hợp ung thư lan tràn nhiều hơn, phương pháp điều trị sẽ tuỳ thuộc mức độ lan tràn, tuổi bệnh nhân, thường là phác đồ phối hợp giữa xạ trị (xạ trị trong, xạ trị ngoài), với phẫu thuật Wertheim-Meig (bao gồm cắt tử cung toàn phần, âm đạo, mô chung quanh tử cung, hai phần phụ (2 vòi trứng và 2 buồng trứng) kèm nạo hạch chậu 2 bên Khi ung thư đã tiến triển xa, lan tràn đến các cơ quan vùng chậu, bệnh nhân sẽ được xạ trị Đôi khi, cần phải phẫu thuật cắt bỏ rộng gồm bàng quang, âm đạo, cổ tử cung, tử cung, trực tràng Tỉ lệ sống còn 5 năm sau điều trị đối với ung thư ở giai đoạn sớm là 50-80%, dù được điều trị bằng xạ trị hay phẫu thuật Giai đoạn trễ chỉ còn 10-30%, nhưng có thể tăng lên đến 30-50% nếu bệnh nhân thuộc nhóm phẫu thuật đủ rộng [3]

I.2 TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS

Epigenetics có thể được định nghĩa là một biến đổi di truyền trong sự biểu hiện kiểu gen nhưng không đi kèm với những biến đổi trong trình tự DNA [8] Trong

tế bào Eukaryote, sự biến đổi epigenetics gồm hai yếu tố chính là sự methyl hóa DNA

(DNA methylation) và sự biến đổi histone (Histone modification)

I.2.1 Sự methyl hóa DNA (DNA methylation):

Sự methyl hóa DNA là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm

-CH3 vào vị trí carbone số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ sự xúc tác của

hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), enzyme này thúc đẩy phản ứng chuyển nhóm -CH3 từ S-adenosylmethionine (SAM) đến Cytosine (Hình I.2) Sự methyl hóa này là trường hợp biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú Khoảng 70% các cặp nucleotide CpG trong bộ gen của động vật có vú đều bị methyl hóa[9]

Quá trình methyl hóa DNA được thực hiện bởi một nhóm enzyme DNA

methyltransferase (DNMTs) đã được biết đến như DNMT1, DNMT2, DNMT3a,

DNMT3b và DNMT3L [10] Trong đó giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành sự

methyl hóa de novo và duy trì sự methyl hóa này là nhờ 3 enzyme DNMT1, DNMT3a,

DNMT3b

Đối với DNMT3a và DNMT3b là các de novo DNA methyltransferase có nhiệm vụ

thiết lập DNA methyl hóa đầu tiên bằng cách gắn những gốc methyl mới vào Cytosine trong cặp CpG mà trước đó không bị methyl hóa, DNMT1 là methyltransferase có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí Cystosine trên sợi đơn DNA vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản DNA Do đó sự methyl hóa DNA là di truyền cho các thế

hệ tế bào tiếp theo nhờ vào cơ chế methyl hóa DNA mạch khuôn [11]

Các enzyme này cũng góp phần vào sự methyl hóa bất thường và dẫn đến sự phát triển của ung thư Sự biểu hiện quá mức của DNMTs ở mức độ mRNA đã được nhận thấy ở

một vài bệnh ung thư, và sự biểu hiện của DNMT1 tăng trong tế bào bình thường thì có thể gây nên sự methyl hóa de novo bất thường ở đảo CpG Mức độ mRNA của

DNMTs được qui định một cách khác nhau trong suốt chu trình tế bào, và sự biểu hiện DNMTs không phù hợp có thể góp phần thay đổi sự methyl hóa trong các tế bào ung thư [8]

Sự methyl hóa đóng một vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các quá trình của tế bào như: sự phát triển phôi thai, sự phiên mã, ức chế nhiễm sắc thể X (X chromosomes inactivation), và “in dấu bộ gen” (genome imprinting) [11] Tuy nhiên khi sự methyl hóa diễn ra bất thường trên các cặp nucleotide CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u (tumor supressor gene) hay các gen liên quan đến khối u sẽ gây ra những biến đổi có thể dẫn tới ung thư vì nó ảnh hưởng tới sự giảm hoạt tính của quá trình phiên mã các gen này

Trong một số bệnh ung thư đang được nhấn mạnh gần đây thì người ta nhận thấy có

sự gia tăng một số lượng lớn các gen đã bị methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen đó [8] Điều này khẳng định hơn về vai trò của sự methyl hóa quá mức đảo CpG trong phát sinh ung thư, và là một biểu hiện sớm trong sự phát triển tế bào ung thư Do đó sự methyl hóa DNA có thể được sử dụng như một dấu hiệu phân tử hữu ích để phát hiện ung thư [8]

Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH 3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)

Đảo CpG là những vùng gen có chứa nhiều cặp nucleotide CpG Trong bộ gen động vật có vú, đảo CpG có ít nhất khoảng 200bp và có tỷ lệ CG lớn hơn 50% Đảo CpG thường không bị methyl hóa trong tế bào bình thường và được phân bố ở gần đầu 5’ của gen [9] Khoảng một nửa tất cả các gen của người đều chứa đảo CpG [10] và gần đây người ta đã ước tính bộ gen người chứa khoảng 29.000 đảo CpG [8] Cặp nucleotide CpG phân bố ngẫu nhiên trong bộ gen nhưng đảo CpG thường nằm trong những vùng nhỏ riêng biệt của gen và khoảng 40% đảo CpG nằm trong và gần vùng promoter

Sự methyl hóa quá mức trên đảo CpG là một hiện tượng chung trong gây ung thư Sự kìm hãm quá trình phiên mã của gen ức chế khối u bởi hiện tượng methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen có thể sẽ góp phần đến sự phát sinh ung thư [9]

Hai nhóm gen chính mà khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát sinh các tế bào ung thư là các gen ung thư (oncogene) và gen ức chế khối u (tumor supressor gene) Trong đó gen ức chế khối u có vai trò kiểm soát sự phân chia tế bào và hạn chế tối đa các đột biến hay tổn thương có thể truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp Do đó khi hiện tượng methyl hóa xảy ra quá mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u sẽ làm giảm sự biểu hiện của gen bằng cách ngăn chặn trực tiếp sự liên kết với các yếu tố phiên mã hoặc chỉ đạo gen liên kết với các protein kìm hãm Từ đó sẽ làm bất hoạt hay làm im lặng gen này, dẫn tới tế bào sẽ phân chia liên tục và những tổn thương được tích lũy lại dần dần hình thành ung thư Đây là một nguyên nhân chính gây ung thư do hiện tượng methyl hóa quá mức trên gen ức chế khối u

Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen

Sự methyl hóa quá mức đảo CpG ở vùng promoter của gen gây ức chế quá trình phiên

mã của gen, làm cho gen im lặng dẫn đến sự phát sinh ung thư

I.2.2 Sự biến đổi histone (Histone modification):

Sự phiên mã trên gen Eukaryote liên quan chặt chẽ đến sự thay đổi cấu trúc

không gian của sợi nhiễm sắc mà cụ thể là sự biến đổi của histone, một thành phần chính của sợi nhiễm sắc Nucleosome, đơn vị cơ sở cấu tạo nên sợi nhiễm sắc, gồm một đoạn DNA quấn quanh phần protein gồm 8 phân tử histone lõi (2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4), với 1 phân tử histone nối (H1) Các histone chứa nhiều acid amin tích điện dương nên nó có thể liên kết ổn định với phân tử DNA tích điện âm tạo nên cấu trúc nucleosome Bình thường, sự nén kích thước DNA trong nucleosome làm giảm khả năng tiếp cận DNA của các protein điều hòa các quá trình sao chép, sửa chửa, tái tổ hợp DNA, và đặc biệt quan trọng là các protein điều hòa quá trình phiên mã [1] Các phân tử histone lõi đều gồm có 2 vùng: một vùng có tính bảo thủ cao được gọi là miền gấp nếp histone tham gia vào sự tương tác với các histone khác; một vùng đuôi histone (đầu N) có cấu trúc dễ biến đổi, mở rộng phạm vi ra ngoài nucleosome nên rất dễ tiếp cận

Đuôi N không phải là phần thiết yếu cho sự liên kết giữa DNA với histone nhưng giữ vai trò quan trọng trong quá trình tham gia điều hòa biểu hiện các gen qua sự biến đổi cấu trúc nucleosome và vì vậy mà mỗi sự biến đổi quá mức trên nucleosome đều có tiềm năng gây ung thư Những biến đổi đó bao gồm sự acetyl hóa và khử acetyl histone hoặc methyl hóa ở gốc Lysine hay sự phosphoryl hóa gốc Serine nằm ở vùng đầu N của các histone [1]

I.2.2.1 Acetyl hóa và khử acetyl histone:

Thông thường việc acetyl hóa và khử acetyl lysine ở đầu N trong đuôi của histone protein sẽ liên quan đến sự hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động của gen Sự cải biến histone diễn ra linh hoạt do một số enzyme tham gia chuyển hóa xúc tác Sự acetyl hóa lysine ở đầu N trong đuôi của histone protein nhờ histone acetyltransferase (HATs) làm giảm sự tích điện dương của đuôi histone và có thể bẻ gãy sự liên kết của chúng với DNA cũng như làm thay đổi sự tương tác của chúng với những protein khác Điều đó giúp cho RNA polymerase và yếu tố phiên mã dễ dàng đi vào vùng promoter thực hiện quá trình phiên mã Ngược lại với sự acetyl hóa histone là sự khử acetyl hóa histone nhờ vào enzyme histone deacetyltransferase (HDACs hay HDs) để loại bỏ nhóm acetyl từ lysine trên histone do đó làm tăng cường ái lực liên kết giữa DNA và histone ngăn chặn quá trình sao chép Vì vậy, trong nhiều trường hợp, sự acetyl hóa histone làm tăng cường sự phiên mã trong khi sự khử acetyl hóa histone nhờ histone deacetyltransferase (HDACs hay HDs) lại làm giảm sự phiên mã

Hình I.4: Sự acetyl hóa và deacetyl hóa histone

Sự acetyl hóa histone nhờ enzyme HAT thúc đẩy quá trình phiên mã của gen Ngược

lại sự deacetyl hóa nhờ enzyme HDAC lại ức chế sự phiên mã

I.2.2.2 Methyl hóa histone:

Nhìn chung sự bất hoạt gen không chỉ liên quan đến sự methyl hóa DNA hoặc

sự loại bỏ nhóm acetyl ra khỏi protein histone mà thường đồng thời liên quan đến sự methyl hóa histone Tương tự với việc HDAC ức chế phiên mã qua việc loại bỏ nhóm acetyl khỏi đoạn đuôi của các protein histone thì các enzyme methyl hóa histone cũng thường có tác dụng ức chế phiên mã [1] Các enzyme histone methylase xúc tác bổ sung nhóm methyl cho các protein histonevà hoạt động của chúng thường liên quan đến sự ức chế của một số gen [1]

Tuy nhiên không giống với sự acetyl hóa, tùy thuộc vào vị trí phản ứng xảy ra, sự methyl hóa những phần khác nhau của đuôi N có thể dẫn đến các hiệu ứng biểu hiện khác nhau, hoặc tăng cường hoặc ức chế phiên mã tùy thuộc vào acid amin nào được methyl hóa [5] Các enzyme histone methylase thường gắn nhóm methyl vào đoạn đuôi histone, cụ thể tại một acid amin Lys đặc thù thuộc đoạn đuôi H3 và H4

I.2.2.3 Phosphoryl hóa histone:

Bên cạnh đó còn có hiện tượng phosphoryl hóa protein histone Hiện tượng phosphoryl hóa đuôi N của H3 thường thấy ở vùng chất nhiễm sắc kết đặc (dị nhiễm sắc) trong nguyên phân Trong khi quá trình acetyl hóa biến đổi các protein histone làm trung hòa điện tích dương (như trung hòa điện tích dương của Lys tại đuôi histone) thì quá trình phosphoryl hóa làm tăng điện tích âm của đuôi histone Những quá trình biến đổi này làm giảm điện tích dương trên phân tử của chúng và vì vậy mà làm yếu đi mối liên kết của chúng với DNA điều này làm thay đổi về mặt cấu tạo của nucleosome, dẫn đến thay đổi khả năng phiên mã của các DNA có liên quan bằng cách thay đổi mức độ xoắn ốc của sợi DNA mạch đôi trong phạm vi các vùng nhiễm sắc thể

Sự methyl hóa DNA và sự biến đổi histone có mối quan hệ trực tiếp trong quá trình phát sinh ung thư Khi xảy ra hiện tượng methyl hóa quá mức trên các gen này thì các trình tự DNA bị methyl hóa thường được một số protein Methyl-CpG-binding domain (MBDs) mà đặc biệt là MeCP2 nhận biết, rồi chúng lại tiếp tục huy động các enzyme histone deacetylase và histone methylase, những enzyme này xúc tác dẫn đến những biến đổi trong sự acetyl hóa histone và cấu trúc nucleosome Kết quả là sự methyl hóa có tính lan tỏa, ức chế quá trình phiên mã và các vùng bị methyl hóa thường chuyển thành vùng dị nhiễm sắc [1], dẫn tới sự phát triển quá mức của các gen liên quan đến ung thư

I.3 ĐẠI CƯƠNG GENE RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta)

I.3.1 Cấu trúc và chức năng:

Gen RARβ (Retinoic Acid Receptor, beta) là một gen ức chế khối u mã hóa cho thụ thể RARβ Gen RARβ nằm trên nhiễm sắc thể số 3 ở vị trí 3p24 Trên gen

RARβ có sư hiện diện của hai vùng promoter P1 và P2 ở đầu 5’ của gen giúp phiên

mã ra bốn loại mRNA khác nhau: mRNA RARβ1, mRNA RARβ2, mRNA RARβ3, mRNA RARβ4 lần lượt mã hóa cho các thụ thể RARβ1, RARβ2, RARβ3, RARβ4 Promoter P1 trực tiếp phiên mã cho đồng phân RARβ1, trong khi đó promoter P2 thì phiên mã cho các đồng phân RARβ2 và RARβ4 Đồng phân RARβ3 được biểu

hiện từ promoter P1 ở chuột nhưng lại vắng mặt ở người [23] Trong tế bào ở người, RARβ2 là dạng hiện diện chủ yếu, với kích thước khoảng 170 kb, gồm 6 exon, chứa đảo CpG thuộc vùng 5’ UTR, yếu tố RAREs, hộp TATA và các yếu tố phiên mã quan trọng

Retinoids, là một lớp các hợp chất hóa học liên quan đến vitamin A, có nhiều vai trò quan trọng trong khắp cơ thể bao gồm khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, tế bào của xương; giữ vai trò quan trọng trong việc quy định sự phát triển và đặc biệt là biệt hóa tế bào, chức năng miễn dịch và kích hoạt gen ức chế khối u [24, 25] Những vai trò này được thưc hiện thông qua trung gian là các thụ thể acid retinoic (Retinoid Acid Receptors-RARs) và các thụ thể retinoid X (Retinoid X receptors-RXRs), mà các thụ thể này có vai trò kích thích các yếu tố phiên mã trong việc đáp ứng liên kết của một phối tử acid retinoic [24] bằng cách gắn các yếu tố RAREs lên vùng promoter của gen đích Những thụ thể của gia đình RARs được biểu hiện khác nhau trong suốt đời sống sinh trưởng và phát triển của tế

bào, và người ta cho rằng protein RARβ2 hạn chế sự phát triển của nhiều loại tế bào

bằng cách điều chỉnh biểu hiện của gen qua quá trình phiên mã

Trong tế bào biểu mô bình thường thì nhận thấy rằng khi được xử lí với RA thì sự

điều hòa phiên mã của RARβ2 được tăng lên giúp kiểm soát quá trình phiên mã

trong nhân Ngược lại trong các kiểu hình ác tính thì có sự thiếu hụt RA ở các tế bào biểu mô được thể hiện thông qua sự phân bào tăng liên tục và mất sự biệt hóa

của tế bào [25]

I.3.2 Sự methyl hóa gen RARβ2 trong ung thư:

Sự methyl hóa quá mức trong đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự mất

biểu hiện của gen RARβ2 đã được khảo sát trên nhiều bệnh ung thư khác nhau như:

ung thư vú [26], ung thư phổi [25], ung thư dạ dày [27], ung thư tuyến tiền liệt [28] Riêng trong ung thư cổ tử cung, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự methyl hóa

có thể là nguyên nhân cho sự giảm biểu hiện của gen RARβ2 trong tế bào ung thư cổ tử

cung Cụ thể theo nghiên cứu của Ivanova và các cộng sự thì 8/20 mẫu (40%) ung thư

tế bào vảy (Squamous Cell Carcinoma-SCC) ở giai đoạn xâm lấn bị methyl hóa có sự

giảm hoặc mất đi sự biểu hiện của RARβ2 Trong khi đó những mẫu tế bào cổ tử cung bình thường thì RARβ2 không bị methyl hóa và biểu hiện bình thường [24] Đối với giai đoạn ung thư cổ tử cung xâm lấn thì mức độ methyl hóa quá mức của RARβ2 dao

động từ 33-66% [29], 11 % đối với mẫu bệnh mức độ tổn thương thấp, 29% đối với

mẫu có mức độ tổn thương cao Sự methyl hóa vùng 5’ của RARβ2 góp phần vào sự im

lặng của gen và có thể là một sự kiện quan trọng và sớm trong ung thư cổ tử cung [24]

Do vậy có lẽ đây là dấu chứng hữu hiệu giúp chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung

Ph ầ n II.V Ậ T LI Ệ U VÀ

II.1 VẬT LIỆU

II.1.1 Các trang Web sử dụng

Phần mềm Annhyb 4.943 năm 2010

Phần mềm trực tuyến : http://www.urogen.org

Trang web : www.ncbi.nlm.nih.gov

Trong tổng số mẫu thu được 32 mẫu thì có 4 mẫu mô tươi và 28 mẫu dịch phết

Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -300C trước khi tiến hành tách chiết DNA

II.2 PHƯƠNG PHÁP

Nghiên cứu được chúng tôi bố trí gồm hai phần Đầu tiên, chúng tôi tiến hành thu thập, khai thác dữ liệu của các nghiên cứu thực hiện trước đó Những dữ liệu này được sử dụng làm cơ sở để chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu methyl và unmethyl cho phản ứng MSP Tiếp theo, phần thực nghiệm sẽ được tiến hành nhằm khảo sát mức độ methyl hóa gen RARβ trên các mẫu bệnh thể hiện có sự tương quan giữa sự methyl hóa và bệnh ung thư cổ tử cung

Khai thác dữ liệu trên

NCBI

Khảo sát in silico gen RARβ

Thiết kế mồi cho MSP

Khai thác dữ liệu

Tách chiết DNA từ mẫu bệnh

Biến đổi bisulfite DNA và tinh sạch sản phẩm sau biến đổi

Khảo sát thực nghiệm

Kiểm tra chất lượng DNA bằng OD,

điện di, PCR

Kiểm tra mức độ methyl hóa gen RARβ

trên nguồn mẫu bệnh

Giải trình tự kiểm tra độ đặc

hiệu của mồi

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng

Q-MSP trên DNA control

I.2.1 Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico

II.2.1.1 Khai thác dữ liệu:

Để thiết kế mồi methyl và unmethyl đặc hiệu của gen RARβ cho phản ứng MSP, tìm hiểu về mối tương quan giữa sự methyl hóa của nó và bệnh ung thư cổ tử cung Đầu tiên, chúng tôi khai thác thông tin, dữ liệu về gen RARβ trên ngân hàng

dữ liệu PubMed của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) PubMed là cở

sở dữ liệu được phát triển và quản lí bởi Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học (National Center for Biotechnology Information_NCBI) thuộc Thư viện quốc gia Hoa Kỳ (National Library of Medicine_NLM) PubMed là một cở sở dữ liệu khổng lồ, bao gồm tất cả các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới Để tìm kiếm dữ liệu trong PubMed, Chúng tôi dùng các từ khóa đơn giản như cervical cancer, methylation, gen retinoic acid receptor, beta,… để tìm kiếm

II.2.1.2 Khảo sát insilico gen RARβ

a Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG:

Thu nhận trình tự nucleotide gen RARβ từ ngân hàng gen với số Gene ID (Identification number) là 5915 Tiến hành xác định vị trí một số vùng quan trọng trong cấu trúc của gen như vùng promoter, 5’UTR, exon 1

Chúng tôi chỉ tập trung khảo sát vùng gen kéo dài từ promoter 1 đến exon 1 vì sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG thuộc vùng này có thể ảnh hưởng đến quá trình phiên

mã của gen gây nên sự im lặng của gen dẫn đến ung thư

Sử dụng phần mềm Methprimer (http://www.urogen.org) với các thông số mặc định sẵn trong chương trình để xác định các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen

b Phương pháp đánh giá – thiết kế mồi:

Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thiết kế và đánh giá mồi cho

phương pháp MSP trong khảo sát thực nghiệm gen RARβ bằng một số công cụ tin sinh

- MethBlast (www.medgen.ugent.be/methBLAST/) và BLAST với các thông số mặc định sẵn trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov): nhằm xác định độ đặc hiệu của các

bộ mồi thiết kế

- IDT analyzer: xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer…

-

II.2.2 Khảo sát thực nghiệm

II.2.2.1 Tách chiết DNA:

❖ Nguyên tắc:

Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh

❖ Thiết bị và hóa chất:

o Đối với mẫu mô

▪ Cho mẫu bệnh phẩm vào ống Eppendorf loại 1.5ml

▪ Thêm 700µl hỗn hợp gồm 14µl NaCl 5M, 14µl Tris HCl 1M (pH=8), 14 µl dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), 33 µl SDS 10%, và 615µl H2O Cắt nhuyễn mô bệnh phẩm Sau đó thêm 10µl protein K (nồng độ 20mg/ml)

o Đối với mẫu dịch phết

▪ Ép tâm bông vào thành của ống Eppendorf loại 1.5 ml