0360KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GENE RECK TRONG UNG THƯ

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

Tổng quan bệnh ung thư

Ung thư là thuật ngữ chỉ khoảng 200 loại bệnh, đặc trưng bởi sự hình thành và tăng trưởng ác tính của các tế bào bất thường trong cơ thể Những tế bào này phân chia và phát triển không kiểm soát, xâm lấn các mô lân cận và có khả năng di căn đến các mô và bộ phận khác thông qua hệ thống bạch huyết và máu.

Ung thư là một bệnh lý phức tạp với nhiều nguyên nhân và giai đoạn phát triển khác nhau, bao gồm các loại như ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư đại trực tràng Việc phòng ngừa, tiên lượng, tầm soát và chẩn đoán sớm ung thư, ngay cả khi chưa có triệu chứng, có thể tăng cường hiệu quả điều trị và giảm nguy cơ tử vong cho bệnh nhân.

I.1.1 Tình hình ung thư trên thế giới

Hình 1.1: Tình hình ung thư trên thế giới [61]

Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở các khu vực trên thế giới [61]

Theo Global (2012), ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với khoảng 14,1 triệu trường hợp mới và 8,2 triệu ca tử vong trong năm 2012 Khoảng 57% các trường hợp ung thư mới và 65% ca tử vong do ung thư xảy ra ở các nước kém phát triển Tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở nam giới cao hơn nữ giới gần 25%, với tỷ lệ cao nhất ở nam giới tại Trung và Đông Âu, và thấp nhất ở Tây Phi Đối với nữ giới, tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao nhất ghi nhận ở Bắc Mỹ và Đông Phi, trong khi thấp nhất là ở Trung Mỹ và Nam Trung Bộ Châu Á.

Ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao ở phụ nữ, đặc biệt tại các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, nơi mà 20% ca tử vong do ung thư liên quan đến nhiễm HPV type độc (type 16, 18) Hai loại ung thư này chiếm hơn 60% tổng số ca mới được phát hiện trên toàn cầu, tập trung chủ yếu ở châu Phi, châu Á và Trung và Nam Mỹ, nơi khoảng 70% các trường hợp tử vong do ung thư xảy ra Theo dự đoán của WHO, tổng số ca tử vong do ung thư trên toàn thế giới sẽ tiếp tục gia tăng, đạt hơn 14 triệu ca vào năm 2030.

Các nghiên cứu dịch tễ học về ung thư vú chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh này có sự phân bố khác nhau theo địa lý, độ tuổi và các yếu tố nguy cơ như nơi cư trú, tiền sử gia đình, bệnh lý, sinh sản và những yếu tố khác.

I.1.2 Tình hình ung thư ở Việt Nam [67]

Theo thông tin từ WHO và IARC năm 2010, tỷ lệ ung thư ở Việt Nam là 137 nam và 94 nữ trên 100.000 người Ung thư vú là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở nữ giới, với khoảng 5.664 trường hợp được ghi nhận trong năm 2010, tương đương 13,6 trường hợp trên 100.000 phụ nữ Tại thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh miền Nam, trung bình có 26 trường hợp ung thư vú mới được phát hiện mỗi năm trên 100.000 phụ nữ Độ tuổi mắc bệnh ung thư vú ở Việt Nam phân bố như sau: 12,9% ở độ tuổi 40-50, 27,7% ở 45-54 tuổi, 18,5% ở 55-64 tuổi, và thấp nhất là 12,9% ở trên 65 tuổi.

Theo tổ chức IARC (2008), khu vực Đông Nam Á ghi nhận 5.174 ca ung thư cổ tử cung mới và 2.472 ca tử vong, chiếm 11,65% tổng số 44.404 ca trong khu vực, tương đương với tỷ lệ 11,7 ca trên 100.000 phụ nữ.

Năm 2010, một nghiên cứu tầm soát và phát hiện bệnh ung thư cổ tử cung tại 7 tỉnh thành ở Việt Nam cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở giai đoạn 1 là 19,9% và ở giai đoạn 2 là 21,4% Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng này là do nhiễm virus HPV loại độc (16,18).

Tại thành phố Hồ Chí Minh, ung thư cổ tử cung là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ, trong khi ở thành phố Hà Nội, ung thư vú lại chiếm tỷ lệ cao nhất.

Ung thư được phân loại dựa trên loại mô mà từ đó ung thư phát sinh, hay vị trí phát triển ban đầu trong cơ thể, như ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư đại trực tràng Theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới năm 1981, nhóm tác giả người Mỹ đã xây dựng một bảng phân loại, được áp dụng tại Bệnh viện K Hà Nội.

Nội và Trung tâm ung bướu Thành phố Hồ Chí Minh đã bắt đầu hợp tác từ năm 1993 với trường Đại học Wisconsin Hoa Kỳ và Hiệp hội Quốc tế phòng chống ung thư Sự hợp tác này nhằm nâng cao chất lượng điều trị và phòng ngừa ung thư tại Việt Nam.

− Ung thư biểu mô ống xâm nhập

− Ung thư biểu mô tuỷ

− Ung thư biểu mô biến thể tuỷ

− Ung thư biểu mô tiểu thuỳ xâm nhập

− Ung thư biểu mô biến thể tiểu thuỳ xâm nhập

− Ung thư biểu mô nhầy

− Ung thư biểu mô biến thể nhầy

− Ung thư biểu mô ống nhỏ

− Ung thư biểu mô biến thể ống nhỏ

− Ung thư biểu mô tại chỗ thể trứng cá

− Ung thư biểu mô tại chỗ không trứng cá

− Ung thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ

− Ung thư biểu mô ống vi xâm nhập,…

 Ung thư biểu mô (carcinoma)

Ung thư biểu mô là khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô và niêm mạc trong hoặc ngoài cơ thể, bao gồm ống tiêu hóa và các tuyến tiêu hóa Loại ung thư này chiếm 80-90% tổng số trường hợp ung thư, ảnh hưởng đến các cơ quan và tuyến có khả năng bài tiết, như tuyến vú, phổi, đại tràng, tuyến tiền liệt và bàng quang.

U lympho có xu hướng phát triển trong hệ bạch huyết (lá lách, amidan, và tuyến ức)

 Ung thư mô liên kết (sarcoma)

Ung thư mô liên kết là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ, gân, sụn, và chất béo

I.1.4 Các yếu tố đặc trưng của bệnh ung thư [71]

1.4.1 Phân độ mô học (histologic grade)

Khối u hình thành từ tế bào phát triển và phân chia không kiểm soát, có thể lành tính hoặc ác tính Tế bào ung thư xâm lấn và phá hủy mô lân cận, đồng thời có khả năng di căn sang các vùng khác của cơ thể Phân độ mô học là hệ thống phân loại tế bào ung thư dựa vào mức độ bất thường hình dạng và tốc độ phát triển của chúng Phân độ này phụ thuộc vào cấu trúc và kiểu phát triển của tế bào, với các yếu tố đặc hiệu cho từng loại ung thư Theo đánh giá của Contesso và Elston, độ của u được xác định qua tổng số điểm: độ 1 (3-5 điểm) là biệt hoá cao, độ 2 (6-7 điểm) là biệt hoá vừa, và độ 3 (8-9 điểm) là kém biệt hoá.

Giai đoạn ung thư xác định mức độ lan rộng và mức độ nghiêm trọng của bệnh, dựa trên các yếu tố như vị trí của khối u nguyên phát, kích thước khối u, số lượng khối u và sự di căn đến hạch bạch huyết.

I.2 Nguyên nhân gây ung thư

Ung thư phát sinh từ sự tương tác giữa yếu tố di truyền và các tác nhân bên ngoài, bao gồm tác nhân vật lý như bức xạ tử ngoại và ion hóa, tác nhân hóa học như amiăng, khói thuốc lá, aflatoxin và thạch tín, cùng với tác nhân sinh học như virus, vi khuẩn và ký sinh trùng Lão hóa cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của ung thư, với tỷ lệ mắc bệnh tăng lên rõ rệt theo độ tuổi (WHO, 2012).

Sự biến đổi “epigenetics” và methyl DNA

II.1 Sự biến đổi “epigenetics”

Epigenetics là sự thay đổi di truyền trong biểu hiện gene, liên quan đến thay đổi cấu trúc DNA mà không làm thay đổi trình tự DNA, và được di truyền ổn định qua các thế hệ Các cơ chế chính của epigenetics bao gồm methyl hóa DNA, biến đổi histone và microRNAs.

Methyl hóa DNA là quá trình thêm nhóm methyl (CH3) vào các nucleotide cytosine hoặc adenine trong DNA Những thay đổi methyl hóa này có thể điều hòa biểu hiện gene và có tính di truyền, dẫn đến sự hòa gene Ngoài ra, methyl hóa DNA cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của hầu hết các loại ung thư.

Methyl hóa DNA tại vị trí 5 của cytosine đóng vai trò quan trọng trong việc giảm biểu hiện gene, được phát hiện ở tất cả các loài động vật có xương sống đã được nghiên cứu Khoảng 60% đến 90% các vị trí nucleotide C trong các cặp CpG bị methyl hóa ở động vật có vú.

II.2 Đảo CpG Đảo CpG là chuỗi ngắn của DNA có chiều dài 0,5 kilobase đến một vài kilobase

[6], trong đó "p" chỉ ra sự liên kết phosphodiester giữa nucleotide cytosine và guanine

[42] Các đảo CpG thường được tìm thấy trong ở vùng 5-promoter kéo dài đến exon đầu

10 tiên của nhiều gene giữ nhà (house-keeping gene) và gene đặc trưng cho mô (tissue- specific genes) [11, 31]

II.3 Sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa bất thường có thể ảnh hưởng đến toàn bộ bộ gene của con người, không chỉ giới hạn ở một số gene cụ thể Các gene DNMTs, bao gồm DNMT1, DNMT3a, DNMT3b và DNML3L, mã hóa cho nhóm protein DNA methyltransferases, có vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình methyl hóa DNA Quá trình này diễn ra khi một nhóm methyl được chuyển từ S-adenosyl-L-methionine (SAM) vào carbon ở đầu 5’ của dinucleotide CpG.

Trong các mô bình thường, sự methyl hóa các đảo CpG ở vùng promoter gây ra hai cơ chế điều hòa biểu hiện gene: (1) Ức chế gắn kết của các yếu tố điều hòa gene vào vùng khởi động do gốc CH3 gắn vào Cytosin, và (2) Sự gắn kết đặc hiệu của các protein với CpG methyl hóa dẫn đến biến đổi histon, làm mất acetyl và co lại cấu trúc sợi chromatin, từ đó ngăn cản các yếu tố phiên mã gắn vào vùng DNA đó.

Sự methyl hóa bất thường, bao gồm hypermethylation trên các gene ức chế khối u và hypomethylation trên các oncogene, là những cơ chế chính dẫn đến sự thay đổi trong biểu hiện gene Hậu quả của sự methyl hóa này là kích hoạt các gene sinh ung hoặc bất hoạt các gene ức chế khối u Hiện tượng bất hoạt gene có thể xảy ra do giảm ái lực hoặc loại bỏ khả năng gắn kết của các yếu tố phiên mã vào vùng DNA bị methyl hóa, cũng như tương tác với các enzyme như DNMTs, histone deacetylase, và methyltransferase.

Hình 1.3: Methyl hóa ADN và điều hòa biểu hiện gene [57]

A) Hai nucleotid CpG ở vùng promoter không methyl hóa, cho phép thực hiện phiên mã trong các tế bào bình thường

B) Phiên mã bị chặn bởi tăng methyl hóa trong vùng promoter

Sự methyl hóa DNA bất thường đang trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong việc phát triển các phương pháp tiên lượng và chẩn đoán sớm bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư vú Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự methyl hóa bất thường tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gene ức chế khối u và các gene liên quan đến chu trình tế bào có thể dẫn đến sự hình thành và phát triển của khối u, cũng như di căn Hiện nay, việc sử dụng thuốc epigenetic, chất ức chế methyl hóa và chất ức chế HDAC, cả đơn lẻ và kết hợp với hóa trị liệu, đang được thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư.

Nghiên cứu nhằm xác định các dấu chứng sinh học tiềm năng để cải thiện khả năng tiên lượng và chẩn đoán sớm các loại bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư vú và ung thư cổ tử cung.

Tổng quan về gene RECK và protein RECK

The Gene RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) is located on chromosome 9 (9p13.3) and spans 88,023 base pairs, comprising 21 exons and 20 introns, with 13 SNPs identified This gene is highly expressed in normal tissues but is rarely found in cancer cell lines or fibroblast lines altered by oncogenes.

Hình 1.4: Vị trí gene RECK [72]

Gen RECK mã hóa protein RECK, một glycoprotein màng neo, đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự di căn của khối u bằng cách kiểm soát các metalloproteinase matrix (MMP-2, MMP-9 và MMP-14) và ức chế hình thành mạch máu Ảnh hưởng của nó đối với sự hình thành khối u chủ yếu thông qua các mối quan hệ với MMP.

MMP không chỉ làm suy yếu cấu trúc ngoại bào (ECM) và màng cơ bản mà còn ảnh hưởng đến sự phát triển, tự giết và di cư của tế bào khỏe mạnh Bằng cách sửa đổi hoặc phá hủy ECM, MMP đóng vai trò quan trọng trong việc di chuyển các tế bào khối u.

Hình 1.5 Chức năng kiểm soát của RECK [66]

Cấu trúc tổng thể của protein, theo mô tả của Takahashi và cộng sự, bao gồm hai khu vực kỵ nước ở hai đầu, năm cysteine lặp lại gần nhóm NH2 cuối, hai khu vực tương tự như EGF ở giữa và ba khu vực ức chế hoạt động của serine protease Cuối cùng, nhóm -COOH cho phép glycosylphosphatidylinositol (GPI) gắn vào màng tế bào.

Hình 1.6: Cấu trúc protein RECK [49]

Khu vực này có sự lặp lại của 6 cysteine quan trọng và chứa glycosylation tại các vị trí asparagin (Asn) residues, những vị trí này cần thiết cho sự tương tác với MMP-9 và MMP-2.

Vùng EGF-like có cấu trúc tương tự với các trình tự protein EGF, cho phép chúng liên kết với thụ thể EGF và kích thích quá trình phân bào, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào, độ bám dính và tương tác giữa các protein.

The central region of the protein structure features three domains resembling serine protease inhibitors (SPIs), also known as serpins These proteins inhibit protease activity through trapping reactions and reversible tight binding interactions Matrix metalloproteinases (MMPs) are a class of proteases secreted by tumor cells that degrade extracellular matrix (ECM) proteins, facilitating metastasis The SPI-like domain plays a crucial role in inhibiting MMP activity.

RECK chủ yếu gắn vào màng tế bào thông qua các khu vực kỵ nước và tương tác GPI Protease serine, được biết đến là gắn vào màng tế bào qua GPI, có vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào Điều này gợi ý rằng RECK cũng có thể tham gia vào quá trình truyền tín hiệu nội bào Cơ chế giảm kiểm soát của RECK trong ung thư đã được nghiên cứu và cho thấy ảnh hưởng của nó trong sự phát triển của bệnh.

Việc phát hiện RECK và khả năng chống lại MMP có ý nghĩa quan trọng trong điều trị ung thư, vì RECK ức chế di căn và hình thành mạch máu, được xác nhận qua nhiều nghiên cứu về khả năng kiểm soát trong nhiều khối u Sự giảm ức chế hoạt động của MMP xảy ra do giảm kiểm soát của RECK, ảnh hưởng bởi K-ras Có hai cơ chế liên quan đến K-ras: đầu tiên là quá trình methyl hóa các đảo CpG trong promoter RECK, trong đó RAS làm tăng sự gắn kết của DNMT3b methyltransferase với promoter, dẫn đến methyl hóa và giảm biểu hiện gene Cơ chế thứ hai liên quan đến các vị trí mục tiêu SP1 trên trình tự promoter RECK, với giả thuyết rằng RAS tạo điều kiện cho quá trình phosphoryl hóa.

15 sửa đổi khác của yếu tố Sp1/Sp3 đã được phát hiện, làm tăng liên kết với các vị trí SP1 trong vùng promoter của gene RECK, từ đó dẫn đến giảm hoạt động sao chép của RECK Kết quả này được xác nhận bởi nghiên cứu của Chang và cộng sự [14].

Hình 1.7: Cơ chế giảm kiểm soát RECK trong ung thư [14]

III.4 Tình hình nghiên cứu về methyl hóa gene RECK

Năm 1998, Takahashi và cộng sự đã chứng minh gene RECK có khả năng kìm hãm sự xâm lấn khối u thông qua việc ức chế hoạt động của MMP-9 Tiếp theo, vào năm 1999, R.M Sasahara cùng nhóm nghiên cứu phát hiện rằng sự phong tỏa vị trí mục tiêu Sp1/Sp3 trên trình tự promoter RECK làm giảm hoạt động kiểm soát của gene này trong các khối u.

Năm 2001, Oh J và cộng sự đã phát hiện gene RECK có khả năng ức chế các enzyme MMP-9, MMP-2 và MT1-MMP, đồng thời ngăn chặn sự hình thành khối u cũng như quá trình di căn.

Jonathan CM (2007) và cộng sự đã xác định hai cơ chế làm giảm kiểm soát của gene RECK trong các khối u, trong đó có sự methyl hóa vùng promoter của gene Nghiên cứu của P.L.E M van Lent và cộng sự (2004), Tokuhiro Kimura và cộng sự (2010), cùng Kato K và cộng sự (2008) đã cung cấp những bằng chứng về mức độ biểu hiện mRNA của gene RECK trong các tế bào ung thư và tế bào lành, khẳng định vai trò quan trọng của gene RECK trong sự hình thành và phát triển khối u.

Vào năm 2007, nghiên cứu của Cho CY và cộng sự đã chỉ ra rằng 44% (11/25) mẫu bệnh nhân ung thư kết tràng ở Trung Quốc có mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK, được thực hiện bằng phương pháp MSP Tiếp theo, vào năm 2008, Kato K và cộng sự cũng đã công bố kết quả khảo sát mức độ methyl hóa của gene RECK trên 4 mẫu khác.

4 dòng tế bào: HSC3, HSC4, SCC9, SCC25 bằng phương pháp MSP tại Nhật Bản ở ung thư vòm họng [29] Đến năm 2010, tại Trung Quốc cũng bằng phương pháp MSP, Yun-

Nghiên cứu của Yi Du và cộng sự (2010) cho thấy tỷ lệ ung thư dạ dày ở ba loại mô khác nhau: 47,5% ở mẫu mô khối u nguyên phát, 27,5% ở mẫu niêm mạc bình thường liền kề, và 57,1% ở mẫu hạch di căn Năm 2011, Victoria K Hill và cộng sự tiếp tục nghiên cứu trong lĩnh vực này.

Các phương pháp nghiên cứu về sự methyl hóa DNA

IV.1 MSP (Methylation-Specific PCR) :

Nguyên tắc của phương pháp MSP là phân tích mức độ methyl hóa và không methyl hóa của các đảo CpG trong vùng promoter của gene Kỹ thuật này cho phép xác định sự biến đổi methyl hóa thông qua việc điện di trên gel agarose, giúp đánh giá khả năng điều hòa gene một cách hiệu quả.

UV Điểm khác biệt chủ yếu ở lý sodium bisulfite làm tất cả các cytosine không b

- Các phương pháp khác dung đ

SSCA hoặc hiện đại hơn như Direct sequencing, Bisulphite pyrosequencing,

Ví dụ về cách đọc kết qu

Các phương pháp nghiên cứu về sự methyl hóa DNA

Phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) là một kỹ thuật PCR cải tiến, được sử dụng để phân tích nhanh mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của gene mục tiêu Sản phẩm PCR sau khi được tách trên gel agarose và nhuộm ethidium bromide sẽ cho phép quan sát mức độ methyl hóa Kỹ thuật này sử dụng DNA mẫu với các cytosine không methyl hóa được chuyển đổi thành uracil, giúp xác định chính xác mức độ methyl hóa của gene.

Các phương pháp khác dung để khảo sát sự methyl hóa DNA : BSP, Q ơn như Direct sequencing, Bisulphite pyrosequencing, t quả phản ứng MSP được mô tả trong hình1.9 nh

Hình 1.9: Đọc kết quả MSP

Sau khi thực hiện PCR, tình trạng methyl hóa của DNA sẽ được phân tích nhanh bằng cách sử dụng 2 bộ mồi Sự hiện diện của methyl nhóm sẽ được kiểm tra bằng ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím, cho phép nhận diện DNA đã được methyl hóa thành uracil.

A : BSP, Q-MSP, MS- ơn như Direct sequencing, Bisulphite pyrosequencing, trong hình1.9 như sau:

Kết quả điện di cho thấy có hai vạch, chứng tỏ các cặp mồi methylation và unmethylation đều bắt cặp đặc hiệu trong phản ứng MSP Điều này cho thấy các đảo CpG khảo sát bị methyl hóa không hoàn toàn.

- Mẫu B: Kết quả điện di chỉ có cặp mồi unmethylation cho kết quả Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát không bị methyl hóa

- Mẫu C: Kết quả điện di có một vạch cho cặp mồi methylation Kết luận mẫu này bị methyl hóa hoàn toàn

- Marker: thang phân tử DNA

IV.2 Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR)

Phương pháp BSP yêu cầu biến đổi DNA bằng bisulfite để chuyển đổi tất cả Cytosine thành Uracil, trừ các Cytosine đã methyl hóa Sau đó, PCR được thực hiện để khuếch đại DNA đã biến đổi Một cặp mồi đặc hiệu được thiết kế mà không chứa vị trí CpG, cho phép khuếch đại cả allele methyl và unmethyl trên DNA đã biến đổi Cuối cùng, quá trình giải trình tự được thực hiện để kiểm tra tính đặc hiệu và xác định vị trí CpG bị methyl hóa trong các gene mục tiêu.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã thực hiện việc tìm hiểu mức độ methyl hóa gene RECK ở các mẫu bệnh phẩm:

Bài viết trình bày 5 mẫu sinh thiết mô vú từ bệnh nhân ung thư vú, kèm theo thông tin và các chỉ tiêu lâm sàng, hóa mô miễn dịch, cùng với 3 mẫu mô vú lành tính từ bệnh nhân mắc các bệnh lý khác về vú không phải ung thư, được cung cấp bởi Bộ môn Giải phẫu bệnh, ĐH Y Dược TP HCM.

Công ty Việt Á cung cấp 15 mẫu DNA được tách chiết từ mẫu máu hoặc dịch phết tế bào âm đạo, kèm theo các chỉ tiêu lâm sàng, nhằm xác định nhiễm Human papilloma virus với các kiểu gene độc và lành.

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico

II.1.1 Khai thác dữ liệu

Chúng tôi tiến hành khai thác dữ liệu trên PubMed bằng một số từ khóa “cancer“,

When researching breast cancer, it is essential to focus on the role of methylation, particularly the methylation of the RECK gene Selecting reference materials should be based on the reliability of the publishing journals and the presence of experimental studies related to the methylation of the RECK gene.

II.1.2 Khảo sát in silico

 Thu nhận trình tự gene, xác định cấu trúc gene:

Thông tin về gen RECK được thu thập từ GeneCards (http://www.genecards.org/) và ngân hàng gene NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua mã số truy cập NC_00009.11.

 Thu thập, khảo sát các bộ mồi cho phản ứng MSP:

Để khảo sát và thu thập các bộ mồi phù hợp cho phản ứng MSP nhằm xác định mức độ methyl hóa các đảo CpG trong vùng promoter của gene RECK, chúng tôi đã áp dụng một số công cụ tin sinh học.

- TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html): Xác định những vị trí gắn với nhân tố phiên mã

- Methprimer (http://www.urogene.org/methprimer/): Sử dụng để xác định vị trí các đảo CpG trên promoter gene RECK

IDT Analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) là công cụ hữu ích giúp xác định các thông số quan trọng của mồi, bao gồm kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, và khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer.

- Annhyb: Kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm.

II.2 Khảo sát thực nghiệm quy trình MSP trên gene RECK

Chúng tôi áp dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA từ mô đúc paraffin và mẫu máu Quá trình bắt đầu bằng việc biến tính màng tế bào và màng nhân bằng chất tẩy mạnh SDS kết hợp với enzym proteinase Tiếp theo, protein sẽ được loại bỏ bằng cách sử dụng phenol/chloroform Cuối cùng, DNA bộ gene được tủa bằng ethanol tuyệt đối ở nhiệt độ lạnh.

− Máy ly tâm lạnh (Hettich)

− Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)

 Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mô đúc paraffin

− Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml

− Bổ sung 1 ml dung dịch xylene, lắc đều Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phòng Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi

− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol tuyệt đối, lắc đều Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phòng Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi

− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 70 %, lắc đều Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phòng Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi

Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 50% vào mẫu, lắc đều và ly tâm ở tốc độ 13,000 vòng/phút trong 2 phút tại nhiệt độ phòng Sau khi ly tâm, thu cặn và loại bỏ dịch nổi, sau đó để khô trong 30 phút.

− Bổ sung l thể tích phù hợp của dung dịch ly trích DNA Sau đó tiến hành ủ trong bể ổn nhiệt ở 56 o C trong 3 ngày

Để tiến hành, bổ sung một thể tích phù hợp dung dịch phenol (pH 8) với chloroform theo tỷ lệ 1:1, sau đó lắc nhẹ Tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 3 phút tại nhiệt độ phòng Cuối cùng, chuyển dịch nổi vào một ống eppendorf mới (1,5 ml).

− Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch chloroform, lắc nhẹ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, ở nhiệt độ phòng Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml)

Bổ sung 0.2 thể tích Ammonium acetate 5M và 2.5 thể tích Ethanol tuyệt đối, sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút tại 4 độ C Cuối cùng, thu cặn và loại bỏ dịch nổi.

− Rửa tủa DNA bằng dung dịch Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút, trong

5 phút ở 4 O C Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi Để khô trong 30 phút

− Thờm 50 àl TE pH 8 hoặc nước cất 2 lần, bảo quản ở 4 O C

 Các bước tiến hành tách chiết DNA từ mẫu máu

− Lấy 1ml mẫu (máu) cho vào eppendorf 1.5ml Ly tâm 13000 vòng/phút trong

5 phút, loại bỏ tủa, thu dịch nổi

− Bổ sung l thể tích phù hợp của dung dịch ly trích DNA Sau đó tiến hành ủ trong bể ổn nhiệt ở ở 56 o C trong 3 giờ

Bổ sung một thể tích phù hợp của dung dịch phenol (pH 8) và chloroform với tỷ lệ 1:1, sau đó lắc nhẹ Tiến hành ly tâm ở tốc độ 10,000 vòng/phút trong 3 phút tại nhiệt độ phòng Chuyển dịch nổi sang một ống eppendorf mới có thể tích 1,5 ml.

− Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch chloroform, lắc nhẹ Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, ở nhiệt độ phòng Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml)

Bổ sung 0.2 lần thể tích Ammonium acetate 5M và 2.5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối Tiến hành ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút tại nhiệt độ 4°C Cuối cùng, thu cặn và loại bỏ dịch nổi.

− Rửa tủa DNA bằng dung dịch Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút, trong

5 phút ở 4 O C Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi Để khô trong 30 phút

− Thờm 50 àl TE pH 8 hoặc nước cất 2 lần, bảo quản ở 4 O C

II.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo mật độ quang

Hàm lượng DNA có thể được xác định thông qua sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm, với giá trị mật độ quang OD260nm cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch, trong đó A260 nm = 1 OD tương ứng với 50 µg/ml DNA Độ tinh khiết của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280.

 Hóa chất và thiết bị:

− Máy đo quang phổ (Bio Rad)

DNA sau khi được tách chiết sẽ được pha loãng bằng nước cất vô trùng Toàn bộ dung dịch DNA pha loãng sau đó được chuyển vào cuvette để tiến hành đo nồng độ DNA tại bước sóng 260 nm Độ tinh sạch của dung dịch DNA được xác định thông qua tỷ lệ OD260/OD280.

II.2.3 Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite bằng EZ DNA METHYLATION- GOLDTM Kit

Nguyên tắc của quy trình này là xử lý mẫu DNA bằng hỗn hợp sodium bisulfite, giúp chuyển đổi cytosine thành uracil, ngoại trừ các vị trí 5mC Sau khi xử lý, DNA sẽ được cố định trên màng cột, tiếp theo là rửa sạch muối và thu hồi DNA.

To prepare the EZ1 transformation reagent, mix 900 µL of double-distilled water with 300 µL of EZ2 solution and 50 µL of EZ3 solution in a CT Conversion Reagent tube Ensure thorough mixing for 10 minutes to achieve a uniform solution.

− Bổ sung 130 àl dung dịch CT Conversion Reagenet (EZ1) và 20 àl dung dịch DNA vào eppendorf 250 àl, trộn đều

− Xử lý dung dịch DNA theo chu trình nhiệt:

Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite

Sau khi đú, bổ sung 600 µl EZ4 và dung dịch DNA đã được xử lý nhiệt vào cột Zymo-spin™ IC (C1) Tiến hành đảo đều ống Eppendorf và ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng.

− Bổ sung 100 àl EZ5vào cột C1, ly tõm 13000vũng/phỳt trong 3giõy, ở nhiệt độ phòng

− Bổ sung 200 àl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phũng 15-20 phỳt, ly tõm 13000 vòng/ phút trong 30 giây

− Bổ sung 200 àl EZ5 EZ5vào cột C1, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 30 giõy ở nhiệt độ phòng (thực hiện 2 lần)

− Đặt cột vào ependorf 1,5 ml, thờm 10 àl EZ7, ly tõm 3000 vũng/phỳt trong

30 giây, ở nhiệt độ phòng Thu dung dịch DNA được biến đổi bisulfite, bảo quản ở -20 o C

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Kết quả khai thác dữ liệu và khảo sát in silico

Chúng tôi đã thu thập 8 bài báo khoa học liên quan đến mối tương quan giữa mức độ methyl hóa các đảo CpG ở vùng promoter của gene RECK và các bệnh ung thư như vú, cổ tử cung, và trực tràng Dữ liệu được cập nhật đến năm 2013, cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của methyl hóa gene RECK trong các loại ung thư này.

Nghiên cứu cho thấy nhiều phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ở các loại ung thư Đặc biệt, 4 trong số 6 công trình nghiên cứu (chiếm 66,7%) đã sử dụng phương pháp MSP, nhờ vào những ưu điểm như đơn giản, độ nhạy cao và khả năng phát hiện nhanh chóng hiện tượng methyl hóa Phương pháp này được coi là phổ biến và phù hợp để khảo sát sự methyl hóa trên vùng promoter gene RECK, đặc biệt trong các loại ung thư như ung thư vú và ung thư cổ tử cung.

Bảng 3.1: Phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK

Hình 3.1: Tỉ lệ các phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK

Chúng tôi ghi nhận rằng các loại mẫu bệnh phẩm ung thư chủ yếu được sử dụng trong nghiên cứu là mẫu mô tươi bảo quản trong nitơ lỏng (57,14%) và mẫu đúc paraffin (28,57%) Ngoài ra, một số mẫu khác như máu toàn phần và dịch thể từ bệnh nhân mới có dấu hiệu bệnh cũng được áp dụng để tìm kiếm dấu chứng sinh học nhằm tiên lượng chẩn đoán và theo dõi tiến triển bệnh ung thư Do thiếu dữ liệu về mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK trong ung thư vú và các loại ung thư khác, chúng tôi không thể thống kê tỷ lệ phần trăm các loại mẫu bị methyl hóa Tuy nhiên, chúng tôi sẽ tập trung phân tích sự methyl hóa trên gene RECK từ mẫu mô đúc paraffin của bệnh nhân ung thư vú và mẫu dịch phết tế bào âm đạo có xác định nhiễm Human papilloma virus kiểu gene độc và lành.

Theo bảng thống kê tỉ lệ methyl hóa gene RECK ở các loại ung thư, mức độ methyl hóa gene này dao động từ 9% đến 100% Đặc biệt, trong bệnh ung thư vú, tỷ lệ methyl hóa gene RECK đạt khoảng 60%.

Bảng 3.2: Tỉ lệ methyl hóa gene RECK trong các loại ung thư

Loại ung thư Tỷ lệ

(Loại mẫu bệnh phẩm) Quốc gia Nguồn trích dẫn

Ung thư kết tràng 44%(11/25) Trung

47,5% (19/40) ở mẫu mô khối u nguyên phát

27,5% (11/40) mẫu niêm mạc bình thường liền kề 57,1% (12/21) mẫu hạch di căn Ung thư vòm họng

100% (4/4) Khảo sát ở 4 mẫu của 4 dòng tế bào:

Ung thư kết tràng 9% (7/75) Mỹ [36]

55,4% (41/74) mẫu ung thư gan nguyên phát Trung

17,6% (13/74) mẫu ung thư gan không phải nguyên phát

Hình 3.2: Tần số methyl hóa gene RECK trung bình trong một số loại ung thư I.2 Kết quả khảo sát in silico

I.2.1 Thu thập trình tự gene

Chúng tôi đã thu thập trình tự gene RECK và vùng promoter của nó từ nguồn dữ liệu GeneCards và GeneBank, với mã số truy cập NC_000009.11, NC_018920.1 và NC_000009.11 Gene RECK nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (9p13.3) và có kích thước 88.023 base (từ 36036430 đến 36124452 theo mã số NC_000009.11), bao gồm 21 exon và 20 intron, cùng với 13 SNPs Vùng promoter của gene này có kích thước 1100 bp (từ 36035943).

Mã số NC_000009.11 (36037042) chứa ba đảo CpG, trong đó đảo lớn nhất có kích thước 145bp nằm ở đầu 3’ của promoter, đảo thứ hai có kích thước 117bp ở đầu 5’, và đảo nhỏ nhất có kích thước 113bp nằm ở giữa.

32 Hình 3.3: Vị trí, cấu trúc gene RECK và promoter gene RECK

Sử dụng chương trình TFSEARCH phiên bản 3.1 với ngưỡng giá trị 76, chúng tôi đã xác định rằng vùng promoter của gene RECK chứa nhiều trình tự nhận biết của các nhân tố điều hòa phiên mã như GATA-1, GATA-2, GATA-3, Lyf-1, CdxA, Sp1 và CP2 Vùng này cũng có sự tập trung của nhiều CpG, chủ yếu ở phần cuối promoter (đảo CpG 3), cho thấy đây là khu vực lý tưởng để khảo sát và thiết kế mồi cho phương pháp MSP.

Hình 3.4: Trình tự đảo CpG3 và sự phân bố của một số nhân tố phiên mã

Chú thích: Vùng có chữ màu đỏ: Đảo CpG 3, vùng có chữ màu đen: Ngoài vùng đảo CpG3, chữ màu xanh: Các CpG

I.2.2 Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP

Bộ mồi là yếu tố quan trọng quyết định kết quả của phương pháp MSP Chúng tôi đã thu thập và tham khảo trình tự mồi từ các tài liệu khoa học công bố từ năm 2009 đến 2013, chọn lọc được bộ mồi (MR-MF; UR-UF) từ hai nhóm tác giả M.Pesta (2009) và Changsong Zhang (2012) phù hợp với phương pháp MSP Thông tin chi tiết về bộ mồi được trình bày ở bảng 3.3 Sau đó, chúng tôi tiến hành phân tích và đánh giá các thông số vật lý cũng như tính đặc hiệu của bộ mồi này Nếu bộ mồi (MR-MF; UR-UF) không đạt yêu cầu về đặc tính, chúng tôi sẽ xem xét các phương án điều chỉnh phù hợp.

34 theo các chỉ tiêu trong thiết kế mồi phản ứng MSP, chúng tôi hướng đến việc thiết kế bộ mồi mới nhằm đạt mục tiêu nghiên cứu

Bảng 3.3: Bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF)

Mồi Trình tự mồi( 5’ -3’) Kich thước

Vị trí bắt cặp Tác giả

Chú thích: MF: Mồi xuôi methyl, MR: Mồi ngược methyl, UF:Mồi xuôi unmethyl, UR: Mồi ngựơc unmethyl

Figure 3.5 illustrates the pairing positions of the MSP primers (MR-MF; UR-UF) on the promoter sequence of the RECK gene The blue primers represent methylated pairs, while the green primers denote unmethylated pairs The red text highlights the CpG islands, and the green text indicates the specific CpG sites.

I.2.3 Đánh giá thông số vật lí của các bộ mồi thu thập được Để khảo sát các thông số vật lí của bộ mồi MSP, chúng tôi sử dụng phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer của hãng IDT, kết quả trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá mồi MSP (MF1-MR1; UF1-UR1)

Mồi Trình tự mồi Dài SP

Tỉ lệ các nucleotide A, T, G, C trong trình tự mồi là yếu tố quan trọng trong thiết kế mồi PCR, ảnh hưởng lớn đến phản ứng PCR, nhiệt độ nóng chảy của DNA và nhiệt độ bắt cặp của mồi Các cặp mồi methyl và unmethyl có thể không đạt tỉ lệ tối ưu như các mồi chuẩn cho PCR, do mồi thiết kế cho phản ứng MSP thường chứa nhiều cytosine tự do và yêu cầu ít nhất một CpG ở vị trí đầu 3’ của mồi Các cytosine trong mồi sẽ bị biến đổi thành thymine.

Quá trình biến đổi với sodium bisulfate ảnh hưởng khác nhau đến từng loại mồi Đối với mồi methyl, toàn bộ cytosine biến đổi thành thymine, trong khi cytosine bị methyl hóa không thay đổi Đối với mồi unmethyl, toàn bộ cytosine cũng biến đổi thành thymine Hàm lượng CG đóng vai trò quan trọng trong chất lượng của mồi, thường dao động từ 50-60% Tuy nhiên, mồi thiết kế cho MSP thường có tỉ lệ CG nằm ngoài ngưỡng tối ưu, với hai cặp mồi MF-MR và UF-U có %CG thấp, chỉ khoảng 30-40%.

Chiều dài mồi là yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, thường dao động từ 18-25 bp, nhưng có thể thay đổi từ 15-30 bp trong một số trường hợp cụ thể Thông thường, cặp unmethyl có chiều dài lớn hơn cặp mồi methyl Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy chiều dài của các cặp mồi (MR-MF; UR-UF) hoàn toàn phù hợp với mức cho phép, với hầu hết các mồi nằm trong khoảng tối ưu từ 18-25 bp.

Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm) là một thông số quan trọng trong phản ứng PCR, được tính bằng công thức Tm = 69,3 + 0,41(%C + G) Để đảm bảo hiệu quả của phản ứng, nhiệt độ bắt cặp của hai mồi cần tương đồng, không nên chênh lệch quá 5°C Qua khảo sát, chúng tôi đã chọn khoảng nhiệt độ từ 52°C đến 62°C để xác định nhiệt độ lai tối ưu cho hai cặp mồi MR-MF và UR-UF.

Cấu trúc thứ cấp của mồi đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng của nó, với khả năng liên kết tạo nên cấu trúc này Cấu trúc thứ cấp bao gồm nhiều yếu tố khác nhau.

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm

II.1 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm

Chúng tôi thực hiện nghiên cứu nhằm tìm hiểu thông tin methyl hóa tại các đảo CpG trong vùng promoter của gene RECK bằng phương pháp Methylation-specific-PCR (MSP), bao gồm các quy trình thực nghiệm cần thiết.

Quy trình tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm bao gồm mẫu sinh thiết mô của bệnh nhân ung thư vú (gồm mẫu mô lành và mẫu mô bệnh) cùng với mẫu DNA từ máu hoặc dịch phết tế bào âm đạo Các mẫu này được phân tích với các chỉ tiêu lâm sàng nhằm xác định nhiễm Human papilloma virus kiểu gene độc và lành, do công ty Việt Á cung cấp.

− Quy trình biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit ZymoResearch

− Quy trình MSP nhằm phát hiện sự methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter trên promoter của gene RECK

2.1.1 Kết quả tách chiết DNA

Chúng tôi thực hiện tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm như sinh thiết mô của bệnh nhân ung thư vú và mẫu dịch phết tế bào âm đạo có nhiễm Human papilloma virus Phương pháp tách chiết DNA sử dụng xylene cho mẫu mô paraffin, kết hợp với xử lý màng tế bào và màng nhân bằng SDS 10% và proteinase K phenol Sau đó, chúng tôi sử dụng phenol/chloroform để biến tính protein và thu tủa DNA Trước khi tiến hành phản ứng biến đổi DNA bằng bisulfite, chúng tôi kiểm tra chất lượng DNA qua đo mật độ quang ở bước sóng 260 và 280 nm với độ pha loãng 80 lần Kết quả đo OD của các mẫu được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5: Kết quả đo OD

Mẫu ung thư vú Mẫu lành của bệnh nhân ung thư vú

Mẫu ung thư cổ tử cung Mẫu Nồng độ Mẫu Nồng độ Mẫu Nồng độ

Phương pháp tách chiết phenol/chloroform đã chứng minh hiệu quả trong việc tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm, với nồng độ DNA cao và chất lượng tốt Đặc biệt, tỷ lệ A260/A280 của DNA đạt từ 1,6 đến 1,8, cho thấy độ tinh sạch đạt yêu cầu.

2.1.2 Thực hiện phản ứng MSP sử dụng DNA bệnh phẩm

Chúng tôi pha loãng các mẫu DNA được chiết xuất từ bệnh phẩm và thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl, theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được mô tả trong bảng 2.1 và hình 2.2 Nguồn mẫu DNA này được lấy từ các bệnh phẩm ung thư vú và ung thư cổ tử cung, đã trải qua quá trình biến đổi bisulfite.

Trong nghiên cứu này, 43 mẫu bệnh phẩm đã được xác định có sự methyl hóa trên một số gen như BRCA1, CCDN1, và CCND2 Tuy nhiên, kết quả thu được không đạt như mong đợi với lượng DNA khoảng 6,135 ng Sau đó, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR với lượng DNA tăng lên gấp 10 lần, đạt khoảng 61,35 ng, sử dụng 2 cặp mồi MF-MR và UF-UR.

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.8: Kết quả điện di mẫu B2

Để nâng cao hiệu quả của phản ứng MSP với bộ mồi methyl và unmethyl, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm một số điều kiện tối ưu, đặc biệt là nhiệt độ lai Nghiên cứu này khảo sát nhiệt độ lai tối ưu cho hai cặp mồi MF-MR và UF-UR trong khoảng nhiệt độ từ 52 o C đến 62 o C Kết quả điện di lô sản phẩm MSP đối với cặp mồi methyl (MR-MF) và unmethyl (UR-UF) của gen RECK ở tất cả các nhiệt độ lai đã được trình bày trong hình 3.9 và 3.10 Các kết quả cho thấy có sự hiện diện của vạch sản phẩm đúng như mong đợi với kích thước 195 bp.

Nhiệt độ 60 o C mang lại hiệu suất tốt nhất cho sản phẩm khuếch đại so với các dãy nhiệt độ khác Vì lý do này, chúng tôi đã quyết định áp dụng nhiệt độ 60 o C để tiếp tục thực hiện phản ứng MSP trên một số mẫu bệnh phẩm khác.

61.2 Hình 3.9: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ tr

Giếng 1-8: Nhiệt độ: 62 o C, 61.2 giếng 9: Chứng ( Hình 3.10: Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ tr II.2 Thử nghiệm MSP trên các m cung

Chúng tôi thực hiện phả

DNA bệnh phẩm với cặp mồi đ

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu trên bệnh nhân ung thư vú và thu thập 3 mẫu minh họa kết quả điện di sản phẩm cho gen RECK Kết quả cho thấy sự thay đổi rõ rệt trong biểu hiện gen này, góp phần vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế phát triển của bệnh.

8: Nhiệt độ: 52 o C, 52.7 o C, 53.9 o C, 55.7 o C, 58.1 61.2 o C, 62 o C, giếng 9: Chứng (-) ết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B1

Kết quả khảo sát gradient nhiệt độ trên mẫu B2 cho thấy các nhiệt độ 61.2 o C, 60 o C, 58.1 o C, 55.7 o C, 53.9 o C, và 52.7 o C Chúng tôi đã thực hiện phản ứng MSP để khảo sát mức độ methyl hóa cụ thể trên các mẫu DNA bệnh phẩm ung thư vú, chỉ thực nghiệm trên 5 mẫu lành của bệnh nhân ung thư vú Các hình ảnh 3.8, 3.11, 3.12, và 3.13 thể hiện sản phẩm MSP khuếch đại từ bộ mồi methyl-unmethyl trên các mẫu ung thư vú.

C, 52.7 o C, 52 o C ẫu B2 ư vú và ung thư cổ tử methyl hóa của các mẫu a gen RECK u bệnh phẩm của ình 3.8, 3.11, 3.12, 3.13 unmethyl đặc hiệu

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.11: Kết quả điện di mẫu B3

M: Thang 100bp; m: Kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: Kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.12: Kết quả điện di mẫu B4, B5, B6

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.13: Kết quả điện di mẫu B7, B8

Kết quả khảo sát từ 8 mẫu bệnh phẩm (B1-B8), bao gồm mẫu sinh thiết mô vú từ bệnh nhân ung thư vú và mẫu lành từ bệnh nhân mắc bệnh lý khác, cho thấy 100% mẫu ung thư vú (B1, B2, B3, B4, B8) có kết quả methyl hóa gen RECK dương tính Tuy nhiên, do kích thước mẫu nhỏ, chúng tôi không thể phân tích mối tương quan giữa mức độ methyl hóa gen RECK và các chỉ số lâm sàng như độ tuổi hay phân độ mô học Ngoài ra, 3 mẫu (B5, B6, B7) chưa được khuếch đại thành công với cặp mồi MF-MR và UF-UR, có thể do thao tác trong quá trình thực hiện phản ứng MSP.

3 mẫu bệnh phẩm B5, B6, B7 (mẫu sinh thiết mô vú lành của các bệnh nhân có bệnh lý khác về vú, không phải mắc bệnh ung thư vú) (hình 3.12, 3.13)

Chúng tôi đã sử dụng phần mềm MedCalc (2003) để phân tích mối tương quan giữa sự methyl hóa vùng promoter của gen RECK trong các mẫu ung thư vú và mẫu lành.

Nghiên cứu với 8 mẫu cho thấy tỷ lệ methyl hóa gen RECK đạt khoảng 62.5% (p< 0.05), đánh dấu một ghi nhận ban đầu quan trọng về sự methyl hóa của gen này liên quan đến bệnh ung thư vú tại Việt Nam.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự methyl hóa gen RECK trên 15 mẫu dịch phết tế bào âm đạo, bao gồm các mẫu nhiễm Human papilloma virus (HPV) kiểu gen độc (nguy cơ cao) và nguy cơ thấp, cũng như các mẫu lành hoặc không nhiễm HPV Kết quả của điện di sản phẩm MSP được thể hiện qua các hình 3.14, 3.15, 3.16, 3.17 và 3.18.

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.14: Kết quả điện di mẫu C1, C2

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.15: Kết quả điện di mẫu: C3, C4, C5, C6

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.16: Kết quả điện di mẫu C9

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.17: Kết quả điện di mẫu C10, C11, C12

M: thang 100bp; m: kết quả khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết quả khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.18: Kết quả điện di mẫu C13, C14, C15, C16, C17

Kết quả khảo sát từ mẫu DNA tách chiết từ các bệnh phẩm như máu và dịch phết âm đạo cho thấy sự nhiễm HPV kiểu gen độc Cụ thể, các mẫu C1, C4, C5, C9, C10, C11, C13, C14, và C17 cho kết quả dương tính với cặp mồi methyl MF-MR, trong khi mẫu C12 dương tính với cả cặp mồi methyl MF-MR và cặp mồi unmethyl UF-UR.