Nghiên cứu xác định đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose của một số chủng vi nấm chịu axit mạnh phân lập tại việt nam

Trang 1

TRUONG DAI HQC MO HA NOI

KHOA CONG NGHE SINH HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

DE TAI:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH ENZYME THỦY PHÂN

LIGNOCELLULOSE CỦA MỘT SÓ CHỦNG VI NÁM CHỊU AXIT MẠNH

PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Vũ Nguyên Thành

Trang 2

MỤC LỤC

1.1.2 Khả năng sinh enzyme của vi nắm chịu axit mạnh sua 13

1.2 Lignocellulose va ede enzyme phan hiy lignocellulose

1.2.1, Cellulose và enzyme thủy phân cellulose

1.2.2 Hemicellulose và enzyme thủy phân hemicellulose 19

2 PHẢN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu ore 5 Song 21 2.2 Hóa chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất 2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

2.3 Môi trường nghiên cứu

2.3.1 Môi trường PDA bà

2.3.2 Môi trường pH thấp (pH 1.0)

2.3.3 Môi trường nuôi và tách chiết enzyme chúng mốc pH thấp

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào

2.4.2 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE

2.4.3 Phương pháp điện di Zymogram 25

2.4.4 Nuôi cây tách chiết enzyme

2.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính phân giai cellulose

2.4.6 Xác định hoạt độ enzyme bằng phương pháp DNS 27

2.4.7 Xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau M009000015000129014601400080n9n1endirsoeeiti

2.4.8 Đánh giá độ bền nhiệt của enzyme oh:

2.4.9 Phương pháp xác định protein (Lowry) 3

3 PHAN III: KET QUA NGHIEN CUU 5

3.1 Quan sát và chụp ảnh hình thái khuân lạc, tế bào

3.2 Đặc tính enzyme của các chủng vi nắm

Trang 3

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học

3.2.1 Phan tích hàm lượng protein của các chúng vi nam -38 3.2.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme của các chủng vi nắm 39 3.2.3 Khảo sát kha năng sinh tổng hợp enzyme phan giải lignocellulose của các chủng vỉ

nắm _

3.2.4 Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocellulose nS

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme thủy phân lignocellulose của các chủng

vi nắm eT

3.3.1 Kiểm tra khả năng hoạt động của enzyme ở các pH khác nhau „48

3.3.2 Kiểm tra khả năng bên nhiệt của các enzyme bằng phương pháp DNS 50

3.3.3 Kiểm tra khả năng bên nhiệt của các enzyme bằng phương pháp điện di lB

Trang 4

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng vì nắm chịu axit mạnh đã được công bố ø12 Bảng 1.2 Khả năng sinh enzyme của một số chủng vi nắm chịu axit 3

nghiệp khác nhau

Trang 5

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các môi trường có tính axit Hình I.2

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bảo trên môi trường PDA (trái) và môi „37 „40 trường Malt 2Bx pH I.0 (phải) của một số chủng vi nấm, thanh chèn 10 pm:

Hình 3.2 Vòng phân giải cơ chất CMC, tỉnh bột, skim milk

Trang 7

MỞ ĐÀU

Vi nam phát triển trong môi trường khắc nghiệt được quan tâm đặc biệt

về mặt công nghệ vì có thê cung cap nguồn enzyme với đặc tính khác biệt, đáp

ứng các yêu cầu công nghệ đặc thù Enzyme hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt về nhiệt độ, pH cũng có thể được ứng dụng trong sản xuất nhằm hạn chế

nguy cơ tạp nhiễm

Là một nước nông nghiệp, hàng năm công nghiệp chế biến ở Việt Nam

tạo ra một nguồn phế phụ phẩm rất lớn và nếu không được sử dụng hợp lý sẽ

dẫn tới các lề ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, phần lớn nguồn nguyên liệu

này có thẻ được ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bằng công nghệ vi

sinh, enzyme

Nghiên cứu này đề cập tới enzyme sinh ra từ các vi nắm có khả năng

phát triển trong điều kiện môi trường axit mạnh (1% H;SO¿) nhằm tìm kiếm các enzyme có khả năng hoạt động ở pH tháp vốn thường gặp trong quá trình xử lý nguyên liệu bằng axit Ngoài ra, enzyme hoạt động ở pH thấp cũng có thể

được ứng dụng trong chăn nuôi do khả năng chống chịu điều kiện axit của dịch

dạ dày động vật

Nhằm mục đích nghiên cứu xác định đặc tính hệ enzyme thủy phân

lignocellulose được tổng hợp từ các chủng vi nấm chịu axit mạnh trong tự

nhiên, nên tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Wghiên cứu xác định đặc tính

enayme thủy phân lignocellulose của một số chủng vi nấm chịu axit mạnh

phân lập tại Việt Nam”

Đề tài nghiên cứu bao gồm các mục tiêu sau:

- Chon được chủng vi nắm chịu axit mạnh có khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose

~_ Xác định hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose

~_ Xác định hoạt tính enzyme ở các điều kiện pH, nhiệt độ khác nhau

Trang 8

1 PHAN I: TONG QUAN TÀI LIEU

1.1 Vi nắm chịu axit và khả năng sinh enzyme của vỉ nấm chịu axit

Các sinh vật nhân chuẩn có khả năng thích nghỉ cao, có mặt trong nhiều

dạng môi trường khắc nghiệt khác nhau và môi trường axit không phải là ngoại lệ Môi trường axit mạnh thường đi kèm với với các thái cực khắc nghiệt khác

của núi lửa và một liên quan đến việc khai thác than và kim loại [1] Trong trường hợp đầu tiên, quá trình oxy hóa sinh học nguyên tố lưu huỳnh từ hoạt

động núi lửa tạo ra axit sulfuric bởi vi sinh vật [14] (Hình 1.1a, b) Trong trường

hợp thứ hai, hoạt động khai thác than và khai thác kim loại làm cho khoáng

chất chứa lưu huỳnh, dưới sự kết hợp của nước và oxy, tạo điều kiện cho sự tấn

công của vi sinh vật [15] Những địa điểm có chứa khoáng chất pyrit được quan tâm đặc biệt trong bối cảnh này (Hình 1.1 c, đ) Ở môi trường pH thấp, chất oxy hóa chính của khoáng chat này là sắt

EeS; + 6 Fe" — 7 Fe?! + S;O;? + 6 H’ Fe?' + 0,25 O; + HạO” — Fe* + 1,5 1:0

Cả hai môi trường sống khác nhau rất nhiều về các đặc điểm hóa lý và

hệ sinh thái vỉ sinh vật của chúng

Cac sinh vat ua axit, dac biét 1a Acidithiobacillus ferrooxidans va

Leptospirillum spp., đây nhanh tốc độ oxi hóa pyrit đồng thời pH thấp tạo điều kiện cho kim loại hòa tan, vì thế nước có tính axit có xu hướng có nồng độ kim

loại nặng cao Bất chấp những điều kiện môi trường khắc nghiệt này, hầu hết

các môi trường axit cho thấy mức độ đa dạng sinh vật nhân chuẩn cao không

ngờ, chăng hạn nhu Chlamydomonas, Chlorella và Dunaliella thường được tìm

thấy trong axit môi trường, cũng như sinh vật nguyên sinh quang hợp Euglena

mutabilis [2][3]

Trang 9

Hinh 1.1 Các môi trường có tính axit

{a)Khu vực địa nhiệt có tính axit Seltun, SW Ieeland, (b)Lưu huỳnh nguyên tố hình thành từ khí thoát ra từ

núi lửa Souftiere HIls trên Montserrat, Tay An, (e)Ruông bậc thang hình thành bởi kết tủa sắt ở Río Tinto, Tây Ban Nha, (d)Rio Tinto, Tay Ban Nha

Dic diém nhém vi nim chju axit

Dựa vào đặc tính thích nghỉ của các chủng nắm trên các môi trường sống

khác nhau mà các nhà khoa học đã chọn lọc và đưa ra những tên gọi tương ứng

với từng nhóm, đó là nắm chịu axit và nắm ưa axit Không có sự phân chia rõ

ràng giữa nhóm ưa axit và nhóm chịu axit, nhưng người ta thường cho rằng nắm ưa axit là những loại nắm có thể phát triển ở pH I và tăng trưởng tối ưu ở

pH3 (hoặc thấp hơn) còn các loài chịu axit là những loài có thể phát triển trong,

môi trường axit nhưng tối ưu ở pH 3 trở lên [4] Hầu hết các loại nắm sống

trong môi trường có axit nên được coi là chịu axit hơn là ưa axit nghiêm ngặt

vì chúng cũng có thể phát triển dưới pH trung tính hoặc thậm chí kiềm [5] Nhìn chung vi nắm có thê tổn tại ở dải pH rộng (pH từ 1.0-11.0) và đã được tìm thấy ở những môi trường axit như suối núi lửa, đòng thải mỏ axit hoặc nước thải công nghiệp có tính axit [5] Nhiều loài trong số chúng chủ yếu chịu

axit, nhưng những loài thực sự ưa axit cũng đã được tìm thấy Từ một dòng

Trang 10

Geotrichum sp va Aspergillus sp 6 mo déng Sar Cheshmeh cũng đã được báo

cáo Thêm vào đó, gần 100 chủng nắm men đã được phan lap tai long chao Rio

Tinto, một trong những hệ sinh thái axit lớn nhất được báo cáo cho đến nay,

Trong đó có 52% chủng có thể phát triển trên môi trường pH 2.3, chúng thuộc

Holtermannia và Mrakia) va 2 chỉ thuộc lép Ascomycetes (Candida và Williopsis) Ngoài ra hơn 100 chủng thuộc lớp Hyphomycetes đã được phân

lập từ hệ sinh thái Tinto và phần lớn chúng đặc trưng về mặt hình thái Khoảng 50% chủng nắm sợi được phân lập có thẻ phát triển trong điều kiện cực kì axit

Trong số này có đến 19% chủng là thuộc chỉ Penieilfiưm và phần còn lại được

định danh thuộc chỉ Seyalidiwm, Bahusakala, Phoma và Heteroconium hoặc

nắm sợi không sinh bào tử sẫm màu (có thể là dematiaceous hyphomycetes)

Ngoài ra một số được phân lập đã được định danh là những chủng thuộc lớp

Ascomycete (Lecythophora, Acremonium) va Zygomycete (Mortierella) [8]

Trang 11

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Báng 1.1 Một số chủng vi nấm chịu axit mạnh đã được công bố

|sTr Lo: pH Nguồn gốc phân lập

1 | Aeidiella bohemiea 2.2-2.5 | Mỏ đá cao lanh với lớp than nâu giàu lưu huỳnh va axit humic

2 | Acidiella uranophila |<3 Nước có tính axit cao tir mé uranium, Nước sông và trầm tích có tính axit cao

3 | Acidomyces acidophilus |1.3-2.0 | Dim ly than bùn, đầm lay mỏ khoáng

san, dim lay ven biển, và những nơi có tính axit cao 4 | Acidomyces 2.0-2.5 | Khu vue dia nhigt Krýsúvik, Cộng hòa acidothermus Séc 5_| Acidea extrema <3 Đất có tính axit cao

6 | Acidothrix acidophila |1.5-2.5 _ | Mô cao lãnh với lớp than nâu giàu lưu huỳnh lộ ra ngoài Cộng Hòa Séc

7 | Soosiella minima 10-25 | Dat cé tính axit cao, mỏ cao lãnh/đất sét có lớp than nâu giàu lưu huỳnh lộ ra ngoài

8 | Purpureocillium 2.0-2.5 | Nude c6 tinh axit cao tir song Rio Tinto lilacinum

Nắm chịu axit có hai ưu điểm chính đáng được quan tâm bởi giá trị mà chúng đem lại cho các ứng dụng thực tế Đầu tiên, nhóm nắm này có khả nang hoạt động trong môi trường axit và tương tự là các enzyme của chúng Ưu điểm này đem lại những lợi ích trong ứng dụng công nghiệp Đầu tiên phải kể đến

ứng dụng trong chăn nuôi Việc bổ sung các enzyme có khả năng thủy phân ignoeellulose hoạt động trong môi trường axit dạ dày của động vật làm tăng

giá trị dinh dưỡng đối với thức ăn [9] Tiếp đến là một ứng dụng nữa trong sản

xuất ethanol từ vật liệu lignocellulose Các vật liệu này ban đầu phải trải qua

bước tiền xử lý bằng axit trước khi bước vào giai đoạn thủy phân, việc sử dụng

Trang 12

các loại enyme có khả năng hoạt động trong điều kiện axit thấp sẽ làm giảm

thiểu chỉ phí trung hòa

Ưu điểm thứ hai của nắm chịu axit bởi nó có khả năng tồn tại và phát

triển trong điều kiện axit mạnh làm giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm Vấn đề thường gặp trong nhiều quy trình công nghệ sinh học như lên men khối hoặc chuyển hóa chất thải thành protein đơn bào là sự xâm nhiễm của các vỉ sinh vật ngoại lai [10] Ứng dụng nắm chịu axit cho phép thực hiện các quy trình này ở pH < 3 khi hầu hết các vi sinh vật tạp nhiễm không thẻ phát triển

1.1.2 Khả năng sinh enayme của vỉ nắm chịu axit mạnh

Vi ndm chịu axit mạnh rất có tiềm năng về mặt công nghệ sinh học vì có

thé san sinh các hệ enzyme hoạt động bền vững ở các điều kiện khắc nghiệt,

các chất chuyên hóa đặc biệt hoặc khai khác trong các quy trình xử lý sinh học

tương ứng Nhìn chung enzyme chịu được các điều kiện khắc nghiệt thu hút sự

chú ý lớn bởi tiền năng ứng dụng của nó Các chủng 4cidomyces acidophilus

đã được tiến hành kiểm tra khả năng sinh các enzyme amylase, lipase và kết quả cho thấy đa số các chủng có khả năng sinh enzyme thậm chí ở môi trường,

có pH 3 Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng chủng 4eidomyces sp được phân lập

tại một suối nước nóng có khả năng sinh các loại enzyme thủy phân

hemicellulose và lignin ngoại bào trong điều kiện môi trường có tính axit và ưa

nhiệt [§]

Acidiella bohemica [3 Multicopper oxidase

Acidomyces acidophilus [<3 Multicopper oxidase, Endo-1,4-B-xylanase CAZymes, Xylanase, Mannanase,

Acidomyces acidothermus | <3 Galactosidase, Glucanase, Glucoamylase,

Endo-polygalacturonase

Aspangituas inmigatus 3.0.3.7 | Xylanase, CMCase, a-amylase, Glucanase, Galacturonase, Glucosidase

Acidothrix acidophila 3 Amidase, Glucoamylase

Trang 13

Ching nam chiu axit ndi tiéng Acidomyces acidothermus (Bispora sp

MEY-1), ching nam va axit dugc phân lập từ nguồn nước thải có tính axit của mỏ uranium có pH sinh trưởng tối ưu 2.5-3.0, có thê sinh tổng hợp nên rất nhiều

loại enzyme như cac enzyme thiy phan carbohydrate (CAZymes), xylanase, CMCase, lichenanase, mannanase, galactosidase, glucanase, glucoamylase, endo-polygalacturonase Cac enzyme được tìm thấy là chịu nhiệt và có khả năng hoạt động trong điều kiện axit Một loạt các gen mã hóa enzyme thủy phân lignoeellulose đã được nhân bản và biểu hiện Trong đó đáng chú ý là enzyme

xylanase xy//0C duge tao ra có đải pH hoạt động từ 2.0-7.0, giữ được trén 80%

hoạt tính sau khi ủ ở 37°C trong 1 giờ trong các đệm có pH từ 1.5-6.0 Tham chí enzyme này còn chịu được nhiệt độ trên 90°C và chịu được sự hiện diện của các ion kim loại nặng như Co?', MtÊ*, Cr* va Ag* [10][1 1]

Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ngoại bào của chủng nắm mốc

ưa nhiệt và ưa axit 4spergillus terreus M11 đã được khảo sát trên môi trường

lignocellulose với các nguồn cacbon khác nhau trong điều kiện lên men rắn

Kết quả cho thấy lượng enzyme cellulase sinh tổng hợp được lớn nhất đạt 581U

CMCase va 128U f-glucosidase trén 1g môi trường có nguồn cacbon từ thân

Enzyme CMCase thu được hoạt động tối ưu ở pH 2 và bền trong khoảng pH từ 2-5 Trong khi đó enzyme j-glucosidase có họat tính cao nhất ở pH 3 và bền trong dai pH tir 3-5 Ca 2 enzyme này đều bền ở pH axit hơn là pH trung tính

và giữ được trên 50% sau khi ủ ở các pH tối ưu với từng enzyme tại 70°C trong 6 giờ Nhờ khả năng chịu nhiệt và axit cao nên enzyme cellulase sinh tổng hợp

từ nấm chịu axit 4spergillus erreus M11 có tiềm năng ứng dụng trong các

ngành công nghiệp, đặc biệt là sản xuất cồn sinh học từ cellulose [12]

Trang 14

Báng 1.3 Tông quan về các ứng dụng của enzym nắm ưa axit trong các ngành công nghiệp khác nhau

Ends

40 25 | Saccharomy

Polyg 42 30 | Aspergillus niger 3 Các ngành

43 50 Aspergillus carbonarius nghé gidy va dét 5.0 45 | Sclerotinia sclerotiorum | may

5.0 30 | Aspergillus niger 4 Điều chỉnh 45 30 | Rhizocronia solani Kuhn | pectic nước thải

(AG2-2) 5 Lên men cả Exo- 40 65 | Paeeilomyees variotii phê và trả polygalacturonases | 5.0 40 | Trichoderma harziumum _ | 6 Sản xuất

33 40 | Fusarim moniliforme thức ăn cho trẻ 34-42 | 60 _| Aspergillus niger em

acidotherma AIU BGA-1 _ | 2 BO sung trong B-galactosidases 15 37 Bispora sp MEY-1 sản phâm sữa

35 65 | Aspergillus niger 3 Sản xuất sữa 40 30 | Penieillium chrysogenmm _ | chua và phô mai

Trang 15

2.6 65 Bispora sp MEY-L 3 Dệt may, chế

5.0 60 | Aspergillus terreus biến thực phẩm

3.0 70 Bispora antennata giấy và bột giấy

1.2 Lignocellulose và các enzyme phân hủy lignocellulose

Lignocellulose được xem là chất hữu cơ phỏ biến nhất trên Trái Dat va

thu hút được rất nhiều sự quan tâm trong các năm gần đây về các ứng dụng như

là một nguồn năng lượng trực tiếp, hay là nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất

nhiên liệu tái tạo, các sản phẩm thức ăn chăn nuôi, hóa chất và thực phẩm

Lignocellulose chủ yếu được tìm thấy ở dạng gỗ và rơm rạ

Trang 16

Lignocellulose được cấu tạo từ 2 loại polyme carbohydrate, là cellulose

và hemicellulose, và polyme của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền

phenylpropanoid là lignin Các thành phần của lignocellulose tạo thành một dạng cấu trúc gọi là vi sợi, các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và

ligin tạo thành các bó sợi góp phần điều chinh độ bèn cấu trúc của vách tế bào thực vật, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của các enzyme và các hóa chất

trong quá trình thủy phân

1.2.1 Cellulose va enzyme thiy phan cellulose

> Cellulose

Cellulose là câu trúc polysaccharide chính của thành tế bào sơ cấp thực

vật Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ

với các polysaccharide khác Nó chiếm khoảng 45% khôi lượng khô của gỗ và

được cấu tạo bởi các mát xích j-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-

glycoside tao thanh cdc phan tử cellobiose Những phân tử này liên kết với nhau

tạo cấu trúc mạnh thẳng bằng liên kết eel và lực van đer Waals [13]

QIẾP ake Kept oe

a So

_ Hinh 1.3 Cau tric phan tir cellulose

Cellulose có cấu trúc rất bên, không tan trong nước và trong nhiều dung

môi hữu cơ, chỉ bị thủy phân khi đun nóng trong axit và kiềm Tuy nhiên, dưới

tác dụng của axit tạo thành các sản phẩm thủy phân không hòa tan Còn với

dung dịch kiềm thì làm mạch cellulose trương phông và hòa tan một phần các cellulose phân tử nhỏ Trong điều kiện bình thường một số vi sinh vật có thể

thủy phân cellulose thành đường đơn

Trang 17

> Hệ enzyme cellulase

Cellulase là hệ enzyme xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các

sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết J-1,4-glyeoside giữa các đơn vị glucose Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu: endo-1,4-B-

glucanase (endocellulase), cellobiohydrolase (exocellulase) va B-glucosidase

(cellobiase) Enzyme cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như: vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn Cellulase hoạt động ở pH từ 3.0-7.0, nhưng pH thích hợp nhất trong khoảng 4.0-5.0 và nhiệt độ tối ưu từ 40-50°C

Bảng 1.4 Bang phan loai hé enzyme cellulase

Endo: Af tinh giữacác — | Chuốiđơn

glucanase (endovellutase) | Cellulose vô chuỗi 3i cellulose định hình cellulose

Chuỗi đơn Cất liên kết

Exocellulase cellulose nội chuỗi (1 | Tetrasaccharides,

(cellobiohydrolase) | Cellulose két vi tri cit sau | disaccharides

tinh 2-4 glucose)

Cất liên kết

Cellobiase (ƒ- Tetrasaccharides, | glycoside | An saoehgyjde glucosidase) disaccharides | gitta 2

glucose

Endoglucanase, hay con duge goi 1a carboxymethylcellulase (CMCase),

phân hủy cellulose bằng cách giải phóng mạch cellulose thành các chuỗi mạch

thẳng có chiều dài khác nhau để cellobiohydrolase dé dang tiếp cận hơn

Cellobiohydrolase tham gia phân hủy các chuỗi trong cellulose hoặc các chuỗi

mdi do endoglucanase tạo ra để tạo thành các cellobiose Mặc dù B-glucosidase

thống cellulase vì nó phá vỡ cấu trúc của cellobiose để tạo ra hai phân tử đường

glucose

Trang 18

brah)

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của cellulase

1.2.2, Hemicellulose va enzyme thiy phan hemicellulose

Hemicellulose là một polyme carbohydrate phức tạp và chiếm khoảng 25-30% khối lượng khô của gỗ Nó là một polysaccharide mạch thẳng với phân

tử lượng thấp hơn cellulose, được cấu tạo bởi đơn phân là D-xylose, D-

mannose, D-galactose, D-glucose, L-arabinose, axit 4-O-methyl-glucuronic,

axit D-galacturonic va axit D-glucuronic, trong đó xylose là thành phần quan trọng nhất Các phân tử đường liên kết với nhau bởi lién két B-1,4- va d6i khi

là liên kết j-1,3-glycosidie Thành phần cơ bản của hemicellulose là B-D

xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết J-(1^>4)

Tùy thuộc trong thành phần của hemicellulose có monosaccharide nào

chiếm ưu thế mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, ølucan và xylan Trong ty nhién, loai hemicellulose dé thay nhiéu nhat 1a xylan, va thay nhiều ở rơm rạ (chiếm 30%), cây lá rộng (chiếm 25%) và những cấy lá kim (thường chiếm ít) Xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết B-1,4-D- xylopyranose, là nguồn năng lượng đồi dào thứ hai trên trái đất Hemicellulose

khi bị phân hủy sẽ tạo thành các đường đơn thuộc nhóm hexose như manose,

Trang 19

2 Oy

Hệ enzyme hemicellulase thường được phân loại dựa trên hoạt động của

chúng trên các cơ chất khác nhau Với sự đa dạng của hemicellulose, để phân

hủy hoàn toàn nó phải cần rất nhiều hydrolase glycoside (như xylanase,

arabinosidase, galactosidase ) cũng như esterase carbohydrate (nhu esterase

glucuronyl, esterase feruloyl ) cùng tham gia phân hủy chúng

Xylose là thành phần chủ yếu của đường pentose-một trong hai nhóm

đường chính thu được khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu gỗ và các

chất thải xơ nông nghiệp như rơm lúa mỳ, lúa nước, thân và lõi ngô Xylanase

là một enzyme có khả năng thủy phân đường xylose với hiệu suất cao Xylanase

(Endo-1,4-B-xylanase, 1,4-D-xylan xylanohydrolase: E.C 3.2.1.8) là enzyme

Trang 20

2 PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nắm mốc chịu pH thấp được lưu trữ trong bộ sưu tập giống của Trung tâm Vi sinh Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm Cơ chất tự

nhiên như bã malt, bã mía, cám gạo được sử dụng cho cả quá trình nghiên cứu

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất đùng trong môi trường nuôi cây và lên men:

D-Glucose (Trung Quốc); Agar (Việt Nam); KH:PO;¿ (Trung Quốc); (NH¿);SO; (Trung Quốc); CaCl; (Trung Quốc); MgSO.7H;O (Trung Quốc); peptone; cao nam men; khoáng chất 1000X

Thanh phan khodng chat bao gdm: FeSO4.7H2O (Trung Quéc); MnSO,.H2O (Trung Quéc); ZnSO4.7H20 (Trung Quốc); CoCl›.6H:O (Trung

Quốc)

Hóa chất chung dùng cho phân tích:

Thuốc thử DNS: 708 ml nước cất dùng để hòa tan 5.3 g DNS (3,5

dinitrosalicylic acid); 9.9 g NaOH; 153 g sodium potassium tartrate; 3.8 ml

phenol tinh thé; 4.15 g sodium metabisulfite

Kiểm tra lại pH của dung dich thudc thtr DNS: Lay 3 ml dung dich DNS

vừa pha, nhỏ phenolphthalein vào dung dịch trên, dung dịch chuyển sang màu đỏ Nhỏ từng 1 ml HCI 0.1N vào Nếu đã nhỏ 3 ml dung dịch HCI 0.1N vào mà

dung dịch không chuyển màu thi dung dịch DNS vừa pha là chuẩn Nếu lượng

HCI 0.1N ding it hon 3 ml da Lim chuyển màu dung dịch sang màu vàng, thi

cứ ít hơn 1 ml HCI 0.1N cn bé sung vào dung dịch trên 2 g NaOH

Co chat CMC 1%: pha trong đệm Na-citrate 0.05M, pH 5.0: Can 1 g CMC, cho dém Na-citrate 0.05 M, pH 5.0 đến khi được 100 g thì dừng lại,

khuấy tan đều rồi bảo quản ở 4°C

Trang 21

Co chất Xylan 1%: pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5, bảo quản ở 4C

Đệm Natri-Citrate 1M, pH 5.0: Cân 105 g Citric acid monohydrate hòa tan trong 375 mÏ nước cất Sử dụng NaOH chỉnh tới pH 4.5 Sau đó định mức lên 500 ml

Hóa chất xác định hoạt tính phân giai cellulose: Agar 2.5% (India); CMC

1% (Korea)

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Tủ cây vô trùng, tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật), nồi hap thanh trùng

và nồi hấp thanh lý (Himayatoko, Nhật), tủ sấy 70°C, (Yamato, Lab-Ware

Drying Oven DG 82), tủ bảo quản giống -30°C (Sanyo, Nhật), lò vi sóng (Gold Sun), máy Votex, máy spin và máy lắc (Labnet), Bể ôn nhiệt (Grant), Máy cô chân không (RVC 2-25, Christ), Máy đo hàm lượng protein (Nanodrop 2000, Thermo Scientific) , May khudy tir gia nhiét (IKA CMAG HS7), BO di

đứng (Labnet, Clever), Box cấy (Bioblock Scientific, Pháp), Cân điện tử (Precisa, Thụy Sÿ), Kính hiển vi quang học (Eclipse E600, Nikon, Nhật), Máy

do pH (Toledo, Anh); Máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), Máy ly tâm cao tốc

(Heraeus-Sepatech),

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống Falcon, ống nghiệm, ống Eppendorf, ng đong, đèn còn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott,

que cấy

2.3 Môi trường nghiên cứu

2.3.1 Môi trường PDA

Dịch chiết khoai tây: Cân1 kg khoai tây gọt sạch vỏ sau đó rửa sạch thái

lát mỏng rồi bổ sung 5 lít nước RO, đun sôi nhỏ lửa 1 h sau đó lọc bỏ bã Dịch chiết dùng để làm môi trường PDA

Trang 22

Môi trường PDA: 1% D-glucose va 1.8% agar trén 1 lit dịch chiết khoai

tây Hấp thanh trùng 121°C trong 15 phút, sau đó đỗ ra đĩa Petri mỗi đĩa khoảng,

20 ml

2.3.2 Môi trường pH thấp (pH 1.0)

Chuan bị môi trường Malt 2 Bx trong đó thành phần môi trường có 2%, agar, sau đó đem đi hấp ở 121°C trong 15 phút Sau khi đã hấp xong hạ nhiệt môi trường bằng bể ồn nhiệt 52°C, khi môi trường đã về nhiệt độ 52°C, bắt đầu

đồ môi trường ra đĩa đã bổ sung 1 ml dung dịch H;SO; 20% Trong quá trình

đồ lắc nhẹ cho dung dịch và axit mix đều với nhau (nồng độ axit cuối đạt 1%

tương ứng)

2.3.3 Môi trường nuôi và tách chiết enapme chủng mốc pH thấp

Môi trường nuôi rắn: trong mỗi bình tam giác 100 ml gồm 4,5 g co chat

hỗn hợp: 1,5 g bã malt, 1,5 g bã mía và 1,5 g cám gạo Thanh trùng 121°C trong 15 phút

Môi trường lỏng bổ sung có thành phần như sau: KH2PO, (4.0 g/l), (NH:);SO; (13.6 g/l), CaCh (0.8 g/l), MgSOs.7H20 (0.6 g/l), Yeast Extract (1.0 g/l), Peptone (1.0 g/l), Tween 80 (0.2 ml/l), Trace elements (1.0 ml/l), duge thanh tring va chinh pH 2.5

Thanh phan khodng chat Trace elements 1000x: FeSO4.7H:0 10 mg/l;

MnS0y.H20 3.2 mg/l; ZnSO4.7H20 2.8 ml/l; CoCh.6H20 4.0 mg/l

Dung dich chiét enzyme: dém Na-citrat 0,05M pH 5.0

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào

Quan sát hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi nắm được cấy ba điểm ra đĩa

Petri có chứa môi trường PDA, đem muôi cấy ở nhiệt độ 30°C Sau 3-7 ngày ta

quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường rồi miêu tả các đặc điểm như: hình thái, màu sắc, kích thước, tốc độ phát triển

Trang 23

Chụp ảnh khuẩn lạc: vi nắm được nuôi trên đĩa Petri môi trường PDA

sau 3-5 ngày sao cho kích thước vòng khuẩn lạc chiếm 2/3 đĩa, tiền hành đem

chụp ảnh Dùng máy ảnh chụp mặt trước và mặt sau khuẩn lạc

Chụp ảnh tế bào: vi nấm sau khi nuôi trên đĩa Petri môi trường PDA ở

nhiệt độ thích hợp, tiến hành làm tiêu bản và nên chụp lúc các khuẩn lạc còn

nhỏ (trẻ) Lấy que cấy vô trùng chấm một lượng nhỏ lên tiêu bản rồi đem soi

dưới kính hiền vỉ quang học có gắn máy ảnh 2.4.2 Phương pháp điện di protein SDS-P.AGE

Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyền của các phân tử protein tích

điện trong một dung dịch đặt trong điện trường Vận tốc dịch chuyển của các

phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vân tốc dịch chuyên khác nhau, nhờ đó mà có thẻ phân tách một hỗn hợp protein

Chuẩn bị

bị sẵn 200 l nước Sau đó, thêm vào 200 wl NaOH 1,6%, trộn đều, sau đó li

ẫu: Lấy khoảng 50 HÌ sinh khối vào các Eppendorf đã chuyển

tâm 10000 rpm trong 4 phút, bỏ dịch, lặp lại 2 lần Tiếp theo, rửa lại bằng 200

HÌ NaOH 0,1%, trộn đều, sau đó li tâm 10000 rpm trong 4 phút, giữ lại khoảng

trong 15 phút Hút 15 ul mẫu sau xử lí điện di

Chuẩn bị gel: Sau khi lắp kính thật khít, cài lược vào khuôn và đánh dấu bên ngoài để mép gel cách chân lược khoảng 0.4 cm, đồ lớp separating gel đến mức đánh dấu rồi cho ngay 1 lớp nước cất lên bề mặt Chờ 30 phút đẻ lớp

running gel đông, đồ nước cất đi, cài lược và đồ tiếp lớp stacking gel, chờ 30

phút để gel đông Đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch điện giải 1x đến

vạch quy định của thiết bị, gỡ lược, loại bỏ các mẫu gel thừa bên trên giếng để

giếng sạch, khi load mẫu sẽ dễ dàng hơn Thanh phan gel:

Phần gel phân tách 10%: Nước cất 3.0 ml; 30% Acrylamide 2.5 ml; 1,5M

Tris-HCI (pH=8.8) 1.9 ml; 10% SDS 80 pl; 12% APS 80 ul; TEMED 8 pl

Trang 24

Phần gel cô 5%: Nước cất 1.385 ml; 30% Acrylamide 0.415 ml; 1,5M Tris-HCI (pH=6.8) 0.625 ml; 10% SDS 25 ul; 12% APS 25ul; TEMED 2.5 ul Sau khi đỗ lớp gel phân tách thì cho ngay một lớp ethanol 100% lên trên,

chờ 30 phút đề gel đông Loại bỏ lớp ethanol và đ tiếp lớp gel cô, gắn lược, chờ 30 phút đề gel đông Đặt bản gel vào buồng điện di và tiễn hành nạp mẫu

Chạy 120V trong khoảng 2 giờ

“Tiến hành nhuộm gel đối với SDS-PAGE: Nhuộm gel trong Coomassie

brilliant blue ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để Coomassie brilliant blue bắt

màu với protein Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I trong 30 phút, lặp lại 2 lần

Ngâm gel trong dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ

các vạch protein Quan sát, chụp ảnh gel đề lưu kết quả

2.4.3 Phương pháp điện di Zymogram

Nguyên tắc: trước tiên hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân

tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất xylan Sau khi phân tách phản ứng

enzyme được tiến hành trong gel, emzyme có mặt sẽ thủy phân cơ chất Sau

phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm bằng Congo red Những phần cơ chất bị

enzyme thủy phân sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, và đo đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với mau nền của gel

Thành phần gel: tương tự phương pháp điện di SDS-PAGE, chỉ thay cơ

chất xylan 1% vào nước cắt trong running gel

Trang 25

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học ~ Nhuộm gel bằng dung dịch Congo red 0.1 %, lắc đều, cho vào tủ ấm

50°C trong 30 phit

Chuẩn bị chủng giống: Cây các chủng vi nắm được bảo quản lạnh trong

ống thạch nghiêng PDA sang đĩa PDA nuôi ở 30°C trong 2-3 ngày đẻ hoạt hóa

ống, giống sau khi được hoạt hóa sẽ được cấy lại vào ống thạch nghiêng PDA,

nuôi trong vòng 2-3 ngày ở 30°C để giống mọc kín bề mặt thạch, cung cấp

giống cho nuôi chiết enzyme

Cách vào giống: Lấy 10 ml dung dịch dinh dưỡng cho vao đĩa giống, cào

hết lượng giống trong đĩa và hút vào mỗi bình có cơ chất trên Trộn đều, nuôi

ở 30°C trong 7 ngày Trong quá trình nuôi thì quan sát khả năng phát triển của

chủng và đảo nếu cần

Tach chiét enzyme: Sau 7 ngay, cho 45 ml Na-Citrate 0.05 M, pH 5.0

vào mỗi bình nuôi, lắc trong 1 giờ bằng máy lắc 6 150 rpm Sau dé ly tam 4000 rpm trong 10 phút, thu lấy dịch chiết và bảo quản ở -20°C Enzyme duge

làm sạch qua cột Hitrap Desalting để loại các phân tử có kích thước nhỏ như

đường, mui

2.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính phân giải cellulose

Xác định hoạt tính phân giải cellulose bằng phương pháp khuyếch tán

trên thạch đĩa Nguyên tắc của phương pháp là enzym cellulase thuỷ phân CMC trong môi trường sẽ tạo vòng thuỷ phân có màu vàng xung quanh lỗ đục đã được nhỏ dịch enzyme, và hiện màu bằng dung dịch congo red 0,1% Dựa vào hệ số giữa đường kính vòng thuỷ phân và đường kính đục lỗ người ta xác định

được hoạt tính định tính enzyme

Trang 26

Phương pháp được tiền hành cụ thể như sau:

+ Can 1% CMC, 2% agar trong 400 ml dém 0.05M Na-citrate pH 5.0 Dé dịch lỏng vào khay thủy tỉnh có chiều dày là 1 cm

* Dùng dụng cụ đục một lỗ tròn (đường kính 10 mm) vào khay chứa môi

* Nhỏ 50 pl dich enzym đã ly tâm vào lỗ được đục Làm đối chứng: đối

chứng dương là enzyme cellulase thương phẩm, đối chứng âm là đệm 0.05M

* Sau đó, để vào tủ ấm 50°C trong Ih hoặc để qua đêm dé enzym tác

dụng với cơ chất CMC

+ Cho vào khay thủy tỉnh 100 ml dung dịch nhuộm màu Cogo red 0,1%,

tráng đều lên mặt thạch và chờ đến khi xuất hiện vòng thủy phân Sau đó, gạt bỏ hệt

ịch cogo red 0,1%, quan sát vòng khuyếch tán

+ Dùng thước kẻ, đo vòng CMC-agar bị phân giải xung quang lỗ (vùng

màu vàng trên nền đỏ) Hoạt tính enzyme được hiền thị bằng hiệu số giữa đường,

kính vòng phân giải và đường kính lỗ đục, đơn vị đo là mm 2.4.6 Xác định hoạt độ ensypme bằng phương pháp DINS

Đường chuân: Đường D-glucose (EU-G7) cho CMCase và D-xylose cho

xylanase được sấy 105°C trong 2h Cân 0.5 g đường hòa với 40 ml đệm Na-

citrate 0.05M pH 5 trong céc đong thủy tỉnh, sau đó định mức đến 50 ml thu

được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20°C) Từ dung dịch stock pha

ác nồng độ 0.2, 0.4 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml

Tiến hành dựng đường chuẩn: Cho vào các eppendorf 0.3 ml dung dịch

loãng ra

đường rồi bổ sung 0.6 ml DNS, trộn đều Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút,

làm lạnh nhanh bằng nước đá Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất,

trộn đều Đo OD ở bước sóng 540 nm Dựng đường chuẩn y= ax +b Tiến hành phân tích mẫu:

Mẫu thí nghiệm: Hút 0.2 ml co chat vao eppendorf, giữ ở 50°C trong 5 phút Bỗ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho

Trang 27

enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C trong 20 phút Bỏ sung 0.6 ml DNS để

ngừng phản ứng Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng

nước đá Lấy 0.2 ml dịch phản ứng trong mix đều với 0.9 ml nude cat, do OD

ở bước sóng 540 nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm,

tuy nhiên dịch enzyme bị bắt hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút)

Mẫu đối chứng dương: phân tích I mẫu enzyme thương phẩm

Hoạt tính CMCase được tính bằng số umol D-glucose tạo ra khi thủy

phan CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C

Hoạt tính xylanase được tính bằng số umol D-xylose tạo ra khi thủy phân

xylan trong một phút bởi một mÍ enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C 2.4.7 Xác định hoạt tính enayme ở các pH khác nhau

> Xylanase

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 wmol D-xylose trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm

Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4 xylanase) phân cắt cơ chất

thành các oligoxylose và xylose có tính khử, có khả năng bắt màu vàng cam

đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng

Dựng đường chuẩn: Đường D-xylose được sấy ở 105”C trong 2 giờ Cân

0.5 g D-xylose hòa tan với 40 ml đệm Na-Citrate 0.05M pH 5.0 trong cốc đong thủy tỉnh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml ở pH 5.0 Thay đệm Na-Citrate 0.05M, pH 5.0 bằng đệm Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm 1% axit sulfurie 0.05M (pH~1) và đệm Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm 0.25% axit sulfurie (pH~3), đệm Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm 0.01% axit sulfuric (pH~5) sẽ thu duge cac dung dich stock 10 mg/ml 6 pH~1, pH-3, pH~5 (bảo quản ở -20°C) Từ đó pha tiếp thành các dung dịch D-xylose với các nồng độ khác nhau như 04; 0.6; 1.2; 1.4; 1.6; 1.8 (mg/ml)

Trang 28

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

- Cho vào các ống Eppendorf 0.3 ml dung dich đường chuẩn

- B6 sung vào các ống 0.6 ml DNS Trộn đều, phản ứng màu ở 100°C

trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0.4 ml dịch phản ứng + 1.8 ml nước cắt, trộn đều trong curvet

- Do OD ở 540 nm

Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-xylose và giá trị

OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel

Đường chuẩn Xylose ở pH 1 Đường chuẩn Xylose ở pH 3 R?= 099

Nông độ đường mginl

Đường chuẩn Xylose ở pH 5 05818x-00114 RẺ 09956 12 1 s08 06 04

Phân tích hoạt tính xylanase ở đồng thời 3 pH: pH~I, pH~3, pH~5 Chuẩn

i dung dich DNS, pha co chat xylan 1% trong 3 loại đệm với các pH khác nhau đã chuẩn bị ở trên

Tiến hành thí nghiệm:

~ Hút 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp) và 0.2

ml cơ chất tương ứng với từng pH vào ống eppendorf, cho enzyme phản ứng

với cơ chất ở 50°C trong 20 phút

~ Làm lạnh nhanh bằng nước đá để ngừng phản ứng Sau đó bồ sung 0.6

ml DNS, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

Trang 29

~ Ly tâm 10000 rpm trong Iphút Lấy 0.4 ml dịch phản ứng + 1.8 ml

nước cất, mix đều Đo OD ở bước sóng 540 nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: 0.1 ml dịch enzyme đã pha loãng bị bất hoạt

(đun sôi 100°C trong 10 phút) được bổ sung 0.2 ml co chat, tiền hành tương tự

theo các bước như trên

Mẫu blank: mỗi pH dùng một blank khác nhau Cho vào eppendorf 0.1 ml đệm ở từng pH cộng với 0.2 ml cơ chất ở pH tương ứng Mẫu blank cũng

được ủ ở 50°C trong 20 phút và tiếp tục các bước như trên

Công thức tính hoạt tính xylanase:

TU=(T-C-b)*D*0.3)/(a*0.15*20*0.1)

- T:d6 hap phụ của mẫu thí nghiệm

C: độ hấp phụ của mẫu đối chứng

-_ a,b: hệ số của đường thắng y= ax+b

- D: hệ số pha loãng

~ 0.15: 150/1000 của đường D- xylose khan - 20: thời gian phản ứng (phút)

- 0.1: thé tich enzyme tham gia phan (mg (ml)

- 0.3: téng thé tich co chat va enzyme tham gia phản ứng (ml)

> CMCase

Định nghĩa: Hoat tinh CMCase (IU/ml): 1 IU được tính bằng lượng

enzyme can thiét dé tao ra 1 pmol glucose khi enzyme thủy phân cơ chất CMC

trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm

liên kết J-1.4

glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide

tương tự khác tạo thành các oligosaccharide, glocose có tính khử, có khả năng

bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng

Dựng đường chuẩn: Đường D-glucose được sấy 6 105°C trong 2 giờ

Cân 0.5 g D-glucose hòa tan với 40 ml đệm Na-Citrate 0.05M pH 5.0 trong cốc

Trang 30

đong thủy tỉnh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml ở pH 5.0 Thay đệm Na-Citrate 0.05M, pH 5.0 bằng đệm Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm 1% axit sulfuric 0.05M (pH~1) và đệm Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm 0.25% axit sulfuric (pH~3), dém Na-Citrate 0.05M có bổ sung thêm

0.01% axit sulfuric (pH~5) sẽ thu được các dung dịch stock 10 mg/ml ở pH~1,

pH~3, pH~5 (bảo quản ở -20°C) Từ đó pha tiếp thành các dung dịch D-glucose với các nồng độ khác nhau như 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.45 1.6; 1.8; 2.0

mg/ml

Tiến hành xây dựng đường chuẩn:

Cho vào các ống Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường chuẩn

Bồ sung vào các ống 0.6 ml DNS Trộn đều, phản ứng màu ở 100°C

trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

Lấy 0.4 ml dịch phản ứng + 1.8 ml nước cắt, trộn đều trong curvet

Do OD 6 540 nm

Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose va gid tri OD

được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel

Nông độ đường mự Nông độ đường min!

Trang 31

Phân tích hoạt tính CMCase ở đồng thời 3 pH: pH~1, pH~3, pH~5

Chuẩn bị dung dịch DNS, pha cơ chất CMC 1% trong 3 loại đệm đã

chuẩn bị ở trên

Tiến hành thí nghiệm:

- Hút 0.1ml địch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp) và 0.2ml

cơ chất tương ứng với từng pH vào ống eppendorf, cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C trong 20 phút

- Làm lạnh nhanh bằng nước đá để ngừng phản ứng rồi bổ sung 0.6 ml

DNS, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá ~ Ly tâm 10000 rpm trong Iphút Lấy 0.4 ml dịch phản ứng + 1.8 ml

nước cất, trộn đều Do OD ở bước sóng 540nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: 0.1 ml địch enzyme đã pha loãng bị bất hoạt

(đun sôi 100°C trong 10 phút) được bổ sung 0.2 ml co chat, tiền hành tương tự

theo các bước như trên

Mẫu blank: mỗi pH dùng một blank khác nhau Cho vào eppendorf 0.1 ml đệm ở từng pH cộng với 0.2 ml cơ chất ở pH tương ứng Mẫu blank cũng được ủ ở 50°C trong 20 phút và tiếp tục các bước như trên

Công thức tính hoạt tính CMCase:

1U=((T-C-b)*D*0.3)/(a*0.18*20*0.1)

T: độ hấp phụ của mẫu thí nghiệm - C:d6 hp phụ của mẫu đối chứng

- a,b: hệ số của đường thăng y= ax+b

- D:hé sé pha loang

- 0.18: 180/1000 ciia duéng D- glucose khan - 20: thdi gian phản ứng (phút)

= 0.1: thé tich enzyme tham gia phản ứng (ml)

- 0.3: téng thé tich co chat va enzyme tham gia phản ứng (ml)

Trang 32

2.4.8 Đánh giá độ bên nhiệt của enzyme

Enzyme được pha loãng tới nồng độ thích hợp ở pH 5.0 Làm 3 mẫu song

song, 1 mẫu không gia nhiệt, 2 mẫu còn lại được đẻ trong bể ôn nhiệt 70C, 90°C trong 20 phút Sau 20 phút, các ống Eppendorf được lấy ra làm lạnh nhanh và cất vào tủ mát, dé qua đêm Sau khi để qua đêm, các mẫu được lấy ra và

phân tích theo phương pháp DNS đẻ xác định hoạt tính So sánh hoạt tính của mẫu được ủ ở 70C, 90°C trong 20 phút với mẫu đề ở nhiệt độ phòng sẽ xác

định được độ bền nhiệt của enzyme

2.4.9 Phương pháp xác định protein (Lowry)

Nguyên jý: Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy so màu để xác

định màu sản phẩm khử của phosphomolipden-phosphowolftamate (thuốc thử

Folin-Ciocalteu) với phức đồng-protein

Chuẩn bị hóa chất:

Dung dịch A: cân 10 g NaCO: pha trong 500ml NaOH 0.1N

Dung dịch B: cân 0.5 g CuSO¿.SH:O pha trong 100ml Postassium tartrate 1%

Dung dich C: trộn A với B theo tỉ lệ 50:1

Thuốc thử Folin-ciocalteu: pha loãng với nước cắt theo tỉ lệ 1:1

Dựng đường chuẩn:

BSA (mg/ml)

[ Stock BSA 10mg/ml (ul)

- Pha stock BSA với nước cất để được các nồng độ BSA như bảng trên

- Cho 0.4 ml BSA + 2 ml thuéc thir C

- Trộn đều và giữ nguyên dung dịch trong 10 phút

- Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin- ciocalteu

- Trộn đều và giữ nguyên trong 30 phút

- Ðo độ hấp phụ quang ở bước sóng 2 =660 nm

Trang 33

Trường Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ BSA va gia tri OD

660 nm được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel

Đường chuẩn Protein_Lowry y=08755% + 01679 R= 0.998

° 02 «04 «06 08 1 12

Phương pháp phân tích:

- Hut 0.4 ml mẫu vào ống nghiệm cho tiếp 2 ml dung dịch C, lắc đều,

giữ nguyên trong 10 phút

~_ Thêm 0.2 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc đều, giữ nguyên trong 30

phút

~_Đo độ hấp phụ quang ở bước sóng 2 =660 nm

- Mẫu Blank: thay 0.4 ml mẫu ở bước | bang 0.4 ml nước cắt, rồi làm

tương tự như các bước trên

Công thức tính: Protein (mg/ml) = [(OD - b)*D]/a

Trong đó: D: độ pha loãng của mẫu

a,b: hệ số của đường chuẩn y= a.x + b

Trang 34

3 PHAN III: KET QUA NGHIEN CUU

3.1 Quan sát và chụp ảnh hình thái khuẩn lạc, tế bào

Để nghiên cứu về các chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân

lignocellulose nhằm ứng dụng trong ngành chăn nuôi, chủng giống nắm mốc chịu pH thấp từ Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp được tiếp nhận Giống được hoạt hóa và tiến hành quan sát hình thái khuân lạc, tế bào

Bảng 3.1 Danh sách 17 chủng vi nắm chịu axit

STT u chủng _ Tên phân loại

1 ASM 138-1 Aspergillus fumigatus 3 | ASM 158 Aspergillus fumigatus 2 | ASS69-1 Aspergillus fumigatus

4 ASM 140 Aspergillus unguis

5 ASS 102-1 Penicillium citreonigrum 6 ASS 89-1 Penicillium citreonigrum

7 | ASM 138-3 Penicillium citrinum 8 | ASM159-1 Penicilliưm gerundense 9 AS 318-1 Penicillium indicum 10 | AS3I Penicillium sp 11 ASM 139-1 Penicillium sp 12 ASM 141-1 Penicillium sp l3 | ASS 125-1 Sarocladium sp 14 ASS30 Sarocladium sp 15 | ASI9 Talaromyces sp

16 AAS 356 Talaromyces verruculosus 17

Các chủng vi nắm được nuôi cấy trên môi trường môi trường PDA ở

nhiệt độ 30°C trong 3-5 ngày và môi trường pH thấp (pH 1.0) ở nhiệt độ 30°C

trong 14 ngày Môi trường PDA là môi trường mà hầu hết các chủng vi nắm có

thể sinh trưởng và phát triển, còn môi trường Malt 2Bx pH 1.0 để đánh giá khả

Trang 35

năng chủng đó có chịu được pH thấp hay không Việc nhận diện bằng hình thái

khuẩn lạc của các chủng trên PDA là rất điển hình vẻ hình dạng, kích thước,

màu sắc và ngược lại với việc quan sát các khuẩn lạc trên môi trường pH 1.0

'Việc quan sát hình thái tế bào rất quan trọng và ý nghĩa đối với việc phân loại các chủng vi nắm cũng như để phân biệt được chủng có thuần hay không

Trang 36

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào trên môi trường PDA (trái)

và môi trường Malt 2B pH 1.0 (phải) của một số chủng vi nắm, thanh chèn 10 im

Trang 37

3.2 Đặc tính enzyme của các chủng vi nắm

Các chủng vi nắm được tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

enzyme thủy phân lignocellulose bằng cách nuôi cấy trên môi trường rắn và thu

nhận dịch enzyme thô như đã nêu ở phần phương pháp Enzyme thô được bảo

3.2.1 Phân tích hàm lượng protein của các chủng vi nấm

Nhằm đánh giá hàm lượng protein tổng số thu được sau quá trình nuôi cấy, tách chiết enzyme déi với mỗi chủng, chúng tôi tiến hành xác theo

phương pháp Lowry Lượng protein sinh ra phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản

thân chủng đó và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Hàm lượng protein tổng,

số còn phản ánh sơ bộ về khả năng hoạt động của các enzyme tiết ra Chủng vỉ

nắm nào có hàm lượng protein cao thì có khả năng hoạt tính enzyme lớn nhưng

nó khơng hồn tồn tỉ lệ thuận với nhau

Hàm lượng Protein tông số của các chủng vi nắm

Talaromyces verruculasus ASM Talaromyces verruculosus AAS 356 Talaromyces spl AS 19 Sarocladium sp ASS 30 Saroeladium sp ASS 125-1 Penicillium sp ASM 141-1 Penicillium sp ASM 139-1 Penicillium sp AS 31 Penicillium indicum AS 318-1 Penicillium gerundense ASM 159-1 Penicillium citrinum ASM 138-3 Penicillium citreonigrum ASS 89-1 Penicillium citreonigrum ASS 102-1 Aspergillus unguis ASM 140

Aspergillus funigats ASM [35-|

6 0 5.00 10.00 15,00 2000 25.00 Hàm lượng protein (mg/ml)

Hàm lượng protein tổng số thu được của các chủng dao động trong

khoảng từ 8.90-21.37 mg/ml Theo như đồ thị thể hiện, hàm lượng protein các

loài tiết ra là khác nhau, thậm chí các chủng trong cùng một loài cũng sinh ra

lượng protein khác nhau dù nuôi trong cùng một điều kiện

Trang 38

3.2.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme ciia các chủng vỉ nấm Để đánh giá định tính khả năng sinh tổng hợp enzyme, chúng tôi tiến hành xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất CMC,

tinh bột, skim milk 1% có bô sung thêm 2% agar trong đệm Na-citrate 0.05M

pH Š (đối với cơ chất CMC và tỉnh bột) và dém Potassium phosphate 0.05M

pH7 (đối với cơ chất skim milk) Vòng thuỷ phân tạo thành thể hiện khả nang

phân giải cơ chất CMC, tỉnh bột, skim milk của dịch enzyme Dùng thước kẻ đo đường kính các vòng thủy phân của các chủng và của enzyme cellulase, ơ- amylase, protease thương phẩm để đánh giá định tính hoạt lực của các dịch

enzyme thé

Trang 39

ee @ e & â & @

eee ee ¢# @ @

oe e ¢ (@

Hinh 3.2 Vòng phân giải cơ chit CMC, tinh bot, skim milk

Chú thích: ĐC ~: đối chứng âm (đệm tương ứng với từng cơ chất), CC: đối chứng cơ chất,

DC +: déi ching duong (enzyme cellulase, a-amylase, protease throng phim),

Dựa vào hình có thể thấy đa số chủng tạo vòng phân giải cơ chất CMC

nhưng vòng phân giải tỉnh bột và skim milk lại không xuất hiện Điều này

chứng tỏ dịch chiết enzyme của hầu hết các chủng vi nắm có hoạt tính CMCase

mà không có khả năng phân giải tỉnh bột và protein Duy nhất chủng

Aspergillus fumigatus ASS 69-1 xuat hién vong phân giải tỉnh bột với đường kính vòng rất nhỏ (khoảng 2.1mm) thể hiện hoạt tính phân giải tỉnh bột rất yếu

Các vòng thủy phân CMC trên đĩa thạch của các chủng vi nắm có đường kính

Trang 40

từ 0.0-9.5mm Một số chủng có vòng thủy phân lớn như Twfaromyces verruculosus AAS 356, Aspergillus fumigatus ASS 69-1, Sarocladium sp ASS 125-1, trong khi cũng có những chủng vòng thủy phân lại rất nhỏ (như Penicillium citrinum ASM 138-3, Penicillium sp ASM 141-1, Aspergillus fumigatus ASM 158) hoac khéng cé vong phan giai (nhur Talaromyces sp.AS

19 va Penicillium citreonigrum ASS 102-1)

Bảng 3.2 Kích thước vòng phân giải cơ chất CMC, tỉnh bột, skim milk 'Đường kính vòng phân giải (mm) STT| Kýhiệu chủng CMC Tỉnh bột Skim milk 1 | Đối chứng cơ chất - - - 2 | Đối chứng âm - - š 3 | Enzyme thương phẩm 12.3401 9.6+0.1 5.1+0.1 4 | AAS 356 7740.1 - - 5 |AS4I 6240.1 ˆ - 6 | AS318-1 6.5+0.1 ~ - 7 | ASM 137-1 5540.1 - - 8 | ASM 138-1 72401 - - 9 | ASM 138-3 4,740.1 - - 10 | ASM 139-1 8640.1 - - 11 | ASM 141-1 4140.1 - - 12 | ASM 158 570.1 sẽ # 13 | ASM 159-1 6/2#0.1 - - 14 | ASS 125-1 72401 - - 15 | ASS 30 6940.1 ˆ - 16 | ASS 89.1 45401 - - 17 |ASI9 “ = = 18 | ASM 140 6940.1 - - 19 | ASS 102-1 - - - 20 | ASS 69-1

Chú thích: Đường kính vòng phân giải là hiệu số giữa bán kính vòng thủy phân và đường kính của lỗ đục, - : không thể hiện hoạt tính 3

Khảo sát khả năng sinh téng hop enzyme phan gidi lignocellulose cita

Để đánh giá khả năng phân giải cơ chất lignocellulose của các chủng vi

nắm chịu axit mạnh, chúng tôi tiến hành phân tích hoạt tính enzyme CMCase

và xylanase của dịch enzyme thô của các chủng thu được sau khi nuôi chị