Tuyển chọn và khảo sát một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm mốc nigrospora sphaerica gây bệnh đốm trên lá dâu tây

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: Tuyển chọn khảo sát số chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm dâu tây Mã số đề tài: 21/1SHTPSV07 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Kim Oanh Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, năm 2022 LỜI CẢM ƠN Đây lần chúng em thực nghiên cứu khoa học, khoảng thời gian đòi hỏi nhiều cố gắng chuyên tâm nỗ lực sinh viên Bên cạnh nhờ vào giúp đỡ nhiệt tình q thầy cơ, gia đình bạn bè để tạo động lực giúp chúng em hoàn thành tốt đề tài Chúng em xin phép gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến: Toàn thể Ban lãnh đạo quý thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học Thực Phẩm Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em thực nghiên cứu đề tài sau quãng thời gian giãn cách xã hội dịch bệnh Đặc biệt, chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Phạm Tấn Việt, Cô Nguyễn Thị Diệu Hạnh Và Thầy Nguyễn Ngọc Ẩn đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ, tạo điều kiện bảo, truyền đạt nhiều kiến thức cho chúng em đưa lời khuyên kịp thời để chúng em hồn thành đề tài nghiên cứu cách tốt Nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể anh chị, bạn bè sinh viên làm việc Phòng thí nghiệm Cơng nghệ Vi Sinh đã ln giúp đỡ quan tâm chia sẻ động viên suốt quãng thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, nhóm chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại học Cơng Nghiệp cấp kinh phí cho chúng em thời gian thực đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường PHẦN I THÔNG TIN CHUNG I Thông tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn khảo sát số chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm dâu tây 1.2 Mã số: 21/1SHTPSV07 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Nguyễn Thị Kim Oanh Trường ĐHCN Chủ nhiệm đề tài Ngô Châu Anh Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 03 năm 2022 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 09 năm 2022 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 03 năm 2021 đến tháng 10 năm 2022 1.6 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 10.000.000 (Mười triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Dâu tây có tên khoa học Fragaria ananassa, thuộc họ Rosaceae, loại thuộc ngành thực vật hạt kín, cho trái với hàm lượng dinh dưỡng cao chứa nhiều loại vitamin (vitamin C, vitamin B9, vitamin B6), khoáng chất (Kali, Magie, Mangan) cần thiết cho thể Theo báo UK Urban AgriTech, sản lượng dâu tây toàn giới 8.89 triệu Trong đó, châu Á khu vực có sản lượng lớn (4.17 triệu tấn) Trung Quốc, Mỹ, Mexico ba nước có sản lượng thu hoạch dâu tây lớn năm 2019 Ngoài ra, sản lượng dâu tây Trung Quốc chiếm 36% tổng số sản lượng giới [1][2] Dâu tây thường trồng vùng ôn đới, nhiệt độ mát mẻ, độ ẩm cao nên chúng nhạy cảm với tác nhân gây bệnh nấm mốc, sâu bọ, virus, vi khuẩn, … Dâu tây thường bị bệnh thân cây, lá, hoa, trái, … số tác nhân Botrytis cinerea (thối quả), Colletotrichum acutatum (bệnh đốm đen), Một số biểu bị nhiễm bệnh kể đến: phát triển, thân còi cọc, khả tạo trái hạt bị giảm sút rõ rệt khiến suất trồng bị ảnh hưởng [3] Bệnh đốm nấm mốc Nigrospora sphaerica gây tình trạng cháy lá, héo rũ lá, ảnh hưởng đến khả hình thành trái Những báo cáo tình trạng gây bệnh chủng nấm đối tượng khác đã làm ảnh hưởng nhiều sản lượng thu hoạch hàng năm Tuy nhiên, tình trạng dâu tây bị nhiễm nấm N sphaerica chưa có nghiên cứu trước Trong đó, xạ khuẩn nhóm vi sinh vật tiềm ứng dụng kiểm sốt bệnh thực vật phân bố rộng rãi tự nhiên với khả sản sinh chất kháng sinh, tiết enzyme kết hợp chất chuyển hóa thứ cấp ức chế phát triển vi sinh vật gây bệnh, thúc đẩy tăng trưởng thực vật [4] Do đó, đề tài “Tuyển chọn khảo sát số chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm dâu tây” thực nhằm làm đa dạng nguồn xạ khuẩn ứng dụng biện pháp kiểm sốt sinh học, góp phần xây dựng nông nghiệp bền vững Mục tiêu Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng với nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm dâu tây Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp thu thâp liệu tổng hợp tài liệu Các tài liệu tham khảo thông qua sách, báo Việt Nam Quốc tế mạng Internet với từ khóa tìm kiếm: Streptomyces, antifungal, crude extract, fungal mycelium, in vitro, in leaf strawberry, suspensions culture, … Tham khảo tài liệu, phương pháp thực thí nghiệm đã cơng bố tạo chí khoa học, tập san, báo cáo chuyên đề khoa học, Viện nghiên cứu, nhà máy công nghiệp Thu thập, tổng hợp tài liệu liên quan đề tài khả đối kháng xạ khuẩn nấm bệnh gây hại trồng, từ xử lý liệu 3.2 Phương pháp giữ giống xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn sau ngày cấy ria môi trường Gause I agar, khuẩn lạc rời rạc có đặc điểm đặc trưng chủng lựa chọn để cấy vào môi trường Gause I broth 10ml, ni lắc 120 vịng/ phút, ngày 35℃ Sau đó, dịch ni cấy phân phối vào eppendorf có bổ sung glycerol, nồng độ glycerol cuối 50% bảo quản 80℃ [5] 3.3 Phương pháp giữ giống nấm mốc Chủng nấm mốc nuôi cấy môi trường PGA 25℃ sau ngày, tiến hành cắt phần thạch có vùng tơ non với kích thước 1 mm2 cho vào eppendorf có bổ sung glycerol 50% bảo quản -80℃ [5] 3.4 Phương pháp hoạt hóa chủng xạ khuẩn cung cấp từ phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Nguyên tắc: Hoạt hóa giống phương pháp kiểm tra khả sinh trưởng phát triển chủng xạ khuẩn, đồng thời cung cấp dinh dưỡng để bào tử xạ khuẩn nảy mầm Với mục đích đảm bảo giống xạ khuẩn khiết không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác, phát triển tốt, tạo khuẩn lạc riêng rẽ, tiến hành bước tiếp nghiên cứu [6] Cách tiến hành: Giống trữ tủ đông -80°C, tiến hành rã đơng hút 10µl từ eppendorf chứa dịch xạ khuẩn có bổ sung glycerol (1:1) nhỏ lên bề mặt thạch môi trường Gause I Agar Sử dụng kỹ thuật cấy trải để trải dịch xạ khuẩn phủ bề mặt thạch khô lại Đĩa để nhiệt độ phịng, sau 3-5 ngày kiểm tra hình thái, phát triển, độ chủng xạ khuẩn Một khuẩn lạc đơn, đặc trưng chọn để cấy chuyền qua đĩa môi trường Gause I Agar Để đĩa đã ria lại xạ khuẩn nhiệt độ phòng, sau ngày khuẩn lạc sử dụng cho nội dung thí nghiệm [6] 3.5 Phương pháp sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả đối kháng nấm mốc N sphaerica gây bệnh đốm dâu tây Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng nấm dịch ni cấy xạ khuẩn thể khả ức chế lan tơ hệ sợi tơ nấm Cách tiến hành: Các chủng xạ khuẩn hoạt hố mơi trường Gause I agar Các khuẩn lạc ngày tuổi môi trường Gause I agar cấy vào môi trường Gause I broth lắc 120 vòng/ phút, 35℃ Sau ngày dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn thu nhận để xác định hoạt tính đối kháng với nấm N sphaerica phương pháp khuếch tán đĩa thạch Mẫu tơ nấm với đường kính 8mm đặt lên tâm đĩa mơi trường PGA đồng thời lỗ giếng có kích thước tương tự đục xung quanh đĩa Mỗi lỗ giếng nhỏ 100μl dịch nuôi cấy xạ khuẩn Đĩa thí nghiệm ủ nhiệt độ phịng Kết thu nhận phương pháp đo đường kính vịng kháng sau 24 đến 48 Hoạt tính kháng nấm đánh giá dựa phần trăm đối kháng tính theo cơng thức: (%) đối kháng = Trong D độ dài từ tâm đến mép giếng đối chứng, d độ dài từ tâm đến vị trí tơ nấm bị ức chế hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn [5] Các mức độ kháng nấm từ mạnh, trung bình yếu đánh theo nghiên cứu Trịnh Thới An (2014) Thí nghiệm lặp lại lần [7][8] 3.6 Định danh chủng xạ khuẩn 3.6.1 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn • Quan sát đại thể chủng xạ khuẩn môi trường Gause I agar sau ngày cấy ria mơi trường • Quan sát hình thái vi thể chủng xạ khuẩn kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần tiêu phịng ẩm 3.6.2 Định danh chủng xạ khuẩn phương pháp giải trình tự gene 16S – rRNA Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng mốc cao định danh dựa phân tích trình tự đoạn gene 16S - rRNA Xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I broth, ngày điều kiện 120 rpm, 35℃ Sau ly tâm 6000 rpm 15 phút, phần cặn thu nhận rửa với nước muối sinh lý ba lần Nhằm chiết DNA tổng số, sinh khối tế bào trộn với 100µL Buffer (10mM Tris, 0.1mM EDTA, pH 8.0), đun sôi 15 phút Vùng gene 16S rRNA khuếch đại cặp mồi 27F: 5’–AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1540R: 5’–AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ [9] Trong thành phần phản ứng PCR gồm có MasterMix 25µL, mồi xi 1µL, mồi ngược 1µL, DNA khn 3µL, DMSO 25% 6µL, thêm dH20 16µL cho đủ tổng thể tích 50 µL [9] Chu trình nhiệt thực điều kiện biến tính 94℃ – 10 phút, 30 chu kỳ 94℃ – 30 giây, 55℃ – 45 phút, 72℃ – phút, 72℃ – 10 phút, cuối bảo quản 4℃ - ∞ [10] Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1.5% TAE 1X ghi nhận kết Sản phẩm PCR gửi đến Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh) để giải trình tự Sau có trình tự gen chủng xạ khuẩn nghiên cứu, trình tự gen tương đồng truy xuất từ ngân hàng liệu Genbank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) giống phần mềm Seaview4 Cây phát sinh lồi xây dựng thuật tốn Neighbor – Joining với boostrap 1000 lần lặp lại phần mềm Mega phiên 3.7 Phương pháp khảo sát điều kiện ni cấy cho hoạt tính kháng mốc chủng xạ khuẩn (carbon, nitrogen, nhiệt độ, pH) Ngun tắc: Trong điều kiện ni cấy thích hợp, chủng xạ khuẩn cho hoạt tính mạnh rút ngắn thời gian nuôi Cách tiến hành: Các chủng xạ khuẩn hoạt hố mơi trường Gause I agar Các khuẩn lạc ngày tuổi môi trường Gause I agar cấy vào môi trường Gause I broth lắc 120 vịng/ phút, 35℃ Dịch ni cấy chủng xạ khuẩn từ môi trường tăng sinh sau ngày chuyển 1% giống vào bình mơi trường khảo sát Để khảo sát nguồn carbon thích hợp, tiến hành khảo sát nguồn carbon khác với nồng độ 1%, đối chứng mơi trường Gause I broth chứa 2% tinh bột tan Tương tự với khảo sát carbon, khảo sát nguồn nitrogen thích hợp với nồng độ 1% đối chứng môi trường Gause I broth chứa 0.1% KNO3 Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát nhiệt độ (25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃); pH (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0) [11] lắc 120 rpm Hoạt tính đối kháng nấm dịch nuôi cấy xác định ngày phương pháp khuếch tán giếng thạch kết được ghi nhận tương tự mục 2.3.5 Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài: “Tuyển chọn khảo sát số chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm dâu tây” đã thu số kết quả: − Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính ức chế nấm mạnh nhất: CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK − Định danh chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn − Thu kết khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho hoạt tính kháng mốc tốt chủng xạ khuẩn Đánh giá kết đạt kết luận Chủng xạ khuẩn CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK có khả kháng nấm mốc N sphaerica gây bệnh đốm dâu tây tốt Có tiềm ứng dụng sản xuất hợp chất đối kháng từ xạ khuẩn, áp dụng rộng rãi lĩnh vực đời sống Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Dâu tây (Fragaria ananassa) thuộc họ Rosaceae, loài cho trái có nhiều dinh dưỡng trồng phổ biến vùng ôn đời Tuy nhiên, suất trồng dâu thường bị đe dọa tác nhân vi sinh vật gây bệnh, có vi nấm Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm Hiện nay, đối kháng tự nhiên phương pháp hiệu có nhiều tiềm kiểm sốt, phịng ngừa bệnh cho trồng thơng qua chế phẩm sinh học có tính an tồn cho người mơi trường, đặc biệt chế phẩm xạ khuẩn Do đó, để góp phần hỗ trợ cho việc kiểm sốt bệnh đốm N spaherica phương pháp đối kháng tự nhiên, 41 chủng xạ khuẩn thuộc sưu tập giống phịng Cơng nghệ Vi Sinh – Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm đã sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng nấm Trong đó, có 34 chủng thể khả ức chế sinh trưởng N sphaerica Thêm vào đó, chủng xạ khuẩn CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK cho hoạt tính đối kháng tốt trình tự gene mã hóa cho 16S-rRNA với phát sinh loài đã cho thấy chúng có quan hệ gần gũi với Streptomyces coelicolor, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces tanashiensis Ngoài ra, chủng CNXK 65.2 cho hoạt tính kháng mốc tốt ni mơi trường Gause I có bổ sung 1% tinh bột tan; 1% cao thịt; pH 7,0; 35℃; 120 rpm Chủng CNXK 63 cho hoạt tính ức chế nấm tốt ni mơi trường Gause I có bổ sung 1% DGlucose; 1% NH4Cl; pH 8,0; 30℃; 120 rpm Chủng CNXK nuôi môi trường Gause I có bổ sung 1% tinh bột tan; 1% NH4Cl; pH 7,0; 30℃; 120 rpm cho hoạt tính kháng mốc tốt Những kết đạt cho thấy tiềm lớn chủng xạ khuẩn việc kiểm soát bệnh đốm nấm N sphaerica, nhằm hướng tới nông nghiệp xanh bền vững Abstract Strawberries (Fragaria ananassa) belong to the Rosaceae family, are a nutritious fruit tree, and are commonly grown in temperate regions However, strawberry yields are often threatened by pathogenic microbial agents, including the Nigrospora sphaerica that causes leaf spot diseases Currently, the natural antagonism is an effective method and has great potential in controlling and preventing diseases for plants through probiotics that are safe for humans and the environment, especially actinomycosis products Therefore, the natural antagonistic method was used for controlling of leaf spot diseases caused by N spaherica, 41 strains of actinomycosis belonging to the seed collection of the Department of Microbiological Technology – Institute of Biotechnology and Food Technology (IBF) were used to screen for antifungal activity 34 strains showed the ability to inhibit the growth of N sphaerica In addition, CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK exhibited the best antagonistic activity, and the 16S-rRNA – encoding gene along with the phylogenetic tree showed that they are closely related to Streptomyces coelicolor, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces tanashiensis respectively In addition, CNXK 65.2 strain exhibited good mold-resistant activity when grown in Gause I environment with the addition of 1% soluble starch; 1% meat extract; pH 7.0; 35°C; 120 rpm CNXK 63 strain showed good fungal inhibitory activity when grown in Gause I with the addition of 1% D-Glucose; 1% NH4Cl; pH 8.0; 30°C; 120 rpm CNXK strain when cultured in Gause I medium with the addition of 1% soluble starch; 1% NH4Cl; pH 7.0; 30°C; 120 rpm for good mold resistance activity The results showed the great potential of these strains of actinomycosis in the control of leaf spot diseases caused by N sphaerica, towards a green and sustainable agriculture III Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) TT Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Giống xạ khuẩn Thu chủng Đạt xạ Sàng lọc tuyển chọn khuẩn có khả kháng chủng xạ khuẩn mốc kháng mốc mạnh Định danh chủng xạ khuẩn Bài Abstract Hội nghị Các báo công bố IUH, ISI, SCOPUS Khoa học trẻ (IUH) Bài báo Đề tài vào vòng nghiên cứu Eureka cấp thành phố (có giấy khen kèm theo) IV Tình hình sử dụng kinh phí T T A Nội dung chi Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn Dịch vụ th ngồi In ấn, Văn phịng phẩm Hóa chất Tổng số Kinh phí duyệt (triệu đồng) 10.000.000 6.000.000 2.000.000 260.000 1.740.000 10.000.000 Kinh phí thực (triệu đồng) 10.000.000 6.000.000 2.000.000 260.000 1.740.000 10.000.000 Ghi V Kiến nghị (về phát triển kết nghiên cứu đề tài) Nghiên cứu nằm phạm vi nhỏ nên cần có nghiên cứu để đánh giá cụ thể sản xuất chế phẩm sinh học giúp ngăn ngừa hạn chế bệnh đốm dâu tây sau: − Khảo sát khả ức chế vi sinh vật chủng nghiên cứu đối tượng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh khác Hình 3.18: Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 63 3.4.2.3 Chủng CNXK Tiến hành khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen khác cho hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy chủng xạ khuẩn CNXK 3, kết thể Hình 3.19 Sau ngày nuôi cấy, NH4Cl NH4NO3 1% nguồn cung cấp nitrogen cho chủng sinh tổng hợp hợp chất kháng mốc có hoạt tính mạnh ngày ni cấy thứ Tiến hành phân tích ANOVA, hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy chủng xạ khuẩn bổ sung chất tương tự Vì vậy, NH4Cl 1% chọn nguồn cung cấp nitrogen q trình ni cấy chủng CNXK cho hoạt tính kháng mốc thí nghiệm 50 Hình 3.19: Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 3.4.3 Ảnh hưởng giá trị nhiệt độ ni cấy khác cho hoạt tính kháng mốc chủng xạ khuẩn 3.4.3.1 Chủng CNXK 65.2 Nhiệt độ mơi trường ni cấy có ảnh lớn đến phát triển khả sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK 65.2 tiến hành khảo sát, kết thể Hình 3.20 Hình 3.20: Ảnh hưởng nhiệt độ khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 65.2 51 Sau thời gian nuôi cấy ngày, kết khảo sát cho thấy hoạt tính kháng mốc chủng đạt cao ngày nuôi cấy thứ với nhiệt độ 35℃, 30℃ Trong tất nhiệt độ nuôi cấy khảo sát 45℃, xạ khuẩn CNXK 65.2 khơng có khả sinh hoạt tính kháng mốc Tuy nhiên, chủng xạ khuẩn Streptomyces chilikensis ACITM-1 nuôi cấy nhiệt độ 30℃ cho hoạt tính kháng mốc tốt (hơn 25%) Nhưng 35℃, chủng xạ khuẩn cho hoạt tính kháng mốc cao (hơn 20%) [53] Vì vậy, 35℃ nhiệt độ nuôi cấy dùng để tiến hành thí nghiệm 3.4.3.2 Chủng CNXK 63 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK 63 tiến hành khảo sát, kết thể Hình 3.21 Sau ngày nuôi cấy nhiệt độ khác (25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃), chủng cho hoạt tính kháng mốc cao ngày nuôi cấy thứ với giá trị nhiệt độ 40℃, 30℃, 35℃, 45℃, 25℃ Sau khoảng thời gian cho hoạt tính tối ưu hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy xạ khuẩn giảm dần Tuy nhiên, hoạt tính 30℃ có tính ổn định số nhiệt độ khảo sát Tương tự nghiên cứu Charu Singh cộng (2017), nhiệt độ môi trường nuôi cấy 30℃, chủng Streptomyces chilikensis ACITM-1 có khả sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính kháng nấm tốt [53] Vì vậy, 30℃ chọn làm nhiệt độ nuôi cấy cho thí nghiệm sau Hình 3.21: Ảnh hưởng nhiệt độ khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 63 52 3.4.3.3 Chủng CNXK Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn CNXK tiến hành khảo sát, kết thể Hình 3.22 Sau ngày ni cấy nhiệt độ khác (25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃), chủng cho hoạt tính kháng mốc cao ngày nuôi cấy thứ với giá trị nhiệt độ 30℃, 35℃, 25℃, 40℃, 45℃ Sau khoảng thời gian cho hoạt tính tối ưu hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy xạ khuẩn giảm dần Tuy nhiên, hoạt tính 30℃ có tính ổn định số nhiệt độ khảo sát Tương tự với nghiên cứu Ruth Chiamaka Osaro-Matthew cộng (2020), chủng xạ khuẩn Janibacter sp RC18 có khả sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm điều kiện ni cấy 30℃ [55] Vì vậy, 30℃ chọn làm nhiệt độ nuôi cấy cho thí nghiệm sau Hình 3.22: Ảnh hưởng nhiệt độ khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 3.4.4 Ảnh hưởng giá trị pH khác cho hoạt tính kháng mốc chủng xạ khuẩn 3.4.4.1 Chủng CNXK 65.2 Bên cạnh yếu tố nhiệt độ, pH môi trường yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp hợp chất ức chế nấm mốc Tiến hành khảo sát môi trường lên men với thay đổi 53 giá trị pH mơi trường (pH 4.0 – pH 10.0) nhằm tìm giá trị pH mơi trường thích hợp cho chủng CNXK 65.2 sinh tổng hợp hợp chất kháng nấm, kết thể Hình 3.23 Hình 3.23: Ảnh hưởng pH khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 65.2 Từ kết thu cho thấy, CNXK 65.2 có khả sinh trưởng, phát triển cho hoạt tính kháng mốc pH 6.0 đến pH 10.0 khơng có khả sinh hoạt tính pH 4.0 – pH 5.0 Ở ngày thứ 2, hoạt tính kháng mốc chủng xạ khuẩn đạt giá trị cao môi trường pH 7.0, pH 9.0, pH 6.0, pH 10.0 hoạt tính kháng mốc chủng xạ khuẩn giảm dần ngày nuôi cấy sau Sau phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, kết đối kháng môi trường giá trị pH khác cho thấy môi trường pH 7.0 pH 9.0 khơng có khác biệt Ngoài ra, theo nghiên cứu Jadon P cộng (2019) chủng xạ khuẩn S griseus AP-27 ni cấy pH 7.0 cho hoạt tính kháng mốc cao [52] Vì vậy, pH mơi trường 7.0 chọn để cố định cho thí nghiệm 3.4.4.2 Chủng CNXK 63 Tương tự chủng CNXK 65.2, tiến hành khảo sát môi trường nuôi cấy lên men với các giá trị pH thay đổi từ pH 4.0 đến pH 10.0 nhằm tìm giá trị pH mơi trường cho hoạt tính kháng mốc tốt chủng CNXK 63, kết thể Hình 3.24 54 Hình 3.24: Ảnh hưởng pH khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 63 Từ kết thu cho thấy, chủng CNXK 63 có khả sinh trưởng, phát triển có hoạt tính kháng nấm pH 6.0 – pH 10.0 Ở pH 4.0 pH 5.0 chủng xạ khuẩn khơng có khả sinh hoạt tính kháng nấm Hầu hết giá trị pH ngày khơng có hoạt tính kháng nấm, trừ mơi trường ni cấy có giá trị pH 6.0 Tuy nhiên, ngày nuôi cấy thứ 3, dịch ni cấy chủng CNXK 63 cho hoạt tính cao giá trị pH 8.0, pH 10.0, pH 6.0, pH 7.0; riêng giá trị pH 9.0 đến ngày ni cấy thứ cho hoạt tính kháng mốc cao Hoạt tính kháng mốc dịch nuôi cấy xạ khuẩn giảm dần ngày nuôi cấy Sau tiến hành phân tích ANOVA (P = 0.05) kết đối kháng môi trường ni cấy có giá trị pH khác cho thấy, mơi trường có pH 8.0 so với giá trị pH mơi trường cịn lại có khác biệt ý nghĩa mặt thống kê Ngoài ra, dựa nghiên cứu Yajie Duan cộng (2020), chủng xạ khuẩn Streptomyces ma FS-4 nuôi cấy môi trường Gause I với giá trị pH 8.0 cho hoạt tính kháng nấm tốt [54] Bên cạnh đó, nghiên cứu Ruth Chiamaka Osaro-Matthew cộng (2020) đã báo cáo kết rằng: chủng xạ khuẩn Janibacter sp RC18 có khả sinh tổng hợp hợp chất kháng nấm Collectotricum coccodes Alternaria pimpriana mơi trường ni cấy có pH 8.0 [55] Vì vậy, pH 8.0 chọn để cố định cho thí nghiệm 55 3.4.4.3 Chủng CNXK Tiến hành khảo sát môi trường nuôi cấy lên men với giá trị pH thay đổi từ pH 4.0 – pH 10.0 nhằm tìm giá trị pH mơi trường cho hoạt tính kháng mốc tốt chủng CNXK 3, kết thể Hình 3.25 Hình 3.25: Ảnh hưởng pH khác cho hoạt tính kháng mốc chủng CNXK Từ kết thu cho thấy, chủng CNXK có khả sinh trưởng, phát triển có hoạt tính kháng nấm pH 6.0 – pH 9.0 Ở pH 4.0, 5.0, 10.0 chủng xạ khuẩn CNXK khơng có khả sinh hoạt tính kháng mốc Ở ngày ni cấy thứ 3, chủng cho hoạt tính kháng mốc mạnh pH 7.0, 6.0 Bên cạnh đó, mơi trường ni cấy có giá trị pH 8.0 cho hoạt tính kháng mốc cao ngày nuôi cấy thứ mơi trường có pH 9.0 ngày ni cấy thứ Ở ngày nuôi cấy tiếp, hoạt tính kháng mốc dịch ni cấy chủng CNXK giảm dần Tiến hành phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%, kết đối kháng môi trường giá trị pH khác cho thấy môi trường pH 7.0 có khác biệt Bên cạnh đó, Jadon P cộng (2019) đã báo cáo kết nghiên cứu: chủng xạ khuẩn S griseus AP-27 mơi trường ni cấy có giá trị pH 7.0 cho hoạt tính kháng mốc tốt [52] Vì vậy, pH môi trường 7.0 chọn để cố định cho thí nghiệm 56 KẾT LUẬN 4.1 Kết luận Từ sưu tập chủng xạ khuẩn phòng thí nghiệm Cơng nghệ Vi Sinh, Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, hoạt hóa thành cơng 41 chủng xạ khuẩn Trong có 34 chủng có hoạt tính kháng nấm mốc N sphaerica gây bệnh đốm dâu tây Từ 34 chủng có hoạt tính kháng mốc chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng mốc mạnh CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK Nhận diện hình thái đại thể, vi thể giải mã trình tự đoạn gene mã hóa cho 16S – rRNA kết hợp với vẽ phát sinh loài đã xác định chủng CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK có quan hệ gần gũi với chủng xạ khuẩn Streptomyces coelicolor, Streptomyces pseudogriseolus, Streptomyces tanashiensis với giá trị tương đồng NCBI 99.64%, 100%, 99.98% giá trị bootstrap 1000 (độ tin cậy cao) Hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 65.2 mơi trường lên men Gause I cho kết đối kháng nấm mốc N sphaerica cao điều điện: Nguồn carbon tinh bột tan (nồng độ 1%), nguồn nitrogen meat extract (nồng độ 1%), pH 7.0, nhiệt độ 35℃, với thời gian nuôi cấy ngày, lắc 120 rpm Hoạt tính kháng mốc chủng CNXK 63 môi trường lên men Gause I cho kết đối kháng nấm mốc N sphaerica cao điều điện: Nguồn carbon glucose (nồng độ 1%), nguồn nitrogen NH4Cl (nồng độ 1%), pH 8.0, nhiệt độ 30℃, với thời gian nuôi cấy ngày, lắc 120 rpm Hoạt tính kháng mốc chủng CNXK môi trường lên men Gause I cho kết đối kháng nấm mốc N sphaerica cao điều điện: Nguồn carbon tinh bột tan (nồng độ 1%), nguồn nitrogen NH4Cl (nồng độ 1%), pH 7.0, nhiệt độ 30℃, với thời gian nuôi cấy ngày, lắc 120 rpm 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu cịn nằm phạm vi nhỏ nên cần có nghiên cứu để đánh giá cụ thể sản xuất chế phẩm sinh học giúp ngăn ngừa hạn chế bệnh đốm dâu tây sau: 57 • Khảo sát khả ức chế vi sinh vật chủng nghiên cứu đối tượng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh khác • Khảo sát đánh giá khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào, tính kháng khuẩn, kháng loại nấm bệnh khác, • Thử nghiệm hiệu ức chế nấm bệnh mơ hình in vivo • Khảo sát mơi trường ni cấy khác • Khảo sát so sánh khả ức chế nấm N sphaerica dịch ni cấy xạ khuẩn có tế bào khơng có tế bào để tìm cách sản xuất chế phẩm sinh học phù hợp 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] FAO, Top Countries in Strawberries Production, Nation Master, 2019 [2] UK Urban AgriTech, What is the role of CEA in the worldwide strawberry product?, Verticalfarm daily, 2021 [3] Ralph Dean et al., The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology, Mol Plant Pathol., 2012 13(4), p 414–430 Doi: 10.1111/j.1364-3703.2011.00783.x [4] Oluwaseyi Samuel Olanrewaju and Olubukola Oluranti Babalola1, Streptomyces: implications and interactions in plant growth promotion, Appl Microbiol Biotechnol., 2019 103(3), p 1179–1188 Doi: 10.1007/s00253-018-09577-y [5] Bùi Hồng Quân, Đàm Sao Mai, Giáo trình thực tập vi sinh vật học, 2011 [6] Th.S Lê Xuân Phương, Phần II: Thí nghiệm Vi Sinh Vật học, 2006 [7] Trịnh Thới An, Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng nấm Pythium sp., Tạp chí Khoa học ĐHSP Tp.HCM, 2014 61, p 113–121 [8] Hariharan Harikrishnan, Vellasamy Shanmugaiah, Natesan Balasubramanian, Mahaveer P Sharma and Simeon O Kotchoni, Antagonistic potential of native strain Streptomyces aurantiogriseus VSMGT1014 against sheath blight of rice disease, World J Microbiol Biotechnol., 2014 30(12), p 3149–3161 Doi: 10.1007/s11274-014-1742-9 [9] Jonghoon Kang, Myung Soog Lee and David G Gorenstein, The enhancement of PCR amplification of a random sequence DNA library by DMSO and betaine : Application to in vitro combinatorial selection of aptamers, Biochem Biophys Methods, 2005 64, p 147– 151 Doi: 10.1016/j.jbbm.2005.06.003 [10] Phan Thị Vân, Trần Thị Thúy Hà, Lưu Thị Hà Giang, Vũ Thị Trang, Phạm Hồng Nhật, Identification and Genetic Assessment of the Pompano Based on the Molecular Markers, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 2019 17(3), p 204–215 [11] Md R Rezuanul Islam, Yong Tae Jeong, Yeon Ju Ryu, Chi Hyun Song and Yong Se Lee, Isolation, Identification and Optimal Culture Conditions of Streptomyces albidoflavus C247 Producing Antifungal Agents against Rhizoctonia solani AG2-2 , Mycobiology, 2009 37(2), p 114 Doi: 10.4489/myco.2009.37.2.114 [12] Martin Welsh, Advancing the culture, study and improvement of vegetables, National 59 Vegetable Society, 2008 [13] Địa chí Đà Lạt, Internet archive Wayback Machine, 2014 [14] Thành phần dinh dưỡng dâu tây, Vinmec International Hospital [15] George A Manganaris, Vlasios Goulas, Ariel R Vicente and Leon A Terry, Berry antioxidants : small fruits providing large benefits, Soc Chem Ind., 2013 94, p 825–833 Doi: 10.1002/jsfa.6432 [16] Global consumption of strawberries increases annually, Fresh plaza, 2018 [17] Mexico as the world’s leading strawberry exporter will face market challenges in the US, Chiapas News, 2020 [18] Food Chain Disruptions, FAO, 2020 [19] Anh Vũ, Trồng dâu tây Lâm Đồng, Trung tâm khuyến nông Lâm Đồng, Sở Nông nghiệp PTNT tỉnh Lâm Đồng [20] Phan Hậu, Trồng dâu tây ‘hái’ tiền, Diễn đàn Hội Liên Hiệp Thanh Niên Việt Nam [21] Xiang-rong Zheng, Cheng-long Liu, Mao-jiao Zhang, Xu-lan Shang, Sheng-zuo Fang, Fengmao Chen, First report of leaf blight of Cyclocarya paliurus caused by Nigrospora sphaerica in China, Crop Protection, 2021 140, p 105453 Doi: 10.1016/j.cropro.2020.105453 [22] Yuanyuan Hao, Janith V S Aluthmuhandiram, K W Thilini Chethana, Ishara S Manawasinghe, Xinghong Li, Mei Liu, Kevin D Hyde, Alan J L Phillips & Wei Zhang, Nigrospora Species Associated with Various Hosts from Shandong Peninsula, China, Mycobiology, 2020 48(3), p 169–183 Doi: 10.1080/12298093.2020.1761747 [23] M Wang, F Liu, P W Crous, and L Cai, Phylogenetic reassessment of Nigrospora: Ubiquitous endophytes, plant and human pathogens, Persoonia Mol Phylogeny Evol Fungi, 2017 39, p 118–142, 2017 Doi: 10.3767/persoonia.2017.39.06 [24] Cây dâu tây, Cẩm nang Cây trồng.com [25] John Hammel, Common Leaf Spot of Strawberry, Univ Wilconsin-Extension, 2013 2863(608), p 2863 [26] Fungal spots, blights, and blotches, Missouri Botanical Garden [27] Juliana S Baggio, James C Mertely, and Natalia A Peres, Leaf Spot Diseases of Strawberry, 60 EDIS, 2020 p 359 Doi: 10.32473/edis-pp359-2020 [28] Michelle Grabowski, Leaf spot diseases of trees and shrubs, University of Minnesota Extension, 2018 [29] H J M Pasindu Chamikara, Advanced Study on selected taxonomic groups of Bacteria and Archaea Actinomycetes, University of Kelaniya [30] B.G Eranga Thilina Jayashantha, Actinobacteria, University of Kelaniya, 2011 [31] M Sharma, P Dangi, and M Choudhary, Actinomycetes : Source , Identification and Their Applications, 2014 3(2), p 801-832 [32] Xạ khuẩn Streptomyces, Cleaner Production Centre [33] Qinyuan Li, Xiu Chen, Yi Jiang and Chenglin Jiang, Morphological Identification of Actinobacteria, Actinobacteria - Basics and Biotechnological Applications, 2016 p 58-86 Doi: 10.5772/61461 [34] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty, Giáo trình Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục, 2005 p 178–396 [35] Noraziah M Zin, Nurul I M Sarmin, Norazli Ghadin, Dayang F Basri, Nik M Sidik, W M Hess and Gary A Strobel, Bioactive endophytic streptomycetes from the Malay Peninsula, FEMS Microbiology Letters, 2007 274(1), p 83–88 Doi: 10.1111/j.1574- 6968.2007.00819.x [36] Keith F Chater, Recent advances in understanding Streptomyces, F1000Research, 2016 5(0), p 1–16 Doi: 10.12688/f1000research.9534.1 [37] Hotam Singh Chaudhary, Bhavana Soni, Anju Rawat Shrivastava, Saurabh Shrivastava, Diversity and versatility of actinomycetes and its role in antibiotic production, Madhav Institute of Technology & Science, 2013 3(8), p 83-94 Doi: 10.7324/JAPS.2013.38.S14 [38] Mustafa Oskay, A Üsame Tamer and Cem Azeri, Antibacterial activity of some actinomycetes isolated from farming soils of Turkey, African Journal of Biotechnology, 2004 3(9), p 441-446 Doi: 10.5897/ajb2004.000-2087 [39] Amena S., Vishalakshi N., Prabhakar M., Dayanand A., Lingappa K., Production, purification and characterization of L-asparaginase from Streptomyces gulbargensis, Brazilian Journal of Microbiology, 2010 41(1), p 173–178 Doi: 10.1590/S151761 83822010000100025 [40] Salma Mukhtar, Ahmad Zaheer, Dalaq Aiysha, Kauser Abdulla Malik and Samina Mehnaz, Actinomycetes: A Source of Industrially Important Enzymes, Journal of Proteomics Bioinformatics, 2017 10(12), p 316–319, 2017.Doi: 10.4172/jpb.1000456 [41] N M Zin, C S Loi, N M Sarmin and A N Rosli, Cultivation-Dependent Characterization of Endophy Actinomycetes, Research Journal of Microbiology, 2010 5(8), p 717–724 [42] Khưu Phương Yến Anh, Nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn lúa phân lập từ đất huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang, Tạp chí khoa học trường Đại học An Giang, 2019 11(3), p 72–82 [43] Rudi Emerson de Lima Procópio, Ingrid Reis da Silva, Mayra Kassawara Martins, Jỗo Lúcio de Azevedo, Janete Magali de Arẳjo, Antibiotics produced by Streptomyces, Brazilian Journal Infectious Diseases, 2012 16(5), pp 466–471 Doi: 10.1016/j.bjid.2012.08.014 [44] Lê Thị Hiền, Đinh Văn Lợi, Vũ Thị Vân, Nguyễn Văn Giang, Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) nấm bệnh cây, Tạp chí Khoa học Phát triển, 2014 12(5), p 656–664 [45] Benjaphorn Prapagdee, Chutima Kuekulvong and Skorn Mongkolsuk, Antifungal potential of extracellular metabolites produced by Streptomyces hygroscopicus against phytopathogenic fungi, International Journal of Biological Sciences, 2008 4(5), p 330–337 Doi: 10.7150/ijbs.4.330 [46] Zander R Human et al., Antifungal Streptomyces spp associated with the infructescences of Protea spp in South Africa, Frontiers in Microbiology, 2016 7, p 1-12 Doi: 10.3389/fmicb.2016.01657 [47] Dongli Liu, Rui Yan, Yansong Fu, Xiangjing Wang, Ji Zhang and Wensheng Xiang, Antifungal, Plant Growth-Promoting, and Genomic Properties of an Endophytic Actinobacterium Streptomyces sp NEAU-S7GS2, Frontiers Microbiology, 2019 10, p 1–16 Doi: 10.3389/fmicb.2019.02077 [48] Esteban A Veliz, Pilar Martínez-Hidalgo and Ann M Hirsch, Chitinase-producing bacteria and their role in biocontrol, AIMS Microbiology, 2017 3(3), pp 689–705 Doi: 10.3934/microbiol.2017.3.689 [49] Tamo Fukamizo, Chitinolytic Enzymes: Catalysis, Substrate Binding, and their Application, 62 Current Protein and Peptide Science, 2005 1(1), p 105–124 Doi: 10.2174/1389203003381450 [50] Hoàng Hải, Dư Ngọc Thành, Giáo trình vi sinh vật đại cương, Nhà xuất Nơng Nghiệp, 2008 pp 32–37 [51] Hồng Thị Hồng, Nguyễn Ngọc Phương, Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn từ rừng ngập mặn Cần Giờ kháng nấm Fusarium sp., Tạp chí Khoa học ĐHSP Tp HCM, 2013 51, p 59–71 [52] Jadon P , Dwivedi A., Singh C and Kumar A, Optimization of various physiochemical parameters to enhance production of secondary metabolite from soil actinomycetes against dermatophytes,” Environment Conservation Journal, 2019 20(1&2), p 35–40 Doi: 10.36953/ecj.2019.1008.1206 [53] Charu Singh, Ramendra Singh Parmar, Pragya Jadon and Ajay Kumar, Optimization of Cultural Conditions for Production of Antifungal Bioactive Metabolites by Streptomyces spp Isolated from Soil, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2017 6(2), p 386–396 Doi: 10.20546/ijcmas.2017.602.043 [54] Yajie Duan, Jian Chen, Wei He, Jingjing Chen, Zhencai Pang, Huigang Hu and Jianghui Xie, Fermentation optimization and disease suppression ability of a Streptomyces ma FS-4 from banana rhizosphere soil, BMC Microbiology, 2020 20(1), p 1–12 Doi: 10.1186/s12866019-1688-z [55] Ruth Chiamaka Osaro-Matthew, Francis Sopuruchukwu Ire and Nnenna Frank-peterside, Optimization of Nutritional Variables Using Response Surface Methodology for Enhanced Antifungal Metabolite Production by Janibacter sp RC18 from Turmeric Rhizosphere, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2020 9(4), p 284–302 Doi: 10.20546/ijcmas.2020.904.035 63 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM 64