T Ổ NG QUAN
SƠ LƯỢC VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
I.1.1.Tình hình ung thư, cụ thể ung thư cổ tử cung trên thế giới và ở Việt Nam
Bệnh ung thư và sức khoẻ cộng đồng đang là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Theo thống kê và ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 11 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này [43] Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người [ 43] Tỷ lệ mắc ung thư có xu hướng gia tăng ở hầu hết các nước trên thế giới Các bệnh ung thư hàng đầu trên thế giới, đối với nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; còn ở nữ giới là ung thư vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi Trong đó các loại ung thư đại trực tràng, tiền liệt tuyến thường gặp ở các nước phát triển, còn ở các nước đang phát triển chủ yếu gặp các loại ung thư cổ tử cung, vòm họng, gan, thực quản…
Ung thư cổ tử cung là bệnh phổ biến thường gặp ở phụ nữ, thường được phát hiện ở những phụ nữ trong độ tuổi khoảng 30-59 tuổi, nhiều nhất là ở độ tuổi từ 45-
55 tuổi, rất hiếm ở phụ nữ dưới 20 tuổi Trên thế giới, ung thư cổ tử cung là bệnh ung thư phổ biến hàng thứ hai (sau ung thư vú) Trong khi ung thư vú là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở các nước phát triển thì ung thư cổ tử cung là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở các nước đang phát triển Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 500.000 người mới mắc bệnh ung thư cổ tử cung [4] , chiếm 4,5 % tỷ lệ người mới mắc bệnh và gần 250.000 phụ nữ trong số này chịu đầu hàng căn bệnh này [4] Trong đó tỷ lệ mắc bệnh ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát triển chiếm khoảng 80% cao hơn ở các nước phát triển [4] Và trong một thời gian dài, ung thư cổ tử cung là cơn ác mộng đối với phụ nữ, không chỉ do bệnh diễn tiến thầm lặng rất khó phát hiện mà còn vì tỉ lệ tử vong và số lượng bệnh nhân Điều đáng sợ là do các dấu hiệu tiền ung thư và ung thư giai đoạn đầu ở cổ tử
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 3 cung không gây đau đớn hay có triệu chứng rõ rệt Tuy nhiên, theo các chuyên gia y tế, ung thư cổ tử cung nếu được phát hiện ở giai đoạn sớm, người bệnh sẽ có cơ hội chữa khỏi bệnh rất lớn và tiết kiệm một khoản chi phí đáng kể trong quá trình điều trị
Cũng như các nước trên thế giới, số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam đang có xu hướng ngày một gia tăng Tại Việt Nam, theo ghi nhận ung thư ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh, ước tính mỗi năm có khoảng 150.000 người mới mắc bệnh ung thư và khoảng 50 – 70 nghìn người chết vì ung thư [44] Đối với nam giới tại Hà nội và thành phố Hồ Chí Minh thì ung thư phổi, dạ dày, gan, đại trực tràng chiếm tỷ lệ cao nhất Còn đối với nữ giới: ung thư vú và ung thư cổ tử cung là hai loại ung thư chiếm tỷ lệ cao nhất tại thành phố Hồ Chí Minh Ngoài hai thành phố lớn là Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, hiện nay chúng ta đã tiến hành ghi nhận các số liệu về ung thư tại một số bệnh viện, thành phố khác như thành phố Huế, Đà Nẵng, Cần Thơ, Hải Phòng, bệnh viện E Hà Nội Nhìn chung tỷ lệ mắc bệnh ung thư ở các địa phương về cơ bản có những nét tương đồng
Trong các căn bệnh ung thư thường mắc phải ở phụ nữ Việt Nam, ung thư cổ tử cung là mối e ngại lớn đối với sức khoẻ và hạnh phúc của phụ nữ bởi ung thư cổ tử cung hiện nay đang là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ 2 ở Việt Nam (sau ung thư vú) Tỷ lệ phụ nữ tại thành phố Hồ Chí Minh bị ung thư cổ tử cung chiếm tỉ lệ cao nhất Điều này khác với thành phố Hà Nội, ung thư vú ở vị trí số 1 Trong khi đó tỷ lệ phụ nữ tại Hà Nội bị ung thư cổ tử cung xếp ở vị trí thứ 5 [45] Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ ung thư cổ tử cung cao trong các nhóm phụ nữ: làm nông nghiệp, có nhiều bạn tình, sinh hoạt tình dục sớm, có con sớm, nhiễm các bệnh lây qua đường tình dục [4] Hiện tại, có khoảng 30,77 triệu phụ nữ tuổi từ 15 tuổi trở lên có nguy cơ mắc phải ung thư cổ tử cung Theo kết quả thống kê của IARC cho thấy rằng có 2.472 ca tử vong trong số 5.174 trường hợp được chẩn đoán ung thư cổ tử cung mỗi năm tại Việt Nam [42]
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 4
Gần đây các nhà khoa học đã xác định thủ phạm chính của hầu hết các dạng ung thư cổ tử cung là Human Papilloma Virus (HPV) – một loại virus gây u nhú ở người, chiếm khoảng 70-80% số trường hợp phụ nữ bị ung thư cổ tử cung [47] Nhiễm HPV thường gặp nhất ở phụ nữ trong độ tuổi 18-28 và những phụ nữ bị nhiễm virus HPV thường có nguy cơ bị ung thư cổ tử cung tăng gấp 2,5-5 lần so với phụ nữ không bị nhiễm [4] Virus HPV được phân làm 2 nhóm: nguy cơ cao và nguy cơ thấp (về tính gây ung thư) Hiện có khoảng 100 phân nhóm virus HPV, trong đó khoảng 40 nhóm tác động trên đường sinh dục, số nhóm nguy cơ cao hiện nay vào khoảng 15 - 18 nhóm, phổ biến nhất là nhóm 16, 18 (2 nhóm HPV-16 and HPV-18 liên quan đến khoảng 70% các ca ung thư cổ tử cung) [4] Nhóm có nguy cơ cao có liên quan cao đến bệnh lý ung thư với khả năng tích hợp DNA vào bộ gen của tế bào người, làm rối loạn sinh sản ác tính, gây ra ung thư (hầu như các trường hợp ung thư cổ tử cung đều phát hiện có nhiễm HPV nguy cơ cao) Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), tỷ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13% [5] , như vậy tổng số phụ nữ nhiễm loại virus này là 630 triệu, trong đó 2/3 trường hợp nhiễm HPV thuộc nhóm nguy cơ cao Tại Việt Nam, theo bác sĩ Lưu Văn Minh (Bệnh viện Ung bướu TPHCM), điều tra của Cơ quan nghiên cứu Quốc tế về Ung thư (IARC) cho thấy năm 2000, trong tổng số 7.700 ca ung thư cổ tử cung mới được phát hiện thì HPV là thủ phạm của 5.500 trường hợp và trong số các bệnh nhân này, 4.000 người đã tử vong [48] Trái lại nhóm HPV nguy cơ thấp thì hiếm khi gặp trong các trường hợp ung thư với bộ gen tồn tại độc lập với tế bào chủ, thường chỉ gây ra các u lành biểu mô
I.1.2.2.Cơ chế gây bệnh nhiễm HPV
HPV là một loại virus DNA không có vỏ bọc cùng nhóm với adenovirus hay parvovirus (nhóm parvovavirus) Virus có một lớp bao protein với một số gen được phát hiện có tính gây ung thư (E6, E7) Đặc biệt các gen có tính gây ung thư (E6, E7) tác động vào các gen của tế bào chủ vốn làm nhiệm vụ ức chế quá trình phát
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 5 triển của tế bào (cụ thể là p53 và RB: 2 loại protein này điều chỉnh sự phân chia và mức độ phát triển tế bào); do đó sẽ gây ra sự phát triển hỗn lọan của nhóm tế bào bị nhiễm Virus HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp 2 lọai mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa) Biểu mô lát tầng không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được qui định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó sẽ được bong ra ngoài Đặc biệt những tổn thương làm giảm sức đề kháng của cơ thể sẽ tạo điều kiện cho virus HPV dễ dàng xâm nhập vào lớp tế bào đáy cổ tử cung có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của một rồi nhiều lớp tế bào sau đó, lớp tế bào đáy này vốn nằm sâu bên dưới và được bảo vệ bằng tế bào lát tầng (loại tế bào vẩy) Khi các tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp của tế bào biểu mô lát (dị sản nặng ung thư tại chỗ), sau đó có khả năng phát triển lan rộng khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung giai đoạn xâm lấn Nhìn chung sau khi xâm nhập, virus HPV sẽ ẩn nấp tồn tại trong nhiều năm thậm chí hàng chục năm rồi tác động gây biến đổi các tế bào này và biến chúng trở thành các tế bào ác tính nhưng khi đã có biểu hiện bệnh, thời gian sống sẽ rất ngắn (tương tự như ung thư cổ tử cung giai đoạn muộn) Tuy nhiên, những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra tại biểu mô lát vốn không có tiếp xúc mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch, và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên HPV
Một điều rất đáng lưu ý là không phải nhiễm HPV là sẽ bị ung thư cổ tử cung Nhiễm HPV bất kỳ thuộc nhóm nào đều có khả năng tự lui bệnh đến hết hẳn và không để lại di chứng gì cho người bị nhiễm Một số trường hợp nhiễm kéo dài, đặc biệt do nhóm nguy cơ cao, sẽ gây ra các tổn thương về phát triển mô học của cổ tử cung (dị sản xếp theo thứ tự nhẹ, vừa, nặng) Hơn phân nửa các trường hợp dị sản nhẹ có khả năng tự thoái lui; 10% các trường hợp dị sản nặng hay vừa có khả năng tiến triển nặng hơn trong 2-4 năm; khoảng 50% dị sản nặng sẽ trở thành ung thư tại chỗ cổ tử cung [45]
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 6
I.1.3.Giai đoạn Đối với ung thư cổ tử cung, quá trình phát triển của một tế bào bình thường đến ung thư được chia ra làm 4 thời kỳ chính, từ nhẹ đến nặng như sau:
- Thời kỳ 1: Nhiễm HPV (Human papilloma virus)
- Thời kỳ 2: Tiền ung thư (chỉ có khoảng 10% phụ nữ bị nhiễm HPV trở thành tiền ung thư, thời gian từ khi nhiễm virus đến tiền ung thư kéo dài từ 5 - 10 năm)
- Thời kỳ 3: Ung thư chưa/không di căn (ở giai đoạn này, tế bào có dấu hiệu ung thư nhưng chỉ giới hạn trong cổ tử cung và do đó việc điều trị có thể đem lại kết quả khả quan)
- Thời kỳ 4: Ung thư di căn (tức là tế bào ung thư xâm lấn sang các bộ phận khác và đây chính là giai đoạn nguy hiểm nhất của bệnh)
Ung thư cổ tử cung có giai đoạn tiền ung thư rất rõ ràng Trước khi có ung thư, đã có những bất thường của tế bào cổ tử cung gọi là tình trạng dị sản Những tổn thương dị sản nhẹ có thể trở về bình thường Nhưng ở thời kỳ đầu mắc bệnh, cơ thể hầu như sẽ không có dấu hiệu, triệu chứng nào cả hoặc nếu có cũng chỉ là những cơn đau nhẹ Nếu xuất hiện tình trạng dị sản nặng hơn hoặc ung thư ở giai đoạn sớm, cần có hướng điều trị phù hợp kịp thời Lúc này, khả năng chữa khỏi là 95% Nhưng khi ung thư ở giai đoạn phát triển mạnh, các triệu chứng biểu hiện rõ rệt và cụ thể hơn Ở giai đoạn cuối này, bệnh nhân thường bị đau bụng dưới, đau lưng và tử vong rất nhanh (tỷ lệ sống thêm 3 - 5 năm chỉ còn khoảng 5%) [47]
ĐẠI CƯƠNG HỌ GEN DNMTs
Ngày nay nhiều bệnh ung thư đã được phát hiện và nghiên cứu Có rất nhiều nguyên nhân gây ra ung thư khác nhau, nhưng ở cơ chế phân tử thì liên quan đến các biến đổi di truyền trên DNA hay các biến đổi epigenetics Vậy epigenetics là gì? Những biến đổi epigenetics có liên quan như thế nào đến sự hình thành và phát triển ung thư?
Epigenetics là hiện tượng liên quan đến những biến đổi cấu trúc DNA mà không liên quan đến biến đổi trình tự DNA và được di truyền cho thế hệ sau [30] Bản thân DNA trong bộ gen Eukaryote chịu các biến đổi do gắn các nhóm chức khác nhau Những thay đổi này có tính đặc thù cho từng vùng nhiễm sắc thể, tác động đến cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc, tham gia kiểm soát hoạt động của các gen [1] Những đặc thù cấu hình riêng của từng vùng nhiễm sắc thể sẽ được di truyền cho thế hệ sau [1] Do đó những sai lệch trong cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc có thể làm xuất hiện tính trạng mới trong khi trình tự nucleotide không sai hỏng Epigenetics bao gồm các biến đổi histone và methyl hóa DNA
Hiện tượng gắn nhóm methyl vào cytosine trong cấu trúc CpG trên DNA được gọi là hiện tượng methyl hóa DNA Quá trình này xảy ra sau sự tổng hợp DNA do sự hoạt hóa của một số enzyme, các enzyme này chuyển hóa nhóm methyl từ S-adenosyl methionine sang cytosine ở những vị trí xác định trên nhiễm sắc thể [3] Sự methyl hóa DNA là hiện tượng bình thường trong sự phát triển của tế bào, xảy ra với cả DNA Prokaryote và Eukaryote Trong khi ở Prokaryote, hiện tượng
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 11 methyl hóa được xem là cơ chế bảo vệ bộ gen, thì ở Eukaryote, methyl hóa đóng vai trò trong cơ chế kiểm soát hiện tượng đánh dấu DNA (DNA imprinting), tức tính trạng của gen được biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ [1]
Phản ứng gắn nhóm methyl vào cytosine được xúc tác bởi các enzyme methyltransferase [1] Có thể phân biệt các enzyme này thành 2 nhóm Nhóm thứ nhất có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở nhũng vị trí cytosine trên sợi đơn DNA vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản DNA Việc gắn gốc methyl mới này dựa vào nhóm m CpG (CpG bị methyl hóa) trên sợi khuôn Chúng được gọi chung là các enzyme duy trì nhóm methyl (maintenance methyltransferase) Nhóm thứ hai gồm các enzyme xúc tác phản ứng gắn gốc methyl vào vị trí cytosine trên phân tử DNA mà vị trí này trước đó không có nhóm methyl [1]
Hình I.1: Sự methyl hóa cytosine dưới sự xúc tác của enzyme DNA methyltransferrase
Khoảng 2-7% DNA ở tế bào động vật bị methyl hóa [1] Hầu hết nhóm methyl được tìm thấy ở Cytosine ( C ) phân bố trong cặp nucleotide CpG [1] Có khoảng 70- 80% CpG bị methyl hóa trong tế bào ở người [15] Những vùng giàu C-G liên kết với nhau (tỷ lệ %GC > 50%) có độ dài khoảng 200 bp được gọi là đảo CpG [11] Các CpG thường phân bố nhiều ở vùng 5’ của gen [19] Có khoảng 56% các gen trong bộ gen của người phân bố gần với đảo CpG [19] , dường như chúng được bảo vệ để tránh những biến đổi bất thường Methyl hóa DNA là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đối với việc hoạt động biểu hiện của gen, nhất là các gen trong quá trình phát triển hình thành cá thể Nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều gen đang phiên mã tổng hợp RNA đều không chứa nhóm methyl ở vùng promoter và exon thứ nhất (đầu 5’), mặc dù các exon tiếp sau và phía 3’ có chứa nhóm methyl [1] Rõ ràng sự methyl hóa có
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 12 tác dụng ngăn cản hoạt động của gen Ngược lại, nếu khử nhóm methyl thì gen được hoạt hóa Những gen hoạt động trong tế bào thường không có đảo CpG bị methyl hóa, đối với các gen đặc hiệu (chỉ hoạt động trong những tổ chức chuyên biệt) thì phản ứng methyl hóa đảo CpG của chúng được kiểm soát chặt chẽ Đảo CpG không bị methyl hóa trong tế bào cần đến sản phẩm của gen nhưng chúng bị methyl hóa trong những tế bào không cần gen biểu hiện Sự methyl hóa cytosine là cơ chế kiểm soát hoạt động tiêu cực của gen Sự methyl hóa đảo CpG được điều hòa chặt chẽ trong quá trình phát triển và thường gắn với "sự im lặng của gen",bất hoạt nhiễm sắc thể X, sự đánh dấu gen [19]
Tuy nhiên dưới tác động của các yếu tố môi trường như hormone, chất dinh dưỡng, thuốc … có thể gây ra những biến đổi bất thường về sự methyl hóa DNA Những biến đổi bất thường về sự methyl hóa này có thể gây ra những rối loạn trong việc biểu hiện của gen Chúng giảm biểu hiện khi có sự methyl hóa quá mức dẫn đến ức chế sự phiên mã và ngược lại chúng tăng cường biểu hiện khi giảm methyl hóa Điều này không chỉ giới hạn trong vài gen mà trải dài toàn bộ gen [29] Vì vậy, khi sự methyl hóa bất thường trên đảo CpG của một gen xảy ra, có thể gây ức chế hay hoạt hóa sự phiên mã gen làm gen không hoạt động hay biểu hiện quá mức, đặc biệt đối với các gen then chốt dẫn đến ung thư do biểu hiện không đúng lúc (các nhóm gen ức chế ung thư, gen gây ung thư…) Một số nghiên cứu trước đây cho thấy sự methyl hóa quá mức hay giảm methyl hóa của gen cụ thể là một dấu hiệu của hầu hết các bệnh ung thư [29] Và điều này được nhấn mạnh gần đây bằng sự gia tăng số lượng các gen bị methyl hóa quá mức và các gen bị giảm methyl hóa [29] Trong hầu hết các loại ung thư, sự methyl hóa quá mức là nguyên nhân gây nên bất hoạt các gen ức chế khối u [29] Đảo CpG trên các gen đó bình thường không bị methyl hóa trong tế bào nhưng bị biến thành đảo m CpG trong tế bào ung thư, điều này gây ức chế phiên mã dẫn đến giảm biểu hiện của gen [29] Gen im lặng bởi sự methyl hóa quá mức thường là một quá trình tích lũy dần dần gây ra, dần dần giảm mức độ phiên mã gen Thông thường, khi có tổn thương DNA xảy ra, các gen ức chế ung thư sẽ được kích hoạt nhưng sự methyl hóa quá mức có thể bất hoạt gen ức chế ung thư, khi đó những tổn thương DNA được tích luỹ lại dần dần hình thành
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 13 ung thư Thực tế cho thấy hầu như tất cả các loại ung thư đều có xảy ra sự methyl hóa bất thường [29] Vai trò của sự methyl hóa quá mức đảo CpG đã được khẳng định trong phát sinh ung thư, và nó là một biểu hiện sớm trong sự phát triển tế bào ung thư [29] Bên cạnh đó trong các tế bào khối u, không chỉ có sự methyl hóa quá mức mà sự giảm methyl hóa DNA (so với các tế bào bình thường) cũng đã được tìm thấy và công nhận từ năm 1983 [29] Ngoài ra, sự biểu hiện quá mức của DNMTs ở mức độ mRNA đã được nhận thấy ở một vài bệnh ung thư [29] Các enzyme này cũng góp phần vào sự methyl hóa bất thường và dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư
Như chúng ta đã biết, DNA của eukaryote thường được đóng gói cùng các protein histone trong cấu trúc nucleosome Nucleosome gồm phần lõi hình thành nên từ 8 phân tử protein histone và DNA bao quanh chúng Có thể nói, ở ekaryote, histone là nhóm protein liên kết DNA phổ biến nhất Có 5 loại histone: H1, H2A, H2B, H3, H4 Trong đó 4 loại H2A, H2B, H3, H4 cấu tạo nên lõi nucleosome, được gọi là các histone lõi Còn phân tử histone H1 liên kết vùng DNA nối, vì vậy được gọi là histone nối Các histone chứa nhiều acid amin tích điện dương nên nó có thể liên kết ổn định với phân tử DNA tích điện âm tạo nên cấu trúc nucleosome Các nucleosome được xem là đơn vị cấu trúc cơ bản và quan trọng nhất của chất nhiễm sắc ở tế bào eukaryote Ở eukaryote, cả sự hoạt hóa cũng như ức chế phiên mã đều thường có liên quan đến sự thay đổi cấu trúc nucleosome [2] Cho nên những biến đổi cấu trúc của nucleosome cụ thể thông qua những biến đổi trên histone có thể gây ra những biến đổi của chất nhiễm sắc Bởi vì đuôi N của histone (đuôi histone ) có cấu trúc dễ biến đổi và nó là phần thuộc nucleosome dễ tiếp cận nhất Và đuôi N không phải là phần thiết yếu cho sự liên kết giữa DNA với histone Thay vào đó vai trò quan trọng của nó là tham gia điều hòa biểu hiện gen qua sự biến đổi cấu trúc nucleosome Những biến đổi đó bao gồm các quá trình acetyl hóa, methyl hóa và phosphoryl hóa histone.
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 14 Ở eukaryote sự methyl hóa DNA là dấu hiệu cơ bản cho biết một vùng hệ gen có được biểu hiện hay không Những vùng này không chỉ có sự methyl hóa DNA mà thường huy động các enzyme acetyl hóa histone hay enzyme deactyl hóa histone cải biến nucleosome nhằm điều hòa hoạt động phiên mã của gen [2] a.Acetyl hóa và khử acetyl histone
Thông thường với việc acetyl hóa và khử acetyl ở histone liên quan đến hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động của gen Tương ứng với các nucleosome được acetyl hóa tương ứng với những vùng nhiễm sắc thể được phiên mã tích cực, còn các nucleosome bị khử acetyl tương ứng với những vùng bị ức chế phiên mã [2] Mỗi loại histone có thể được gắn nhóm acetyl ở những vị trí đặc hiệu bởi các enzyme riêng biệt [1] Điều đó gây ra những tác động khác nhau đến biểu hiện của gen Ngoài ra, quá trình acetyl hóa còn làm thay đổi phức điều biến chromatin (remodeling chromatin complexes) [1] Phức này có chức năng phá vỡ tạm thời cấu trúc lõi histone hay dịch chuyển nucleosome trên sợi nhiễm sắc Chúng thường tương tác với vùng đuôi N của histone [1] Nhóm acetyl gắn vào lysine tích điện dương trong đuôi histone làm cho chromatin tháo xoắn Khi vùng này có mang nhóm acetyl, phức điều biến chromatin có thể làm cho các histone H2A-H2B bị di chuyển ra khỏi cấu trúc lõi nucleosome Nhờ đó các promoter được bộc lộ, cho phép quá trình tổng hợp RNAm bắt đầu [1]
Sự cải biến histone diễn ra linh hoạt do một số enzyme chuyên hóa xúc tác Các enzyme histone acetylase xúc tác bổ sung nhóm acetyl cho lysine (Lys) ở đuôi
N của histone, nơi mà các enzyme histone deacetylase có tác dụng ngược lại (loại bỏ nhóm acetyl ) [2] Những biến đổi thuận nghịch giữa hai dạng acetyl và deacetyl của histone phụ thuộc vào hai loại enzyme histone acetyl transferase (HAT) và histone deacetylase (HDAC) [1] Hai enzyme này đòi hỏi các protein đồng hoạt hóa với HAT hoặc đồng ức chế với HDAC Rõ ràng hai quá trình acetyl hóa và khử acetyl có tác dụng ngược nhau trong việc thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc và hoạt động của các gen Các enzyme deacetylase (HDAC) làm giảm mức độ acetyl hóa histone, dẫn đến kìm hãm phiên mã Ngược lại, enzyme acetyl transferase (HAT)
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 15 tăng cường mức độ acetyl hóa, kích thích quá trình phiên mã Mặt khác, cạnh tranh giữa hai phản ứng acetyl hóa và khử acetyl giúp sợi nhiễm sắc thay đổi linh hoạt, đáp ứng kịp thời với việc tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động của gen [1] b.Methyl hóa histone
ẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 25
Các mẫu bệnh phẩm và mẫu máu được bảo quản ở nhiệt độ -30 o C trước khi tiến hành tách chiết DNA.Trong đó 7 mẫu bệnh phẩm mà chúng tôi sử dụng để phân tích được cung cấp từ công ty Việt Á, những mẫu này đã được khẳng định nhiễm HPV type độc (HPV 11, 18, 33) Đối với mẫu máu ,chúng tôi sử dụng để tối ưu hóa phản ứng BSP
II.2.1.Khảo sát in silico
II.2.1.1 Các phần mềm và trang web sử dụng
⮚ Phần mềm trực tuyến IDT www.idtdna.com
⮚ Trang web: www.ncbi.nlm.nih.gov, www.urogen.org
II.2.1.2 Phương pháp tiến hành a.Thu nhận trình tự gen, xác định vùng cần khảo sát
Thu nhận trình tự gen DNMT3L từ ngân hàng gen trên www.ncbi.nlm.nih.gov Từ trình tự gen thu nhận được này ta xác định vùng khảo sát, cụ thể là promoter đến exon 1 Tiếp theo xác định vùng promoter đến exon 1 có đảo CpG hay không bằng phần mềm trực tuyến www.methprimer.com b.Xác định yếu tố phiên mã :
Dựa vào phần mềm trực tuyến TFSEARCH , chúng tôi có thể xác định các vị trí gắn các yếu tố phiên mã trên gen DNMT3L c.Phương pháp thiết kế đánh giá primer
Tiến hành biến đổi bisulfite in silico đoạn DNA cần khảo sát bằng cách sử dụng phần mềm trực tuyến www.methprimer.com Dựa trên trình tự đã biến đổi
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 26 bisulfite này, giai đoạn thiết mồi được tiến hành sau đó Đồng thời, chúng tôi cũng tiến hành thu thập các trình tự mồi khảo sát sự methyl hóa trên gen DNMT3L đã được công bố
Kiểm tra khả năng bắt cặp bổ sung của mồi trên gen DNMT3L bằng phần mềm Annhyb
Kiểm tra và phân tích các thông số của các cặp mồi thu được bằng phần mềm trực tuyến www.IDTDNA.com, Annhyb Các thông số của primer cần phải phân tích như nhiệt độ nóng chảy Tm , kích thước sản phẩm tạo thành, chiều dài, tỷ lệ
%GC, khả năng tạo dimer và hairpin loop…
Sử dụng MethBlast để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi
II.2.2.Khảo sát thực nghiệm
Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện theo quy trình thực nghiệm sau đây
Biến đổi Bisulfite DNA và tinh sạch sản phẩm sau khi biến đổi
Kiểm tra chất lượng DNA thu được bằng đo OD, điện di, PCR
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 27
II.2.2.1.Tách chiết DNA a.Nguyên tắc:Chúng tôi sử dụng phương pháp phenol/chloroform để tách chiết DNA Trong đó, màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh b.Thiết bị và hóa chất:
Máy ly tâm lạnh Hettich c.Các bước tiến hành:
- Bước 1: Cho mẫu vào ống Eppendorf loại 1,5ml
- Bước 2: Thờm 700àl hỗn hợp gồm 14àl NaCl 5M, 14àl Tris HCl 1M (pH=8), 14 àl dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8), 33 àl SDS 10%, và 615àl H2O Cắt nhuyễn mụ bệnh phẩm Bổ sung 10àl protein K (nồng độ 20mg/ml)
- Bước 3: Trộn đều hỗn hợp ủ 48 o C trong 2h , thỉnh thoảng lắc nhẹ
- Bước 4: Thờm 700 àl phenol: chloroform (tỷ lệ 1:1) Trộn đều Ly tâm 15.000 vòng trong 3 phút
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 28
- Bước 5: Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch Lặp lại bước 4, bước 5 thêm một lần
- Bước 6: Thêm một lượng dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được Trộn nhẹ Ly tâm 15.000 vòng trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf sạch
- Bước 7: Thêm một lượng Sodium acetate NH4OAc 5M bằng 0,2 lần thể tích dịch nổi và một lượng cồn ethylic (EtOH) 100% bằng 2,5 lần thể tíc dịch nổi
- Bước 8: Trộn đều Để kết tủa DNA ở -20 0 C trong 30 phút Ly tâm 15.000 vòng ở 4 0 C trong 10 phút Thu lấy kết tủa, loại bỏ phần dịch trong ống
- Bước 9: Thờm 500 àl cồn EtOH 70% lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tõm 15.000 vòng ở 4 0 C trong 5 phút
- Bước 10: Thu kết tủa loại bỏ EtOH phía trên Để khô tự nhiên qua đêm
- Bước 11: Hũa tan kết tủa DNA trong 30-50 àl nước Bảo quản DNA ở (-20 0 C)
II.2.2.2 Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận a Phương pháp đo quang phổ
❖ Nguyên tắc: Hàm lượng của DNA trong dung dịch thu được có thể xác định dựa trên sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các bazơ nitơ trong phân tử DNA mạch kép và mạch đơn Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm- Optical Density) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch Một đơn vị OD ở bước sóng 260 nm ký hiệu A260 nm
Máy đo quang phổ Bio Rad
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 29
DNA sau khi tách chiết được pha loãng 7 lần bằng nước cất vô trùng Sau đó chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở bước sóng 260nm Độ tinh sạch của dung dịch được xác định bằng OD260/OD280 b Phương pháp điện di
Các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ12 nm) Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn
Buồng điện di Bio Rad
Dung dịch nạp mẫu Bio Rad
Máy đọc gel Bio Rad
Ethidium bromide (10mg/ml) Bio Rad
Thang chuẩn 100bp (in vitro) Bio Rad
DNA đã pha loãng sau khi đo OD xong được chúng tôi sử dụng tiếp cho quá trỡnh điện di Hỗn hợp 15àl DNA đó pha loóng và 3 àl dung dịch nạp mẫu được chạy điện di với gel agarose 2% ở hiệu điện thế 80 V trong 30 phút Nếu phổ điện di của dung dịch DNA đã tách chiết sau khi hiện hình cho một dải băng rộng hoặc cho nhiều vạch thì chứng tỏ DNA đã bị gãy đoạn nhiều, hoặc lẫn DNA với RNA Phổ điện di là băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy và không lẫn tạp
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 30 c Kiểm tra chất lượng DNA bằng phản ứng PCR
Sau khi xác định nồng độ và chất lượng DNA bộ gen bằng điện di và OD như trên, chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR bằng cặp mồi DcR1 hoang dại (DcR1-W) đã được thiết kế từ nghiên cứu trước đây của nhóm [6] để đánh giá hiệu quả của quá trình tách chiết DNA Nếu kết quả cho ra vạch sản phẩm như mong đợi chứng tỏ trong dịch chiết thu được có chứa DNA bộ gen và có thể sử dụng DNA thu nhận này cho các bước thực nghiệm tiếp theo
Premium PCR master mix 2X Việt Á
Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tớch 25 àl với mồi DcR1-W (bảng III.4), thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR như bảng II.1 và II.2
Bảng II.1: Thành phần phản ứng PCR với DcR1-W
Thành phần Thể tớch (àl)
SVTH: Bùi Thị Tuyết Nga 31
Bảng II.2: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với DcR1-W
II.2.2.3 Biến đổi bisulfite bằng Epitect Bisulfite Kit: a.Nguyên tắc:
K Ế T LU ẬN VÀ ĐỀ NGH Ị
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã thành công trong việc:
− Thu nhận trình tự gen DNMT3L và xác nhận vùng promoter, 5’UTR, exon 1a của gen DNMT3L
− Nhận diện vị trí hot spot và vùng gen cần khảo sát mức độ methyl hóa gen DNMT3L
− Thu thập được bộ mồi sử dụng cho phản ứng BSP nhằm xác định mức độ methyl hóa của gen DNMT3L
− Các cặp mồi thu thập có các thông số khá phù hợp với yêu cầu và có độ đặc hiệu cao
− Tối ưu hóa phản ứng BSP để khảo sát mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter gen DNMT3L.
ĐỀ NGHỊ
Bổ sung kết quả giải trình tự để khảo sát mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trên vùng promoter gen DNMT3L
Tiến hành đánh giá mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng gen DNMT3L khảo sát bằng phương pháp BSP trên một số lượng mẫu bệnh phẩm lớn hơn và theo các diễn tiến của các giai đoạn ung thư cổ tử cung.
SVTH: BÙI THỊ TUYẾT NGA
Bảng I: Trình tự và các thông số IDT của hệ thống mồi cho gen DcR1 hoang dại
Primer Trình tự Chiều dài %CG Tm
Cấu trúc homo - dimer ∆G (kcal/mole)
Cấu trúc hetero - dimer ∆G (kcal/mole)
Chiều dài khuếch đại (bp)
⮚ Kết quả khảo sát đặc tính primer từ bài báo “DNA methylation profile at
DNMT3L promoter “ o Kết quả Methblast
SVTH: BÙI THỊ TUYẾT NGA
Primer biến đổi Bisulfite xuôi: 5’ -TTT GAG GGT TTT ATT TTT TGA ATT
SVTH: BÙI THỊ TUYẾT NGA
Primer biến đổi Bisulfite ngược: 5’- AAA AAT CCA AAC CCA CCT AAA AC-3’
1 Lan VTT (2007) Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng
2 Long ĐĐ & Thăng ĐL (2009) Cơ Sở Di Truyền Học Phân Tử Và Tế Bào
NXB Đại học quốc gia Hà Nội
3 Lựơng NĐ, Huyền PT, Tiên LTT, Oanh HN & Cường C (2002) Công Nghệ Gen NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh
4 Trung NS & Hà HTN (2008) Ung thư Cổ tử cung : Phát hiện và Phòng ngừa Y Học TP Hồ Chí Minh Tập 12 số 2
5 Hà NPN Bước đầu chuẩn đoán HPV bằng phương pháp sinh học phân tử tại bệnh viện Phong - Da liễu Trung ương Quy Hòa
6 Linh, L.T.T., H.B Khuyen, and L.H.A Thuy, Xây dựng qui trình methylation specific PCR nhằm khảo sát mức độ methl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter 2 gen TRAIL-R3, TRAIL - R4 trên các bệnh nhân bị ung thư cổ tử cung Tạp chí công nghệ sinh học, 2010 8: p 1091-
Tài li ệ u Ti ế ng Anh
7 Aapola U, Maenpaa K, Kaipia A & Peterson P (2004) Epigenetic modifications affect DNMT3L expression Biochem.J,vol 380, 705-713
8 Bacolla A, Pradhan S , Roberts RJ & Wells RD (1999) Recombinant human DNA (Cytosine-5) methyltransferase lI steady-state kinetics reveal allosteric activation by methylated DNA J Biol Chem 274, 33011-
9 Beard C, Li E and Jaenisch R (1995) Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells Genes Dev 9, 2325-2334
10 Bestor TH (1992) Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn-binding regulatory domain EMBO J 11, 2611-2618
11 Li, L.-C and R Dahiya, (2002) Methprimer: designing primers for methylation PCRs 2002 18: p 1427-1431
12 Brooks J, Cairns P & Zeleniuch-Jacquotte A (2009) Promoter methylation and the detection of breast cancer
13 Chen RZ, Pettersson U, Beard C, Jackson-Grusby L and Jaenisch.R (1998) DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates Nature
14 Dong A,Yoder JA, Zhang X, Zhou L, Bestor TH & Cheng X (2001) Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA Nucleic Acids
16 EI-Maarri O,Kareta M, Mikeska T, Becker T, Diaz-Lacava A, Junenl J, Nusgen N, Behne F, Wienker T, Waha A, Oldenburg J & Chedin F (2009)
A systematic search for DNA methyltransferase polymorphisms reveals a rare DNMT3L variant associated with sudtelomeric hypomethylation
17 Fatemi M, Hermann A, Pradhan S and Jeltsch A (2001) The activity of the murine DNA methyltransferase Dnmt1 is controlled by interaction of the catalytic domain with the N-terminal part of the enzyme leading to an allosteric activation of the enzyme after binding to methylated DNA J
18 Gokul G, Gautami B, Malathi S, Sowjanya AP, Poli UR, Jain M, Ramakrishna G & Khosla S (2007) DNA methylation profile at DNMT3L promoter 2007 Landes Bioscience
19 Hirst M & A.Marra M (2008) Epigenetic and human disease The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, www.elsevier.com/locate/biocel
20 Hu YG, Hirasawa R, Hu JL, Hata K, Li CL, Jin Y, Chen T, Li E, Rigolet
M, ´Quignot EVP, Sasaki H & Xu GL (2008) Regulation of DNA methylation activity through Dnmt3L promoter methylation by Dnmt3 enzymes in embryonic development Human Molecular Genetics, Vol17
21 Lauster R, Trautner TA and Noyer-Weidner.M (1989) Cytosine-specific type II DNA methyltransferases A conserved enzyme core with variable target-recognizing domains J Mol Biol 206, 305-312
22 Lei H, S P OH, Okano.M, Juttermann.R,.Goss K A, Jaenisch.R and Li.E (1996) De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells Development 122, 3195-3205
23 Li E, Bestor TH and JaenischR (1992) Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality Cell 69, 915-926
24 Li E (2002) Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development Nat Rev Genet 3, 662-673
25 Lyko F (2001) DNA methylation learns to fly Trends Genet 17, 169-172
26 Manderwad GP, Gokul G, Kannabiran C, G.Honavar S, Khosla S & K.Vemuganti G (2010) Hypomethylation of the DNMT3L promoter in Ocular surface Squamous Neoplasia Arch Pathol Lab Meb ,2010, vol 134
27 Margot JB, Aguirre-Artete AM, Di Giacco BV, Pradhan S, Roberts R.J, Cardoso M.C and Leonhardt H (2000) Structure and function of the
Margot JB, Ehrenhofer-Murray AE and Leonhardt H (2003) Interactions within the mammalian DNA methyltransferase family BMC Molecular
29 Nephew PK & HuangTH-M (2002) Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression
30 Okano M, Xie S and Li E (1998) Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells Nucleic Acids Res 26, 2536-2540
31 Okano M, Bell DW, Haber DA and Li E (1999) DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development Cell 99, 247-257
32 Posfai J, Bhagwat AS, Posfai G and Roberts RJ (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases Nucleic Acids Res 17, 2421-
33 Robertson KD, Uzvolgyi E, G Liang G, Talmadge C, Sumegi J, Gonzales FA and Jones.P.A (1999) The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors Nucleic Acids Res 27, 2291-2298
34 Szalmas A & Konya J (2009) Epigenetic alterations in cervical carcinogenesis Seminar in Cancer Biology 19, 144-152
35 Tweedie S, H H NG; Barlow AL, Turner B M, Hendrich M and Bird A (1999) Vestiges of a DNA methylation system in Drosophila melanogaster? Nat Genet 23, 389-390
36 Yoder JA and Bestor TH (1998) A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmt1p of fission yeast Hum Mol Genet 7, 279-284
37 Justyna T.P and Pawel P J (2005) The role of Mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression Cellular &
Molecular Biology Letters Volume 10, pp 631 – 647
38 RheeI, Jair KW, Yen R W, Lengauer C, Herman J G, Kinzler K W, Vogelstein, B., Baylin, S B., and Schuebel, K E DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells (2000) Nature 404, 1003-
39 Deplus R, Brenner C, Burgers WA, Putmans P, Kouzarides T, Launoit Yd
& Fuks F (2002) DNMT3L is a transcription repressor that recruits histone deacetylase Nucleic Acids research,2002 Vol 30,No17.