Khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc nigrospora sp gây bệnh đốm lá dâu tây của dịch nuôi cấy vi khuẩn bacillus sp

Bộ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HÔ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÃI KHOA HỌC KẾT QUẢ THựC HIỆN ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOẤ HỌC CÁP TRƯỜNG Tên đề tài: Khảo sát đặc diễm kháng nấm mốc Nỉgrospora sp gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp Mã số đề tài: 21.2 SHTPSV 06 Chủ nhiệm đề tài: Hứa Huỳnh Minh Thảo Đon vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 2023 LỜI CÁM ƠN Đe thực tốt đề tài này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh tạo mơi trường học tập nghiên cứu thân thiện phát huy tốt khả Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Phòng Quản lý khoa học Hợp tác quốc tế, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh ln hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm kiến thức chuyên môn giúp kịp thời giải vấn đề, động viên tơi lúc khó khăn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Tấn Việt, TS Nguyễn Ngọc Ân cho lời khun, lời góp ý hữu ích giúp cho tơi có nhìn sâu sắc vấn đề nghiên cứu, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tập thể Lab Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công nghiệp giúp đỡ tạo động lực để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập nghiên cứu Mặc dù cố gắng hoàn thành đề tài phạm vi cho phép khả kinh nghiệm thân nhiều hạn chế, nên đề tài chắn không tránh khỏi tồn tại, hạn chế thiếu sót Tơi mong nhận thơng cảm, góp ý tận tình bảo Q thầy cô Tôi xin chân thành cảm ơn! PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tín tống qt 1.1 Tên đề tài: Khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuấn Bacillus sp 1.2 Mã số: 21.2 SHTPSV 06 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên Đon vị cơng tác Vai trị thực đề tài Hứa Huỳnh Minh Thảo CHSH9A, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài Dương Thảo Vi CHSH9B, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thư ký Nguyễn Mộc Tấn CHSH9B, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên Mã Thị Anh Thư CHSH9B, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia Đỗ Huy Nhật Minh CHSH9A, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Thành viên tham gia 1.4 Đon vị chủ trì: 1.5 Thòi gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm 2023 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng năm 2022 đến tháng năm 2023 1.6 Những thay đổi so vói thuyết minh ban đầu (nếu có): (về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tẻ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt cũa đề tài: 20.000.000 (Hai mươi triệu đồng) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Dâu tây (Fragaria ananassa) lồi ăn có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng Nhìn chung, nhu cầu tiêu thụ dâu tây Việt Nam cao Dâu tây nguồn cung cấp khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin chất chống oxy hóa dồi Do đó, việc sử dụng dâu tây tốt cho sức khỏe, giảm bệnh tim mạch, huyết áp Với hương vị thơm ngon, dâu tây nguồn nguyên liệu phổ biến ngành công nghiệp thực phẩm [1] Theo thống kê FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) vào năm 2019, tong sản lượng dâu tây đạt 8,9 triệu tấn, tiêu thụ mạnh mẽ nước Trung Quốc, Mỹ Canada Thị trường dâu tây giới dự báo tiếp tục tăng trưởng 3,4% giai đoạn 2021-2026 [2], Tuy nhiên, dâu tây nhạy cảm với nhiều mầm bệnh Đặc biệt nấm mốc tác nhân gây bệnh nặng nề, ảnh hưởng lớn đến kinh tế, suất trồng Diện tích trồng dâu tây Đà Lạt khoảng 180 hec-ta Bệnh đốm làm giảm khoảng 14.6% suất chất lượng dâu tây Đà Lạt [3] Theo thống kê Francisco cộng (2011), đối tượng gây bệnh dâu phát chủ yếu Coỉỉetotrichum spp., Tetranychus urticae Koch, Aỉtemaria aỉtemata, Mycosphaereỉla fragariae, Xanthomonasfragariae [4], Nigrospora chi quan trọng ngành nấm túi với phân bố rộng rãi phổ vật chủ rộng Hầu hết loài thuộc chi ghi nhận tác nhân gây bệnh thực vật ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất, chất lượng mùa màng, thiệt hại đáng kể đến kinh tế nơng nghiệp N sphaerica lồi phổ biến thuộc chi Nigrospora Lồi nấm có khả gây bệnh 40 loài thực vật với bệnh chủ yếu, bệnh đốm chiếm khoảng 50% [5] Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu khả gây bệnh chủng dâu tây Theo Chi cục Trồng trọt Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng, số thuốc bảo vệ thực vật chống nấm người dân sử dụng phổ biến chlorothalonil, đồng hydroxide, carbendazim, metalaxyl mancozeb [6] Tuy nhiên, việc sử dụng bừa bãi thuốc hóa học khơng tác động tiêu cực đến môi trường thời gian phân hủy dài, gây nhiễm nguồn đất, nước, khơng khí mà cịn ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người, động vật Đồng thời việc lạm dụng thuốc hóa học làm gia tăng phát triển biến chủng kháng thuốc Do đó, việc hiểu rõ tác nhân gây bệnh biện pháp kiểm dịch thực vật thay thuốc hóa học có ảnh hưởng khơng ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe động vật ngày cấp thiết [7] Chi Bacillus thuộc giói vi khuẩn, ngành Firmicutes, lớp Bacillales, Bacilli, họ Bacillaceae Bacillus chi đa dạng phong phú nghiên cứu khoa học lẫn đời song Bacillus sử dụng nhiều ngành công nghiệp sở hữu đặc tính quan trọng như: tốc độ tăng trưởng nhanh chóng giúp rút ngắn thời gian sản xuất, tăng giá trị sản phẩm, có khả sản sinh lượng đáng kể enzyme ngoại bào có hoạt tính cao, có khả tạo nội bào tử để chống chịu với điều kiện khắc nghiệt [8] Kiểm soát sinh học mang lại đặc tính quan trọng như: đặc hiệu với mầm bệnh, chi phí thấp, khơng gây ô nhiễm môi trường Co chế đối kháng vi sinh vật vói mầm bệnh khơng phải lúc rõ ràng, thường chủ yếu tác động sau: • Ký sinh trực tiếp gây chết mầm bệnh • Cạnh tranh dinh dưỡng, khơng gian với mầm bệnh • Tác động trực tiếp lên mầm bệnh hợp chất có khả ức ché phát triển mầm bệnh [9] Trong số vi khuẩn dùng để kiểm soát bệnh học thực vật, Bacillus spp chủng có nhiều tiềm hon Đặc biệt chủng B subtilis B amyloliquefaciens coi an tồn với mơi trường Đồng thời chúng coi rhizobacteria, có khả kích thích tăng trưởng thực vật Nhiều nghiên cứu cho thấy rang Bacillus spp có khả sản xuất số lượng lớn peptide, hợp chất dễ bay hoi số lipopeptide có khả ức chế lại vi sinh vật gây bệnh Các chủng Bacillus spp chứng minh có khả kháng nấm bệnh mạnh mẽ Đây coi đối tượng tiềm sử dụng biện pháp sinh học [10] Do tiến hành thực đề tài: “Khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc Nỉgrospora sp gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuấn Bacillus sp.” với mong muốn tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả đối kháng mạnh vói chủng nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây Dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm có khả phịng trừ bệnh hại dâu tây cách an toàn, hiệu quả, đáp ứng nhu cầu đa dạng thị trường với giá cạnh tranh, góp phần xây dựng nông nghiệp xanh, bền vững Mục tiêu 2.1 Mục tiêu tổng quát Khảo sát khả kháng nấm Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp 2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập nấm mốc Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây Tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả ức chế mạnh nấm mốc Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc từ Bacillus sp Xác định so đặc điểm họp chất kháng mốc dịch nuôi cấy Bacillus sp Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phân lập nấm mốc Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây - Phân lập nấm mốc từ mẫu dâu bệnh, quan sát đặc điểm hình thái vi thể, đại thể - Tái nhiễm dâu phương pháp Koch nhằm thu nhận chủng mốc gây bệnh mạnh - Định danh chủng nấm mốc nghiên cứu phương pháp sinh học phân tử 3.2 Tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả ức chế mạnh nấm mốc Nìgrospora sp gây bệnh đốm dâu tây - Sàng lọc sơ khả ức chế phát triển nấm mốc gây bệnh đốm dâu tây chủng vi khuẩn có sưu tập giống - Định danh phương pháp sinh học phân tử chủng vi khuẩn có khả kháng mốc mạnh 3.3 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh tổng họp hợp chất kháng mốc từ Bacillus sp - Khảo sát mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc phương pháp khuếch tán giếng thạch + Nguồn nitrogen: urea, peptone, cao trùn quế, cao thịt, tryptone, casein, NaNCh, NH4CI, NH4NO3 (NH4)2SO4 + Nguồn carbon: D-glucose, a-Lactose, mannitol, sucrose, glycerol, maltodextrin, tinh bột, bột đậu nành, rỉ đường + pH ban đầu môi trường nuôi cấy: 4,0 - 10,0, với bước nhảy 1,0 + Nhiệt độ nuôi cấy: 25 - 45°c, với bước nhảy 5°c + Thời gian ni cấy: kiểm tra hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy 12 giờ/lần 3.4 Quan sát đánh giá tác động dịch nuôi cấy Bacillus sp lên hệ sọi tơ nấm - Đánh giá tác động dịch nuôi cấy vi khuẩn lên hệ sợi tơ nấm kính hiển vi độ phóng đại 1000X 3.5 Khảo sát sơ đặc điểm họp chất kháng mốc dịch nuôi cấy Bacillus sp Khảo sát tác động điều kiện vật lý (nhiệt độ, pH), hóa chất (chất hoạt động bề mặt, dung mơi hữu cơ), enzyme lên hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy vi khuẩn phương pháp khuếch tán giếng thạch Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài “Khảo sát đặc điểm kháng nấm mốc Nigrospora sp gây bệnh đốm dâu tây dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus sp.” đạt số kết sau: - Phân lập định danh chủng Nigrospora sp MD11 gây bệnh đốm dâu tây - Tuyển chọn chủng TH5 thể khả ức chế MD11 mạnh, xác định thuộc chi Bacillus có mối quan hệ gần với chủng Bacillus velezensis Bac57 - Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng TH5 sinh hợp chất kháng MD11 môi trường LB (Luria-Bertani) thay the peptone 1,0% cao trùn quế, bổ sung 1,0% lactose, nhiệt độ nuôi cấy 35°c, pH ban đầu môi trường nuôi cấy 7,0 lên men 84 Tại điều kiện này, hoạt tính kháng mốc từ TH5 thu nhận 5120AƯ/mL - Dịch nuôi cấy chủng TH5 sau 16-24 tác động với hệ sợi tơ nấm tỉ lệ trộn 1:1, 37°c làm biến dạng, sưng phù, xuất nhiều không bào hệ sợi tơ nấm Đồng thời vách tế bào bị mỏng rách, gây ly giải tế bào chất - Dịch nuôi cay TH5 chứa nhiều loại hợp chất kháng mốc MD11 với chất khác Các hợp chất chất có chat protein, chất có chứa liên kết ester hình thành với gốc acid béo, biosurfactant anion hóa hay chất có khả hòa tan tốt ethyl acetate chất bền nhiệt, hoạt động pH rộng (6,0-10,0) Đặc tính ổn định hoạt động cao điều cần thiết cho phát triển hợp chất kháng mốc sản xuất thuốc kháng nấm sinh học Việc hợp chất kháng mốc ổn định hoạt tính chất hoạt động bề mặt chất không ion hóa, cho thấy chất chất hoạt động bề mặt thích hợp để phối trộn sản xuất chế phẩm sau Đánh giá két đạt kết luận - Việc phân lập chủng nấm mốc gây bệnh dâu tiền đề cho nghiên cứu bệnh học dâu tây, từ đưa giải pháp điều trị, phịng bệnh an tồn, thân thiện với môi trường - Nghiên cứu giúp hiểu rõ chế đối kháng số đặc tính hợp chất kháng mốc sinh tổng hợp vi khuẩn Đây sở để khai thác chủng vi khuẩn tiềm năng, ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh nhằm kiểm sốt, phịng trừ bệnh dâu tây an tồn, hiệu quả, góp phần vào việc phát triển nên nông nghiệp xanh, bền vững Tóm tắt két (tiếng Việt tiếng Anh) Tóm tắt: Dâu tây (Fragaria ananassa) loại ăn có giá trị dinh dưỡng kinh tế cao Tuy nhiên dâu tây đối tượng nhạy cảm, dễ bị tác nhân gây bệnh thực vật cơng Trong đó, bệnh nấm mốc gây ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng suất Các chủng Nigrospora tác nhân gây bệnh có khả phá hủy mạnh với phổ vật chủ đa dạng Hiện nay, kiểm soát sinh học biện pháp xanh, thân thiện với mơi trường cơng tác bảo vệ, phịng trừ bệnh hại ỏ thực vật Do đó, việc xác định tác nhân gây bệnh tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả đối kháng vói nấm bệnh điều quan trọng Trong nghiên cứu phân lập chủng Nigrospora sp MD11 có khả gây bệnh đốm dâu Sau sàng lọc khả đối kháng, 10/12 chủng vi khuẩn thuộc sưu tập giống có khả ức chế MD11 Trong đó, chủng vi khuẩn TH5 có hoạt tính ức chế phát triển hệ sợi to nấm mạnh nhất, xác định thuộc chi Bacillus có tưong đồng với chủng B velezensis Bac57 Khi nuôi cấy môi trường LB cải tiến, sử dụng 1% cao trùn quế nguồn nitrogen, bổ sung 1% lactose, 35°c, pH 7,0, sau 84 thu nhận dịch ni cấy vói hoạt tính kháng MD11 5120AU/mL Dịch ni cấy sau 24 tác động lên hệ sợi to nấm có khả làm biến dạng, sưng phù tế bào, mỏng vách tế bào gây ly giải tế bào chất Các hợp chất kháng mốc sinh TH5 có khả bền nhiệt, ben pH Các hợp chất bị tác động 0,1-1,0% chất hoạt động bề mặt (SDS, tween 20, tween 80 triton-X100) Hoạt tính kháng mốc bị giảm đáng kể xử lý vói enzyme lipase protease (5-10 mg/mL) Sự tác động số dung mơi tỉ lệ 1:1 làm họat tính kháng mốc dịch nuôi cấy giảm rõ rệt lô xử lý với ethanol, methanol, acetone ethyl acetate Do đó, chủng vi khuẩn xem tác nhân sinh học tiềm kiểm soát bệnh đốm dâu tây, góp phần xây dựng nông nghiệp bền vững Abstract: Strawberry (Fragaria ananassa') is a fruit with high nutritional and economic value However, it is a sensitive subject, susceptible to attack by plant pathogens The leaf diseases caused by molds significantly affect the quality and yield Nigrospora is among the most leaf pathogens with a diverse host spectrum Currently, biological control is an eco-friendly method in the protection and prevention of plant diseases Therefore, it is especially important to identify the causative agent as well as to search for bacterial strains that can antagonize the fungus In this study, Nigrospora sp MD11 which is causing strawberry leaf spot disease was isolated After screening for antagonistic ability, 10/12 bacterial strains were able to inhibit MD11 Among them, the strain TH5 has the strongest inhibitory activity on the growth of mycelium, was identified as belonging to the genus Bacillus and has similarities with#, velezensis Bac57 When cultured on LB medium, using 1.0% earthworm extract as nitrogen source, adding 1.0% lactose, 35°c, pH 7.0, after 84 hours, the antifungal MD11 stain activity was 5120AU/mL The cultures can distort, expand, and thin the cell wall after 24 hours of impact on the mycelium, leading to cytoplasmic lysis The antifungal compounds produced by TH5 are heat and pH stable These compounds are less affected by 0.1-1.0% of surfactants (SDS, tween 20, tween 80 and triton-X100) The antifungal activity was significantly reduced when treated with lipase and protease enzymes (5-10 mg/mL) The impact of some solvents at a ratio of 1:1 resulted in a significant decrease in the antifungal activity of the cultures in the case treated with ethanol, methanol, acetone, and ethyl acetate Therefore, this bacterial strain is considered as a potential biocontrol agent in controlling strawberry leaf spot disease towards sustainable agriculture III Sản phẩm đề tài, công bố két đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) TT Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh té - kỹ thuật Tên sản phẩm Đạt Đăng ký Sản phẩm dạng 1 giống vi khuẩn kháng - Giống chủng, mốc bảo quản glycerol 50% phịng Thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Dịch nuôi cấy từ chủng có khả ức chế 30% phát triển nấm mốc Hoạt tính kháng mốc có khả chịu nhiệt, chịu pH Sản phẩm dạng báo đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ IUH báo: “Nghiên cứu xác định số chủng nấm gây bệnh đốm dâu tây Đà Lạt” chấp nhận đăng tạp chí Khoa học Cơng nghệ IƯH Ghì chú: - Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo ) đươc chấp nhân có ghi nhận địa cảm ơn trường ĐH Công Nghiệp Tp HCM cấp kính phí thực nghiên cứu theo quy định - Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm phần phụ lục minh chứng cuối báo cáo (đối với ấn phẩm sách, giáo trình cần có photo trang bìa, trang trang cuối kèm thông tin định số hiệu xuất bản) IV Tình hình sử dụng kinh phí T T A Nội dung chi Chi phỉ trực tiếp Th khốn chun mơn Ngun, nhiên vật liệu, Thiết bị, dụng cụ Cơng tác phí Dịch vụ th ngồi Kỉnh phí duyệt (triệu đồng) Kỉnh phí thực (triệu đồng) 16.464.500 2.035.500 16.464.500 2.035.500 Ghi 7 B Hội nghị, hội thảo, thù lao nghiệm thu kỳ In ấn, Văn phịng phẩm Chi phí khác Chi phỉ gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nước Tong số r z ' r r _ r 1.500.000 1.500.000 20.000.000 20.000.000 „ A V Kiên nghị (về phát trỉên kêt nghiên cứu đê tài) Bên cạnh khả gây bệnh đốm dâu tây Đà Lạt, chủng MD11 cần kiểm tra khả gây bệnh nhiều đối tượng trồng khác nhằm phục vụ cơng tác kiểm sốt quản lý bệnh hại thực vật Chủng TH5 thể khả ức chế tốt MD11 gây bệnh đốm dâu tây mơ hình in vitro, in situ Tuy nhiên, để ứng dụng vào thực tiễn, chủng cần thực thí nghiệm khảo sát mức độ an tồn vói người mơi trường Đồng thời, khảo sát đánh giá tác động chủng TH5 lên MD11 mơ hình thực nghiệm lớn hon trồng nhà kính, mơ hình đồng ruộng Quy trình sản xuất chế phẩm kiểm sốt Nigrospora sp MD11 từ chủng Bacillus sp TH5 cần nghiên cứu thêm, hồn thiện thêm thơng số kỹ thuật để áp dụng sản xuất quy mô pilot, quy mô công nghiệp Các hợp chất kháng mốc từ chủng TH5 cần xác định thêm đặc điểm hóa sinh tác động, co chế ảnh hưởng đến MD11 nói riêng nấm mốc nói chung cần nghiên cứu sâu hơn, giúp ứng dụng hiệu thực tiễn VI Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng sản phẩm nêu Phần III) 1 giống vi khuẩn kháng mốc bảo quản Phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm Bài báo “Nghiên cứu xác định số chủng nấm gây bệnh đốm dâu tây Đà Lạt” chấp nhận đăng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ IƯH Chủ nhiệm đề tài Phòng QLKH&HTQT Tp HCM, ngày 09 tháng năm 2023 Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Viện trưởng PHẢN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC CHƯƠNG TỒNG QUAN 1.1 Cây dâu tây Cây dâu tây (Fragaria ananassa) loại ăn thuộc họ Rosaceae, chi Fragaria, thị trường ưa chuộng giá trị dinh dưỡng cao hương vị thơm ngon Dâu tây coi loại trái tốt cho sức khỏe Fructose dâu tây giúp điều chỉnh lượng đường máu Dâu tây nguồn cung cấp khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin chất chống oxy hóa dồi Do đó, việc sử dụng dâu tây tốt cho sức khỏe, giảm bệnh tim mạch, huyết áp [1], Dâu tây hay sản phẩm làm từ dâu tây ưa chuộng mứt, nước trái cây, thạch, kem, sữa, bánh Do đó, sản lượng tiêu thụ dâu tây giới tương đối lớn Trung Quốc quốc gia lớn sản xuất dâu tây, sản xuất 3,8 triệu dâu tây năm 2016, chiếm 42% sản lượng dâu tây toàn cầu Sản lượng xuất dâu tây tồn cầu đạt 86 nghìn vào năm 2016 cho thấy tăng trưởng ổn định vài năm gần đây, đặc biệt từ năm 2007 đến năm 2011 Năm 2012, lượng dâu tây xuất toàn cầu đột ngột tăng 18% dao động nhẹ năm 2016 [11] Theo thống kê FAO vào năm 2019, tổng sản lượng dâu tây đạt 8,9 triệu tấn, tiêu thụ mạnh mẽ nước Trung Quốc, Mỹ Canada Thị trường dâu tây giới dự báo tiếp tục tăng trưởng 3,4% giai đoạn 2021-2026 [2], Tuy nhiên, dâu tây nhạy cảm với nhiều mầm bệnh vi khuẩn, virus tác nhân gây bệnh ảnh hưởng kinh tế, suất nhiều nấm mốc Bệnh từ nấm mốc lây nhiễm sang tất phận làm chết [12], 1.2 Bệnh đốm dâu tây Lá nơi chủ yếu chuyển đổi quang thành hóa nhờ trình quang hợp Lá dâu thường có tuổi thọ từ 1-3 tháng Hình thái khác giống dâu tây, có chung đặc điểm tập trung số lượng lớn khí khổng bề mặt [11] Bệnh hại thường xuyên xuất dâu tây Các mầm bệnh thường công chủ yếu vào khí khổng xâm nhiễm trực tiếp lớp biểu bì (Hình 1.1) [13] Khi lượng mơ bị phá hủy đủ nhiều, yếu dễ tổn thương Ngoài ra, tác nhân gây bệnh cịn lây nhiễm sang quả, rễ, gây thối, rụng quả, làm giảm chất lượng suất trồng Conidia Ascospores Asexual Conidia and ascospores are splash dispersed by rain Acervulus containing conidia Spores germinate and infect plant tissues by entering the stomata of the leaf and wounds in the tissue The fungus over-winters in the infected leaves and petioles Perithecia and ascus containing ascospores Hình 1.1 Chu kì sống G comari gây bệnh đốm dâu tây Nguồn: [13] Multiple Range Tests for Hoat tinh (AU/mL) by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet 45 25 30 40 35 Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 24 24 24 24 24 467.5 1142.5 1310.0 1415.0 2330.0 143.255 143.255 143.255 143.255 143.255 A B B B c ♦♦♦ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy 55 72 84 96 56 Phụ lục 8: Anh hưởng pH môi trường lên hoạt tính kháng mơc dịch ni ❖ Số liệu 12h 24h lần pha lỗng cịn hoạt t STT , pH lần íân lân lần pha lỗng cịn hoạt t Hoạt tính lân lân Trung bình íân Hoạt tính 0 0 0 0 0 0 5.0 0 0 0 0 0 0 0 6.0 4 80 80 80 80 16 16 16 320 320 320 320 7.0 4 80 80 80 80 32 32 32 640 640 640 640 8.0 1 20 20 20 20 32 32 32 640 640 640 640 9.0 ìo.o 0 0 0 4 80 80 80 80 0 0 0 2 40 40 40 40 36h STT , pH 4.0 lân pha lỗng cịn hoạt t lần lân lân Hoạt tính Trung bình Hoạt tính Trung bình 0 0 0 0 0 0 0 4 80 80 80 80 4 80 80 80 80 6.0 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 7.0 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 8.0 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 9.0 -Ị ìo.o 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 32 32 32 640 640 640 640 60h 72h , pH lần lân fan lần pha lỗng cịn hoạt t Hoạt tính lân lân Trung bình íân Hoạt tính Trung bình 4.0 0 0 0 0 0 0 0 5.0 8 160 160 160 160 8 160 160 160 160 6.0 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 7.0 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 8.0 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 9.0 ìo.o 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 32 32 32 640 640 640 640 64 64 64 1280 1280 1280 1280 96h 84h lần pha lỗng cịn hoạt t STT 48h Tân pha lỗng cịn hoạt t íán lân lân lần pha lỗng cịn hoạt t STT Trung bình 4.0 , pH lân lần íân lần pha lỗng cịn hoạt t Hoạt tính íân íần lần Trung bình Hoạt tính Trung bình 4.0 0 0 0 0 0 0 0 5.0 6.0 8 160 160 160 160 8 160 160 160 160 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 7.0 256 256 256 5120 5120 5120 5120 256 256 256 5120 5120 5120 5120 8.0 128 128 128 2560 2560 2560 2560 128 128 128 2560 2560 2560 2560 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 64 64 64 1280 1280 1280 1280 9.0 ìo.o ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy 57 12 60 24 36 72 84 48 96 58 Ket thống kê Analysis of Variance for Hoat tinh (AU.l'mL) - Type III Sums of Squares Sum of Squares Source Df MAIN EFFECTS A: pH 5.96714E7 B:Thoi gian (gio) 5.14127E7 RESIDUAL 4.45804E7 134 TOTAL (CORRECTED) 1.55665E8 146 Mean Square F-Raiio P-Va/ue 9.94524E6 8.56878E6 332690 29.89 25.76 0.0000 0.0000 All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple Range Tests for Hoat tinh (AU/mL) by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 10 21 21 21 21 21 21 21 91.4286 645.714 651.429 1097.14 1337.14 1931.43 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 125.866 A A B B c c D 59 Phụ lục 9: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu ĐỐI CHỨNG NHIỆT ĐỘ 40 30 PHÚT Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 60 PHÚT 7 2560 2560 2560 100 100 100 30 PHÚT 60 PHÚT Hoạt tính kháng AU/mL 30 PHÚT 60 PHÚT Hoạt tính cịn lạl (%) NHIỆT ĐỘ 30 PHÚT Hoạt tính khángAU/mL Hoạt tính cịn lạl (%) ❖ Kết 128 128 70 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 64 64 64 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 1280 1280 1280 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 50 50 90 128 60 128 128 80 Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 50 128 128 121 100 128 128 128 128 128 128 64 64 64 60 PHÚT 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 30 PHÚT 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 1280 1280 1280 60 PHÚT 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 1280 30 PHÚT 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 50 50 60 PHÚT 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 thống kê Analysis of Variance for Hoat tinh lai (%) - Type III Sums of Squares Sum of Squares Source Of MAIN EFFECTS A:Nhietdo 15000.0 B:Thoi gian (phut) 6666.67 44 RESIDUAL 8333.33 TOTAL (CORRECTED) 30000.0 53 All F-ratios are based on the residual mean square error Mean Square F-Raũo P-Vafue 1875.0 6666.67 189.394 9.90 35.20 0.0000 0.0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet 121 100 70 80 90 50 40 60 Doi Chung ❖ Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 6 6 6 6 50.0 75.0 75.0 75.0 75.0 100.0 100.0 100.0 100.0 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 5.61833 A B B B B c c c c Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy ĐỐI CHỨNG 60 □oĩZT DoOOĩ 3o06 Do08 3oOZ Do09 DoOS DoOV 19 iriHd 09 lỌHd OE Phụ lục 10: Anh hưởng pH lên hoạt tính kháng môc dịch nuôi ❖ Số liệu ĐỔI CHỨNG pH SỐ lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lạĩ (%) pH Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL 128 128 2560 100 2560 100 2560 32 640 100 25 25 25 64 64 64 64 64 1280 50 1280 1280 1280 50 50 1280 50 1280 50 50 F 7.0 5.0 64 -F 8.0 9.0 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 128 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 2560 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 pH 11.0 10.0 Số lần pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 32 640 128 100 Hoạt tính cịn lại (%) 32 640 -? 6.0 r 4.0 3.0 128 128 2560 100 128 128 2560 100 2560 100 64 1280 50 12.0 64 1280 50 64 64 64 64 1280 50 1280 50 1280 50 1280 50 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy ĐỐI CHỨNG Phụ lục 11: Ánh hưởng enzyme lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ♦♦♦ Số liệu ĐỐI CHỨNG Enzyme mg/mL Số lần pha lỗng cịn hoạt tính 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính kháng AU/mL 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính lại (%) 10 mg/mL 128 2560 128 128 2560 32 16 640 32 16 640 32 16 640 128 128 2560 2560 100 100 2560 2560 320 160 100 100 320 25 12.5 320 100 100 25 12.5 25 12.5 12.5 16 16 16 16 Trypsin 16 16 8 8 8 320 320 320 320 320 320 160 12.5 6.25 160 12.5 6.25 160 12.5 6.25 160 12.5 6.25 160 12.5 6.25 12.5 Enzyme Pepsin mg/mL sõ lần pha lỗng cịn hoạt tính 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính kháng AU/mL 10 mg/mL mg/mL Hoạt tính cịn lại (%) Lipase 128 10 mg/mL 160 6.25 16 320 6.25 Proteinase K 16 320 160 12.5 6.25 Chymotrypsin 8 160 6.25 0 160 6.25 16 320 160 12.5 6.25 160 6.25 ❖ Kết thống kê 62 Analysis of Variance for Hoat tinh lai (%) - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df MAIN EFFECTS AiEnzyme 41250.0 B:Nong do(mg/mL) 351.563 RESIDUAL 117.1S8 29 TOTAL (CORRECTED} 41718.8 35 All F-ratios are based on the residual mean square error Mean Square F-Rai!O P-Value 8250.0 351.563 4.04095 2041.60 87.00 0.0000 0.0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Enzyme Method: 95.0 percent LSD Enzyme Chymotrypsin Proteinase K Pepsin Trypsin Lipase Doi Chung ❖ Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 6 6 6 3.125 9.375 9.375 9.375 18.75 100.0 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 0.820665 A B B B c D Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần -: Môi trường nuôi cấy Li: enzyme lipase Tiyp: enzyme trypsin Chy: enzyme chymotrypsin Pep: enzyme pepsin ProK: enzyme proteinase K Lipase Proteinase K Pepsin Trypsin Chymotrypsin Đối chứng Đối chứng mg/mL 10 mg/mL 63 Phụ lục 12: Anh hưởng chât hoạt động bê mặt lên hoạt tính kháng môc dịch nuôi cấy ♦♦♦ Số liệu chái hoạt độn bề m ặt 0.1% Bậc pha lỗng cịn hoạt tính 1% 0.1% Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1% 0.1% 1% Đối chứng Mau ĐC_CHDBM Mau ĐC CHDBM Mẩu ĐC_CHDBM Mau ĐC_CHDBM Mầu Mầu 128 Bậc pha lỗng cịn hoạt tính 1% 0.1% Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1% 0.1% 1% 100 100 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 2560 2560 100 100 Chất hoạt động bề mặt 0.1% 100 100 128 2560 2560 2560 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 Triton-X100 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 Tween 80 Tween 20 Mầu ĐC CHDBM Mẩu ĐC_CHDBM Mẩu ĐC_CHDBM Mau ĐC_CHDBM Mau Mầu SDS CTAB 32 256 256 640 160 5120 5120 18.75 128 128 128 128 2560 2560 20 100 99.21875 128 128 2560 40 2560 160 98.4375 93.75 128 128 32 2560 160 2560 640 93.75 75 ❖ Hình ảnh Ghi chú: G: Dịch ni cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần - : Môi trường nuôi cấy CTAB SDS TWEEN 20 TWEEN 80 TRITON-XÍOO Đối chứng 0,1% 1,0% 64 Đối chứng ❖ Kết thống kê Analysis of Variance for Hoa tinh lai (%) - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares MAIN EFFECTS A:Chat hoat dong be mat 38528.4 B:Nong (%) 478.516 RESIDUAL 610.962 TOTAL (CORRECTED) 39617.9 All F-ratios are based on the residual mean square error.l Df Mean Square F-Rauo P-Value 29 35 7705.69 478.516 21.0677 365.76 22.71 0.0000 0.0000 Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Chat hoat dong be mat 0,1% Method: 95.0 percent LSD Level CTAB Triton-X100 SDS Doi Chung Tween 20 Tween 80 Count Mean Homogeneous Groups 3 3 3 18.75 93.75 98.4375 100.0 100.0 100.0 A B c D D D Phụ lục 13: Ảnh hưởng dung môi lên hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy ❖ Số liệu Dung mơi Bậc pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1:9 1:1 1:9 1:1 1:9 1:1 Dung mơi Bậc pha lỗng cịn hoạt tính Hoạt tính kháng AU/mL Hoạt tính cịn lại (%) 1:9 1:1 1:9 1:1 1:9 1:1 ❖ Kết ĐỐI CHỨNG 128 128 128 128 2560 2560 2560 2560 100 100 100 100 Ethyl acetate 64 64 32 32 1280 1280 640 640 50 50 25 25 25 Ethanol 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 Methanol 128 32 2560 640 100 25 128 128 2560 2560 100 100 Chloroform 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 Hexan 128 128 2560 2560 100 100 128 128 2560 2560 100 100 128 32 2560 640 100 64 32 1280 640 50 25 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 Acetone 128 32 2560 640 100 25 128 32 2560 640 100 25 128 128 2560 2560 100 100 thống kê 65 Analysis of Variance for Hoattinh lai (%) -Type III Sums of Squares Sum of Squares Source Of MAIN EFFECTS A: Du ng moi 22500.0 B:Ti Ie 13392.9 RESIDUAL 12857.1 34 TOTAL (CORRECTED) 48750.0 41 All F-ratios are based on the residual mean square error Wean Square F-Rai!O P-Va/ue 3750.0 13392.9 378.151 9.92 35.42 0.0000 0.0000 The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variability of Hoat tinh lai (%) into contributions due to various factors Since Type III sums of squares (the default) have been chosen, the contribution of each factor is measured having removed the effects of all other factors The P-values test the statistical significance of each of the factors Since P-values are less than 0.05, these factors have a statistically significant effect on Hoattinh lai (%) at the 95.0% confidence level Multiple Range Tests for Hoat tinh lai (%) by Dung moi Method: 95.0 percent LSD Dung moi Ethyl acetate Ethanol Methanol Acetone Chloroform Doi Chung Hexan ❖ Hình Ghi chú: Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 6 6 6 37.5 62.5 62.5 62.5 100.0 100.0 100.0 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 7.93884 A B B B c c c ảnh G: Dịch nuôi cấy gốc, khơng pha lỗng 1-9: Dịch ni cấy pha lỗng 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 256 lần -: Môi trường nuôi cấy A: acetone, C: chloroform, E: ethanol, EA: ethyl acetate, M: methanol, H: hexan 66 Ethanol Methanol Acetone Ethyl acetate Chloroform Hexan Đối chứng Đối chứng Phụ lục 14: Thành phần môi trường nuôi cấy STT Tên môi trường LB (Luria-Bertani) PGA (Potato glucose agar) PGB (Potato glucose broth) Thành phần Cao nam men: 5,0g; peptone: 10,0g; NaCl: 10,0g; nước cất đủ l,0L; pH 7,0 ± 0,2 Khoai tây: 200,0g; glucose: 20,0g; agar: 20,0g; nước cất đủ l,0L; pH 5,6 ± 0,2 Khoai tây: 200,0g; glucose: 20,0g; nước cất đủ l,0L; pH 5,6 ± 0,2 68 PHẢN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM (tất văn có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lỷ hợp đong với phịng kế tốn Chủ nhiệm đề tài khơng đính vào báo cáo Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường 01 đĩa CD) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình ) 69