Do đó, các nghiên cứu về xây dựng dấu chứng sinh học tiềm năng cũng được tập trung trên các gene của EBV, đặc biệt là việc phát hiện các biến thể trên các gene của EBV trên bệnh nhân ung
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ
Ung thư không phải là một căn bệnh, mà nó là tập hợp một nhóm các bệnh liên quan có thể xảy ra ở hầu hết mọi nơi trong cơ thể chúng ta Cơ bản nhất, ung thư là căn bệnh của các gene trong các tế bào của cơ thể, bởi vì gene kiểm soát cách thức hoạt động của các tế bào Vì vậy, khi những gene này bị bột biến, sự thay đổi đó có thể khiến các tế bào gặp trục trặc, khiến chúng phát triển và phân chia một cách không cần thiết, sự chết đi của tế bào không xảy ra đúng hạn Khi đó, những tế bào bất thường này có thể trở thành ung thư Các tế bào ung thư có thể phát triển trực tiếp vào mô hoặc di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác qua hệ bạch huyết hoặc máu, quá trình này được gọi là di căn (1)
Có hơn 100 loại ung thư hiện nay Ung thư thường được đặt tên theo nơi chúng hình thành hoặc loại tế bào hình thành nên chúng (2)
Về cơ bản, ung thư thường được chia thành các nhóm chính sau (2):
Ung thư biểu mô là loại ung thư phổ biến nhất, xuất hiện khi tế bào biểu mô - lớp tế bào phủ bên trong và bên ngoài cơ thể - phát triển không kiểm soát.
- Ung thư mô liên kết (Sarcoma): là ung thư hình thành trong các mô xương và mô mềm, bao gồm cơ, mỡ, mạch máu, mạch bạch huyết và mô sợi (như gân và dây chằng)
- Bệnh bạch cầu (Leukemia): là ung thư hình thành trong mô tạo máu của tủy xương Những ung thư này không tạo thành khối u rắn, mà thay vào đó tạo thành một lượng lớn bạch cầu bất thường tích tụ trong máu và tủy xương, lấn át các tế bào máu bình thường Do đó, nó gây ra lượng tế bào máu trong cơ thể bị thấp khiến cơ thể khó lấy oxy hơn đến các mô, khó kiểm soát chảy máu hoặc chống nhiễm trùng
- Ung thư hạch (Lymphoma): là ung thư bắt đầu trong tế bào lympho (tế bào T hoặc tế bào B) Trong ung thư hạch, các tế bào lympho bất thường tích tụ trong các hạch bạch huyết và mạch bạch huyết, cũng như trong các cơ quan khác của cơ thể Có hai loại ung thư hạch chính là ung thư hạch Hodgkin ( có các tế bào lympho bất thường là Reed-Sternberg được hình thành từ các tế bào B) và ung thư hạch không Hodgkin ( có một nhóm lớn các tế bào lympho bất thường và được hình thành từ tế bào B hoặc tế bào T)
- Đa u tủy (Multiple Myeloma): là ung thư bắt đầu trong các tế bào plasma Các tế bào plasma bất thường, tích tụ trong tủy xương và hình thành các khối u trong xương khắp cơ thể Đa u tủy còn được gọi là u nguyên bào plasma và bệnh Kahler
- Ung thư hắc tố: bắt đầu trong các tế bào trở thành melanocytes, là những tế bào chuyên biệt tạo ra melanin (sắc tố màu cho da)
- Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ các mô hệ thần kinh, tế bào não và tủy sống
1.3 Tình hình ung thư trên thế giới và trong nước ta
Theo thống kê của Globocan năm 2018, toàn cầu ghi nhận khoảng 18,1 triệu ca ung thư mới, gây ra gần 9,6 triệu ca tử vong (3) Trung bình cứ 6 người thì có 1 người tử vong vì ung thư (1) Các quốc gia có tỷ lệ tử vong do ung thư cao nhất lần lượt là Trung Quốc, Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Đức Đáng chú ý, châu Á chiếm tỷ lệ mắc ca mới và tỷ lệ tử vong do ung thư cao nhất thế giới, lần lượt là 48,4% và 57,3% (3).
Hình 1.1 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do ung thư trên cả hai giới tính của từng châu lục trên thế giới.
Hình 1.2 Tỷ lệ ca mắc mới do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018
Hình 1.3 Tỷ lệ ca tử vong do các ung thư trên toàn thế giới năm 2018.
Trong khi đó, số ca ung thư mắc mới vào năm 2018 của Việt Nam cũng vô cùng cao, lên đến khoảng 164.671 ca, số ca tử vong do ung thư trong cùng năm là 114.871 ca (3) Việt Nam đang đứng trước những khó khăn to lớn và cấp thiết do ung thư gây ra bởi số ca mắc mới và tử vong do ung thư ngày càng tăng lên nhanh chóng Theo ước tính của Globocan, vào năm 2040 ở Việt Nam số ca mắc mới và tử vong do ung thư có thể lên đến con số 285.374 và 214.269 ca
Hình 1.4 Tỷ lệ các loại ung thư ở Việt Nam năm 2018.
Chú thích: Số liệu được thống kê cho tất cả các độ tuổi và không phân biệt giới tính.
TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG
2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng
Ung thư biểu mô vòm họng (UTVH) là một khối u phát sinh từ các tế bào biểu mô bao phủ bề mặt và đường vào vòm họng Năm 1921, lần đầu tiên Regaud và Schmincke mô tả UTVH như một thực thể riêng biệt (5, 6) UTVH thường bắt đầu trong vùng vòm mũi họng, là phần trên cùng của hầu họng, nằm phía sau khoang mũi và gần nền sọ Các triệu chứng thường gặp bao gồm: [1] sự xuất hiện của khối u trong vòm họng gây chảy máu cam, tắt nghẽn mũi; [2] sự rối loạn chức năng của ống eustachian gây ù tai, nghe kém, điếc tai; [3] xói mòn nền sọ và liệt dây thần kinh sọ gây đau đầu, tê liệt; [4] di căn hạch ở cổ,…(4) Cũng như các ung thư khác, việc chẩn đoán, sàng lọc sớm bệnh ung thư vòm họng sẽ hứa hẹn cho việc nâng cao khả năng sống sót của bệnh nhân
Hình 1.5 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng
Chú thích: UTVH nằm ở vùng vòm mũi họng, là nơi tiếp giáp với mũi, họng và chỗ đổ của ống vòi nhĩ (nơi thông giữa tai và mũi họng)
Có ba phân nhóm của UTVH được công nhận trong phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (7):
Loại I: ung thư biểu mô tế bào vảy sừng, thường thấy ở người lớn tuổi (Keratinising squamous-cell carcinoma)
Loại II: ung thư biểu mô không sừng hóa (Differentiated nonkeratinising carcinoma)
Loại III: ung thư biểu mô không biệt hóa (Undifferentiated carcinoma)
Theo thống kê tại Bắc Mỹ, khoảng 25% bệnh nhân có khối u thuộc mô học loại I, 12% có loại II và 63% có loại III Còn ở phía nam Trung Quốc, bệnh nhân thuộc loại I là 2%, loại II là 3% và loại III là 95% (4) Năm 1991, loại II và III đã được kết hợp thành một loại ung thư biểu mô không sừng hóa (8)
UTVH thường được phát hiện trễ, hầu hết ở giai đoạn muộn do biểu hiện của những người bệnh UTVH thường không rõ ràng, dễ dàng bị người bệnh xem nhẹ, vì triệu chứng của UTVH hầu hết là các triệu chứng “mượn” từ các cơ quan lân cận khác như: tai, mũi, thần kinh… Trong khi đó, nếu được phát hiện, chẩn đoán và chữa trị vào giai đoạn đầu thì bệnh nhân mắc UTVH có thể được chữa trị và phục hồi tốt Ở Singapore, bệnh nhân thường được phát hiện mắc UTVH vào giai đoạn 2 hoặc giai đoạn 3 và phần lớn ở người lớn tuổi (9) Ở Indonesia, hơn 80% bệnh nhân phát hiện đang mắc UTVH vào giai đoạn muộn (10) Bệnh nhân phát hiện mắc UTVH giai đoạn muộn thường khó chữa trị, có nguy cơ tái phát cao và tỷ lệ sống sót giảm đáng kể Vì vậy, ngành y học vẫn luôn tích cực tìm kiếm các biện pháp tốt nhất để có thể trị liệu và cải thiện tình trạng bệnh của bệnh nhân UTVH như phương pháp phẫu thuật, hóa trị, xạ trị Tuy nhiên, các phương pháp này thường ảnh hưởng rất lớn đến cơ thể người bệnh, nhất là các bệnh nhân lớn tuổi Mặt khác, sự di căn của các khối u ác tính vẫn luôn là vấn đề nan giải của y học, bệnh nhân ung thư bị di căn chiếm tỷ lệ 25-34% và những bệnh nhân này thường có tỷ lệ sóng sót rất thấp (11, 12)
Các nghiên cứu trước đó về UTVH cho thấy, UTVH có sự phân hóa về mặt địa lý và chủng tộc (10) UTVH có sự phân bố địa lý không đồng đều trên thế giới, chủ yếu tập trung tại khu vực Châu Á và Châu Phi (10) Theo thống kê của Globocan năm 2018, có 84,6% trường hợp mắc ung thư vòm họng xảy ra tại Châu Á và 7,4% trường hợp tại châu Phi (3) UTVH rất phổ biến tại Châu Á (đặc biệt là Trung Quốc và Đông Nam Á) (13) Ngoài ra, cũng theo thống kê này, tổng số ca UTVH trên thế giới là 129.079 ca, tổng số ca tử vong lên đến 72.987 ca Quốc gia có số ca UTVH cao nhất là Trung Quốc (60.558 ca), Indonesia (17.992 ca), Việt Nam (6.212 ca) và Ấn Độ (5.086 ca)
Một số nhóm dân tộc có nguy cơ mắc UTVH cao, ví dụ: dân tộc Bidayuh trên đảo Borneo, dân tộc Nagas ở miền Bắc Ấn Độ và dân tộc Inuits ở Bắc Cực (10) Ngoài ra, còn có một số quần thể khác có nguy cơ mắc bệnh cao bao gồm: người bản địa Đông Nam Á, người bản địa của vùng Artic, người Ả Rập ở Bắc Phi và một phần ở Trung Đông Đặc biệt, tỷ lệ mắc UTVH của người ở các tỉnh miền Nam Trung Quốc cao gấp
20 lần đến 50 lần so với các nước phương Tây (16, 17) Ngoài ra, đàn ông có khả năng mắc UTVH cao hơn gấp hai đến ba lần so với phụ nữ (14) và độ tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là từ 50 đến 60 tuổi (15) Người cao tuổi có nguy cơ bị tái phát UTVH cao hơn và cũng có tỷ lệ sống thấp hơn Mặt khác, tỷ lệ tử vong cao nhất do UTVH đã được ghi nhận ở những người trên 85 tuổi (10)
Quá trình hình thành UTVH trải qua nhiều giai đoạn phát triển Đầu tiên là từ trạng thái bình thường, cá thể bắt đầu chuyển sang trạng thái rối loạn tổn thương ở mức độ thấp (Low grade dysplastic lesion), tiếp đó có sự hình thành khối u tại chỗ (Carcinoma in situ), sau đó khối u tăng sinh và chuyển sang giai đoạn xâm lấn các cơ quan khác (Invasive carcinoma) (18, 19) Tại mỗi một giai đoạn đều có các yếu tố tác động khác nhau Tuy nhiên, có ba nguyên nhân chính gây nên ung thư vòm họng, bao gồm: [1] sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr Virus); [2] yếu tố di truyền; [3] yếu tố môi trường (20)
Nhiều nghiên cứu chứng minh ung thư vòm họng có mối liên hệ đặc biệt với virus Epstein-Barr (EBV) Nghiên cứu của Niedobitek (1991) và Weiss (1989) chỉ ra ung thư biểu mô vòm họng không biệt hóa luôn dương tính với EBV Wu (2003) phát hiện khối u vòm họng dương tính với EBV phát triển nhanh hơn Nghiên cứu của Chou (2008) cho thấy khoảng 95% khối u vòm họng liên quan đến EBV EBV thường tồn tại ở dạng tiềm ẩn trong giai đoạn đầu và gây bệnh khi chuyển sang trạng thái hoạt động, kích hoạt gen EBNA-1 và các protein khác như LMP1, BARTs.
(BamHI-A Right-ward Transcripts),… giúp chúng nhân lên, xâm nhiễm vào các tế bào và gây biến đổi mô, tế bào cơ thể để phát triển thành khối u ác tính (18) EBV chỉ biểu hiện bệnh khi các gene virus (EBNA-1, LMPs, BARTs,…) chuyển sang trạng thái hoạt động (dạng tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm Lúc này, chúng sẽ di căn trong cơ thể, phát triển thành khối u ác tính (18, 24)
Các yếu tố di truyền có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư Yếu tố di truyền bao gồm: hiện tượng epigenetics (sự methyl hóa, biến đổi protein histone và miRNA), đột biến, tính đa hình (SNPs,…) (25) Những nghiên cứu về yếu tố đa hình một số gene của EBV gần đây cũng cho thấy, các biến thể ở một số gene của EBV liên quan đến khả năng phát sinh khối u vòm họng và đẩy nhanh tiến trình hình thành ung thư (26, 27)
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng môi trường đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư vòm họng Sự khác biệt về địa lý, lối sống, nơi sinh sống và điều kiện sống ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc ung thư vòm họng ở các vùng khác nhau trên thế giới Ví dụ, ung thư vòm họng hiếm gặp ở người da trắng nhưng phổ biến ở Quảng Đông (Trung Quốc) và ở người Eskimo ở Alaska và thổ dân Greenland Ngoài ra, các thói quen sống như tiêu thụ cá muối, rau củ không tươi, hút thuốc lá, tiếp xúc với hóa chất độc hại cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư vòm họng Các nghiên cứu kiểm soát trường hợp tại các quần thể khác nhau trên khắp Châu Á và Bắc Mỹ đã chứng minh cá muối kiểu Quảng Đông và thực phẩm bảo quản chứa nhiều Nitrosodimethylamine (NDMA), N-nitrospyrrolidene (NPYR) và N-nitrospiperidine (NPIP) có thể là yếu tố nguy cơ gây ung thư vòm họng.
31, 32) Ở Tunisia, hỗn hợp gia vị “harissa” cũng đã được xác định là yếu tố có nguy cơ gây ung thư biểu mô mũi họng (33) Nghiên cứu của Yu và cộng sự (2002) đã chứng minh nếu tiếp xúc với muối ở độ tuổi sớm sẽ có nguy cơ cao mắc UTVH ở miền Nam Trung Quốc Ngoài ra, việc hút thuốc lá và nghề nghiệp có phơi nhiễm với formaldehyd và bụi gỗ cũng là những yếu tố rủi ro có thể gây UTVH (17) Điều kiện kinh tế xã hội kém cũng có liên quan đến nhiễm EBV tiên phát sớm, trong khi nhiễm EBV nguyên phát muộn được thấy ở những người có tình trạng kinh tế xã hội cao Thu nhập thấp và điều kiện gia đình đông đúc cũng đã được chứng minh làm tăng khả năng mắc EBV ở trẻ em từ các khu vực như Thái Lan (34), Thổ Nhĩ Kỳ (35), Ghana (36) và Đan Mạch (37)
2.3 Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và trong nước ta
Theo thống kê của Globocan (2018), Châu Á có tỷ lệ mắc UTVH cao nhất là 84,6%, Châu Phi đứng thứ hai là 7,4%, tiếp đến là Châu Âu (3,9%), Mĩ Latin và Caribbean (2,1%), Nam Mĩ (1,9%) (3) và toàn thế giới có 129.074 ca mắc mới, có 72.987 ca tử vong do UTVH Trong đó, Trung Quốc là quốc gia có số ca mắc UTVH mới cao nhất với 60.558 ca
Hình 1.6 Tỷ lệ mắc ca mới (Incidence) và tỷ lệ tử vong (Mortality) do UTVH trên cả hai giới tính của từng châu lục trên thế giới
Hình 1.7 Tỷ lệ ca mắc mới của UTVH trên thế giới năm 2018
Hình 1.8 Tỷ lệ ca tử vong của UTVH trên thế giới năm 2018
Cũng theo thống kê của Globocan (2018), trong khu vực Đông Nam Á, tổng số ca mắc UTVH là 34.681 ca Trong đó, quốc gia có số ca mắc UTVH mới cao nhất là Indonesia (17.992 ca), tiếp đó Việt Nam đứng thứ hai trong khu vực với 6.212 ca, tiếp xuống là Philippines (2.913 ca), Thailand (2.200 ca), Malaysia (2.089 ca) Việt Nam đang phải đối mặt với số lượng khổng lồ bệnh nhân UTVH và con số này còn không ngừng tăng lên hằng năm Số ca chết do UTVH vào năm 2018 của Việt Nam cũng vô cùng cao là 4.232 ca (theo thống kê Globocan), chiếm vị trí số 2 trong khu vực Đông Nam Á (vị trí số 1 là Indonesia với 11.204 ca tử vong)
Hình 1.9 Tỷ lệ ca mắc mới (Incidence) và tỷ lệ chết (Mortality) do ung thư vòng họng tại Việt Nam
Bảng 1.1 Thống kê Globocan số ca ung thư vòm họng mắc mới và tử vong của khu vực Đông Nam Á năm 2018
Số ca ung thư mới Số ca tử vong
Ca Xếp hạng % Ca Xếp hạng %
EPSTEIN-BARR VIRUS VÀ TÍNH ĐA HÌNH
Virus Epstein-Barr (EBV) là virus khối u đầu tiên ở người được phát hiện, đem mang lại cái nhìn sâu sắc về mầm bệnh ung thư và quá trình nhiễm kéo dài của herpesvirus (38) EBV thuộc nhóm herpesvirus type 4, họ herpesviridae, được phát hiện bởi Epstein và Barr vào năm 1964 trong mô khối u của một bệnh nhân bị mắc ung thư hạch Burkitt từ Châu Phi (39) Năm 1984, Baer và cộng sự EBV đã cho xuất bản bộ gene được giải trình tự hoàn toàn của EBV, đây cũng là virus herpesvirus đầu tiên có bộ gene được giải trình tự hoàn toàn, EBV này có nguồn gốc từ một bệnh nhân bị mắc bệnh bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng (40), nghiên cứu này đã tạo được tiền đề rất lớn cho các nghiên cứu về EBV và UTVH sau này Việc nhiễm EBV là rất phổ biến, nó ảnh hưởng đến tất cả các nhóm người (41, 42), phần lớn không có triệu chứng và bị nhiễm suốt đời
Virus Epstein-Barr (EBV) mang trong mình một bộ gen DNA sợi đôi, xoắn, mạch hở có kích thước 170.180 kb Chúng tồn tại dưới hai dạng: episome ở giai đoạn tiền tan và mạch thẳng lúc mới xâm nhập tế bào Cấu trúc vật lý của EBV bao gồm vỏ protein capsid, lớp vỏ bọc bên ngoài và bộ gen virus bên trong.
Trong in vitro, EBV chuyển đổi hiệu quả các tế bào B đang nghỉ ngơi thành các dòng tế bào lymphoblastoid bị nhiễm trùng vĩnh viễn (LCL) (42, 44, 45) Các LCL được tạo ra do nhiễm trùng tế bào lympho B in vitro mang nhiều bản sao DNA virus hình tròn, ngoại bào (episomes) trong mỗi tế bào và biểu hiện bộ gene của virus, bao gồm 6 kháng nguyên hạt nhân EBNAs (-1, -2, -3A, -3B, -3C, và -LP) và 3 protein màng tế bào tiềm ẩn
LMPs (-1, -2A và -2B) Ngoài các protein tiềm ẩn, LCL cũng cho thấy sự biểu hiện phong phú của các RNA nhỏ mã hóa EBV không được polyadenyl hóa (EBER) là EBER1 và
EBER2 và ba protein thuộc họ BARTs là RPMS1, A73, BARF0; những protein này được thể hiện trong tất cả các dạng nhiễm EBV tiềm ẩn và chúng cũng là mục tiêu tuyệt vời để phát hiện EBV trong các khối u (42, 44, 45)
Hình 1.10 Cấu trúc hệ gene của EBV (46)
Các gene trong EBV đều có chức năng riêng và bổ trợ lẫn nhau Sáu gene mã hóa cho protein kháng nguyên nhân EBNAs có liên quan đến quá trình xâm nhiễm và nhân lên của EBV ở giai đoạn đầu, ngoài ra, sự phối hợp hoạt động của các kháng nguyên hạt nhân giúp kiểm soát biểu hiện gene của virus và vật chủ thông qua việc tương tác trực tiếp với các mạch điều khiển tế bào trong nhân; ba gene mã hóa cho protein màng LMPs là mô phỏng của các protein tín hiệu tế bào chịu trách nhiệm cho việc kích hoạt và sống sót của tế bào B, liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B và có thể kích thích tạo khối u, góp phần khiến u lành trở thành u ác tính; hai gene không mã hóa RNA EBER có chức năng ngăn chặn quá trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) (38, 51) và ba protein thuộc họ BARTs liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch, điều hòa lượng Ca 2+ trong tế bào (48-50)
Sau xâm nhập, EBV có thể tiến triển theo ba hướng: gây nhiễm tới tế bào biểu mô và nhân lên; xâm nhiễm tế bào lympho B, nhân lên, giải phóng virus qua nước bọt; tàng nhiễm trong tế bào lympho B, gây ung thư trong điều kiện thích hợp.
Hiện nay, nghiên cứu các gene của EBV được xem là mục tiêu nhắm đến để tìm ra các phương pháp sàng lọc, chẩn đoán cho bệnh nhân UTVH bằng phương pháp sinh học phân tử Hướng nghiên cứu hướng tới đa dạng như nghiên cứu đột biến, biểu hiện gene, tính đa hình,…và nhiều dạng khác, giúp cơ sở dữ liệu về EBV ngày càng đầy đủ và làm rõ ràng hơn mối quan hệ giữa EBV và UTVH
Tính đa hình có ba dạng đặc trưng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP) Đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP) là sự thay thế của một nucleotide duy nhất xảy ra tại một vị trí cụ thể trong bộ gene, trong đó mỗi biến thể có mặt ở mức độ hơn 1% trong dân số (53) Ví dụ, tại một vị trí cụ thể trong bộ gene người, hầu hết tất cả mọi người đều là ncleotide C, tuy nhiên một số ít cá nhân cũng tại vị trí này thì lại là nucleotide T, điều này thể hiện SNP ở vị trí cụ thể này
Hình 1.11 Minh họa một SNP, thay thế G-C thành A-T và ngược lại
Có hai loại SNP là SNP nằm trong khu vực không mã hóa (Non-coding region) và SNP nằm trong khu vực mã hóa (Coding region) của gene Trong đó, SNPs xảy ra thường xuyên hơn ở khu vực không mã hóa do các ảnh hưởng từ chọn lọc tự nhiên, tỷ lệ tái tổ hợp và đột biến di truyền SNPs nằm trong khu vực mã hóa không nhất thiết phải làm thay đổi trình tự amino acid của protein được tạo ra, vì sự thoái hóa của mã di truyền (54) Ngoài ra, SNPs trong khu vực mã hóa được chia làm hai loại: SNP đồng nghĩa (Synonymous) không gây ảnh hưởng tới trình tự protein và SNP không đồng nghĩa (Non- synonymous) làm thay đổi trình tự protein SNP không đồng nghĩa còn được chia thành hai phân nhóm nhỏ hơn là missense và nonsense Mặt khác, SNPs không nằm trong khu vực mã hóa protein vẫn có thể gây ảnh hưởng đến quá trình tách gene, liên kết các yếu tố phiên mã, suy thoái RNA thông tin hoặc trình tự RNA không mã hóa Biểu hiện gene bị ảnh hưởng bởi SNPs này được gọi là eSNP (SNP biểu hiện)
SNP xảy ra thường xuyên trong DNA bộ gene người Trung bình cứ 1000 nucleotide thì xảy ra một SNP, điều đó có nghĩa là có khoảng 4 đến 5 triệu SNP trong bộ gene của một người Đến nay, đã có hơn 335 triệu SNP đã được tìm thấy trên bộ gene người đến từ nhiều quần thể (55) Thông thường, SNPs được tìm thấy trong DNA giữa các gene Chúng hoạt động như các dấu hiệu sinh học, giúp xác định vị trí các gene có liên quan đến bệnh tật Khi SNPs xảy ra trong gene hoặc trong khu vực gần gene quy định, chúng có thể đóng vai trò trực tiếp hơn trong bệnh bằng cách gây ảnh hưởng tới chức năng gene
Hầu hết SNPs không ảnh hưởng đến sức khỏe hoặc sự phát triển của vật chủ Tuy nhiên, một số SNPs đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu về sức khỏe con người Ví dụ, rs6311 và rs6313 là các SNP trong gene thụ thể Serotonin 5-HT2A trên nhiễm sắc thể số 13 của người (56); một SNP trong gene F5 là nguyên nhân gây ra huyết khối yếu tố V Leiden (57); rs148649884 và rs138055828 là hai SNP trong gene FCN1 mã hóa cho M-ficolin làm tê liệt khả năng liên kết phối tử của M-ficolin tái tổ hợp (58); một SNP ở vùng không mã hóa của APOC3 (gene apolipoprotein C3) liên quan nguy cơ làm tăng triglyceride máu và xơ vữa động mạch (59);…Ngoài ra, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy SNPs có thể giúp dự đoán một số phản ứng của cá nhân với một số loại thuốc nhất định Mặt khác, SNPs có thể bị ảnh hưởng từ các yếu tố môi trường như độc tố và nguy cơ phát triển các bệnh cụ thể SNPs cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gene bệnh trong gia đình (60) Vì vậy, nghiên cứu SNPs là hướng nghiên cứu triển vọng và mang tính chiến lược để xây dựng càng hoàn thiện cơ sở dữ liệu về bộ gene của người và sinh vật, đem lại các hướng phát triển mới cho nghiên cứu về di truyền bệnh.
GENE LMP1
4.1 Đặc điểm cấu tạo và chức năng của gene LMP1
Latent membrane protein 1 (LMP1) là protein đầu tiên từ EBV có đặc tính gây ung thư được chứng minh bằng thực nghiệm (61) Nó được phát hiện ở hầu hết các bệnh và khối u ác tính liên quan đến EBV, góp phần quan trọng vào sinh bệnh học và kiểu hình bệnh
LMP1 là một protein màng nguyên phân gồm 386 amino acid và có thể được chia thành ba miền: 1) đầu N tế bào chất ngắn (amino acid 1 đến 23); 2) sáu màng xoắn alpha có tính chất kỵ nước (amino acid 24 đến 186); và 3) đuôi C tế bào chất dài (amino acid
187 đến 386), với vùng này có hoạt động báo hiệu LMP1 cao nhất Do đó, đuôi C tế bào chất dài có hai miền chức năng riêng biệt: vùng kích hoạt đầu cuối C1 và C2 (CTAR1/ 2) (62, 63)
Hình 1.12 Sơ đồ biểu diễn sự tương tác của các phân tử và đường dẫn tín hiệu của gene LMP1 (64)
Chú thích: LMP1 có một đầu N tế bào chất ngắn, sáu đoạn xuyên màng tạo ra sự kết tụ và oligome hóa ở màng plasma, đuôi C tế bào chất dài chứa hai miền chức năng riêng biệt là CTAR1 (aa 194-232) và CTAR2 (aa 351-386) CTAR1 rất cần thiết cho quá trình bất tử tế bào B qua trung gian EBV, nó liên kết TRAF1, TRAF2, TRAF3 và TRAF5 thông qua mô-đun P204xQ206xxD209 và kích hoạt các đường dẫn tín hiệu NF-κB và p38 CTAR2 hỗ trợ sự tăng trưởng kéo dài của các tế bào B bất tử và nhận TradD thông qua mô-đun YYD386 để kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng, chẳng hạn như NFκB, JNK và p38 Ngoài ra, cả hai miền ở đuôi C của LMP1 cũng làm trung gian cho việc kích hoạt đường dẫn JAK/STAT Các miền xuyên màng của LMP1 chịu trách nhiệm kích hoạt các tiểu GTPase CDC42 dẫn đến thay đổi tế bào học (64)
Gene LMP1 cho thấy tiềm năng nghiên cứu cao của nó trong ung thư vòm họng và EBV thông qua việc phá hủy các con đường truyền tín hiệu tế bào dẫn đến sự tăng sinh tế bào đích và ức chế, lật đổ đồng thời các chương trình chết của tế bào (apoptosis ) Mặt khác, ngoài việc biến đổi và bất tử tế bào LMP1 còn có nhiều vai trò quan trọng khác Chẳng hạn, LMP1 cảm ứng cytokine và chemokine, điều chỉnh miễn dịch, thay đổi hoàn toàn các kiểu biểu hiện gene và microRNA để điều chỉnh sự hình thành khối u, tiếp xúc với tế bào, di chuyển tế bào và thúc đẩy sự phát triển của tế bào khối u LMP1 biểu hiện trên bề mặt tế bào, ở đây nó tập hợp tạo thành một thụ thể, bằng cách hoạt động như một thụ thể kích hoạt cấu thành, LMP1 nhận các phân tử tín hiệu tế bào liên quan đến thụ thể yếu tố hoại tử khối u như TRAF và TradD để mô phỏng các tín hiệu của thụ thể CD40 bị nhiễm trùng, điều này cho phép LMP1 gây ảnh hưởng đến tế bào thông qua tương tác với các phân tử tế bào khác nhau liên quan đến mỗi tầng tín hiệu nội bào LMP1 cũng kích hoạt các protein kinase hoạt hóa NF-κB, mitogen (MAPK), phosphatidylinositol 3- kinase (PI3-K), IRF7 và STAT (65) Khái quát lại toàn bộ các vấn đề trên, sự tham gia của LMP1 trong cơ chế bệnh sinh của UTVH (66, 67), bao gồm các yếu tố sau: 1) ức chế apoptosis trong các tế bào bị nhiễm bằng cách điều hòa các gene Bcl-2, Mcl-1, Bfl-1, A20 và cIAPs (68-72); 2) điều biến hình thái và hoạt động của các tế bào biểu mô (73); 3) điều chỉnh giảm tác dụng của một số chất ức chế di căn (74); 4) thúc đẩy sự hình thành mạch (75); và 5) gây ra sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm và một số các cơ chế khác (75, 76)
Gen LMP1 đã được chứng minh là đa hình, với đa hình tiêu biểu là biến thể xóa 30 cặp bazơ (30-bp del), thường gặp trong sinh thiết ung thư vòm họng trên (UTVH) Biến thể này xóa 30 cặp bazơ gần cuối vùng đuôi C tế bào chất, gần với miền CTAR2, dẫn đến tăng hoạt động gây ung thư và hình thành kiểu hình tích cực hơn cho khối u liên quan đến EBV Ngoài ra, còn có đột biến điểm khác xảy ra ở vị trí nucleotide từ 129 đến 136 trên gen LMP1.
169423 đến 169428, dẫn đến mất một vị trí hạn chế được gọi là XhoI-loss, xuất hiện ở đầu N tế bào chất, thuộc exon 1 Tính đa hình XhoI-loss thường được tìm thấy trong các mẫu từ bệnh nhân mắc UTVH nhưng không có trong các mẫu từ người khỏe mạnh (19, 79)
Hầu hết các gene LMP1 có nguồn gốc từ sinh thiết UTVH của Trung Quốc được đánh dấu bằng đa hình xóa mười amino acid (aa 346-355) hoặc xóa 30-bp (168,287- 168,256 nt) trong đoạn cuối của đuôi carboxyl và nhiều đột biến cơ sở trong khu vực mã hóa (79-82) 30-bp del được phát hiện trong 100% trong số 48 sinh thiết UTVH ở Đài Loan (82), trong 34 trường hợp của 37 sinh thiết UTVH ở Hồng Kông (83), và 16 trường hợp của 21 sinh thiết UTVH ở Quảng Tây và Thượng Hải (84) Trong một nghiên cứu lớn hơn, 30-bp del đã được tìm thấy trong 86% của 187 trường hợp sinh thiết UTVH ở châu Á (85) Những kết quả này cho thấy sự liên kết giữa UTVH và sự hiện diện của 30- bp del của gene LMP1 Hơn nữa, các nghiên cứu khác tiết lộ rằng 30-bp del có khả năng thành lập biến đổi các nguyên bào sợi của loài gặm nhấm và bất tử các tế bào keratinocyte của con người trong ống nghiệm (77, 86) Ngoài ra, nó còn có khả năng gây miễn dịch yếu hơn cho phép các tế bào khối u thoát khỏi sự giám sát miễn dịch (87) Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2002), đa hình 30-bp del được tìm thấy ở khu vực đặc hữu UTVH là Quảng Châu và khu vực không đặc hữu UTVH là Haerbin cho kết quả tương tự nhau, điều này chứng minh được 30-bp del đại diện cho bệnh UTVH đa hình liên quan đến địa lý thay vì bệnh UTVH đa hình liên quan đến kiểu hình bệnh (88) Đối với việc xóa 30-bp trong đầu cuối carboxyl, mối liên hệ của nó với hoạt động gây ung thư của gene LMP1 vẫn còn gây tranh cãi Việc xóa này dẫn đến mất một đoạn
30 nucleotide, vị trí này có liên quan đến vị trí bộ chuyển đổi 2 (TES2) (codon 352 đến
386) Li và cộng sự (1996) đã báo cáo rằng việc xóa chuỗi 30-bp này của gene LMP1 trong chủng B95-8 gây chuyển đổi gene từ không gây ung thư thành gây ung thư và khi chèn chuỗi 30-bp này vào LMP1 của chủng C1510 sẽ loại bỏ khả năng biến đổi Tuy nhiên, chimerae của gene LMP1 chủng Cao và B95-8 hoặc chimerae của gene LMP1 chủng C15 và B95-8 khi được trao đổi (trong đó gồm các tên miền carboxyl hoặc CTAR- 2) lại không thể chứng minh rằng việc xóa 30-bp chịu trách nhiệm cho sự biến đổi chức năng trong các gene LMP1 (77) Mặc khác, đột biến xóa 30-bp đã được tìm thấy trong bệnh Hodgkin (HD) (89), các trường hợp HD liên quan đến suy giảm miễn dịch ở người (90); Bệnh bạch huyết sau ghép gan của Malaysia và Đan Mạch (PTL) (89); u lympho T /tế bào NK (nature killer) (91); ung thư hạch Burkitt và bệnh không Hodgkin (92) Việc xóa 30-bp cũng đã được chứng minh dẫn đến một kiểu hình tích cực hơn của bệnh lymphoproliferative liên quan đến EBV và u lympho trong in vivo (78)
XhoI-loss là đột biến thay thế xảy ra ở codon 17 làm thay đổi amino acid R (Arg) thành L (Leu) hoặc codon 18 làm thay đổi amino acid G (Gly) thành R (Arg) thuộc exon
1 của LMP1, vị trí này thường nằm ở nucleotide từ 169423 đến 169428 trên trình tự của chủng B98-5, nhưng sự thay đổi phổ biến là ở vị trí 169425 từ G thành T (93) Các đa hình XhoI-loss có mặt trong tất cả các mẫu UTVH từ Alaska và trong một số mẫu UTVH từ người Mỹ da trắng nhưng lại vắng mặt trong mẫu UTVH của người châu Phi và người khỏe mạnh (19, 94) Trong các chủng EBV được nghiên cứu kỹ là CAO và C1510, những biến thể này được thể hiện rõ (79, 80) Có ý kiến cho rằng, những biến thể này ở cả hai chủng CAO và C1510 có liên quan đến việc tăng độc tính khối u ở SCID và chuột nude (95) Ngoài ra, các đa hình XhoI-loss đã được tìm thấy ở các chủng EBV ở HD (96), u lympho tế bào T, u mũi ngoại vi (NPTL) và bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng (IM) (97)
Sự hiện diện của biến thể XhoI-loss chiếm 97-100% trường hợp UTVH ở miền Nam Trung Quốc và Đài Loan (19, 98) Việc mất một vị trí cắt giới hạn XhoI có liên quan đến UTVH Trung Quốc được coi là một dấu ấn khối u cụ thể trong sinh thiết UTVH và mẫu rửa họng (79, 80, 82, 99) Tuy nhiên, cho đến nay, có rất ít thông tin về hiệu quả biến đổi ác tính của biến thể này
Theo nghiên cứu của Hui Shien See và cộng sự (2008), cho thấy rằng các biến thể xóa 30-bp (30-bp deletion) và XhoI-loss được tìm thấy chủ yếu trong ung thư biểu mô không biệt hóa (loại III) so với ung thư biểu mô tế bào vảy keratin hóa (loại I) Điều này cho thấy, các biến thể có thể có một mối liên hệ quan trọng với khả năng hình thành ung thư biểu mô không biệt hóa (loại III) (93).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO
Các công bố được trích xuất để phục vụ định hướng nghiên cứu về mối quan hệ giữa các biến thể đa hình và ung thư biểu mô tế bào vảy đường tiết niệu (UTVH) Dựa trên dữ liệu trích xuất, các phương pháp phù hợp được xác định để định hướng thực hiện nghiên cứu nhằm phân tích sâu hơn về tần suất xuất hiện biến thể đa hình 30-bp deletion và XhoI-loss trên các khu vực và quốc gia có dữ liệu trong các nghiên cứu đã được đề cập.
1.1 Kết quả khảo sát in silico đa hình 30-bp deletion
Sau khi nghiên cứu và sàng lọc các nghiên cứu có liên quan đến biến thể 30- bp del của gen LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng, các kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1 Bảng kết quả trích xuất dữ liệu các công bố khoa học về đa hình 30-bp deletion trên LMP1
STT Tác giả Năm Quốc gia
Mẫu bệnh Mẫu chứng Tần số hiện diện
1 Cheung và cộng sự 1996 Trung Quốc 69/74 Sinh thiết 10/11 Sinh thiết (83)
2 Grunewald và cộng sự 1998 Đa trung tâm 46/64 Sinh thiết 26/45 TW (100)
3 Hahn và cộng sự 2001 Nga 0/7 Sinh thiết 1/6 PBMC (101)
4 Zhang và cộng sự 2002 Trung Quốc 36/43 Sinh thiết 39/53 TW (88)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO
Theo dữ liệu trích xuất được, các công bố đã góp phần định hướng nghiên cứu về mối tương quan giữa biến thể đa hình với UTVH Trên cơ sở đó, các nhà nghiên cứu đề xuất các phương pháp phù hợp nhằm giúp thực hiện nghiên cứu hiệu quả hơn Đồng thời, số liệu về tần suất xuất hiện của biến thể xóa đoạn 30 bp và mất XhoI trên các khu vực và quốc gia được thống kê chi tiết, cung cấp thông tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo.
1.1 Kết quả khảo sát in silico đa hình 30-bp deletion
Sau khi tiến hành tìm kiếm và sàng lọc các nghiên cứu có liên quan đến biến thể 30- bp del của gene LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng, các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày qua bảng bên dưới (bảng 3.1)
Bảng 3.1 Bảng kết quả trích xuất dữ liệu các công bố khoa học về đa hình 30-bp deletion trên LMP1
STT Tác giả Năm Quốc gia
Mẫu bệnh Mẫu chứng Tần số hiện diện
1 Cheung và cộng sự 1996 Trung Quốc 69/74 Sinh thiết 10/11 Sinh thiết (83)
2 Grunewald và cộng sự 1998 Đa trung tâm 46/64 Sinh thiết 26/45 TW (100)
3 Hahn và cộng sự 2001 Nga 0/7 Sinh thiết 1/6 PBMC (101)
4 Zhang và cộng sự 2002 Trung Quốc 36/43 Sinh thiết 39/53 TW (88)
5 Tan và cộng sự 2003 Malaysia 10/49 Sinh thiết 0/7 Sinh thiết (99)
6 Dardari và cộng sự 2006 Morocco 51/61 Sinh thiết 6/17 PBMC (102)
7 Tiwawech và cộng sự 2008 Thái Lan 44/75 PBP 16/44 PBMC (103)
8 See và cộng sự 2008 Malaysia 19/34 Sinh thiết 0/8 Sinh thiết (93)
9 Li và cộng sự 2009 Trung Quốc 43/50 Sinh thiết 33/52 PBMC
10 Banko và cộng sự 2012 Serbia 1/16 Sinh thiết 10/30 PBMC
11 Gurtsevitch và cộng sự 2013 Nga 3/21 Sinh thiết 7/14 PBMC
12 Senyuta và cộng sự 2014 Nga 4/22 Sinh thiết 7/14 PBMC (106)
Chú thích: PBP – tế bào đầu dòng máu ngoại vi, TW – mẫu rửa họng, PBMC – tế bào đơn nhân máu ngoại vi, TLTK – tài liệu tham khảo
Mô sinh thiết của UTVH được sử dụng ở 91,67% (11/12) trong các nghiên cứu trên, nghiên cứu còn lại (Tiwawech và cộng sự, 2008) sử dụng mẫu tế bào máu chiếm 8,33%
Do đó, xét về mẫu bệnh sử dụng trong nghiên cứu về đa hình 30-bp del trên gene LMP1, mẫu mô sinh thiết được sử dụng nhiều nhất Điều này có thể được giải thích là do mẫu mô sinh thiết lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán chắc chắn là bị UTVH và cho kết quả có độ chính xác cao trong nghiên cứu Vậy nên, mẫu sinh thiết được chọn để thực hiện phân tích thực nghiệm trong nghiên cứu này
Các mẫu chứng lại được sử dụng đa dạng về loại hơn: 3/12 (25%) nghiên cứu sử dụng mô sinh thiết (83, 99, 93); 7/12 (58,33%) nghiên cứu sử dụng mẫu PBMC ( 77,
101, 102, 103, 104, 105, 106) và 2/12 (16,67%) nghiên cứu còn lại sử dụng mẫu rửa họng (mẫu dịch phết) (88, 100) Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, mẫu dịch phết từ những người không bị UTVH được sử dụng Lý do là do mẫu sinh thiết (mẫu xâm lấn) khó có thể lấy được ở người lành, mẫu dịch phết dễ lấy hơn vì nó là mẫu không xâm lấn và không gây tổn thương cho các tình nguyên viên, cũng như thao tác thu nhận mẫu dễ dàng
Do đó, trong nghiên cứu này, mẫu bệnh là mẫu mô sinh thiết và mẫu lành là mẫu dịch phết được sử dụng để thực hiện cho nghiên cứu thực nghiệm sau này
Mặt khác, qua kết quả khảo sát ở nhóm bị UTVH, đa hình 30-bp del có sự phân bố không đồng đều về mặt địa lý 30-bp del xuất hiện nhiều hơn trong mẫu UTVH ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia) và Morocco, nhưng ít hơn ở nước Nga và Serbia (bảng 3.1)
Hơn nữa, sự xóa 30-bp thường được tìm thấy chủ yếu ở hai vị trí chính là vị trí nu
168266 – 168295 (amino acid từ 343-352, mã số truy cập V01555.2) theo nghiên cứu của Kim và cộng sự (2003), Miller và cộng sự (1994), Tang và cộng sự (2008), Henry và cộng sự (2001), Chabay và cộng sự (2004),… và vị trí nu 168256 – 168285 (amino acid từ 346-355, mã số truy cập V01555.2) theo Hu và cộng sự (1991), Cheung và cộng sự (1996), Ayadi và cộng sự (2007), Banko và cộng sự (2012), Senyuta và cộng sự (2014),…
1.2 Kết quả khảo sát in silico đa hình XhoI-loss
Sau khi tiến hành tìm kiếm và sàng lọc các nghiên cứu có liên quan đến biến thể XhoI-loss của gene LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng, các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày qua bảng bên dưới (bảng 3.2)
Bảng 3.2 Bảng kết quả trích xuất dữ liệu các công bố khoa học về đa hình XhoI- loss trên LMP1
STT Tác giả Năm Quốc gia
1 Abdel-Hamid và cộng sự 1992 Đa trung tâm 36/53 Sinh thiết 3/22 Sinh thiết (94)
2 Jeng và cộng sự 1994 Đài Loan 22/25 Sinh thiết 10/25 TW (107)
3 Chang và cộng sự 1995 Đài Loan 48/48 Sinh thiết 2/25 Sinh thiết (108)
4 Khanim và cộng sự 1996 Đa trung tâm 19/28 Sinh thiết 9/32
5 Cheung và cộng sự 1996 Trung
Quốc 5/5 Sinh thiết 11/11 Sinh thiết (83)
6 Tan và cộng sự 2003 Malaysia 25/27 Sinh thiết 0/7 TW (99)
7 See và cộng sự 2008 Malaysia 34/39 Sinh thiết 0/8 Sinh thiết (93)
Chú thích: TW – mẫu rửa họng, PBMC – tế bào đơn nhân máu ngoại vi, TLTK – tài liệu tham khảo
Qua khảo sát từ các công bố khoa học trên, nghiên cứu ghi nhận rằng mô sinh thiết UTVH được sử dụng cho 100% (7/7) ở các nghiên cứu trên Ở mẫu chứng, mô sinh thiết cũng được sử dụng chủ yếu Tuy nhiên như đã giải thích ở phần trên, nghiên cứu này sẽ sử dụng mẫu lành là mẫu dịch phết và mẫu bệnh là mẫu sinh thiết Mặt khác, sự mất vị trí XhoI xuất hiện chủ yếu trên mẫu bệnh UTVH ở Trung Quốc, Đài Loan và Malaysia (bảng 3.2), các vị trí xuất hiện XhoI thường là từ vị trí 169423 – 169428 (trên trình tự B98-5, mã số truy cập V01555.2), thường là sự thay đổi nucleotide sau: G169423C (vị trí codon 18 làm thay đổi aa Gly thành Arg), A169424G (vị trí codon 17 làm thay đổi aa Arg thành Leu), G169425T (vị trí codon 17 làm thay đổi G thành T) Nhưng dạng biến thể được phát hiện cao trong các mẫu UTVH và các công trình nghiên cứu là G169425T (chiếm 6/7, tức 85,71% các nghiên cứu trên) [79]
Các công bố khoa học trên đa phần sử dụng phương pháp PCR và giải trình tự làm công cụ chính để thực nghiệm, cho thấy PCR và giải trình tự là phương pháp tối ưu để tiến hành chạy thực nghiệm mẫu UTVH khảo sát sự hiện diện của 30-bp del và XhoI- loss.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI
2.1 Khảo sát mồi bằng phần mềm IDT
Các thông số vật lý của mồi được khảo sát bằng phần mềm IDT và được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Các thông số vật lý của mồi
Chú thích: Dựa vào phân tích IDT, các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo được đánh giá về : chiều dài mồi (L), phần trăm GC (%GC), nhiệt độ nóng chảy (Tm), mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc (Hairpn dimer), cấu trúc tự bắt cặp (Homo dimer), cấu trúc bắt cặp chéo giữa hai mồi(Hetero dimer)
Cặp mồi L30-F (mồi xuôi) và L30-R (mồi ngược): Chiều dài của mồi xuôi và mồi ngược đều là 21 bp, phù hợp với thông số vật lý của mồi (17 - 28 bp) %GC của cả hai mồi xuôi và ngược lần lượt là 42,9% và 38,1%, thấp hơn khoảng tối ưu (50 – 60%), vì vậy nhiệt độ mồi khi PCR được điều chỉnh phù hợp để tạo điều kiện cho mồi bắt cặp tối ưu nhất Nhiệt độ Tm của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 50,2 o C và 50,8 o C, giá trị này phù hợp với khoảng nhiệt độ tối ưu từ 50 – 65 o C Nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi là 0,6 o C trong khoảng cho phép Không có bất cứ base nào lặp lại hơn 4 lần, ở đầu 3’ cũng có base G hoặc C để có lực liên kết mạnh khi mồi bắt cặp với trình tự đích Các giá trị ΔG của cấu trúc thứ cấp đều nằm trong khoảng tối ưu nhất khi đánh giá thông số vật lý của mồi (∆G đều lớn hơn -9Kcal/mol), mồi đạt yêu cầu
Cặp mồi ET1-F (mồi xuôi) và ET2-R (mồi ngược) được thiết kế phù hợp với thông số vật lý của mồi, với độ dài mồi xuôi là 23 bp và mồi ngược là 21 bp Về thành phần nucleotide, %GC của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là 43,5% và 52,4%, nằm trong khoảng cho phép, đảm bảo độ bám dính và độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR.
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và ngược lần lượt là 53,7 °C và 56,7 °C, phù hợp với khoảng nhiệt độ tối ưu (50-65 °C) Độ chênh lệch nhiệt độ giữa hai mồi (3 °C) nằm trong giới hạn cho phép Không có base nào lặp lại quá 4 lần, 3' có base G hoặc C để tạo liên kết mạnh khi mồi ghép cặp với trình tự đích Các giá trị ΔG của cấu trúc thứ cấp đáp ứng yêu cầu tối ưu (-9Kcal/mol), cho thấy mồi đạt chất lượng tốt.
2.2 Khảo sát mồi bằng phần mềm ANNHYB
Kích thước sản phẩm sau khi khuếch đại được dự đoán và kiểm tra độ nhạy dựa trên việc phân tích sự bắt cặp của mồi và trình tự DNA của chủng B95-8 có mã truy cập là V01555.2 được thu nhận từ ngân hàng gene NCBI
Hình 3.1 Kết quả khảo sát mồi L30-F và L30-R
Chú thích: Màu đỏ là vị trí bắt cặp của mồi xuôi Màu xanh lá là vị trí bắt cặp của mồi ngược
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược L30-F, R lên trên trình tự B95-8, mồi xuôi L30-F có điểm số bắt cặp là 100, mồi ngược L30-R là 100 Mồi xuôi L30-F bắt cặp bổ sung tại vị trí 168163 - 168183 (21 bp) và mồi ngược L30-R tại vị trí 168328 - 168348 (21 bp), dự kiến sản phẩm khuếch đại được là
156 bp (bị đột biến mất 30-bp) hoặc 186 bp (không đột biến)
Hình 3.2 Kết quả khảo sát mồi ET1-F và ET2-R
Chú thích: Màu xanh là vị trí bắt cặp của mồi xuôi Màu vàng là vị trí bắt cặp của mồi ngược
Kết quả Annhyb cho thấy kích thước và vị trí bắt cặp của mồi xuôi (ET1-F) và mồi ngược (ET2-R) lên trên trình tự B95-8, mồi xuôi ET1-F có điểm số bắt cặp là 100, mồi ngược ET2-R là 100 Mồi xuôi ET1-F bắt cặp bổ sung tại vị trí 169209 - 169231 (23 bp) và mồi ngược ET2-R tại vị trí 169454 - 169474 (21 bp), dự kiến sản phẩm khuếch đại được là 266 bp
2.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm BLAST
Nhằm kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi L30-F, R và ET1, 2-F, R, phần mềm BLAST được sử dụng để so sánh độ tương đồng của trình tự cặp mồi với các trình tự DNA trong CSDL
Hình 3.3 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi L30-F, R với CSDL
Hình 3.4 Kết quả bắt cặp của trình tự mồi ET1, 2-F, R với CSDL
Kết quả BLAST trong hình cho thấy, hai khối màu hai bên đại diện cho trình tự mồi Những khối màu trái và phải này nối với nhau bởi một đường kẻ mỏng màu đen cho biết rằng mồi xuôi và mồi ngược cùng xuất hiện trên một trình tự lưu trữ trong CSDL GenBank của NCBI Nói cách khác, cặp mồi L30-F, R và ET1, 2-F, R khi PCR có thể bám trên trình tự đó (ở hai mạch khác nhau) và tạo ra sản phẩm PCR (hình 3.3, hình 3.4)
Hình 3.5.Hình sắp gióng cột trình tự mồi L30-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất.
Trong kết quả sắp gióng cột hình 3.5 trên cho thấy, về độ tương đồng (Identities): ở range 1, chỉ số 21/21 (100%) nghĩa là mồi xuôi dài 21 nucleotide và khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBank, có thể hiểu là mồi sẽ bám được trên trình tự DNA mạch đôi này trong phản ứng PCR; tương tự ở range 2, chỉ số 21/21 (100%) là mồi xuôi khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBank Ngoài ra, gaps không xuất hiện (0%) khi các mồi sắp gióng cột trên trình tự mẫu
Hình 3.6 Hình sắp gióng cột trình tự mồi ET1, 2-F, R với trình tự trong CSDL có độ tương đồng cao nhất
Tương tự, trong kết quả sắp gióng cột ở hình 3.6 trên, về độ tương đồng (Identities): ở range 1, chỉ số 23/23 (100%) nghĩa là mồi xuôi dài 21 nucleotide và khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBank, có thể hiểu là mồi sẽ bám được trên trình tự DNA mạch đôi này trong phản ứng PCR; tương tự ở range 2, chỉ số 21/21 (100%) là mồi xuôi khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBank Ngoài ra, gaps không xuất hiện (0%) khi các mồi sắp gióng cột trên trình tự mẫu
Từ các kết quả khảo sát về thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ tương đồng của các cặp mồi trên CSDL, cặp mồi L30-F, R và ET1, 2-F, R được xác định phù hợp để sử dụng cho thực nghiệm của nghiên cứu.
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
3.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA
20 mẫu mô sinh thiết UTVH và 20 mẫu lành dịch phết được tách chiết bằng phương pháp Phenol Chroloform (pH = 8) và lưu trữ trong môi trường TE 1X ở nhiệt độ -20 o C Sau đó, các mẫu DNA này được đo OD ở bước sóng 260nm, 280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết Tỉ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 – 2 cho biết kết quả DNA có độ tinh sạch khá cao, nếu nằm ngoài khoảng này, DNA tách chiết có khả năng đã bị nhiễm protein hoặc RNA Do đó, kết quả tách chiết của 20 mẫu bệnh và 20 mẫu lành đều cho kết quả khả quan, nằm trong khoảng cho phép có tỉ số A268/A280 từ 1,8 – 2 (được trình bày ở phụ lục 2, phụ lục 3) Điều này cho thấy, các mẫu DNA có độ tinh sạch khá cao và có thể sử dụng trong thực nghiệm nghiên cứu
3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR của hai cặp mồi được mang đi điện di trên gel agarose 1,5 %, ở 30 phút, điện thế 100 V trong môi trường TBE 1X
3.2.1 Kết quả điện di mẫu bệnh và lành với cặp mồi L30-F, R
Kết quả điện di cho thấy có băng sáng rõ ở vị trí có kích thước khoảng 156 bp hoặc
186 bp khi PCR ở nhiệt độ 60 o C (hình 3.7) Như vậy, các sản phẩm PCR này có thể là đoạn gene đích trên LMP1 tương ứng với đoạn sản phẩm mà cặp mồi L30-F, R đã khuếch đại được
Hình 3.7.Kết quả điện di mẫu bệnh của cặp mồi L30-F, R.
Chú thích: N1, 2, 3,… - mẫu bệnh; N – mẫu chứng âm; T – thang
Ngoài ra, khi khuếch đại trình tự gene các mẫu với cặp mồi L30-F, R, trong 20 mẫu sinh thiết UTVH, có 18/20 mẫu dương tính với gene LMP1 Trong đó, có 11/18 mẫu
(chiếm 61,11%) khi PCR với mồi L30-F, R cho băng kích thước khoảng 156 bp, 7/18 mẫu (chiếm 38,89%) cho băng kích thước khoảng 186 bp (phụ lục 4)
Mặt khác, khi cho 20 mẫu lành là mẫu dịch phết phản ứng PCR với cặp mồi L30-F,
R, kết quả điện di đều không cho băng sản phẩm PCR của các mẫu lành này (hình 3.8) Mặc dù trước đó ở mẫu bệnh, các cặp mồi này đã khuếch đại thành công và tạo ra sản phẩm PCR với kích thước như dự kiến, nhưng ở mẫu lành, sự khuếch đại này không thành công Điều này cho thấy, 20 mẫu lành có thể không có sự tồn tại của gene LMP1
Hình 3.8 Kết quả điện di mẫu lành của cặp mồi L30-F, R
Chú thích: L1, 2, 3,… - mẫu lành; N – mẫu chứng âm; T – thang
3.2.2 Kết quả điện di mẫu bệnh và lành với cặp mồi ET1, 2-F, R
Kết quả điện di cho thấy có 18/20 mẫu bệnh cho băng sáng rõ ở vị trí có kích thước khoảng 266 bp khi phản ứng PCR với cặp mồi ET1, 2-F, R ở nhiệt độ 62 o C (hình 3.9),
18 mẫu có băng này cũng là 18 mẫu bệnh cho băng điện di sản phẩm PCR với cặp mồi L30-F, R trước đó Do đó, có thể kết luận 18 mẫu này là các mẫu dương tính với gene
LMP1 Như vậy, các sản phẩm PCR này có thể là đoạn gene đích trên LMP1 tương ứng với đoạn sản phẩm mà cặp mồi ET1, 2-F, R đã khuếch đại được
Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu bệnh của cặp mồi ET1, 2-F, R
Chú thích: N1, 2, 3,… - mẫu bệnh; N – mẫu chứng âm; T – thang
Tương tự với khi PCR với cặp mồi L30-F, R, 20 mẫu lành là mẫu dịch phết được phản ứng PCR với cặp mồi ET1, 2-F, R đều không cho băng điện di sản phẩm PCR Điều này cho thấy, 20 mẫu lành không có gene LMP1 (hình 3.10)
Hình 3.10 Kết quả điện di mẫu lành của cặp mồi ET1, 2-F, R
Chú thích: L1, 2, 3,… - mẫu lành; N – mẫu chứng âm; T – thang
3.3 Kết quả giải trình tự
3.3.1 Đối với đa hình 30-bp deletion
Trong 11 mẫu có sản phẩm PCR với cặp mồi L30-F, R cho băng điện di có kích thước khoảng 156 bp, 5 mẫu được lấy đại diện để GTT bao gồm các mẫu: N1, N3, N8, N9 và N10 Đồng thời, trong 7 mẫu có sản phẩm PCR với cặp mồi L30-F, R cho băng điện di có kích thước khoảng 186 bp, 5 mẫu cũng sẽ được lấy đại diện để GTT bao gồm các mẫu: N2, N4, N11, N12 và N13 Các mẫu này sẽ được mang đi GTT 2 chiều ở công ty Nam Khoa Các kết quả GTT sẽ được sử dụng để phát hiện và kiểm tra chính xác sự hiện diện của đột biến đa hình 30-bp del trên gene LMP1 của các mẫu UTVH
Sau khi có kết quả GTT, các trình tự khuếch đại gene LMP1 này được so sánh và sắp gióng cột trên trình tự LMP1 (mạch mã gốc) của chủng B95-8 (mã số truy cập là
Phân tích trình tự cho thấy sự xuất hiện của đột biến mất đoạn 30 cặp bazơ (del) ở vị trí 168285 - 168256 (amino acid 346-355) ở các mẫu N1, 3, 8, 9 và 10 Các mẫu không bị mất đoạn 30-bp (N2, 4, 11, 12 và 13) có biến thể tại vị trí amino acid 351 và 352 so với chủng tham chiếu B95-8 (V01555.2) Hai vị trí mất đoạn 30-bp được chú ý là 168295-168266 (amino acid 343-352) và 168285-168256 (amino acid 346-355), và các mẫu được phân tích trên cả hai vị trí này.
1ÍĨR7QS 1fia?as 1ỐRÍÍĨÍĨ
Hình 3.11 Trình tự khuếch đại LMP1 trên các mẫu sinh thiết UTVH đại diện
Chú thích: (A) - Trình tự khuếch đại LMP1 trên mẫu N4 tại vị trí nu 168295 - 168266; (B) - Trình tự khuếch đại LMP1 trên mẫu N12 tại vị trí nu 168285 - 168256, bao gồm hai đột biến thay thế ở 2 vị trí được đóng khung vuông; (C) - Trình tự khuếch đại LMP1 trên mẫu N3 tại vị trí đa hình 30-bp del, cụ thể ở vị trí 168285-168256 nucleotide; (D) - Hình sắp gióng cột các trình tự khuếch đại gene LMP1 với trình tự CDS và mRNA của LMP1 (chủng B95-8, mã số truy cập: 01555.2) và các đoạn đa hình 30-bp del Chú ý: vị trí 30-bp del từ 168285-168256 là vị trí đa hình 30-bp del của nghiên cứu này; vị trí 30- bp del từ 168295-168266 là vị trí đa hình 30-bp del của các nghiên cứu trước đó Các vị trí có đột biến thay thế được đóng khung vuông đen nhỏ quanh kí tự
Bảng 3.4 So sánh giữa các trình tự khuếch đại với cặp mồi L30-F, R và trình tự nguyên mẫu chủng B95-8 (V01555.2)
His Ser His Asp Ser
Gly His Gly Gly Gly
Chú thích: Bốn hàng trên cùng tương ứng với nucleotide, vị trí amino acid, nucleotide và amino acid của gene LMP1 trên nguyên mẫu B95-8 (từ 168297 đến 168256); ký tự trong ô (A, T, G, C) là ký hiệu nucleotide khác với trình tự nguyên mẫu B95-8 Ngược lại, dấu chấm (.) biểu thị nucleotide tương đồng so với trình tự tham chiếu Ký tự d (d) biểu thị các nucleotide bị xóa Các ký tự dưới đây chỉ ra amino acid được viết trong mã so sánh với tham chiếu trình tự: dấu hoa thị (*) biểu thị amino acid không thay đổi; dấu cộng (+) biểu thị sự thay đổi im lặng amino acid; và dấu trừ (-) biểu thị amino acid đã bị xóa, so với nguyên mẫu B95-8 trình tự amino acid (từ codon 342 đến codon 355) Các amino acid có sự thay đổi được trực tiếp ghi rõ tên
Dựa trên các kết quả giải trình tự của 10 mẫu đại diện cho thấy phương pháp PCR với cặp mồi L30-F, R đã khuếch đại thành công được đoạn gene mục tiêu trên LMP1 Qua đó, các kết quả cũng chứng minh được sự chính xác của kích thước băng sản phẩm PCR với cặp mồi này, cụ thể, sản phẩm PCR có kích thước băng 156 bp đúng là của mẫu có hiện diện đột biến 30-bp deletion, cũng theo đó, sản phẩm PCR băng 186 bp cũng chính là băng sản phẩm của mẫu không mang đột biến Qua đó, nghiên cứu có thể chứng minh được rằng, đa hình 30-bp deletion có thể được phát hiện thông qua phương pháp PCR với cặp mồi L30-F, R Vậy nên, các kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu bệnh và mẫu lành là hoàn toàn đáng tin và có thể sử dụng để nghiên cứu phát hiện đa hình 30- bp del
Bảng 3.5 Tổng hợp số liệu nghiên cứu trên đa hình 30-bp deletion
Chú thích: (+) – dương tính, (-) – âm tính
Ngoài ra, thông qua các kết quả GTT, nghiên cứu đã xác định được vị trí đoạn đột biến 30-bp del trên trình tự khuếch đại của các mẫu sinh thiết UTVH Sự xóa 30-bp thường xảy ra chủ yếu ở hai vị trí chính là vị trí từ nu 168295 - 168266 (amino acid từ 343-352) và vị trí từ nu 168285 – 168256 (amino acid từ 346-355) so trên chủng B95-8 có mã số truy cập V01555.2 Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự (2003), Miller và cộng sự (1994), Tang và cộng sự (2008), Henry và cộng sự (2001), Chabay và cộng sự (2004),… cùng một số nghiên cứu khác, đa hình 30-bp del được tìm thấy tại vị trí nu 168295-168266 (aa 343-352) Tuy nhiên trong nghiên cứu này, đa hình 30-bp del được tìm thấy tại vị trí nu 168285-168256 (aa 346-355), điều này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Hu và cộng sự (1991), Cheung và cộng sự (1996), Ayadi và cộng sự (2007), Banko và cộng sự (2012), Senyuta và cộng sự (2014),… (hình 3.11, bảng 3.4) Hơn nữa, dựa trên kết quả điện di, đột biến 30-bp del chiếm tỷ lệ khá cao trong các mẫu sinh thiết UTVH (hiện diện 11/18 (chiếm 61,11%) trên tổng số mẫu sinh thiết UTVH), không mang đột biến 30-bp del là 7/18 mẫu (chiếm 38,88%) trên tổng số mẫu sinh thiết UTVH (bảng 3.5) Điều này cho thấy, đa hình 30-bp del chiếm ưu thế trong sinh thiết của UTVH và hiện diện khá phổ biến trong mẫu sinh thiết UTVH tại Việt Nam (tần số mẫu bệnh hiện diện 30-bp del gấp 1,57 lần so với mẫu bệnh không hiện diện đa hình này) Hơn nữa, đa hình này đã được nghiên cứu và xác định rằng việc xóa 30-bp xảy ra ở gần cuối đuôi C tế bào chất, gần với chức năng miền CTAR2 của gene LMP1 Trong khi đó, CTAR2 có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ kéo dài quá trình tăng trưởng của các tế bào B bất tử và kích hoạt các con đường tín hiệu (như NF-κB, JNK và p38), kích hoạt đường dẫn JAK/STAT trong gene LMP1 (64) Do đó, 30-bp deletion xảy ra sẽ gây ảnh hưởng tới chức năng và hoạt động của CTAR2, từ đó ảnh hưởng lên hoạt động gene LMP1, dẫn đến sự tăng hoạt động gây ung thư của các tế bào bị nhiễm bệnh và hình thành kiểu hình tích cực hơn cho các khối u liên quan đến EBV (77, 78) Vì vậy, từ những kết quả trên, có thể nhận định rằng, 30-bp del có thể là một dấu ấn khối u tiềm năng của gene LMP1 trên mẫu sinh thiết u UTVH tại Việt Nam Mặt khác, sự thay đổi amino acid ở hai vị trí 351 (do biến thể G168270C) và 352 (do biến thể A168266G) cho thấy một mô hình kiểu gene khác của đoạn bị mất 30-bp này (bảng 3.4, bảng 3.6)
Bảng 3.6 So sánh trình tự amino acid của các mẫu trong nghiên cứu và trình tự amino acid nguyên mẫu chủng B95-8 (V01555.2)
Chú thích: ký tự chữ cái đại diện cho amino acid; dấu hoa thị (*) biểu thị amino acid không thay đổi; dấu cộng (+) biểu thị sự thay đổi im lặng amino acid; và dấu trừ (-) biểu thị amino acid đã bị xóa, so với nguyên mẫu B95-8trình tự amino acid (từ codon 342 đến codon 355)
