0360KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GENE RECK TRONG UNG THƯ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA VÙNG PROMOTER GENE RECK TRONG UNG THƯ KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy SVTH: Nguyễn Thị Thúy Tài Tp Hồ Chí Minh, tháng 6/2014 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở TP.HCM, khoa Công nghệ sinh học giúp để em thực đề tài Đặc biệt em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS TRƯƠNG KIM PHƯỢNG trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo ân cần với lời khuyên quý báu suốt trình em thực đề tài Em xin cảm ơn thầy, (cơ) phịng thí nghiệm Sinh học phân tử hướng dẫn giúp để em suốt trình thực đề tài Em xin cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, bạn bè động viên, chia giúp đỡ em thời gian học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Ngày , tháng 06, năm 2014 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thúy Tài Mục Lục DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU I Tổng quan bệnh ung thư I.1 Ung thư I.2 Nguyên nhân gây ung thư I.3 Ung thư vú I.4 Ung thư cổ tử cung II Sự biến đổi “epigenetics” methyl DNA II.1 Sự biến đổi “epigenetics” II.2 Đảo CpG II.3 Sự methyl hóa DNA 10 III Tổng quan gene RECK protein RECK 12 III.1 Gene RECK 12 III.2 Cấu trúc protein 13 III.3 Cơ chế giảm kiểm soát RECK ung thư 14 III.4 Tình hình nghiên cứu methyl hóa gene RECK 15 IV Các phương pháp nghiên cứu methyl hóa DNA 17 IV.1 MSP (Methylation-Specific PCR) : 17 IV.2 Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 18 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 I VẬT LIỆU 19 II CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 II.1 Khai thác liệu khảo sát in silico 19 II.2 Khảo sát thực nghiệm quy trình MSP gene RECK 20 Chương III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28 Kết khai thác liệu khảo sát in silico 28 I I.1 Khai thác liệu 28 I.2 Kết khảo sát in silico 31 II Kết nghiên cứu thực nghiệm 41 II.1 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 41 II.2 Kết tách chiết DNA 42 II.3 Thực phản ứng MSP sử dụng DNA bệnh phẩm 42 II.4 Thử nghiệm MSP mẫu DNA bệnh phẩm ung thư vú ung thư cổ tử cung 44 II.5 Giải trình tự mẫu đại diện 50 Chuơng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 I II Kết luận 52 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT WHO World Health Organization IARC International Agenecy for Research on Cancer NCBI National Center for Biotechnology Information IUUC Hiệp hội phòng chống ung thư giới RECK Reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs SAM S-denosyl-L-methionine BRCA Breast cancer susceptibility DNMT Enzym methyltransferase MMP Metalloproteinase matrix ECM Extracellular matrix TIMP Tissue inhibitor of metalloproteinase EGF Epidermal Growth Factor K-ras Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog GPI Glycosylphosphatidylinositol Asn Asparagin SPIs Serpins MSP Methylation-Specific PCR BSP Bisulfite sequencing PCR Q-MSP Quantitative methylation-Specific PCR MS-SSCA Methylation-sensitive single-strand conformation analysis OD Optical Density i UV Ultraviolet, tia tử ngoại PCR Polymerase Chain Reaction Tm Nhiệt độ nóng chảy RNA Ribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid MF Mồi xuôi methyl MR Mồi ngược methyl UF Mồi xuôi unmethyl UR Mồi ngựơc unmethyl CCDN Cyclin D NSAID Non-steroidal anti-inflammatory drug ERK Extracellular signal-regulated kinase HER-2/neu Human Epidermal growth factor Receptor HDAC Histone deacetylase TSA Trichostatin A SDS Sodium Dodecyl Sulfate EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid HSC Hematopoietic Stem Cell SCC Somatic Cell Count ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.1: Phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK Bảng 3.2: Tỉ lệ methyl hóa gene RECK loại ung thư Bảng 3.3: Bộ mồi MSP (MR-MF; UR-UF) Bảng 3.4: Kết đánh giá mồi MSP (MF1-MR1; UF1-UR1) Bảng: 3.5: Kết đo OD Bảng 3.6: Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen RECK mẫu bệnh phẩm ung thư vú mẫu u sợi tuyến Bảng 3.7: Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen RECK 15 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm nhiễm HPV iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tình hình ung thư giới Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh ung thư khu vực giới Hình 1.3: Methyl hóa ADN điều hịa biểu gene Hình 1.4: Vị trí gene RECK Hình 1.5 Chức kiểm sốt RECK Hình 1.6: Cấu trúc protein RECK Hình 1.7: Cơ chế giảm kiểm sốt RECK ung thư Hình 1.8 Phương pháp MSP Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite Hình 2.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Hình 3.1: Tỉ lệ phương pháp sử dụng để khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK Hình 3.2: Tần số methyl hóa gene RECK trung bình số loại ung thư Hình 3.3: Vị trí, cấu trúc gene RECK promoter gene RECK Hình 3.4: Trình tự đảo CpG3 phân bố số nhân tố phiên mã Hình 3.5: Vị trí bắt cặp mồi MSP (MR-MF; UR-UF)trên đoạn trình tự đích Hình 3.6: Kết Annhyb cặp mồi MF-MR vùng promoter gene RECK Hình 3.7: Kết Annhyb cặp mồi UR-UF vùng promoter gene RECK Hình 3.8: Kết điện di mẫu B2 Hình 3.9: Kết khảo sát gradient nhiệt độ mẫu B1 iv Hình 3.10: Kết khảo sát gradient nhiệt độ mẫu B2 Hình 3.11: Kết điện di mẫu B3 Hình 3.12: Kết điện di mẫu B4, B5, B6 Hình 3.13: Kết điện di mẫu BP4, BP5 Hình 3.14: Kết điện di mẫu C1, C2 Hình 3.15: Kết điện di mẫu: C3, C4, C5, C6 Hình 3.16: Kết điện di mẫu C9 Hình 3.17: Kết điện di mẫu C10, C11, C12 Hình 3.18: Kết điện di mẫu C13, C14, C15, C16 Hình 3.19: Kết giải trình tự v ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo tổ chức Y tế giới (World Health Organization –WHO), ung thư nguyên nhân gây tử vong ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người toàn giới Hiện nay, số 200 dạng bệnh ung thư khác nhau, ung thư vú ung thư cổ tử cung loại bệnh ung thư thường gặp [63, 18] Theo báo cáo tổ chức Y Tế Thế giới WHO có khoảng 8.2 triệu người chết ung thư năm 2012 70% số ca tử vong nước có thu nhập thấp thu nhập trung bình Gene RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs) nằm NST ( 9p13.3), có kích thước 88.023 bp, mã hóa cho lớp màng glycoprotein hình mỏ neo giúp ngăn chặn xâm lấn khối u hình thành mạch cách ức chế phân giải protein Maxtri metalloproteinase -9,2,14 ( MMP-9, 2, 14) [47] Gene RECK biểu nhiều mô lành lại gặp dịng tế bào ung thư hay dòng nguyên bào sợi bị biến đổi gene gây ung thư Ở trạng thái bình thường, RECK hoạt động có tác dụng kiềm chế khối u Trong trường hợp vùng promoter bị methyl hóa hoạt động RECK bị ức chế hoàn toàn dẫn đến khối u tăng sinh khơng kiểm sốt di sang tế bào lành Trên giới, nhiều nghiên cứu mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK công bố loại ung thư khác nhau: ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư phổi, [36, 32, 29 ] Do vậy, nhằm tìm hiểu mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK tế bào ung thư (ung thư vú, ung thư cổ tử cung…) chúng tơi thực đề tài khóa luận tốt nghiệp: “Khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ung thư” Kết nghiên cứu sở khoa học để xác định gene RECK có phải dấu chứng sinh học tiềm tiên lượng, chẩn đốn hỗ trợ thơng tin cho việc phòng chống điều trị bệnh ung thư nói chung, cụ thể bệnh ung thư vú ung thư cổ tử cung Kết khảo sát mẫu bệnh phẩm B1-B8 (mẫu sinh thiết mô vú từ bệnh nhân mắc ung thư vú, mẫu lành từ bệnh nhân mắc bệnh lý khác) thể hình: 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.112, liệu trình bày bảng 3.6 cho thấy 5/5 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư vú (mẫu B1, B2, B3, B4, B8) cho kết methyl hóa gen RECK dương tính đạt tỷ lệ 100% Tuy nhiên, với cỡ mẫu nhỏ nên chúng tơi khơng tiến hành phân tích mối tương quan mức độ methyl hóa gen RECK với số lâm sàng (độ tuổi, phân độ mô học,…) Hơn nữa, mẫu (mẫu B5, B6, B7) chưa thực thành công việc khuếch đại với cặp mồi MF-MR cặp mồi UF-UR, nguyên nhân thao tác q trình thực phản ứng MSP Kết khảo sát mẫu bệnh phẩm B5, B6, B7 (mẫu sinh thiết mơ vú lành bệnh nhân có bệnh lý khác vú, mắc bệnh ung thư vú) (hình 3.12, 3.13) Chúng tơi sử dụng phần mềm MedCalc (2003) phân tích sơ mối tương quan methyl hóa vùng promoter gen RECK tổng số mẫu ung thư vú mẫu lành (8 mẫu), kết cho thấy tỷ lệ methyl hóa khoảng 62.5% (p< 0.05) Đây ghi nhận ban đầu methyl hóa gen RECK bệnh ung thư vú Việt Nam Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành khảo sát methyl hóa gen RECK 15 mẫu dịch phết tế bào âm đạo xác định nhiễm Human papilloma virus (HPV) kiểu gen độc (nguy cao) nguy thấp mẫu lành không nhiễm HPV Kết điện di sản phẩm MSP thể qua hình 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18 M: thang 100bp; m: kết khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.14: Kết điện di mẫu C1, C2 46 M: thang 100bp; m: kết khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.15: Kết điện di mẫu: C3, C4, C5, C6 M: thang 100bp; m: kết khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.16: Kết điện di mẫu C9 M: thang 100bp; m: kết khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.17: Kết điện di mẫu C10, C11, C12 47 M: thang 100bp; m: kết khuếch đại với cặp mồi MF-MR; u: kết khuếch đại với cặp mồi UF-UR Hình 3.18: Kết điện di mẫu C13, C14, C15, C16, C17 Kết khảo sát mẫu DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu, dịch phết âm đạo) xác định có nhiễm HPV kiểu gen độc cho thấy: C1, C4, C5, C9, C10, C11, C13, C14, C17 cho kết dương tính với cặp mồi methyl MF-MR; Trường hợp mẫu C12 cho kết dương tính với cặp mồi methyl MF-MR, cặp mồi unmethyl UF-UR Trong tổng số mẫu bệnh phẩm có nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cao: 16, 18, 58 ), 5/6 (83%) mẫu cho kết dương tính với cặp mồi methyl hóa gen RECK Đối với mẫu bệnh phẩm không nhiễm HPV, 1/5 (25%) mẫu cho kết dương tính với cặp mồi methyl hóa gen RECK (dữ liệu trình bày bảng 3.7) Bảng 3.6: Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen RECK mẫu bệnh phẩm ung thư vú mẫu u sợi tuyến Ký hiệu mẫu Tuổi Chẩn đoán Kết methyl gen RECK B1 B2 B3 B4 B8 B5 B6 B7 30 35 56 53 47 31 38 18 Ung thư vú Ung thư vú Ung thư vú Ung thư vú Ung thư vú U sợi tuyến U sợi tuyến U sợi tuyến methyl methyl methyl methyl methyl nd nd nd Ghi chú: nd: non-data (chưa có liệu) 48 Bảng 3.7: Kết khảo sát methyl hóa vùng promoter gen RECK 15 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm nhiễm HPV Ký hiệu mẫu Tuổi Xét nghiệm Kết xét nghiệm C1 C2 C3 C4 C5 C6 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 35 29 27 45 33 31 28 33 30 33 33 48 36 1987 1958 HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno HPV-Geno (-) (-) (-) (-) (-) Nguy thấp Nguy thấp Nguy thấp Nguy thấp Nguy cao Nguy cao Nguy cao Nguy cao Nguy cao Nguy cao Kết methyl gen RECK methyl nd nd methyl methyl nd methyl methyl methyl methyl methyl methyl nd methyl methyl Đối với trường hợp không khuếch đại thành công với cặp mồi MF-MR, UF-UR mẫu: C2, C3, C6, C7, C8, C15 điều kiện khách quan nên chưa thực lại phản ứng MSP mẫu nêu Một kết ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK mẫu bệnh phẩm mắc bệnh ung thư vú mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cao) khoảng tỷ lệ: 60%-83%, phù hợp với kết khảo sát tỷ lệ methyl gen RECK giới (hình 3.2) Một đặc điểm chung nhận thấy mẫu bệnh phẩm nêu (bệnh phẩm ung thư vú, bệnh phẩm ung thư cổ tử cung): B5, B6, B7, C3, C6, C7, C8, C15 không khuếch đại cặp mồi MF-MR (có thể mẫu DNA khơng bị 49 methyl hóa gen RECK); toàn mẫu bệnh phẩm nêu không khuếch đại cặp mồi UF-UR Một điểm đáng lưu ý cặp mồi UF-UR không hoạt động tốt, phải ý, phân tích tính đặc hiệu thông số vật lý cặp mồi UF-UR mẫu bệnh phẩm Việt Nam Mặc dù điểm hạn chế đề tài kinh nghiệm vấn đề đặt cho nhóm nghiên cứu chúng tơi cần tiếp tục tìm hiểu phải hồn thiện quy trình MSP gen RECK phụ thuộc vào nguồn mẫu bệnh phẩm (thuộc chẩn đoán lâm sàng: sinh thiết mô vú ) từ bệnh viện nhằm xác định chi tiết mối tương quan methyl hóa gen RECK bệnh ung thư vú, ung thư cổ tử cung Việt Nam II.3 Giải trình tự mẫu đại diện: Sau thực phản ứng MSP, tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu mạch riêng biệt với mồi xuôi ngược methyl gen RECK Kết giải trình tự cho thấy sản phẩm MSP gen RECK đặc hiệu, hình 3.19 minh họa kết điển hình sản phẩm giải trình tự gen RECK, sử dụng mồi ngược methyl Kết giải trình tự thu mồi ngược methyl từ sản phẩm MSP bị methyl hóa gen RECK mẫu bệnh phẩm B2, cho thấy vùng cuối trình tự xuất xác trình tự bổ sung mồi xi methyl Như vậy, vị trí CpG mồi ngược methyl bị methyl hóa Bên cạnh đó, vùng trình tự nằm mồi cho kết trùng khớp, vị trí CpG vùng gen khảo sát cho kết methyl hóa Đồng thời, kết giải trình tự cịn cho phép chúng tơi khẳng định q trình biến đổi DNA sodium bisulfite thực trước thành cơng 50 Hình 3.19: Kết giải trình tự (a) Vùng trình tư RECK chưa biến đổi bisulfite; (b) Vùng trình tự RECK biến đổi bisulfite; (c) Trình tự thu từ giải trình tự với cặp mồi methyl (MF-MR); Vùng1, vùng 2: vị trí CpG nằm vùng khảo sát, vùng 3: vị trí CpG nằmg mồi xi methyl CpG nằm vùng khảo sát; Vùng chữ màu đỏ: trình tự gắn mồi xi methyl MF; Chữ màu xanh: CpG 51 Chương IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận Qua trình thực đề tài nghiên cứu khoa học cấp sinh viên, thu nhận số kết quan trọng sau: Khai thác liệu: Thu thập liệu mức độ methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter gen RECK số bệnh ung thư: bệnh ung thư vú (tỷ lệ 57,1%.) [53] ung thư cổ tử (chúng tơi chưa tìm thấy cơng trình nghiên cứu cơng bố tỷ lệ methyl hóa gene RECK bệnh này) Khảo sát in silico Thu thập xác định thông số vật lý mồi (MF-MR; UF-UR) hai nhóm tác giả M.Pesta cộng (2009) Changsong Zhang cộng (2012) phù hợp với phương pháp MSP nhằm khảo sát mức độ methyl hóa đảo CpG vùng promoter gen RECK số bệnh ung thư ung thư vú ung thư cổ tử cung Thực nội dung nghiên cứu thực nghiệm: Tiến hành quy trình tách chiết biến đổi bisulfide DNA từ nguồn mẫu sinh thiết mô bệnh nhân ung thư vú (mẫu mô lành, mẫu mô bệnh); mẫu DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm máu bệnh nhân xác định nhiễm HPV type lành và/hoặc không nhiễm HPV Xác định nhiệt độ lai tối ưu 600C cho mồi (MF-MR; UF-UR) khuếch đại đặc hiệu vùng promoter gen RECK, kích thước sản phẩm khuếch đại cặp mồi methyl (MF-MR) 195bp, cặp unmethyl (UF-UR) 197bp Tiến hành xác định mức độ methyl hóa mẫu mơ lành mẫu mô bệnh ung thư vú, mẫu DNA bệnh nhân nhiễm HPV type nguy cao (type 16, 18 ), mẫu DNA bệnh nhân nhiễm HPV type nguy thấp, mẫu DNA bệnh nhân không nhiễm HPV Một kết ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK mẫu bệnh phẩm mắc bệnh ung thư vú mẫu bệnh phẩm nhiễm HPV kiểu gen độc (nguy cao) khoảng tỷ lệ: 60%-83% 52 Đồng thời, chúng tơi phân tích sơ mức độ methyl hóa gen RECK bệnh ung thư vú thông qua phần mềm MedCalc (MedCal, 2003), ghi nhận tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen RECK tổng số mẫu ung thư vú mẫu lành (8 mẫu) khoảng 62.5% (p< 0.05) II Đề nghị - Một điểm đáng lưu ý nghiên cứu tính hiệu cặp mồi UF-UR chưa bộc lộ tốt số mẫu Do vậy, có điều kiện chúng tơi cần phân tích nhằm xác định lại cặp mồi UF-UR phù hợp (điều trỉnh trình tự,…) với phương pháp MSP việc khảo sát methyl Từ đó, chúng tơi hồn thiện việc thực xây dựng quy trình phản ứng PCR xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK ung thư - Chúng mong muốn tiếp tục thực phát triển nghiên cứu nhằm có số liệu methyl hóa gen RECK mẫu bệnh phẩm ung thư vú ung thư cổ tử cung Từ đó, chúng tơi hướng đến việc khẳng định giá trị sử dụng thông tin methyl hóa bất thường gen RECK thơng tin methyl hóa bất thường gen BRCA1, (nhóm nghiên cứu công bố liệu vào năm 2011, 2012, 2013) dấu chứng sinh học tiềm cho bệnh ung thư vú ung thư cổ tử cung người Việt Nam tiên lượng bệnh, chẩn đoán xác định phương pháp điều trị bệnh 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cẩm nang ung bướu học lâm sàng Hiệp hội quốc tế chống ung thư, tập I, trang 1, 168-175 Cẩm nang ung bướu học lâm sàng Hiệp hội quốc tế chống ung thư, tập II, trang 495-506, 527-539 Võ Đức Hiếu (2002) Một số độc tính hóa trị ung thư vú di Y học thành phố Hồ Chí Minh 6(4), tr 283-292 Tiếng Anh Harrison A, Parle-McDermott A (2011) DNA methylation: a timeline of methods and applications Frontiers in Genetics, 2:74 Dworkin A.M, Huang T H.M, Toland A E (2009) Epigenetic alterations in the breast: implications for breast cancer detection, prognosis and treatment Seminars in Cancer Biology,19 ( 3): 165–171 Bird A P( 1986) CpG-rich islands and the function of DNA methylation Nature, 321 (6067) :209–213 An T Vo, RichardM.Millis (2012) Epigenetics and Breast Cancers Hindawi Publishing Corporation Obstetrics and Gynecology International, Article ID 602720, 10 pages Benhattar J, Clément G (2004) Methylation-sensitive single-strand conformation analysis: a rapid method to screen for and analyze DNA methylation 287:181-93 Bianco T, Hussey D, Dobrovic A (1999) Methylation-sensitive, single-strand conformation analysis (MS-SSCA): A rapid method to screen for and analyze methylation 14(4):289-93 10 Brooks J, Cairns P, Zeleniuch-Jacquotte A (2009) Promoter methylation and the detection of breast cancer 11 C Nguyen, G Liang, T T Nguyen ( 2001) Susceptibility of nonpromoter CpG islands to de novo methylation in normal and neoplastic cells Journal of the National Cancer Institute, 93 (19): 1465–1472 54 12 Carpenter G, Cohen S (1990) Epidermal growth factor Journal of Biological Chemistry, 265(14), 7709–712 13 Chang HC, Cho CY and Hung WC (2006) Silencing of the metastasis suppressor RECK by RAS oncogene is mediated by DNA methyltransferase 3b-induced promoter methylation Cancer Res, 66(17): 8413-8420 14 Chang HC, Liu LT and Hung WC (2004) Involvement of histone deacetylation in ras-induced down-regulation of the metastasis suppressor RECK Cellular Signalling, 16(6): 675-679 15 Cho CY, Wang JH, Chang HC, Chang CK, Hung WC (2007) Epigenetic inactivation of the metastasis suppressor RECK enhances invasion of human colon cancer cells J Cell Physiol, 213(1): 65-73 16 Changsong Zhang, Y.L., Chenghui Zhang, Yun Xu, Lu Gao, Rong Li, Jing Zhu, Lieying Fan, Lixin Wei (2012) The Silencing of RECK Gene is Associated with Promoter Hypermethylation and Poor Survival in Hepatocellular Carcinoma international Joural of Biological Sciences, 8(4): 451-485 17 Clark JC, Thomas DM, Choong PF, Dass CR (2007) RECK a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer Cancer Metastasis Rev, 26: 675-83 18 Coussens LM, Fingleton B and Matrisian LM (2002) Matrix metalloproteinas inhibitors and cancer: trials and tribulations Science, 295(5564): 2387-2392 19 Dvir Aran, Sivan Sabato, Asaf Hellman (2013) DNA methylation of distal regulatory sites characterizes dysregulation of cancer genes Geneome Biology, 14:R21 20 Flusberg BA, Webster DR, Lee JH, Travers KJ, Olivares EC, Clark TA, Korlach J, Turner SW, (2010) Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing 21 Goldhirsch A et al J Natl (1998) “Meeting highlights: International concensus panel on the treatment of Primary Breast Cancer” Cancer Inst, 90:1604 22 Hirst, M and M.A Marra, Epigenetics and human disease Elsevier, 2008 55 23 Iqbal K, Jin S –G, Pfeifer G P, Szabo P E (2011) Reprogramming of the paternal geneome upon fertilization involves geneome-wide oxidation of 5methylcytosine Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (9): 3642– 3647 24 Jaenisch R, Bird A (2003) Epigenetic regulation of gene expression: how the geneome integrates intrinsic and environmental signals Nature Genetics, 33(3): 245–254 25 James G Herman, Jeremy R Graff, Sanna Myohanen, Barry D Nelkin, Stephen B Baylin (1996) Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands 26 James G Herman, M D, Stephen B Baylin, M.D (2013) Gene Silencing in Cancer in Association with Promoter Hypermethylation The new england journal of medicine, 49(21): 2042-2054 27 Jassem J, Pienowski T, Plzanka A (2001) Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracin, and Endoxan as first line therapy for women with metastatic breast cancer: Final results of a randomized phase III multicenter trail J Clin Oncol, 9: 1707-1715 28 Jonathan C.M Clark, David M Thomas, Peter F.M Choong, Crispin R Dass (2007) RECK- a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer Cancer Metastasis Rev, 26: 675-683 29 K Kato N.L, H Makita, M Toida, T Yamashita, D Hatakeyama, A Hara, H Mori and T Shibata (2008) Effects of green tea polyphenol on methylation status of RECK gene and cancer cell invasion in oral squamous cell carcinoma cells British Journal of Cancer, 99: 647-654 30 Lister R, Mukamel E A, Nery J R, Urich M, Puddifoot C A, Johnson N D, Lucero J, Huang Y, Dwork A J, Schultz M D, Yu M, Tonti-Filippini J, Heyn H, Hu S, Wu J C, Rao A, Esteller M, He C, Haghighi F G, Sejnowski T J, Behrens M M, Ecker J R (2013) Global Epigeneomic Reconfiguration During Mammalian Brain Development Science doi:10.1126/science.1237905 56 31 Esteller M ( 2002) CpG island hypermethylation and tumor sup- pressor genes: a booming present, a brighter future Onco-gene, 21 (35): 5427–5440 32 M Pesta, V K., O Topolcan, J Safranek, J Vrzalova, R Cerny and L Holubec (2009) Significance of Methylation Status and the Expression of RECK mRNA in Lung Tissue of Patients with NSCLC Anticancer research, 29: 4535-4540 33 Mark Clemons, M.B., B.S., M.D., Paul Goss, M.D., Ph.D – NEJM (2001) Estrogene and the Risk of Breast Cancer The New England Journal of Medicine, 344(4) 34 Lustberg M.B, Ramaswamy B (2009) Epigenetic targeting in breast cancer: therapeutic impact and future direction Drug News Perspect, 22(7):369-81 35 Mikeska T, Felsberg J, Hewitt CA, Dobrovic (2011) Analysing DNA Methylation Using Bisulphite Pyrosequencing, 791:33-53 36 Motofumi Tanaka P.C, Yanan Li (2011) Promoter Methylation with Disease CHFR Association of Recurrence in Locally Advanced Colon Cancer Clin Cancer Res, 17: 4531-4540 37 Nephew K.P, T.H –M Huang (2002) Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression Cancer Letters, 190:125-133 38 Noda M, Oh J, Takahashi R, Kondo S, Kitayama H, Takahashi C (2003) RECK: a novel suppressor of malignancy linking oncogeneic signaling to extracellular matrix remodeling Cancer Metastasis Rev, 22(2-3): 167-175 39 Noel A, Maillard C, Rocks N, Jost M, Chabottaux V, Sounni N E (2004) Membrane associated proteases and their inhibitors in tumour angiogenesis Journal of Clinical Pathology, 57(6): 577–84 40 Oh J, Takahashi R, Kondo S (2001) The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular ma-trix integrity and angiogenesis Cell, 107:789–800 41 P L E M van Lent, P N Span, A W Sloetjes, T R D J Radstake, A W T van Lieshout, J J T M Heuvel, C G J Sweep, W B van den Berg (2005) Expression and localisation of the new metalloproteinase inhibitor RECK (reversion inducing 57 cysteine-rich protein with Kazal motifs) in inflamed synovial membranes of patients with rheumatoid arthritis (2004) Ann Rheum Dis, 64:368–374 42 R M Millis (2011) Epigenetics and hypertension Current Hyper- tension Reports, 13(11): 21–28 43 Rosen, P P., S Groshen, P E Saigo, D W Kinne & S Hellman (1989) Pathological prognostic factors in stage I (T1N0M0) and stage II (T1N1M0) breast carcinoma: a study of 644 patients with median follow-up of 18 years Journal of Clinical Oncology, 7: 1239 44 Meeran S M, Ahmed A, Tollefsbo T O (2010 ) Epigenetic targets of bioactive dietary components for cancer prevention and therapy Clinical Epigenetics, 1–16 45 Mishra S, Dwivedi S.P, Singh R.B (2010) Areviewon epigenetic effect of heavymetal carcinogenes on human health The Open Nutraceuticals Journal, 3: 188–193 46 Siegel R, Naishadham D, Jemal A (2012) Cancer statistics CA Cancer Journal for Clinicians, 62(1):10–29 47 Sasahara RM, Brochado SM, Takahashi C, Oh J, Maria-Engler SS, Granjeiro JM, Noda M, Sogayar MC (2002) Transcriptional control of the RECK metastasis angiogenesis suppressor gene C, 26(6):435-43 48 Szalmás, A, Kónya J (2009) Epigenetic alteration in cervical carcinogenesis Elsevier 49 Takahashi C, Sheng Z, Horan T P, Kitayama H, Maki M, Hitomi K (1998) Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 13221–3226 50 Timothy J Hobday, Edith A Perez (2005) Moleculary Targetd Therapies For Breast Cancer Cancer Control, 12(2): 73-81 51 Tokuhiro Kimura, Aiko Okada,Taku Yatabe, Masashi Okubo,Yoshiaki Toyama, Makoto Noda, Yasunori Okada (2010) RECK Is Up-Regulated and Involved in 58 Chondrocyte Cloning in Human Osteoarthritic Cartilage The American Journal of Pathology, 176( 6), 2859-2867 52 Verma M, Manne U (2006) Genetic and epigenetic bicomarkers in cancer diagnosis and identifying high risk populations Oncology Hematology, 60: 9-18 53 Victoria K Hill, Christopher Ricketts, Ivan Bieche, Sophie Vancher, Dean Genetle, Cheryl Lewis, Eamonn R Maher, Farida Latif (2011) Geneome- Wide DNA Methylation Profiling of CpG Islands in Breast Cancer Identifies Novel Genes Associated with tumorigeneicity Cancer Res, 71(8), 2988-3115 54 Wang W, Srivastava S (2010) Strategic approach to validating methylated genes as biomarkers for breast cancer Cancer Prev Res (Phila), 3(1):16-24 55 Wojdacz TK, Thestrup BB, Overgaard J, Hansen LL (2011) Methylation of cancer related genes in tumor and peripheral blood DNA from the same breast cancer patient as two independent events Diagn Pathol, 6:116 56 X Yang, L Yan , N E Davidson (2001) DNA methylation in breast cancer Endocrine-Related Cancer, 8: 115–127 57 Shaw R (2005) The epigenetics of oral cancer International journal of oral and maxillofacial surgery, 36(2), 101-106 58 Yun-Yi Du, D.-Q.D., Zhi Yang (2010) Role of RECK methylation in gastric cancer and its clinical significance World J Gastroenterol 16(7): 904-908 59 Zuo T, Tycko B, Liu TM, Lin JJ, Huang TH (2009) Methods in DNA methylation profiling Epigeneomics, 1(2):331-45 60 International Agenecy for Research on Cancer 2010, Breast Cancer Incidence and Mortality Worldwide, GLOBOCAN 2008, International Agenecy for Research on Cancer, 150 Cours Albert Thomas, 69372 Lyon CEDEX 08, France, viewed 1st 61 Globocan (2008), Cancer Incidence and Mortality Worldwide IARC (2010) 62 UICC.(1994) Manual of Clinical Oncology 6th 63 World Health Organization (2007) World health statistic 59 64 World Health Organization (2006) Comprehensive Cervical Cancer Control A guide to essential practice 65 International Agenecy for Research on Cancer, 2008 Tài liệu web 66 Cancer geneome Anatomy Project http://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/m_reckPathway 67 http://ungthu.net.vn/tinh-hinh-mac-benh-ung-thu-tren-gioi-va-o-viet-nam 68 http://globocan.iarc.fr/factsheets/cancers/breast.asp 69 Phòng chống ung thư, Bệnh viện K ( Vietnam national cancer hopital) (2008) http://benhvienk.com/pcut/mot-so-benh-ut-thuong-gap/1220-ung-thu-vu 70 National Cancer Intitute at the National Institutes of Health http://www.cancer.gov 71 Phân loại mô học ung thư biểu mô tuyên vú, Trung tâm y học hạt nhân ung bướu bệnh viện Bạch mai (2009) http://ungthubachmai.com.vn 72 http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RECK 60