TỔNG QUAN
Tổng quan về ung thư vú
I.1.1 Tổng quan về tình hình ung thư vú trên thế giới và Việt Nam:
Ung thư vú là loại ung thư thường gặp nhất và gây tử vong hàng đầu ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới Theo Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC), ước tính trong năm 2008, có 1380000 trường hợp ung thư vú được chẩn đoán (chiếm 23% của tất cả các bệnh ung thư) Theo kết quả xếp hạng của Globocan năm 2008, ung thư vú là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ năm trong các loại bệnh ung thư và là loại ung thư phổ biến nhất ở cả khu vực các nước phát triển và đang phát triển, ước tính có khoảng 690000 trường hợp được phát hiện ở mỗi khu vực Tại Việt Nam, ung thư vú là loại ung thư có tần suất cao nhất ở Hà Nội và cao thứ hai sau ung thư cổ tử cung ở thành phố Hồ Chí Minh Năm 2008, theo thống kê của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC), ung thư vú ở phụ nữ Việt Nam đứng vị trí thứ ba sau ung thư gan và phổi, với 6830 trường hợp mắc bệnh (chiếm 15.6% trong các loại bệnh ung thư) và 2423 ca tử vong mỗi năm (chiếm 5.7% các trường hợp mắc bệnh)
I.1.2 Các nguyên nhân dẫn đến ung thư vú, phân loại, phương pháp phát hiện và điều trị:
I.1.2.1 Các nguyên nhân dẫn đến ung thư vú:
Ung thư vú là loại ung thư có nguồn gốc từ mô vú, phổ biến nhất là từ lớp lót bên trong của các ống dẫn sữa hoặc từ các tiểu thùy nơi phân phối các ống dẫn sữa Nguyên nhân của ung thư vú chưa được biết rõ, nhưng với những nghiên cứu dịch tễ học cùng với những hiểu biết sâu hơn về sinh học của tế bào tuyến vú đã mang lại những cơ sở mới cho bệnh này Ung thư vú xuất hiện thông qua các tác nhân môi trường và di truyền (Henson & Tarone, 1994) Hầu hết các tác nhân như là kinh nguyệt sớm, có con muộn và mãn kinh muộn, không sinh con, béo phì, hoặc do bức xạ ion… có liên quan đến sự gia tăng nguy cơ bị ung thư vú ở phụ nữ (Feigelson & Henderson, 1996) Các bệnh nhân có tiền sử gia đình bị ung thư vú khi trẻ tuổi, và nhiều thành viên gia đình bị ảnh hưởng thì nguy cơ mắc càng cao (Pharoah et al., 1997)
I.1.2.2 Phân loại ung thư vú:
Nguyễn Phan Cẩm Trang 6 Theo American Cancer Society (2011), việc phân loại thường bệnh thường bao gồm các khía cạnh sau: các giai đoạn bệnh (Tumor-lympho Nodes-Metastasis (TNM)), bệnh lý, lớp, tình trạng thụ thể và sự có mặt hay vắng mặt của các gen được xác định bởi thử nghiệm DNA
Việc phân loại ung thư vú theo TNM dựa vào: kích thước của khối u nguyên phát (T-tumor), giai đoạn có hoặc không có các khối u đã di căn tới các hạch bạch huyết (N-lympho nodes) ở nách và cuối cùng là khối u đã di căn (M-metastasis) trong cơ thể Theo phân loại TNM, bệnh có 5 giai đoạn chính:
- Giai đoạn 0: là giai đoạn tiền ung thư với tình trạng đánh dấu như ung thư ống dẫn sữa tại chỗ (DCIS- Ducal in situ) hoặc ung thư biểu mô thùy tại chỗ (LCIS- in situ lobular carcinomas)
- Giai đoạn 1-3: được xác định là giai đoạn đầu của bệnh với một tiên lượng tốt
- Giai đoạn 4: được xác định là giai đoạn di căn của bệnh với một tiên lượng xấu
I.1.2.3 Phương pháp phát hiện và điều trị ung thư vú:
Bệnh ung thư vú diễn biến âm thầm, đa phần được chính người bệnh phát hiện khi họ nhận thấy một sự thay đổi ở tuyến vú Các phương pháp chẩn đoán trước đây chủ yếu là phát hiện khi bệnh đã vào giai đoạn tiến triển của khối u Nếu việc tự khám vú theo tiêu chuẩn y tế hoặc chụp nhũ ảnh đã cho thấy triệu chứng bất thường (Pisano et al., 2005), có thể lấy dịch hay tế bào để thử nghiệm chỗ bất thường có dạng u nang tức là bướu nước (cyst) bằng cách dùng kim nhỏ (Aspiration) Nếu phương pháp này không cho kết quả, có thể sử dụng phương pháp sinh thiết (Biopsy), trích mô với sự hướng dẫn của quang tuyến (Stereotactic Biopsy), hoặc phương pháp siêu âm phân biệt được bướu đặc và bướu nước để chẩn đoán Nhiều phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác cũng được sử dụng trong chẩn đoán ung thư vú như: cắt lớp điện toán CT scan, chụp cộng hưởng từ MRI Các xét nghiệm giúp đánh giá tình trạng di căn xa và đánh giá đáp ứng điều trị như: tìm thụ thể với estrogen, đo nồng độ estradiol tự do trong máu, xét nghiệm máu, sinh hoá, siêu âm, X-quang (theo American Cancer Society, 2011)
Nguyễn Phan Cẩm Trang 7 Tùy vào giai đoạn của bệnh sẽ sử dụng các phương pháp chữa trị khác nhau Ung thư vú được chữa trị bằng cách phẫu thuật cắt bỏ khối u, sau đó có thể kết hợp điều trị bằng hóa trị và xạ trị Thuốc sử dụng điều trị bổ trợ ung thư vú chia thành 3 nhóm là: liệu pháp hormone ngăn chặn, hóa trị và các kháng thể đơn dòng Các loại thuốc này được dùng sau khi phẫu thuật hoặc đưa vào trong phẫu thuật dưới dạng tá dược Trong nhóm liệu pháp hormone ngăn chặn, sử dụng thuốc kháng các thụ thể estrogen (ví dụ như tamoxifen), thuốc ức chế enzyme aromatase (Anastrozole, letrozole ) Với liệu pháp hóa trị, phương pháp điều trị phổ biến là sử dụng các hóa chất như cyclophosphamide và doxorubicin (adriamycin) (CA); hoặc cyclophosphamide, methotrexate và fluorouracil (CMF) Trong liệu pháp dùng kháng thể đơn dòng, trastuzumab là kháng thể đơn dòng được sử dụng để kháng lại thụ thể tăng trưởng biểu bì - HER2/neu (Jahanzeb, 2008)
Ung thư vú có thể phòng ngừa và chữa trị kịp thời nếu phát hiện ở giai đoạn sớm, điều này sẽ làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư ở phụ nữ Do đó, việc tìm ra một dấu chứng sinh học phát hiện bệnh và các giai đoạn của bệnh là điều cấp thiết.
Tổng quan về Epigenetics
Epigenetics được định nghĩa là sự thay đổi di truyền trong sự biểu hiện của gen liên quan đến những thay đổi cấu trúc DNA nhưng không liên quan đến thay đổi trình tự DNA và được di truyền một cách ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác (Nephew & Huang, 2002)
Epigenetics bao gồm các hiện tượng sau: sự methyl hóa DNA, các biến đổi histone (phosphoryl hóa, acetyl hóa và methyl hóa (hình 1.1)), và microRNAs (Brooks et al., 2009) Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào hiện tượng methyl hóa DNA và biến đổi histone, vì chúng có liên quan mật thiết với nhau trong quá trình hình thành ung thư
H ì nh 1.1: Hi ện tượ ng Epigenetics (s ự methyl h ó a DNA v à bi ến đổ i histone) I.2.1 Hiện tượng methyl hóa DNA:
Sự methyl hóa DNA là một hiện tượng bình thường xảy ra trong quá trình phát triển của tế bào Nó đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát các chu trình thuộc tế bào, sự phát triển của phôi, quá trình phiên mã, sự bất hoạt nhiễm sắc thể X và việc đánh dấu bộ gen (Hirst & Marra, 2008) Ở người, sự methyl hóa DNA được tìm thấy xuyên suốt bộ gen, nhóm –CH3 được bổ sung tại vị trí C5 của cytosine đứng trước guanine trong cặp dinucleotide CpG (Laird, 2003; Hirst & Marra, 2008) Trong các tế bào của người có khoảng 70-80% dinucleotide CpG bị methyl hóa Các cặp dinucleotide CpG phân bố không đồng đều trong bộ gen, chúng trải dài trên trình tự gen và xen kẽ với các vùng không bị methyl hóa Vùng DNA giàu dinucleotide CpG có kích thước khoảng 0.5-4 kb gọi là đảo CpG (Brooks et al., 2009) Các đảo CpG thường kéo dài từ đầu 5’ đến exon đầu tiên trong vùng điều khiển gen, ở các tế bào bình thường phần lớn các đảo này không bị methyl hóa, chỉ những phân nhóm riêng biệt từ vùng promoter đến vùng exon đầu tiên của gen bị methyl hóa (Brooks et al., 2009; Szalmás & Kónya, 2009)
Hiện tượng methyl hóa DNA xảy ra sau quá trình tổng hợp DNA, quá trình này được thực hiện bởi các enzyme chuyển nhóm methyl từ chất cung cấp methyl
S-adenosylmethionine (SAM) đến vị trí C5 của cytosine (hình 1.2) (Laird, 2003) Đây là một hệ enzyme chuyên dụng có tên DNA methyltransferase (DNMTs) trong đó có 3 enzyme DNA methyltransferase 1, 3A, 3B (DNMT1, 3A, 3B) sẽ trực tiếp
Nguyễn Phan Cẩm Trang 9 tham gia quá trình methyl hóa DNMT1 là enzyme hoạt động chính ở động vật hữu nhũ, làm nhiệm vụ duy trì sự methyl hóa ổn định của các tế bào soma khác nhau trong suốt quá trình sao chép DNA Trong khi đó, DNMT3A và DNMT3B được cho rằng có liên quan tới quá trình de novo methyl hóa tạo nên các vị trí methyl hóa mới (Laird, 2003; Szalmás & Kónya, 2009) Các enzyme DNMTs được coi như
“ứng cử viên” dùng để đánh giá những thay đổi, sự phân bố của hiện tượng de novo methyl hóa khác thường và dẫn tới sự phát triển của ung thư Thực vậy, việc biểu hiện quá mức hoặc thay đổi cấu trúc của tất cả DNMTs trong các tế bào bình thường có thể gây nên các hiện tượng methyl hóa khác thường của DNA Điển hình cho hiện tượng methyl hóa khác thường này là sự tăng và giảm mức độ methyl hóa DNA Trong đó, hiện tượng DNA bị methyl hóa tăng cao được đặc trưng bởi sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen ức chế khối u, nhóm gen gây ung thư, nhóm gen tham gia vào điều hòa chu trình tế bào… xuất hiện từ rất sớm trong quá trình phát sinh ung thư Sự methyl hóa quá mức của đảo CpG tại vùng promoter của gen ảnh hưởng nghiêm trọng đến biểu hiện của gen kìm hãm và làm cho gen không phiên mã được dẫn tới ung thư (hình 1.3) (Nephew & Huang, 2002) Như vậy, sự methyl hóa DNA có liên quan trực tiếp đến việc khởi xướng ung thư Sự methyl hóa quá mức tại vùng promoter của các gen ức chế khối u và các gen có liên quan đến khối u thường được tìm thấy trong các tế bào ung thư (Laird, 2003)
H ì nh 1.2: S ự b ổ sung nh ó m – CH 3 v à o v ị tr í 5’ của cytosine nhờ DNMTs
H ì nh 1.3: S ự methyl h ó a trong t ế b à o b ình thườ ng v à t ế b ào ung thư
Histone là thành phần cơ bản của nhiễm sắc thể, có thể bị biến đổi acetyl hóa, phosphoryl hóa và methyl hóa (Brooks et al., 2009) (hình 1.4) Sự acetyl hóa lysine của histone-3 (H3), histone-4 (H4) được thực hiện bởi histone acetyltransferase (HATs) đưa đến kết quả nhiễm sắc thể sẽ tháo xoắn nhiều hơn và phiên mã Bên cạnh đó, histone còn bị deacetyl hóa bởi histone deacetylases (HDACs), khi hiện tượng deacetyl hóa histone xảy ra sẽ hình thành nên trạng thái rắn chắc của nhiễm sắc thể liền kề với DNA methyl hóa làm cho nhiễm sắc thể không tiến đến phiên mã được (Szalmás & Kónya, 2009) Như vậy, enzyme HATs như một chất kích hoạt và enzyme HDACs là một chất ức chế quan trọng trong sự điều khiển quá trình phiên mã (Nephew & Huang, 2002) Sự methyl hóa các CpG trong trình tự DNA gắn kết với các vùng biến đổi protein (DNA methyl-CpG binding domain proteins (MBPs)) và DNMT1 có thể khôi phục HDACs để methyl hóa promoter Các phức hợp này liên quan đến sự methyl hóa đảo CpG và đồng ức chế các hoạt động phiên mã của gen (Nephew & Huang, 2002; Szalmás & Kónya, 2009) Có thể nói, những thay đổi của các mẫu biến đổi histone tham gia trực tiếp vào việc phát triển của ung thư (Hirst & Marra, 2008) Các biến đổi histone là sự kiện đầu tiên khởi xướng sự im lặng của gen, trong khi sự methyl hóa quá mức của đảo CpG là một sự kiện đến sau thiết lập trạng thái im lặng của gen (Nephew & Huang, 2002) Cả hai hiện tượng này đều được tìm thấy trong các mô của nhiều loại ung thư
Hình 1.4: Các biến đổi histone ảnh hưởng đến quá trình phiên mã
Tổng quan về gen RASSF1A
I.3.1 Cấu trúc, chức năng của gen RASSF1A:
RASSF1A (Ras association domain family 1 isoform A) hay còn được biết đến với các tên khác như 123F2, NORE2A, RAD32, REH3P21 là một gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) nằm trong vùng 3p21.3 trên nhiễm sắc thể số 3 của bộ gen người (Donninger et al., 2007) RASSF1 kéo dài khoảng 18000 bp, bao gồm 8 exon và 7 intron, phát triển thành 8 vùng phiên mã khác nhau từ RASSF1A tới RASSF1H (Donninger et al., 2007) Trong đó, RASSF1A có các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho một chuỗi polypeptide ngắn có 340 amino acid với trọng lượng phân tử là 38,8 kD (Pfeifer & Dammann, 2005; Richter et al., 2009)
Trong tế bào bình thường, RASSF1A là gen ức chế khối u tham gia vào con đường điều hòa sự phát triển và chết theo chu trình của tế bào (apoptosis) (Pfeifer & Dammann, 2005) RASSF1A đồng định vị (co-localizes) với các sợi thoi (microtubules) ở kì trung gian, với các sợi tơ vô sắc (spindle) và trung thể (centrosome) trong suốt quá trình nguyên phân Sự tái biểu hiện của RASSF1A trong các dòng tế bào thụ động sẽ dẫn tới ổn định các sợi thoi và bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân phân hủy polymer thành các monomer Khi RASSF1A liên kết với các sợi thoi thì các biến đổi của nó bị thiếu hụt dẫn tới ức chế tổng hợp
Nguyễn Phan Cẩm Trang 12 DNA và ức chế sự phát triển của tế bào (Pfeifer & Dammann, 2005; Reuter & Horsthemke, 2005)
Bên cạnh đó, RASSF1A có thể gây kìm hãm chu trình tế bào bằng sự lôi kéo protein Rb (protein Retinoblastoma) đánh dấu kiểm soát chu trình tế bào Nó ức chế quá trình tích lũy của cyclin D1 - gen điều khiển hiện tượng phosphoryl hóa Rb và kiểm soát chương trình chết của tế bào từ pha G1 Nhờ vậy, RASSF1A có thể ức chế quá trình tiếp diễn của chu trình tế bào tại giai đoạn chuyển đổi G1/S Đồng thời, sự kìm hãm phát triển tế bào của RASSF1A cũng có thể mất đi do sự biểu hiện lệch lạc của các cyclin (Shivakumar et al., 2002; Richter et al., 2009) Mặt khác, chu trình tế bào có thể bị kiểm soát gián tiếp khi RASSF1A liên kết với Cdc20 - một nhân tố điều hòa chu trình tế bào chủ yếu cần thiết cho việc hoàn tất quá trình nguyên phân, nó hoạt động như tác nhân kích hoạt của phức hợp kích thích kì sau APC (anaphase-promoting complex) Sau khi liên kết với RASSF1A, Cdc20 sẽ không kích hoạt APC và chu trình tế bào sẽ bị chặn lại tại thời điểm trước kì giữa nguyên phân (Pfeifer & Dammann, 2005; Reuter & Horsthemke, 2005; Donninger et al., 2007) Như vậy, RASSF1A hoạt động trong giai đoạn trước kì giữa của nguyên phân sẽ trì hoãn quá trình này diễn ra, từ đó ngăn chặn hiện tượng đứt gãy của các cyclin và ổn định chúng (Song et al., 2004) Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Liu và cộng sự, sự tương tác giữa RASSF1A và phức hợp Cdc20-APC đã không được xác nhận (Liu et al., 2007) Vì vậy, vai trò của Cdc20-APC trong việc RASSF1A kiểm soát gián tiếp chu trình tế bào cần được nghiên cứu sâu hơn (Pfeifer & Dammann, 2005; Donninger et al., 2007)
Vai trò của RASSF1A còn được chứng minh như một nhân tố kích hoạt con đường chết theo chương trình của Ras - protein hoạt động liên quan đến tăng cường sự phát triển, chuyển hóa và tồn tại của tế bào (Pfeifer & Dammann, 2005; Donninger et al., 2007) Cũng như NORE1A (novel Ras effector 1 isoform A)- nhân tố kích hoạt Ras, RASSF1A có thể kết hợp với các enzyme điều hòa quá trình
“tiền apoptosis” (pro-apoptosis) serine/threonine kinase MST1, MST2 (mammalian sterile twenty) để điều khiển Ras theo con đường chết theo chương trình (Pfeifer & Dammann, 2005; Reuter & Horsthemke, 2005; Richter et al., 2009) Thực vậy, khi
Nguyễn Phan Cẩm Trang 13 RASSF1A và NORE1A tương tác với MST1 tạo phức hợp NORE1A/RASSF1A- MST1 sẽ kích hoạt cho con đường chết theo chu trình tế bào Phức hợp này đại diện cho con đường chết theo chu trình bất thường được điều khiển bởi Ras trong tế bào (Khokhlatchew et al., 2004), từ đó dẫn tới kìm hãm sự phát triển của khối u Có thể tóm tắt và trò sinh học của RASSF1A bằng sơ đồ sau:
Hình 1.5 : Tóm tắt vai trò sinh học của RASSF1A I.3.2 Hiện tượng methyl hóa RASSF1A trong ung thư và ung thư vú:
Sự im lặng của các gen bởi sự methyl hóa DNA là hiện tượng phổ biến được tìm thấy trong các tế bào ung thư ở người Trong đó, các hoạt động methyl hóa của vùng promoter đóng vai trò chủ yếu trong việc làm mất đi chức năng sinh học cố định của các gen ức chế khối u Hiện tượng mất biểu hiện của các gen RASSF1A do sự methyl hóa quá mức ở vùng promoter thường được tìm thấy trong các loại bệnh ung thư (Herman & Baylin, 2003)
Sự methyl hóa bất thường promoter gen RASSF1A, thường được phát hiện trong nhiều loại ung thư như: ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi, ung thư đầu và cổ, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng… (Lewis et al., 2005; Pfeifer & Dammann, 2005; Weyden & Adams, 2007; Kioulafa et al., 2009) Hiện tượng methyl hóa của RASSF1A hiếm khi được tìm thấy trong các mô bình thường, nhưng nó lại được tìm thấy trong vài mẫu mô không ung thư gần kề với các khối u Khi chữa trị với tác nhân làm giảm sự methyl hóa 5-aza-2’-deoxycytidine sẽ tái hoạt
Nguyễn Phan Cẩm Trang 14 động biểu hiện của RASSF1A Ngoài ra, hiện tượng methyl hóa promoter RASSF1A đã được mô tả trong quá trình gia tăng biểu mô và hình thành khối u ống nội dẫn của vú, cũng như các mô ung thư điều này đưa đến nhận định rằng sự methyl hóa
RASSF1A là một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thư vú (Weyden
& Adams, 2007) Theo kết quả của nhiều công trình nghiên cứu sự methyl hóa tại các đảo CpG của gen RASSF1A được xem là sự kiện xảy ra trước và theo sau đó là sự mất đoạn ở vùng nhiễm sắc thể 3p (Dammann et al., 2001; Kioulafa et al., 2009)
Sự methyl hóa của RASSF1A có tiềm năng là dấu chứng sinh học ung thư lý tưởng - phát hiện mức độ tần số methyl hóa cao trong phạm vi rộng của các loại ung thư, đồng thời còn tìm thấy hiện tượng methyl hóa tương đối hiếm gặp trong các mô bình thường (Lehman et al., 2002; Xing et al., 2004; Yegnasubramanian et al., 2004; Xu et al., 2009) Vì vậy, sự methyl hóa của gen RASSF1A được cân nhắc sử dụng trong lâm sàng như một dấu chứng chẩn đoán cho việc phát hiện ung thư sớm, như một dấu chứng tiên lượng để dự đoán nguy cơ phát triển của ung thư từ sự phát triển của khối u lành tính, dự đoán việc tiên lượng bệnh của các bệnh nhân với khối u đã được chẩn đoán và thậm chí như một dấu chứng cho sự đề kháng của một số phương pháp điều trị (Weyden & Adams, 2007) Dấu chứng chẩn đoán là nó chứng tỏ rằng các bệnh nhân ung thư có sự gia tăng mức độ của DNA tự do trong dịch huyết thanh giải phóng từ các tế bào ung thư (Leon et al., 1977; Stroun et al., 1989) Giá trị của hiện tượng methyl hóa của RASSF1A như một dấu chứng chẩn đoán đã được nghiên cứu cặn kẽ trong ung thư phổi, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư trực tràng, ung thư bàng quan và nhiều loại ung thư khác Dấu chứng tiên lượng của RASSF1A cho một số loại ung thư có liên quan giữa sự methyl hóa của
RASSF1A với điều kiện bệnh bất lợi đã được theo dõi Nói chung, sự methyl hóa của RASSF1A kết hợp với các gen khác có liên quan đến khối u, có thể là một dấu chứng hữu dụng chẩn đoán quá trình phát triển và di căn khối u ở nhiều loại ung thư trong đó có ung thư vú (Evron et al., 2001; Lee, 2007; Weyden & Adams, 2007; Xu et al., 2009)
Hiện nay, trên thế giới nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh hiện tượng methyl hóa đáng kể của RASSF1A đã được tìm thấy trong khối u ở các giai đoạn trễ
Nguyễn Phan Cẩm Trang 15 hơn, cũng như giai đoạn xâm lấn hoặc di căn của khối u ở nhiều loại ung thư trong đó có ung thư vú (Weyden & Adams, 2007) Theo Pubmeth (http://matrix.ugent.be/temp/FriJul80542122011/breast_RASSF1.html), các nghiên cứu về sự methyl hóa của gen RASSF1A trong ung thư vú đã được tiến hành, với tổng số mẫu là 593 và tần số methyl hóa xác định được là 60-80% (72%) Có thể kể đến một số công trình tiêu biểu sau:
- Công trình nghiên cứu của Lehmann và cộng sự năm 2002, đã mô tả sự methyl hóa của promoter RASSF1A trong quá trình gia tăng biểu mô và hình thành khối u ống nội dẫn của vú, cũng như các mô ung thư cho thấy rằng sự methyl hóa
RASSF1A là một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thư vú (Lehman et al., 2002)
Các phương pháp phát hiện sự methyl hóa DNA
Việc phân tích sự methyl hóa của DNA được tiến hành với bước đầu tiên là biến đổi sodium bisulfite DNA bộ gen Phản ứng xử lý sodium bisulfite được sử dụng để phân biệt cystosine và cystosine methyl hóa (5mC) trong DNA Dưới tác dụng của sodium bisulfite tất cả các cystosine không bị methyl hóa sẽ được chuyển hóa thành uracil (hình 1.6), trong khi đó các cystosine methyl hóa không bị tác động và vẫn giữ nguyên trạng thái (Herman et al., 1996; Laird, 2003) Như vậy, biến đổi
Nguyễn Phan Cẩm Trang 16 sodium bisulfite sẽ cho biết sự thay đổi đặc biệt trên trình tự DNA và tình trạng methyl hóa cho đoạn gen
Hình 1.6: Xử lý sodium bisulfite và sự chuyển đổi cytosine thành uracil I.4.1.Phương pháp MSP:
Phương pháp MSP do Herman và cộng sự tìm ra vào năm 1996, được sử dụng để phân tích nhanh tình trạng methyl hóa của các đảo CpG MSP thực chất là một kĩ thuật PCR mới có độ nhạy phát hiện đến 0.1% các alen bị methyl hóa của vùng đảo CpG khảo sát và đặc hiệu cho việc đánh giá sự methyl hóa của hầu như bất kì vị trí CpG thuộc đảo CpG (Herman et al., 1996)
MSP là phản ứng PCR tiến hành với mạch khuôn DNA đã biến đổi sodium bisulfite, khuếch đại bởi hai cặp mồi methyl và không methyl được thiết kế để phân biệt giữa các allen bị methyl hóa và không bị methyl hóa, cũng như để phân biệt giữa DNA đã biến đổi sodium bisulfite với DNA chưa bị biến đổi bằng hai phản ứng độc lập (hình 1.7) Để đạt được các mục tiêu này thì các trình tự mồi cho phản ứng MSP thường thiết kế chứa nhiều cytosine và có các cặp CpG nằm gần vị trí 3’ của các mồi (Herman et al., 1996)
Hình 1.7: Phương pháp MSP
Q-MSP (Quantitative real time MSP) là phương pháp PCR định lượng hay PCR thời gian thực kết hợp phương pháp MSP, tiến hành với DNA đã được biến đổi sodium bisulfite (Wisman et al., 2006) Phản ứng PCR định lượng theo thời gian thực dựa trên việc xác định chính xác hàm lượng sản phẩm của phản ứng PCR tạo ra ở từng thời điểm trong quá trình phản ứng Việc xác định hàm lượng sản phẩm tại từng thời điểm dựa trên cơ sở các chất phát huỳnh quang bao gồm hai nhóm: nhóm các chất phát huỳnh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu và nhóm các phân tử gắn chèn vào DNA mạch đôi Số lượng trình tự mục tiêu trong phản ứng bắt đầu được đếm kể từ chu kì PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang vượt khỏi tín hiệu nền Dựa vào đường cong hàm lượng của một trình tự dùng làm chuẩn có thể suy ra được hàm lượng trình tự mục tiêu trong mẫu ban đầu (Hồ, 2008) Phản ứng Q-MSP gồm hai phản ứng độc lập sử dụng hai cặp mồi methyl và unmethyl (hình 1.8)
Hình 1.8: Phương pháp Q - MSP với mẫu dò thủy giải I.4.3 Phương pháp BSP:
BSP (Bisulfite sequencing PCR) là phản ứng PCR diễn ra qua hai bước: bước đầu tiên là biến đổi sodium bisulfite DNA, sau đó thực hiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự DNA đã được biến đổi bởi các mồi đặc hiệu (hình 1.9) Sản phẩm PCR có thể được sử dụng theo ba cách sau: (1) giải trình tự dòng và trình tự con để khảo sát tình trạng methyl hóa trong các phân tử độc lập, (2) giải trình tự trực tiếp để kiểm tra quá trình methyl hóa đặc biệt trên các mạch cho toàn bộ các phân tử, (3) kết hợp với các enzyme cắt giới hạn nhạy với hiện tượng methyl hóa để kiểm tra sự methyl hóa của vị trí CpG đặc biệt (Li & Dahiya, 2002)
Hình 1.9: Phương pháp BSP
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Nghiên cứu sử dụng 27 mẫu mô vú được đúc trong paraffin được chẩn đoán tại bệnh viện Đại học Y Dược, bộ môn Giải phẫu bệnh ĐH Y Dược TP HCM từ năm
2010, 2011 Phần mô (phẫu thuật cắt bỏ) từ các bệnh nhân ung thư vú nói trên, sẽ được đúc và bảo quản ở nhiệt độ -30 o C đến khi sử dụng
DNA chứng methyl hoặc không methyl của bộ kit 59695 Qiagen.
Phương pháp
II.2.1 Các phần mềm và trang web sử dụng:
• Phần mềm Annhyb- 4.944, phiên bản năm 2011: kiểm tra vị trí bắt cặp và sản phẩm tạo thành của mồi
• Phần mềm trực tuyến IDT www.idtdna.com: xác định các thông số của mồi
• Trang web www.ncbi.nlm.nih.gov: lấy trình tự gen khảo sát
• www.urogen.org để xác định các đảo CpG
• http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html: xác định các nhân tố phiên mã
• http://medgen.ugent.be/methBLAST/: kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
II.2.2 Khảo sát in silico:
II.2.2.1 Thu nhận gen xác định vị trí vùng cần tìm:
Từ ngân hàng gen www.ncbi.nlm.nih.gov chúng tôi thu nhận được trình tự nucleotide của gen RASSF1A
Sử dụng phần mềm trực tuyến Methprimer trên trang web http://www.urogen.org để xác định vị trí các đảo CpG trong cả vùng gen
II.2.2.2 Phương pháp đánh giá, thiết kế mồi:
Chúng tôi sử dụng giá trị ngưỡng (76.0) trên chương trình trực tuyến TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) để xác định vị trí nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng promoter của các gen
Chúng tôi thiết kế mồi cho phản ứng MSP bằng chương trình MethPrimer trên trang web www.urogen.org và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi MSP bằng chương trình MethBlast trên trang web http://medgen.ugent.be/methBLAST/
Nguyễn Phan Cẩm Trang 22 Khả năng bắt cặp bổ sung, vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm tạo thành của các cặp mồi trên gen RASSF1A được kiểm tra bằng phần mềm Annhyb- 4.944, phiên bản năm 2011
Cuối cùng, chúng tôi phân tích các thông số của mồi: Tm (nhiệt độ nóng chảy), chiều dài, tỷ lệ % GC, khả năng tạo các cấu trúc thứ cấp của mồi, bao gồm: self dimer, hairpin loop và hetero dimer bằng phần mềm trực tuyến IDT www.idtdna.com Qua đó, chúng tôi có thể sơ bộ đánh giá mức độ tối ưu trên lý thuyết của các cặp mồi
II.2.3 Khảo sát thực nghiệm:
Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo qui trình thực nghiệm (sơ đồ 2.1)
Sơ đồ 2.1: Quy trình thực hiện tổng quát II.2.3.1 Tách chiết DNA:
Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó protein sẽ được biến tính, loại bỏ bằng phenol/chloroform DNA bộ gen sẽ được tủa
Kiểm tra chất lượng DNA bằng PCR
Biến đổi sodium bisulfite Đọc kết quả
Nguyễn Phan Cẩm Trang 23 với ethanol lạnh Tuy nhiên, do đặc thù của nguồn mẫu (được đúc trong paraffin) chúng tôi sử dụng xylene để xử lý paraffin trước khi tiến hành tách chiết DNA
- Máy ly tâm lạnh Hettich
- Mẫu mô trong paraffin được cho vào eppendorf 1,5 ml Thêm 1 ml xylene, vortex 1 phút Ly tâm 13000 rpm/ 2 phút Lặp lại 3-5 lần, đặt ở nhiệt độ phòng 10 phút
- Thêm 1 ml Ethanol 100%, vortex 2 phút (2 lần)
- Thêm 700 μl lysis buffer, vortex nhẹ Ủ trong 48 o C/ 4-16 h
- Thêm 700 μl phenol:chloroform (1:1) Trộn đều, ly tâm 10000 rpm/ 3 phút Thu pha nước chứa DNA (500-600 μl) (lặp lại 2 lần)
- Thêm 1 vol chloroform Ly tâm 10000 rpm/ 3 phút, thu 300 μl dịch nổi
- Thêm 0,2 vol NH4OAC 5M; 2,5 vol Ethanol 100% Trộn đều Giữ ở nhiệt độ -20 o C trong 30 phút Ly tâm 13000 rpm/ 10 phút/ 4 o C Thu tủa
- Thêm 500 μl Ethanol 70% Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 4 o C
II.2.3.2 Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết:
Nồng độ DNA sau tách chiết được kiểm tra bằng máy quang phổ ở bước sóng
260 nm Các mẫu DNA được pha loãng trước khi kiểm tra Cứ 1 nồng độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm tương ứng với 50 μg/ml một dung dịch DNA sợi đôi
Nguyễn Phan Cẩm Trang 24 Độ tinh sạch của DNA được xác định thông qua tỉ số A260nm/A280nm, 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất Nếu tỉ số A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1,8-2,0 là DNA tinh sạch
DNA bộ gen sau khi xác định nồng độ được pha loãng bằng nước cất vô trùng để kiểm tra chất lượng DNA trước khi sử dụng chúng trong phản ứng biến đổi với sodium bisulfite
II.2.3.3 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phản ứng PCR:
PCR là phản ứng khuếch đại một trình tự DNA dựa vào đặc tính của DNA polymerase Một mồi xuôi và mồi ngược sẽ bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA prolymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới
- Itaq DNA polymerase Bio Rad
Ngoài việc kiểm tra chất lượng DNA bằng máy quang phổ, DNA sau khi tách chiết sẽ được khuếch đại với cặp mồi bắt trên gen người DcR1 (Lê et al., 2010), tạo sản phẩm 127 bp để kiểm tra chất lượng của DNA Cặp mồi được liệt kê trong bảng 3.4 Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng được liệt kê trong bảng 2.1, 2.2
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
10 mM dNTP mix 200 àM/ loại 0,3 iTaq DNA polymerase 0,75 U 0,15
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
II.2.3.4 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite Qiagen kit:
Mẫu DNA sau khi được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển các cytosine thành uracil trừ 5mC, được cố định trên màng của cột EpiTect Sau các bước rửa sạch muối, DNA được tách rửa khỏi màng bằng buffer EB
- Thành phần EpiTect Bisulfite Kit-59104 Qiagen
- Máy ly tâm lạnh Hettich
- Thêm 30 ml ethanol (96-100 %) vào buffer BW, và để ở nhiệt độ phòng 15-25 o C, chuyển vào chai nhiều lần trước khi bắt đầu quy trình
- Thêm 27 ml ethanol (96-100 %) vào buffer BD, và giữ ở 2-8 o C, chuyển vào chai nhiều lần trước khi bắt đầu quy trình
- Thêm 310 μl RNase-free water vào mỗi đơn vị Bisulfite Mix, vortex mạnh, và ủ ở 60 o C, trong 5 phút cho tan đều
- Chuẩn bị thành phần phản ứng biến đổi bisulfite: 20 μl (DNA + RNase- free water), 85 μl Bisulfite mix, 35 μl DNA protect buffer và ủ theo chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite của EpiTect bisulfite Kit
Bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút)
- Ly tâm nhẹ, chuyển vào eppendorf 1,5 ml
- Thêm 310 μl mix buffer BL - RNase carrier có nồng độ 10 μg/ml vào eppendorf vortex nhẹ, ly tâm nhẹ
- Thêm 250 μl Ethanol (96-100 %)/ mẫu, vortex 15 giây, ly tâm nhẹ
- Ly tâm 15000rpm/ 1 phút, bỏ dịch
- Thêm 500 μl buffer BW, ly tâm 15000 rpm/ 1 phút, bỏ dịch
- Thêm 500 μl buffer BD, ly tâm 15000 rpm/1 phút, bỏ dịch
- Thêm 500 μl buffer BW, ly tâm 15000rpm/ 1 phút, bỏ dịch (2 lần)
- Chuyển cột EpiTect vào một eppendorf 2 ml mới, ly tâm 15000 rpm/ 1 phút, để loại bỏ hết dịch
- Chuyển cột EpiTect vào một eppendorf 1,5 ml mới, mở nắp, để khô
- Ủ cột EpiTect ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
- Thêm 20 μl buffer EB, ly tâm 12000 rpm/ 1phút (2 lần)
- Bỏ cột, thu dịch chứa DNA vào eppendorf 1,5 ml mới; bảo quản ở -20 o C
MSP thực chất là phản ứng PCR bình thường Điểm khác biệt chủ yếu ở đây là phản ứng này sử dụng mạch khuôn DNA đã qua xử lý sodium bisulfite làm tất cả các cytosine không bị methyl hóa thành uracil Phản ứng MSP sử dụng hai bộ mồi methyl và unmethyl trong hai phản ứng PCR riêng biệt Sản phẩm sau khi PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose được nhuộm ethium bromide và quan sát dưới tia UV
- Itaq DNA polymerase Bio Rad
Trong phương pháp này mạch khuôn DNA đã được biến đổi với sodium bisulfite và sử dụng các cặp mồi chuyên biệt cho mẫu DNA methyl và không methyl húa Phản ứng được thực hiện trong tổng thể tớch 15 àl Với chu trỡnh nhiệt và thành phần phản ứng theo bảng 2.4, 2.5 Các cặp mồi được liệt kê trên bảng 3.1
Bả ng 2.4 : Thành phần của phản ứng MSP
Thành phần Nồng độ Thể tớch (àl)
10 mM dNTP mix 200 àM/ loại 0,3 iTaq DNA polymerase 0,75 U 0,15
Bảng 2 5 : Chu trình nhiệt của phản ứng MSP (X = 55 o C cho cặp mồi WT1, 53 o C cho cặp mồi WT2)
II.2.3.6 Điện di trên gel agarose:
Nucleic acid là những phân tử tích điện âm trên khắp bề mặt (do gốc phosphate PO4 3-) Do đó, trong điện trường, các phân tử nucleic acid sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ phụ thuộc vào điện tích và trọng lượng phân tử của chúng Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được quan sát dưới tia UV nhờ ethidium bromide được nhuộm vào gel có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid
- Ethidium bromide 10 mg/ ml Bio Rad
- Máy điện di Bio Rad
- Thang chuẩn 100bp (in vitro) Bio Rad
- Dung dịch nạp mẫu Bio Rad
Trong mỗi giếng của bản gel, nạp vào một hỗn hợp gồm 5 μl sản phẩm PCR và 1 μl dung dịch nạp mẫu Nạp 5 μl thang chuẩn 100 bp vào giếng Điện di 45 phút ở hiệu điện thế 80 V Kết thúc quá trình điện di, bản gel được đưa lên bàn đèn UV, chụp ở bước sóng 312 nm để phát hiện vạch kết quả 192 bp