Nghiên cứu tính đa hình của gen LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam
MỤC LỤC
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. VẬT LIỆU
- CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Phần mền Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm dùng để thực hiện các thao tác xử lí trên các trình tự nucleotide, bao gồm nhiều tính năng như đọc, tìm kiếm, chú thích và sắp xếp các trình tự oligonucleotide, phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn, khung đọc mở,…. - Phần mềm trực tuyến IDT analyzer giúp đánh giá các thông số vật lý quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, phần trăm GC, nhiệt độ nóng chảy của mồi, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (hairpin-dimer, self-dimer, hetero-dimer),…. - MEGA (phiên bản 6.0 Kumar, 1993): phần mềm miễn phí dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining. - BioEdit version 7.0.5.3: Phần mềm miễn phí dùng để sắp gióng cột, phân tích và hiệu chỉnh trình tự gene, protein. Chọn lọc và thu nhận các công bố khoa học liên quan dùng làm cơ sở cho khai thác CSDL. Đầu tiên, những công bố khoa học có nội dung liên quan đến tính đa hình 30-bp deletion và XhoI-loss trên gene LMP1 được tiến hành tìm kiếm các thông tin. Nghiên cứu sử dụng các CSDL như: NCBI, PUBMED, Web of Science, ScienceDirect, SciELO,… với các từ khóa như: Epstein-Barr virus OR EBV OR virus AND cancer OR tumor OR nasopharyngeal carcinoma AND LMP1 30-bp deletion OR LMP1 variant OR BNLF1 AND XhoI polymorphism OR XhoI variants. Các công bố khoa học được dựa vào các tiêu chí sau để lựa chọn: 1) các nghiên cứu có mẫu chứng hoặc mẫu lành đã phân tích đa hình 30-bp del và XhoI-loss trên gene LMP1 của EBV trên bệnh nhân UTVH; 2) các nghiên cứu được lựa chọn bất kể nơi xuất xứ, tuổi tác, giới tính cũng như loại mô học UTVH của mẫu. Các tiêu chí để loại trừ công bố khoa học bao gồm: 1) các nghiên cứu là dạng review;. 2) nghiên cứu chỉ phân tích các dạng ung thư khác mà không phải là UTVH; 3) các ấn phẩm đã trùng lập trước đó; 4) các nguyên cứu không liên quan đến đa hình 30-bp del và XhoI-loss trên gene LMP1 của EBV cho bệnh nhân mắc UTVH.
Nhiệt độ chênh lệch giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 5oC (lý tưởng là 2- 3oC), duy trì nhiệt độ nóng chảy Tm trong khoảng 50 - 60oC; 4) Cấu trúc thứ cấp bao gồm: cấu trúc Hairpin- dimer (tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide), Self-dimer (hai oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp) và Hetero-dimer (các mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp với nhau), nếu các cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của các mồi vào trình tự đích. Phản ứng PCR hoạt động trên nguyên tắc sử dụng enzyme DNA polymerase xúc tác phản ứng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn dưới sự hiện diện của mồi chuyên biệt (một đoạn oligonucleotide ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với DNA của mạch khuôn). Để khuếch đại trình tự DNA thì hai mồi chuyên biệt là mồi xuôi và mồi ngược sẽ bắt cặp hai đầu với trình tự mồi được cung cấp, DNA polymerase sẽ kéo dài mồi bằng các nguyên liệu nucleotide tạo thành mạch mới theo nguyên tắc bổ sung với mạch đã có.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO
Điều này có thể được giải thích là do mẫu mô sinh thiết lấy từ bệnh nhân được chẩn đoán chắc chắn là bị UTVH và cho kết quả có độ chính xác cao trong nghiên cứu. Lý do là do mẫu sinh thiết (mẫu xâm lấn) khó có thể lấy được ở người lành, mẫu dịch phết dễ lấy hơn vì nó là mẫu không xâm lấn và không gây tổn thương cho các tình nguyên viên, cũng như thao tác thu nhận mẫu dễ dàng. Do đó, trong nghiên cứu này, mẫu bệnh là mẫu mô sinh thiết và mẫu lành là mẫu dịch phết được sử dụng để thực hiện cho nghiên cứu thực nghiệm sau này.
30-bp del xuất hiện nhiều hơn trong mẫu UTVH ở các nước Châu Á (Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia) và Morocco, nhưng ít hơn ở nước Nga và Serbia (bảng 3.1). Sau khi tiến hành tìm kiếm và sàng lọc các nghiên cứu có liên quan đến biến thể XhoI-loss của gene LMP1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng, các kết quả nghiên cứu thu được được trình bày qua bảng bên dưới (bảng 3.2). Các công bố khoa học trên đa phần sử dụng phương pháp PCR và giải trình tự làm công cụ chính để thực nghiệm, cho thấy PCR và giải trình tự là phương pháp tối ưu để tiến hành chạy thực nghiệm mẫu UTVH khảo sát sự hiện diện của 30-bp del và XhoI- loss.
KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỒI
Chú thích: Dựa vào phân tích IDT, các thông số quan trọng của cặp mồi tham khảo được đánh giá về : chiều dài mồi (L), phần trăm GC (%GC), nhiệt độ nóng chảy (Tm), mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc (Hairpn dimer), cấu trúc tự bắt cặp (Homo dimer), cấu trúc bắt cặp chéo giữa hai mồi(Hetero dimer). Các giá trị ΔG của cấu trúc thứ cấp đều nằm trong khoảng tối ưu nhất khi đánh giá thông số vật lý của mồi (∆G đều lớn hơn -9Kcal/mol), mồi đạt yêu cầu. Kích thước sản phẩm sau khi khuếch đại được dự đoán và kiểm tra độ nhạy dựa trên việc phân tích sự bắt cặp của mồi và trình tự DNA của chủng B95-8 có mã truy cập là V01555.2 được thu nhận từ ngân hàng gene NCBI.
Nhằm kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi L30-F, R và ET1, 2-F, R, phần mềm BLAST được sử dụng để so sánh độ tương đồng của trình tự cặp mồi với các trình tự DNA trong CSDL. Những khối màu trái và phải này nối với nhau bởi một đường kẻ mỏng màu đen cho biết rằng mồi xuôi và mồi ngược cùng xuất hiện trên một trình tự lưu trữ trong CSDL GenBank của NCBI. Từ các kết quả khảo sát về thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ tương đồng của các cặp mồi trên CSDL, cặp mồi L30-F, R và ET1, 2-F, R được xác định phù hợp để sử dụng cho thực nghiệm của nghiên cứu.
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
Các ký tự dưới đây chỉ ra amino acid được viết trong mã so sánh với tham chiếu trình tự: dấu hoa thị (*) biểu thị amino acid không thay đổi; dấu cộng (+) biểu thị sự thay đổi im lặng amino acid; và dấu trừ (-) biểu thị amino acid đã bị xóa, so với nguyên mẫu B95-8 trình tự amino acid (từ codon 342 đến codon 355). Qua đó, các kết quả cũng chứng minh được sự chính xác của kích thước băng sản phẩm PCR với cặp mồi này, cụ thể, sản phẩm PCR có kích thước băng 156 bp đúng là của mẫu có hiện diện đột biến 30-bp deletion, cũng theo đó, sản phẩm PCR băng 186 bp cũng chính là băng sản phẩm của mẫu không mang đột biến. Điều này cho thấy, đa hình 30-bp del chiếm ưu thế trong sinh thiết của UTVH và hiện diện khá phổ biến trong mẫu sinh thiết UTVH tại Việt Nam (tần số mẫu bệnh hiện diện 30-bp del gấp 1,57 lần so với mẫu bệnh không hiện diện đa hình này).
Do đó, 30-bp deletion xảy ra sẽ gây ảnh hưởng tới chức năng và hoạt động của CTAR2, từ đó ảnh hưởng lên hoạt động gene LMP1, dẫn đến sự tăng hoạt động gây ung thư của các tế bào bị nhiễm bệnh và hình thành kiểu hình tích cực hơn cho các khối u liên quan đến EBV (77, 78). Ngoài ra, sự xuất hiện biến thể C169426T là một đột biến mới của đa hình XhoI-loss, cũng như một mẫu mang song song cả hai biến thể XhoI-loss trở thành một trong những dữ liệu quan trọng và tiềm năng để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn về gene LMP1 sau này. Sự xuất hiện của các biến thể mới chưa được công bố (C169373G, C169426T và G169422T) cho thấy tính đa dạng trong cấu trúc gene LMP1 của EBV trên bệnh nhân UTVH tại Việt Nam, cũng như tiềm năng phát triển chúng trở thành các dấu chứng sinh học tiêu biểu của gene LMP1 trên bệnh nhân UTVH nước ta.
Có hai đột biến amino acid chính, đó là đột biến nucleotide làm thay đổi từ aid amin ban đầu thành một amino acid khác (đột biến có ý nghĩa) và có đột biến nucleotide nhưng chỉ làm thay đổi trình tự amino acid nhưng không làm thay đổi amino acid tổng hợp được (đột biến im lặng). Do có các đột biến này, chuỗi LMP1 sẽ bị thay đổi cấu trúc amino acid và gây ra những ảnh hưởng tích cực hoặc tiêu cực (hoặc cũng có thể không gây ảnh hưởng ) lên chức năng gene LMP1, cũng như có thể tác động lên cơ chế sinh ung thư vòm họng của gene LMP1.
