II.2.1. Tách chiết DNA
Nguyên tắc: Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết
DNA từ các mô đúc paraffin và từ mẫu máu. Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh (SDS) kết hợp sử dụng enzym proteinase. Sau đó, protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ. DNA bộ gene sẽ được tủa với ethanol tuyệt đối trữ lạnh.
21 Hóa chất: − Phenol − Chloroform − SDS 10% − NaCl 5M − Proteinase K − EDTA 0.5M (pH=8) − Tris HCl 1M (pH=8) − Ammonium acetate 5M − Ethanol tuyệt đối
Thiết bị:
− Máy ly tâm lạnh (Hettich) − Bể ổn nhiệt (Thermo Final Test)
Các bước tiến hành tách chiết DNA từ các mô đúc paraffin
− Cắt nhỏ mẫu bệnh phẩm cho vào ống eppendorf loại 1,5 ml.
− Bổ sung 1 ml dung dịch xylene, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13000 vịng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phịng. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
− Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol tuyệt đối, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13000 vịng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phịng. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi. − Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 70 %, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13000
vịng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phịng. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi. − Bổ sung 1 ml dung dịch Ethanol 50 %, lắc đều. Sau đó, ly tâm 13000
vịng/phút trong 2 phút, ở nhiệt độ phịng. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi. Để khô trong 30 phút.
− Bổ sung l thể tích phù hợp của dung dịch ly trích DNA. Sau đó tiến hành ủ trong bể ổn nhiệt ở 56oC trong 3 ngày.
22 − Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch phenol (pH8): chloroform] (tỷ lệ1:1), lắc nhẹ. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml).
− Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch chloroform, lắc nhẹ. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml).
− Bổ sung 0.2 lần thể tích Ammonium acetate 5M và 2.5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối. Sau đó ly tâm 13000 vịng/phút, trong 5 phút ở 4OC. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
− Rửa tủa DNA bằng dung dịch Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút ở 4OC. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi. Để khơ trong 30 phút.
− Thêm 50 µl TE pH 8 hoặc nước cất 2 lần, bảo quản ở 4OC.
Các bước tiến hành tách chiết DNA từ mẫu máu
− Lấy 1ml mẫu (máu) cho vào eppendorf 1.5ml. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa, thu dịch nổi.
− Bổ sung l thể tích phù hợp của dung dịch ly trích DNA. Sau đó tiến hành ủ trong bể ổn nhiệt ở ở 56oC trong 3 giờ.
− Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch [phenol (pH8): chloroform] (tỷ lệ1:1), lắc nhẹ. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml).
− Bổ sung 1 thể tích phù hợp của dung dịch chloroform, lắc nhẹ. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút, ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi chuyển sang 1 eppendorf mới (1,5 ml).
− Bổ sung 0.2 lần thể tích Ammonium acetate 5M và 2.5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối. Sau đó ly tâm 13000 vịng/phút, trong 5 phút ở 4OC. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi.
− Rửa tủa DNA bằng dung dịch Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút ở 4OC. Sau đó thu cặn, loại bỏ dịch nổi. Để khô trong 30 phút.
23
II.2.2. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh
sáng ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang OD260nm (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A260 nm= 1OD = 50 µg/ml DNA sợi đơi). Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280.
Hóa chất và thiết bị:
− Nước cất hai lần
− Máy đo quang phổ (Bio Rad)
Các bước tiến hành:
DNA sau khi tách chiết được pha lỗng bằng nước cất vơ trùng. Sau đó chuyển tất cả dung dịch DNA pha loãng vào cuvette. Sau đó, tiến hành đo nồng độ DNA ở bước sóng 260 nm và xác định độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng OD260/OD280.
II.2.3. Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite bằng EZ DNA METHYLATION-
GOLDTM Kit
Nguyên tắc: Mẫu DNA sau khi được xử lý với hỗn hợp biến đổi sodium bisulfite để chuyển cytosine thành uracil (ngoại trừ các 5mC) sẽ được cố định trên màng của cột, sau đó muối được rửa sạch và DNA được thu hồi lại.
Hóa chất:
− CT conversion reagenet ( EZ1) − M-Dilution buffer (EZ2) − M-Dissolving buffer (EZ3) − M-Binding buffer (EZ4) − M-Wash buffer (EZ5)
− M-Desulphonation buffer (EZ6) − M-Elution buffer (EZ7)
24
Các bước tiến hành:
− Chuẩn bị chất biến đổi EZ1: trộn đều 900 µl dung dịch nước cất 2 lần và 300 µl dung dịch EZ2, 50 µl dung dịch EZ3 vào ống CT Conversion Reagenet, trộn đều trong 10 phút.
− Bổ sung 130 µl dung dịch CT Conversion Reagenet (EZ1) và 20 µl dung dịch DNA vào eppendorf 250 µl, trộn đều.
− Xử lý dung dịch DNA theo chu trình nhiệt:
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt biến đổi bisufite
− Sau đó, bổ sung 600 µl EZ4 và dung dịch DNA được xử lý nhiệt vào cột Zymo-spinTMIC (C1), đảo ống eppendort thật đều. Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phịng.
− Bổ sung 100 µl EZ5vào cột C1, ly tâm 13000vịng/phút trong 3giây, ở nhiệt độ phòng.
− Bổ sung 200 µl EZ6 vào cột C1, để nhiệt độ phòng 15-20 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 30 giây.
− Bổ sung 200 µl EZ5 EZ5vào cột C1, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng (thực hiện 2 lần).
25 − Đặt cột vào ependorf 1,5 ml, thêm 10 µl EZ7, ly tâm 3000 vịng/phút trong 30 giây, ở nhiệt độ phòng. Thu dung dịch DNA được biến đổi bisulfite, bảo quản ở -20oC.
II.2.4. Phản ứng MSP:
Sau khi thực hiện tách chiết và biến đổi bằng sodium bisulfite các mẫu DNA bộ gene người từ các mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến thực phản ứng MSP xác định mức độ methyl hóa gene RECK, bao gồm các nội dung: xác định tính đặc hiệu, độ nhạy và nhiệt độ lai tối ưu của 2 cặp mồi methyl (MF-MR) và unmethyl (UF-UR) của gene RECK.
Đồng thời, chúng tôi tiến hành phản ứng MSP nhằm khảo sát mức độ methyl hóa vùng promoter gene RECK
Hóa chất:
− Dung dịch Master mix 2X (Hãng My tab pol)
− Bộ mồi methyl và unmethyl trên gene RECK (hãng IDT) − Nước cất hai lần.
Thiết bị:
− Máy luân nhiệt (Thermo cycler, hãng BioRad)
Các bước tiến hành:
Phản ứng MSP được tiến hành trong thể tích 25 l, thành phần và chu kỳ nhiệt của phản ứng MSP như bảng 2.1 và hình 2.2
26 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (l) Master mix 2X 12,5 MFprimer/UFprimer (10 M) 0,5 MR primer/UR primer (10 M) 0,5 DNA (ng/l) X (10-100 ng) H2O cho đủ tổng thể tích Tổng 25
27
II.2.5. Phương pháp điện di: Nguyên tắc:
Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA. Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được ghi lại dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ=300 nm). Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn.
Hóa chất:
− Thang chuẩn 100bp (Bio line) − Agarose (Bio basic)
− 25X TAE Buffer (Bio basic)
− Chất nhuộm: Ethidium bromide (Bio Rad)
Thiết bị:
− Buồng điện di
− Máy đọc gel (Bio Rad)
Các bước tiến hành:
Hút khoảng 7-10 l sản phẩm PCR và chạy điện di với gel agarose 1,5 % đã bổ sung chất nhuộm ở hiệu điện thế 70 V trong 50 phút.
28 Chương III
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN