khảo sát đặc điểm vùng promoter của gen cs acs1g ở dưa leo

DANH MỤC HÌNHHình 1: Các gen chính kiểm soát sự biểu hiện giới tính trên cây dưa leo Hình 2: Cấu trúc gen Cs-ACS1 và Cs-ACS1G Hình 3: Kết quả điện di DNA của 10 mẫu tách theo quy trình t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÙNG PROMOTER CỦA

GEN Cs-ACS1G Ở DƯA LEO

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: TS Lê Thị Trúc Linh SVTH: Lương Hiếu Ngân MSSV: 1553010119

Khóa: 15

Tp Hồ Chí Minh, tháng… năm…

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÙNG PROMOTER CỦA

GEN Cs-ACS1G Ở DƯA LEO

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: TS Lê Thị Trúc Linh SVTH: Lương Hiếu Ngân MSSV: 1553010119

Khóa: 15

Tp Hồ Chí Minh, tháng… năm…

Lê Thị Trúc Linh

Chữ ký GVHD

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, em xin chân thành cảm ơn TS Lê Thị Trúc Linh,giảng viên khoa Công nghệ Sinh học, trường đại học Mở TP.HCM Sự chỉ dẫn tận tình vàtâm huyết của cô, luôn luôn là nguồn động lực giúp em có thể hoàn thành đề tài thực tậpnày

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố

Hồ Chí Minh đặc biệt là phòng Công Nghệ Sinh Học Y Dược đã cho em cơ hội để họctập vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành đề tài

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh cùngquý Thầy Cô ở Khoa Công nghệ Sinh học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đãtruyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt khoảng thời gian học tập tạitrường

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và các Thầy

Cô phụ trách các phòng thí nghiệm sinh hóa, tế bào, công nghệ vi sinh đã giúp đỡ, tạođiều kiện cho em thực hiện đề tài

Và trên hết con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến bố, mẹ và anh chị em tronggia đình mình vì đã chăm sóc, dạy dỗ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con, luôn là điểm tựa

và là nguồn động viên dồi dào cho con thực hiện tốt đề tài

Em xin trân trọng cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

Sinh viên thực hiện đề tài

Lương Hiếu Ngân

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Tình hình cây trồng dưa leo trên thế giới (2010-2017)

Bảng 2: Thành phần hóa học của dưa leo

Bảng 3: Hàm lượng carotenoid và hoạt tính vitamin A của dưa leo

Bảng 4: Một số kỹ thuật được sử dụng để nhận tính trạng toàn hoa cái

Bảng 5: Trình tự mồi sử dụng trong đề tài

Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR

Bảng 7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bảng 8: Nồng độ và độ tinh sạch của 10 mẫu DNA tách theo quy trình của nhà sản xuất Bảng 9: Nồng độ và độ tinh sạch của 10 mẫu DNA tách theo quy trình tối ưu hóa

Bảng 10: Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi F1, F2, R

Bảng 11: Độ đặc hiệu của cặp mồi F1R và F2R trên 14 dòng thuần

Bảng 12: Độ đặc hiệu của hai cặp mồi F1R và F2R trên 133 mẫu dưa leo F2

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Các gen chính kiểm soát sự biểu hiện giới tính trên cây dưa leo

Hình 2: Cấu trúc gen Cs-ACS1 và Cs-ACS1G

Hình 3: Kết quả điện di DNA của 10 mẫu tách theo quy trình tối ưu hóa

Hình 4: Phản ứng PCR cùng 2 cặp mồi F1R và F2R của gen Cs-ACS1G trên dòng dưa

leo có kiểu hình G - gynoecious (F) và M - monoecious (f) Thang chuẩn 100 bp.

Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm PCR 2 cặp mồi F1R và F2R trên 14 mẫu thuộc 14 dòng

thuần khác nhau Thang chuẩn 100 bp.

Hình 6: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F1R trên 130 mẫu dưa leo F2 Thang

chuẩn 100 bp.

Hình 7: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F2R trên 130 mẫu dưa leo F2 Thang

chuẩn 100 bp.

AFLP Amplified fragment length polymorphismBSA Bulked segregant analysis

IAA Acid-3- indolaxetic

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random amplification of polymorphic DNARFLP Restriction fragment length polymorphismSCAR Sequence characterized amplication regionsSNP Single Nucleotide Polymorphism

SRAP Sequence related amplified polymorphismSSR: Simple sequence repeats

TBE: Tris/Borate/EDTA

TE: Tris/EDTA

Tm: Nhiệt độ nóng chảy của mồi

3’UTR: 3’ untranslated region

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 3

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây dưa leo 4

1.1.1 Tên gọi 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.3 Công dụng 6

1.1.4 Thành phần hóa học của dưa leo 7

1.2 Promoter 7

1.2.1 Khái niệm promoter 7

1.2.2 Vai trò promoter 8

1.2.3 Phân loại promoter 9

1.3 Marker phân tử 10

1.4 Các gen điều hòa biểu hiện giới tính trên cây dưa leo 14

1.5 Marker Cs-ACS1G 16

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17

1.6.1 Tình hình trong nước 17

1.6.2 Tình tình nghiên cứu trên thế giới 18

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Mẫu và mồi 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.2 Phương pháp 22

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Tách chiết DNA 25

3.2 Phản ứng PCR đặc hiệu với mồi 28

3.3 Khả năng nhận diện dòng dưa leo toàn hoa cái ở các dòng thuần 29

3.4 Khả năng nhận diện dòng dưa leo toàn hoa cái ở thế hệ F2 30

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Tiếng Việt 41

Tiếng Anh 41

Nguồn internet 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dưa leo (Cucumis sativus L.) là cây rau ăn quả thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) có

thể trồng được ở nhiều vùng trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAOSTAT năm

2017, tổng diện tích dưa leo trên thế giới là 2,27 triệu ha với sản lượng 84 triệu tấn(www.fao.org) Nhờ có vị ngọt, giòn, tính mát và chứa rất nhiều nước (chiếm 90%),nên từ lâu dưa leo đã trở thành một loại thực phẩm quen thuộc trong bữa ăn của nhiềugia đình Dưa leo chứa rất nhiều vitamin và các khoáng chất tự nhiên cần thiết cho cơthể, bao gồm: chất xơ, vitamin C, vitamin B1/ B2/ B5/ B6, folic acid, canxi, sắt, magie.Không những thế, lariciresinol, pinoresinol và secoisolariciresinol trong dưa leo còn cótác dụng phòng ngừa ung thư rất tốt, đặc biệt là ung thư vú, buồng trứng, tử cung vàtuyến tiền liệt (Muruganantham N và cs, 2015)

Hiện nay, năng suất và chất lượng là hai yếu tố chính của tiến trình cải thiệngiống dưa leo Hai đặc tính này cùng với những tính trạng có liên quan là những đặcđiểm được quan tâm nhiều nhất của các nhà chọn giống Trong đó, việc biểu hiện giớitính toàn hoa cái có một vai trò quan trọng trong chọn giống dưa leo Dưa leo toàn hoacái được sử dụng làm dòng mẹ trong quá trình chọn giống , góp phần làm tăng năngsuất của cây dưa leo Việc sử dụng những dòng dưa leo mang toàn hoa cái sẽ tạo ramột số lợi ích sau: hạn chế tình trạng lẫn giống do quá trình tự thụ gây ra, không phảitốn công lao động trong việc khử đực hoặc bao cách ly hoa cái, có thể tận dụng côntrùng để thụ phấn trong quá trình sản xuất hạt lai F1

Phương pháp chọn lọc truyền thống những dòng dưa leo toàn hoa cái dựa trên sựquan sát biểu hiện giới tính hoa của cây ở ngoài đồng Phương pháp này có một số hạnchế về độ chính xác, cũng như hạn chế về khả năng nhận diện sớm Vì thế, phươngpháp chọn lọc phân tử đối với tính trạng toàn hoa cái trở nên cần thiết cho việc cảithiện hiệu quả và độ chính xác của phương pháp chọn tạo giống dưa leo truyền thống.Trong nghiên cứu thực tập trước đây đã thực hiện khảo sát 15 dòng thuần với

marker phân tử Cs-BCAT và thu được tỷ lệ nhận diện đặc hiệu là 60% Trong khóa

luận tốt nghiệp này tiếp tục thực hiện khảo sát khả năng nhận diện các dòng dưa leo

của marker Cs-ACS1G thuộc vùng promoter của gen Cs-ACS1G, nhằm tăng độ nhận

biết chính xác dòng dưa leo toàn hoa cái Đó là lí do tôi thực hiện đề tài nghiên cứu:

“KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÙNG PROMOTER CỦA GEN Cs-ACS1G Ở DƯA LEO”

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây dưa leo

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Cucumis sativus L.

Giới (regnum): Plantae

Ngành (phylum/divisio): Magnoliophyta

Lớp (classis): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Cucurbitales

Họ (familia): Cucurbitaceae Juss

Chi (genus): Cucumis

Loài (species): C sativus

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Dưa leo là cây rau ăn quả được trồng trọt lâu đời và được biết đến cách đâykhoảng 5.000 năm (Tanurdzic, M And Banks, J.A., (2004)) Tuy vậy, nguồn gốc vềloài cây này hiện nay vẫn còn là một ẩn số và mặc cho rất nhiều ý kiến khác nhau xungquanh sự tồn tại của loại cây này nhưng vẫn chưa giải đáp được câu đố về tổ tiên củachúng Năm 1912, De Candolle đưa ra quan điểm về sự khởi nguyên này bắt đầu từTây Bắc Ấn Độ dựa theo sự tồn tại của các loại họ hàng hoang dã với số lượng nhiễmsắc thể 2n=14 Hiện nay, đây là giả thuyết được nhiều nhà khoa học tin tưởng, xem

trọng nhất Loài hoang dại, Cucumis hardwickii, là dạng dưa leo quả nhỏ, đắng, có gai,

quả cứng và được tìm thấy mọc hoang dại ở chân núi Himalaya (De Candole A (1984),

IBPGR (1993), Robinson R.W et al.,(1999), Siemonsma, J.S et al., (1994), Wehner

T.C (1999)) Bên cạnh đó, nhiều ý kiến cho rằng dưa leo có nguồn gốc tại vùng đấtNam Á, được trồng từ lâu đời vào khoảng 3.000 năm trước Từ những nơi này, dưa leo

được đưa đến các vùng như Tây Á, các nước Bắc Phi và Nam Âu (Bose T.K et al.,

(1986)).

Ở Trung Quốc, trước Công nguyên, dưa leo đã được trồng trọt Các giống dưa leođịa phương của Trung Quốc có nhiều tính trạng lặn như quả dài, hình thành quả không

cần qua thụ phấn (dạng parthenocarpy), quả không chứa chất gây đắng (cucurbitaxin),gai quả màu trắng Nhà thực vật học Vavilo và Tatliogu, thông qua các cuộc thámhiểm và nghiên cứu của chính bản thân cho rằng Trung Quốc là trung tâm khởi nguyên

thứ hai của cây dưa leo (Pierce, L.K and Wehner, T.C (1990), Vincent E et al.,

(1997))

Trong thời kỳ La Mã, dưa leo được phát triển theo phương pháp trồng dưới máiche Đến thế kỷ 13, dưa leo được đưa đến nước Anh Columbus trong chuyến du lịchđường biển lần thứ 2 của mình, đã gieo trồng dưa leo ở Haiti Từ thế kỷ 16, người TâyBan Nha đã phát hiện ra cây dưa leo ở các thuộc địa bị họ thống trị (Tạ Thu Cúc

(2007), De Candole A (1984), Robinson R.W et al., (1999)).

Việc phát hiện ra các dạng cây dưa leo dại, quả rất nhỏ, mọc tự nhiên ở các vùngĐồng bằng Bắc Bộ và các dạng quả to, gai trắng, mọc tự nhiên ở các vùng núi cao phíaBắc Việt Nam cho thấy, khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam giáp Lào có thể là nơiphát sinh cây dưa leo Ở đây vẫn còn tồn tại các dạng hoang dại này (Trần Khắc Thi(1985)) Ở nước ta, cây dưa leo có thể trồng được ở nhiều vùng trong cả nước nhưngthích hợp nhất chủ yếu ở đồng bằng và trung du miền núi phía Bắc Một số tỉnh trồngnhiều dưa leo như: Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Nam Định, Hà Nội, PhúThọ,…(www.fao.org)

Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO),diện tích trồng dưa leo trên thế giới tăng đều hàng năm (bảng 1) Diện tích gieo trồng

và năng suất dưa leo của từng châu lục trong năm 2017 là: Châu Á, diện tích:1.589.901 ha, sản lượng 73.539.031 tấn; Châu Âu, 184.477 ha, 6.158.525tấn; Châu

Mỹ, 98.873 ha, 2.436.822tấn; Châu Phi, 397.015 ha, 1.547.955 tấn; Châu Đại Dương,

857 ha, 20.844 tấn (www.fao.org)

Bảng 1: Tình hình cây trồng dưa leo trên thế giới (2010-2017)

Năm Diện tích

(ha)

Năng suất(hg/ha)

Sản lượng(tấn)

1.1.3 Công dụng

Dưa leo có vị ngọt, tính mát, hương vị giòn, ngon, hấp dẫn và đặc biệt chứarất nhiều nước Chính vì vậy, từ lâu nó đã trở thành thực phẩm quen thuộc trongbữa ăn của nhiều gia đình Ngoài ra, loại thực phẩm này còn có tác dụng tốt chosức khỏe con người rất hiệu quả

Dưa leo chứa nhiều dưỡng chất tốt cho sức khỏe, đặc biệt là nước (chiếmđến 90%) Bên cạnh đó, nó chứa hầu hết các loại vitamin, khoáng chất tự nhiên,

mà mọi người cần nạp vào cơ thể hàng ngày bao gồm vitamin C, chất xơ, vitaminB1, vitamin B2, vitamin B5, vitamin B6, folic acid, vitamin C, canxi, sắt,magie,… Chính vì vậy, ăn dưa leo mỗi ngày sẽ là phương pháp tốt, hiệu quả vàđơn giản để bạn nạp dưỡng chất cho cơ thể, đặc biệt là nguồn cung cấp vitamin,khoáng chất tự nhiên hết sức phong phú và cần thiết (nongnghiep.vn)

Dưa leo giúp huyết áp ổn định Chứa nhiều magie, kali và chất xơ, dưa leo

trở thành vị thuốc hỗ trợ đắc lực cho những người có huyết áp không ổn định, bất

kể là huyết áp cao hay huyết áp thấp (nongnghiep.vn)

Dưa leo tốt cho sức khỏe răng miệng với hàm lượng nước, giàu chất xơgiúp răng nướu khỏe mạnh, trắng sáng Đồng thời chất phytochemcial có trongdưa leo còn giúp giết chết các vi khuẩn gây hôi miệng một cách hiệu quả(nongnghiep.vn)

Dưa leo tốt cho hệ tiêu hóa đi cùng hàm lượng nước, cùng chất xơ hết sứcdồi dào kết hợp với vị ngọt, tính mát vượt trội, việc ăn dưa leo tươi hàng ngày sẽgiúp đẩy lùi và cải thiện chứng táo bón, ợ chua, đầy hơi, khó tiêu, ợ nóng, đau dạdày rất hiệu quả (nongnghiep.vn)

1.1.4 Thành phần hóa học của dưa leo

Trong dưa leo có rất nhiều hợp chất và thành phần hóa học khác nhau như(bảng 2 và 3)

Bảng 2: Thành phần hóa học của dưa leo

Ẩm (%) Protein Béo Carbonhydrate Xơ Tro

96,01 0,69 0,13 2,76 0,8 0,82

( Nguồn: ASHRAC Refrigeration Handbook (SI)- 2002)

Bảng 3: Hàm lượng carotenoid và hoạt tính vitamin A của dưa leo

Gama-Cryptoxanthin lutein lycopene RE

(Nguồn: Viện dinh dưỡng Việt Nam)

1.2 Promoter

1.2.1 Khái niệm promoter

Promoter là một thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen và đóngvai trò then chốt trong việc biểu hiện gen Promoter bao gồm vùng trình tự nucleotide

nằm về phía đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS),đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biếtcho các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen như enzyme RNApolymerase, các yếu tố phiên mã (transcription factor – TF là các protein tham gia điềukhiển mức độ biểu hiện gen thông qua việc gắn vào các trình tự DNA ngắn đặc hiệu(các yếu tố cis) trong vùng promoter cuả các gen đích và làm tăng hoặc giảm mức độbiểu hiện của chúng).

Cấu trúc promoter phúc tạp và chứ nhiều yếu tố cho chức năng gắn/ liên kết vớicác yếu tố protein tham gia vào quá trình phiên mã gen Các yếu tố điều hòa(relugatory element – RE) nằm trên promoter và cùng một sợi với vùng mang mã của

gen được gọi là các yếu tố cis (cis elements) (Buchanan et al.,(2000)) Mỗi yếu tố được đặt tên trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng Yếu tố cis cơ bản nhất là hộp

TATA (TATA box), được tìm thấy ở hầu hết các gen của sinh vật nhân chuẩn, nằm ở

vị trí khoảng -30 (có nghĩa là 30 nucleotide trước TSS, vị trí được xác định là +1)

Ở thực vật, hộp TATA thường nằm ở vị trí từ -35 đến -25bp trước TSS(Breathnack, Chambon, 1981) Hộp CCAAT nằm ở vị trí giữa -70 và -100 bp trướcTSS Hộp này có thể có trình tự khác nhau và được gọi là hộp AGGA Ngoài các trình

tự đặc trung như hộp TATA và CCAAT, hầu như tất cả các promoter của sinh vậtnhân chuẩn được nghiên cứu cho đến nay có chứa thêm các yếu tố điều hòa khác làcác trình tự DNA nằm ở phía trước TSS, tham gia điều hòa hoạt động của gen (Benoist,

Chambon,(1981); Gruss et al.,(1981); Khoury, Gruss, (1983)) Những trình tự này rất

đa dạng về chiều dài, có thể dao động từ khoảng -100bp đến 100bp hoặc ngược khá xa

về phía đầu 5’ của TSS với những dạng cấu trúc là các trình tự lặp lại Tuy nhiên, các

vùng tăng cường cũng có thể được tìm thấy ở vùng 3’ không được dịch mã và thậm

chí ở cả các intron (Buchanan et al., (2000)) Mỗi vùng tăng cường có thể có chức năng độc lập như là một yếu tố cis và nằm trên cùng một sợi với các gen được tác

động.Vùng tăng cường có thể có cai trò điều hòa biếu hiện đặc hiệu, điều khiển genbiểu hiện ở những mô hoặc cơ quan cụ thể Vai trò này thường vẫn được duy trì khivùng tăng cường được cắt và đưa vào gen khác để điều khiển biểu hiện một gen khác

để điều khiển biểu hiện một gen mới trong cơ thể chủ

Ở promoter thực vật được phân tích bởi Yamamoto và đồng tác giả (2007) có chứa

3 nhóm các trình tự DNA đặc biệt: pyrimidine patch (Y patch) (thường ở vị trí -100đến -13), hộp TATA (vị trí từ -50 đến -20) và nhóm yếu tố điều hòa (REG – regulatoryelement group) (vị trí -20 đến -400) Trong đó Y patch hay còn gọi là vùng pyrimidinethường có trình tự TCTCTC hoặc CTCCTC hay TTCTTC Chức năng sinh học của Ypatch chưa được nghiên cứu rõ nhưng đây là thành phần chung của promoter thực vật( không có trong promoter động vật) Y patch được các tác giả phát hiện thấy khi

nghiên cứu genome của Ẩbidopsis REG thường là các trình tự ngắn 5-15bp trên promoter Nhóm này bao gồm trên 200 loại trình tự, phần lớn là các yếu tố cis và là

các vị trí nhận biết của các protein tham gia điều khiển biếu hiện gen

1.2.3 Phân loại promoter

Promoter có thể được chia làm hai loại chính:

- Promoter không đặc hiệu hay còn gọi promoter cơ định (constitutive promoter)

- Promoter đặc hiệu với các yếu tố cis chuyên biệt (specific promoter).

❖Promoter cơ định

Promoter này tham gia điều khiển biểu hiện gen ở tất cả hoặc hầu như tất cả cácloại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển của sinh vật Điểnhình cho nhóm promoter này là CaMV35S promoter điều khiển biểu hiện RNA 35Sđược phân lặp từ virus khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) CaMV35Spromoter là trình tự có kích thước khoảng 350bp nằm ở phía đầu của 35S transcript(-343 đến +8, với vị trí Cap ở +1) Có 3 vùng trên promoter, promoter trung tâm chứahộp TATA (vị trí từ 46 đến +8) và 2 vùng chính khắc có chức năng tăng cường

❖ Promoter đặc hiệu

Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen giới hạn ở một hoặc mộtvài mô (hạn chế về không gian – spatial limitation) và ở một hoặc vài giai đoạn pháttriển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation) Nhấn mạnh rằng không có mộtpromoter đặc hiệu: cascpromoter dường như hoạt động ở một số mô, trong khi ở một

số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu Hiện tượng này được biết đến là sự biểuhiện yếu

Promoter đặc hiệu mô (tissue specific promoter): các loại promoter đặc hiệu mô chỉđiều khiển biểu hiện gen ở những mô nhất định, ví dụ như promoterr đặc hiệu rễ

(Conkling et al., (1990)), promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật (Wang,(1992)),

promoter đặc hiệu hoa (Robert,(1998)) Promoter cảm ứng với môi trường(environmentally inducible promoter): trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn,nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, oxy hóa cao… các gen chống chịu thường được biểuhiện với tốc độ rất nhanh Vì vậy, vấn đề khởi động phiên mã cũng như cấu trúcpromoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biếu hiện gen thôngqua nhận biết và hoạt hóa trình khởi động phiên mã được đặc biệt quan tâm

1.3 Marker phân tử

Trong di truyền học, marker phân tử là khi những đặc tính sinh học được xácđịnh bởi các allele của một gene hoặc một nhóm gene liên kết với một locus nhất địnhtrong bộ gene và được di truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác Locus nhất định nàyđược gọi là marker phân tử và chúng có thể được sử dụng để nhận diện một cá thể,một mô, một tế bào, một nhiễm sắc thể hoặc một gene

Với phương pháp chọn lọc truyền thống những dòng dưa leo toàn hoa cái dựa trên

sự quan sát sự biểu hiện giới tính của cây ở ngoài đồng có một số hạn chế về độ chínhxác của việc chọn lọc, cũng như hạn chế về khả năng nhận diện sớm tính trạng hoa cái.Chính vì thế, phương pháp chọn lọc phân tử (molecular selection) đối với tính trạngtoàn hoa cái (gynoecy) trở nên thiết yếu cho việc cải thiện hiệu quả thời gian và độchính xác cao (chỉ thị phân tử không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường) của quátrình tuyển chọn dòng dưa leo toàn hoa cái với chi phí thấp (có thể kiểm tra kết quả

chọn giống ở giai đoạn cây con) so với phương pháp chọn tạo giống dưa leo truyềnthống.

Một số kỹ thuật ứng dụng marker phân tử phổ biến (Nguyễn Đức Thành(2015)):

SSR (Simple sequence repeats): là chuỗi lặp lại đơn giản các đoạn DNA từ 2bpđến 8bp Marker SSR được lựa chọn để lập bản đồ phân tử, xác định những giống câytrồng, đánh giá nguồn gốc tổ tiên của cây trồng cho mục đích quần thể và sự tiến hóa

vì nó tồn tại những đặc điểm như: tính đa allen và tính biến dị cao, là marker đồngtrội, phân bố ngẫu nhiên khắp bộ gen, dễ dàng xác định bằng PCR sử dụng các primerđặc biệt

Nguyên lý của marker SSR là: dựa vào 2 đầu của các đoạn lặp lại có trình tựđặc biệt và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gene không phân biệt cáthể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại củađơn vị lặp lại là khác nhau Từ đó thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạnDNA trên gene chứa trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được

sự giống nhau và khác nhau giữa các cá thể cùng loài Do đây là một dạng marker cónhiều ưu điểm, nên được nghiên cứu khá nhiều

SNP (Single Nucleotide Polymorphism): Những thay đổi một nucleotide trongtrình tự genome của các cá thể trong quần thể được gọi là đa hình nucleotide đơn(SNP) Các vị trí thể hiện SNP trong genome là nơi mà ở đó chuỗi DNA được phânbiệt bởi một bazơ duy nhất khi một hay nhiều cá thể được so sánh Sự khác nhau vềnucleotide này có thể dẫn đến thay đổi tính trạng đặc biệt theo kiểu hình hoặc có thể là

sự thay đổi trung tính có thể được sử dụng để đánh giá sự đa dạng trong tiến hóa SNP

là dạng thay đổi trình tự genome phổ biến nhất cho tới nay

RFLP (Restriction fragment length polymorphism): cắt DNA mẫu bằng 1 hoặcnhiều RE (Retriction Endonuclease- enzyme cắt giới hạn nội bào), sản phẩm phân táchbằng điện di argarose

-Ưu điểm của phương pháp này là: khả năng lặp lại cao, xác định được ditruyền đồng trội, có tính đặc hiệu locus ( nhờ đó trình tự bảo tồn của các gene trên các

sinh vật có quan hệ gần gũi có thể xác định được), không yêu cầu thông tin chuỗi, dễghi điểm do kích thước các băng thường khác nhau đáng kể.

-Nhược điểm cần phải lưu tâm như: yêu cầu số lượng và chất lượng DNAcao, không thể tự động hóa nên tốn công sức và chi phí, mức độ đa hình thấp khó đọckết quả

AFLP (Amplified fragment length polymorphism): cải tiến từ RFLP, phươngpháp dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc các đoạn DNA đã bị cắt, bằng phươngpháp PCR Mẫu DNA được phân cắt bằng các RE (RestrictionEndonuclease-enzyme cắt giới hạn nội bào), các sản phẩm cắt được nối với cácadapter, adapter hoạt động như 1 mồi liên tục khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu

-Ưu điểm: Độ tin cậy và khả năng lặp lại cao, không cần biết trước vềthông tin genome của đối tượng nghiên cứu, rất giàu thông tin vì có thể đánh giá đồngthời nhiều locus (đánh giá đa hình trên toàn bộ gene)

-Nhược điểm: Phương pháp này trải qua nhiều bước thực hiện, đòi hỏi kỹthuật rất phức tạp, đắt tiền do nhận diện bằng điện di polyacryamide và phải thêm RE,adapter

RAPD (Random amplification of polymorphic DNA): kỹ thuật này thực chất làquá trình nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết

kế ngẫu nhiên (thông thường có chiều dài khoảng 6-10bp), trong đó DNA đượckhuếch đại bởi các đoạn mồi ngẫu nhiên, dùng để nghiên cứu sự khác biệt di truyềncủa những giống/loài khác nhau

- Ưu điểm: phát hiện nhanh dạng di truyền, đơn giản không đòi hỏi kỹthuật cao, rẻ, không dùng phóng xạ

- Nhược điểm: xuất hiện các băng tính trạng trội không phân biệt được

cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử, tính lặp lại không cao do mồi ngẫunhiên

CAPS (Cleaved Amplified Polymorphism Sequences) thông qua kỹ thuật PCRcác phân đoạn DNA có kích thước khác nhau xuất hiện tạo nên sự đa hình Phươngpháp này sử dụng các mồi đặc hiệu để nhân bản vùng trình tự xác định, sản phẩm PCR

được phân cắt bằng RE (Restriction Endonuclease enzyme- enzyme cắt giới hạn nộibào).

- Ưu điểm: Độ tin cậy và khả năng lặp lại cao

- Nhược điểm: Phức tạp, tốn kém

SCAR (Sequence characterized amplication regions): kỹ thuật SCAR được cảitiến từ kỹ thuật RADP (Random amplification of polymorphic DNA) Ở kỹ thuậtSCAR đoạn mồi được sử dụng dài 22-30 nu thay vì 8-10 nu như ở kỹ thuật RAPD,đoạn mồi dài hơn và được thiết kế đặc hiệu giúp DNA xác định mồi bắt cặp đặc hiệungay tại vị trí đích, khuếch đại đúng vùng gen quan tâm, từ đó cho kết quả ổn định hơn,

dễ lặp lại hơn so với kỹ thuật RAPD Tuy nhiên SCAR là marker trội chỉ cho kết quả

có hoặc không, nên chúng không phân biệt được cây mang gene đồng hợp hay gene dịhợp, do đó marker này không được sử dụng cho những loài gần giống nhau Một sốmarker SCAR cụ thể đã được áp dụng trong các nghiên cứu lập bản đồ gene và hỗ trợchọn giống (Nguyễn Đức Thành (2015))

Lai Southern Blot: là phương pháp lai giữa DNA của tế bào với mẫu dò DNA.Phương pháp này cho phép nghiên cứu DNA của bộ gene, kiểm tra kết quả chuyểngene hoặc kiểm tra sự có mặt của một gene nào đó trong bộ gene của tế bào Giúp lậpbản đồ giới hạn của một gene Phát hiện các đa dạng trình tự của cùng một gene ở cácchủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng Qua đócũng phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gene vìchúng làm thay đổi bản đồ giới hạn(Vavilov N.I (1926))

Bảng 4: Một số kỹ thuật được sử dụng để nhận tính trạng toàn hoa cái.

Sequencing Cs-BCAT, CsFemale4, CsFemale7. Khin Thanda Win(2015)

SSR SSR18956, CSWCT35 Fazio G et al, (2002) ;Ren Y et

al, (2009)RFLP Mẫu dò Cs-ACS1 phát hiện Locus F Siemonsma, J.S., Kasem Piluck

(1994)SCAR Phát hiện gen CsACS1 và CsACS1G Siemonsma, J.S., Kasem Piluck

(1994)Lai Southern Blot Phân biệt các dạng FF, Ff, ff. Vavilov N.I (1926)

1.4 Các gen điều hòa biểu hiện giới tính trên cây dưa leo

Đóng vai trò quan trọng trong chương trình chọn tạo giống dưa leo, tính

trạng giới tính hoa có một số kiểu hình liên quan đến sự biểu hiện giới tính như:

- Cây có hoa đực và hoa cái trên cùng một cây (monoecy- A_ MM ff ),

- Cây chỉ có hoa cái (gynoecious- aa M_FF),

- Cây chỉ có hoa lưỡng tính (hermaphroditus- aa mm F_ ),

- Cây lưỡng tính đực, có cả hoa đực và hoa lưỡng tính(andromonoecious-mmff),

- Cây lưỡng tính cái, có hoa cái và hoa lưỡng tính (gynomonoecious),

- Cây chỉ có hoa đực (androecious- aaMMff ),

- Cây có cả hoa đực, hoa cái và hoa lưỡng tính (trimonoecious) (KahanaA,Silberstein Leah, Kessler N, Goldstein RS, Treves RP (1999))

Hình 1: Các gen chính kiểm soát sự biểu hiện giới tính trên cây dưa

leo (Galun, E (1961), Seiji Yamasaki, et al.,(2003)).

Gen F thúc đẩy sự hình thành hoa cái trên cây dưa leo, còn gen M quy địnhđơn tính cùng gốc Vì vậy kiểu gene aa M_FF là gynoecy, M_Ff là subgynoecy,

aa mm F là lưỡng tính, MM ff A_ là monoecy, MM ff aa là androecy

Ngoài kiểu gen, giới tính của dưa leo có thể bị tác động của môi trường,hormone thực vật (Siemonsma, J.S., Kasem Piluck (1994)) Khi gặp điều kiệnngày dài, nhiệt độ cao cây thúc đẩy ra nhiều hoa đực, ngược lại trong điều kiệnngày ngắn, nhiệt độ thấp cây cho nhiều hoa cái hơn (Galun, E (1961)) Ngoài ra,việc sử dụng hormone ngoại sinh như ethylene, auxin cũng có thể làm kích thích

sự phát triển ra hoa cái trên cây

Nhìn chung sự biểu hiện giới tính của hoa dưa leo được xác định bởi 3gene chính (sex- determination genes) là: F/f, M/m và A/a Trong đó gen F(Female) trội sẽ làm tăng số lượng hoa cái trong cây lên, gen M trội quy định đơntính cùng gốc (có cả hoa đực và hoa cái trên cùng một cây), gen a quy định làm

tăng sự phát triển hoa đực, hình thành cây toàn hoa đực (Seiji Yamasaki, et al

(2003)) Gene F/f là gen trội hoàn toàn, đồng hợp trội (FF) tác động lớn nhất đếnmức độ biểu hiện hoa cái, kế đến là gen dị hợp (Ff) và cuối cùng là đồng hợp lặn(ff) (FF>Ff>ff) Trong khi gene (MM, Mm) xác định hoa đơn tính hoặc gene (mm)xác định hoa lưỡng tính Gene A có xu hướng làm tăng hoa đực nếu xuất hiện 2gene lặn kết hợp là aa và ff

Theo phân tích di truyền thì locus F có chứa thêm một bản sao của gene

Cs-ACS1G (ACC synthase sequence) mã hóa cho một amino acid

1-aminocyclo-propane-1- carboxylic acid quy định tổng hợp ethylene Vì vậy, mà

số lượng hoa đực sẽ giảm xuống và số lượng hoa cái sẽ tăng lên do sự tích tụEthylene trong cây Vì thế, trong chương trình chọn giống, các nhà di truyền chọn

(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase), mã hóa cho enzyme ACCsynthase có chức năng tổng hợp ethylene - một hormone trong dưa leo, thúc đẩybiểu hiện hoa cái cùng với auxin Ethylene là một hormone thực vật, đảm nhiệmchức năng ức chế sự phát sinh hoa đực và cảm ứng kích thích hoa cái bằng cáchgây ảnh hưởng đến hai thụ thể ethylene khác nhau một cách độc lập Một số điềutra đã chỉ rõ ràng rằng ethylene là hormone điểu khiển giới tính (Galun, E (1961),

Malepszy, S And Niermirowicz-Szczytt, K (1991), Trebitsh, T et al., (1987),

Vavilov N.I (1926))

1.5 Marker Cs-ACS1G

Để phân tích gene ACS, các nhóm nghiên cứu khác nhau đã tiến hành tạodòng gene ACS của các loài thực vật để phân tích, kết quả cho thấy gene ACS làmột họ đa gene (Rottmann W H và cs, 1991; Liang X và cs, 1992; O’Neill S D

và cs, 1993; Destéfano-Beltrán L J C và cs 1995)

Ở dưa leo, locus F chứa gene ACS1, thuộc họ gene ACS Năm 1997, Trebitsh và cs sử dụng kỹ thuật lai Southern blot phân tích gene Cs-ACS1

(Cucumis sativus ACS1) từ dòng dưa leo mang toàn hoa cái (có kiểu gene MMFF)

và dòng mang cả hoa đực và hoa cái (có kiểu gene MMff), phát hiện trên dòng

dưa leo toàn hoa cái có thêm một trình tự của gene ACS1 (đặt tên là Cs-ACS1 Gynoecious, viết tắt Cs-ACS1G) Trebitsh và cs tiếp tục phân tích trên quần thể

F2 và nhận thấy gene này đồng phân ly với gen trội F, từ đó chứng minh geneCs-ACS1G đặc trưng cho cây mang toàn hoa cái (Trebitsh T và cs, 1997)

Năm 2004, Mibus và Tatlioglu giải trình tự vùng promoter và một phần gene

của CsACS1 và Cs-ACS1G, phát hiện có sự khác nhau ở vùng promoter giữa hai gene.

Dựa vào kết quả giải trình tự này, Mibus và Tatlioglu thiết kế một marker tại vị trí

khác biệt giữa hai gene (vùng trình tự chỉ có trên gene Cs-ACS1G) và một marker khác

nằm ở trình tự chung để làm chứng nội cho phản ứng Kết quả PCR cho 2 sản phẩm

430-bp và 288-bp đối với gene Cs-ACS1G tương ứng với locus F (kiểu gene FF và Ff), chỉ có sản phẩm 288-bp đối với gene Cs-ACS1 tương ứng với locus f (kiểu gene ff)

(Mibus H và Tatlioglu T., 2004) Marker của Mibus và Tatlioglu có thể phân biệtlocus F và f nhưng không phân biệt được cây mang kiểu gene đồng hợp trội FF hay dịhợp Ff

Năm 2006, Knopf và Trebitsh kiểm chứng sự có mặt của Cs-ACS1G ở cây

mang toàn hoa cái bằng phương pháp lai DNA blot Sau khi tiến hành giải trình tự toàn

bộ vùng gene Cs-ACS1 và Cs-ACS1G, kết quả chỉ ra rằng sự xuất hiện của Cs-ACS1G

là kết quả của sự sao chép và tái tổ hợp của 2 gene Cs-ACS1 và Cs-BCAT (Knopf R R.

và Trebitsh T., 2006)

Năm 2015, Zhang và cs phân tích vùng trình tự locus F của 2 dòng dưa leomang toàn hoa cái và dòng mang cả hoa đực và hoa cái, phát hiện một vùng trình tự30.2 kb lặp lại, chỉ có trên locus F của dòng mang toàn hoa cái Đoạn trình tự 30.2 kb

này chứa bốn gene: Cs-ACS1 (làm tăng thêm một bản sao Cs-ACS1G trên cây mang

toàn hoa cái), một gene chưa xác định chức năng, một gene mã hóa cho yếu tố phiên

mã MYB và một phần của gene Cs-BCAT (Zhang Z và cs, 2015) Nghiên cứu này củng cố thêm bằng chứng CsACS1G là kết quả của sự sao chép và tái tổ hợp của 2 gene Cs-ACS1 và Cs-BCAT như Knopf và Trebitsh đưa ra năm 2006 (Knopf R R và

Trebitsh T., 2006)

Dựa vào kết quả của bốn bài nghiên cứu trên, cấu trúc gen Cs-ACS1 và

Cs-ACS1G đã xác định được như hình bên dưới:

Hình 2: Cấu trúc gen Cs-ACS1 và Cs-ACS1G.

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.6.1 Tình hình trong nước

Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong hỗ trợ chọn tạo giống rất phổ biến trong chọntạo giống lúa ở Việt Nam, tuy nhiên trên cây rau và cụ thể là cây dưa leo thì việc nàycòn nhiều hạn chế Hiện nay trong nước chỉ mới ứng dụng chỉ thị phân tử trong phânnhóm đa dạng di truyền dưa leo, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong hỗ trợ chọn lọc

tính trạng mục tiêu thì chưa thấy được công bố.

Hiện có báo cáo của Trần Khắc Thi và cộng sự “ Nghiên cứu xây dựng quy trình

sản xuất dòng mẹ đơn tính cái (gynoecious) để sản xuất hạt lai giống dưa leo F1 ” là

ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân nhóm đa dạng di truyền dưa leo Xác định sự ảnhhưởng của các hóa chất AgNO3, GA3 đến sự hình thành hoa đực trong cây toàn hoa

cái (gynoecy) nhằm giúp duy trì dòng dưa leo đơn tính cái sử dụng cho tạo dòng dưa

leo lai F1 góp phần hạ giá thành của hạt giống dưa leo lai sản xuất trong nước

Cùng với đó nhóm nghiên cứu TS Lê Thị Kính đã thành công trong việc xác địnhcây dưa leo mang toàn hoa cái trên bộ giống do công ty Giống Cây Trồng Miền Namcung cấp bằng kỹ thuật sinh học phân tử Đầu tiên, sử dụng 6 marker phân tử nhậndiện trên 15 dòng thuần đã biết trước để đánh giá xem marker nào phù hợp nhất với bộgiống của công ty Giống Cây Trồng Miền Nam Kết quả cho thấy 3 marker

CsFemale-4, CsFemale-7 và CsBCAT cho kết quả nhận diện cây mang toàn hoa cái

chính xác hơn Vì vậy, khảo sát tiếp theo tiến hành trên 92 cá thể F2 và 250 cá thể F3

chỉ sử dụng 3 marker này Kết quả sàng lọc ở F2 cho thấy, marker CsBCAT cho kết quả nhận diện chính xác hơn hai marker CsFemae-4 và CsFemale-7 Kết quả nhận

diện ở F3 vẫn chưa được xác nhận do giới hạn thời gian nên chưa đánh giá được kiểu

hình ở F3 Kết quả bước đầu từ nghiên cứu này cho thấy CsBCAT là marker tiềm năng

cho việc nhận diện cây dưa leo mang toàn hoa cái

1.6.2 Tình tình nghiên cứu trên thế giới

Nhìn chung, tính trạng toàn hoa cái (gynoecy) đã được nghiên cứu nhiều trên thế

giới, đặc biệt là các nước nông nghiệp phát triển như:

- Đức: Dựa vào marker RFLP, nhóm nghiên cứu của H.Mibus và T.Tatlioglu

(2004) đã xác nhận sự hiện diện của gene CsACS1G tồn tại trong những dòng

gynoecious, đồng thời cũng giúp phân biệt được những dòng đồng hợp và dị hợp

gynoecious (FF và Ff).

- Israel: Ronit Rimon và cộng sự (2006) đã tiến hành nhân bản và phân tích vùng

gene CsACS1 và CsACS1G Kết quả chỉ ra rằng CsACS1G là kết quả của quá trình nhân bản và tái tổ hợp của gene CsACS1 và gene BCAT.

- Trung Quốc: Có nhiều báo cáo chi tiết về cơ chế di truyền của tính trạng này như

đề tài của Tao Wu và cộng sự (2015): “Phân tích vùng Promoter của gene CsACS1G ở

cây dưa leo ” Đây là đề tài nghiên cứu rất chi tiết về gene CsACS1G bằng kỹ thuật

chuyển gen Trong đó, nhóm của ông cho thấy đoạn 1678 bp của vùng promoter trên

gene CsACS1G đóng một vai trò quan trọng trong việc quyết định hình thành giới tính

của dưa leo Vào năm 2008, Zheng Li và cộng sự đã phát hiện ra 8 marker liên kết vớilocus M/m bằng kỹ thuật BSA (Bulked Segregant Analysis) và SRAP (SequenceRelated Amplified Polymorphism), trong đó có 2 marker SRAP đồng trội làME1EM26 và ME1EM23

- Hàn Quốc: Khin Thanda Win và cộng sự (2015) đã thực hiện đề tài “ phát triển vàxác định tính chất của một chỉ thị phân tử đồng trội giúp nhận diện locus Female (F) ởcây dưa leo ”, với đề tài này nhóm của ông đã nhận diện được một marker đồng trội

(Cs-BCAT) giúp phân biệt được những dòng mang kiểu gen đồng hợp và dị hợp toàn hoa cái (gynoecy) trong công tác chọn tạo giống dưa leo.

- Ấn Độ: Vào năm 2015, Kalidas Pati và cộng sự đã sử dụng phương pháp ưu thế lai

để tạo ra những giống biểu hiện toàn hoa cái (gynoecy) vượt trội nhằm sản xuất giống

thương mại hóa Bằng cách sử dụng các dòng mang tính trang toàn hoa cái

(gynoecious), phẩm chất không tốt (GBS-1,GS-4…) lai với các dòng có phẩm chất tốt,

năng suất kém (Pusa Uday, Punjab Naveen…) Tạo ra quần thể ưu thế lai F1 có nhữngđặc tính trội hơn, trong đó GBS-1 × Pusa Uday cho năng suất cao nhất (tăng 66,40%)

và được ứng dụng để sản xuất hạt lai F1