Khảo sát đặc điểm đột biến gen a globin trong chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia tại viện huyết học truyền máu trung ương từ năm 2022 đến tháng 2 năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC DƯƠNG KHÁNH LINH KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN A-GLOBIN TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA THALASSEMIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ NĂM 2022 ĐẾN THÁNG NĂM 2023 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC DƯƠNG KHÁNH LINH KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN A-GLOBIN TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA THALASSEMIA TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ NĂM 2022 ĐẾN THÁNG NĂM 2023 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khóa: QH 2019.XN Người hướng dẫn: TS Dương Quốc Chính ThS.BSNT Nguyễn Minh Thu Hà Nội – 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Dương Quốc Chính – Giảng viên Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, TS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành đề tài khóa luận này, ln hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét quý báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn ThS BSNT Nguyễn Minh Thu – Khoa Di truyền Sinh học phân tử - Viện Huyết học Truyền máu Trung ương tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, cung cấp cho kiến thức, liệu, thông tin cần thiết, nhiệt tình góp ý, sẵn sàng giải đáp thắc mắc tạo điều kiện thuận lợi cho việc lập kế hoạch, triển khai hoàn thành khóa luận cách tốt Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương cho đề tài Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ quý thầy cô, anh chị bạn sinh viên làm việc thực tập Khoa Di truyền – Sinh học phân tử Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường, tồn thể thầy giáo Trường Đại học Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội truyền đạt cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2023 Dương Khánh Linh DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleotit ARN Acid ribonucleic ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate DPG Diphosphoglycerate FIL Filipino GAP - PCR GAP - Polymerase Chain Reaction (PCR khoảng cách) Hb Hemoglobin (Huyết sắc tố) HbCs Hemoglobin Constant Spring HbF Hemoglobin Fetal HbQs Hemoglobin Quong Sze HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) MCV Mean Corpuscular Volume (Thể tích trung bình hồng cầu) MCH Mean corpuscular Hemoglobin (Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MCHC Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu) MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NST Nhiễm sắc thể NGS Next generation sequencing (Giải trình tự hệ mới) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RDW Red Cell Distribution With (Dải phân bố hồng cầu) SEA South East Asian (Đông Nam Á) THAI Thái Lan ARMS – PCR Amplification-refractory mutation system DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số loại đột biến phổ biến bệnh alpha thalassemia .6 Bảng 3.1 Tuổi trung bình đối tượng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Đặc điểm tiền sử sản khoa thai phụ .24 Bảng 3.3 Đặc điểm siêu âm thai thời điểm xét nghiệm .25 Bảng 3.4 Kiểu gen thai phụ có nguy cao sinh mắc bệnh 26 Bảng 3.5 Đặc điểm huyết học theo kiểu gen thai phụ có nguy cao 26 Bảng 3.6 Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen alpha thalassemia thai phụ .27 Bảng 3.7 Các kiểu đột biến gen α globin phát thai nhi .29 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Đặc điểm phân bố đột biến gen bệnh alpha thalassemia giới Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Hemoglobin Hình 1.3 Cấu trúc cụm gen α-globin Hình 1.4 Mối quan hệ kiểu gen - kiểu hình bệnh αlpha thalassemia .7 Hình 1.5 Trẻ sơ sinh mắc hội chứng hemoglobin Bart's hydrops .8 Hình 1.6 Hồng cầu bất thường bệnh Thalassemia Hình 1.7 Cơ chế di truyền bệnh alpha thalassemia 11 Hình 1.8 Phát đột biến đoạn α3.7 GAP – PCR 13 Hình 1.9 Hình ảnh đột biến SEA/αα test α – Globin Strip Assay 14 Hình 1.10 Kết MLPA người lành mang đột biến -αHbCs 16 Hình Sơ đồ nghiên cứu .18 Hình 3.1 Phân bố nhóm tuổi đối tượng nghiên cứu 23 Hình 3.2 Tuổi thai làm xét nghiệm 24 Hình 3.3 Tỷ lệ thiếu máu thai phụ 25 Hình 3.4 Kết chẩn đốn trước sinh tế bào dịch ối thai nhi 28 Hình 3.5 Tỷ lệ loại alen đột biến thai nhi 30 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Định nghĩa đặc điểm dịch tễ bệnh alpha thalassemia 1.2 Cơ sở di truyền bệnh alpha thalassemia 1.2.1 Sinh lý hồng cầu 1.2.2 Đột biến gen gây bệnh alpha thalassemia 1.3 Mối liên quan kiểu gen kiểu hình 1.3.1 Bệnh phù thai hemoglobin Bart’s – thể nặng .7 1.3.2 Bệnh hemoglobin H – thể trung gian 1.3.3 Thể nhẹ thể ẩn 1.4 Đặc điểm cận lâm sàng .9 1.5 Quy luật di truyền 10 1.6 Tầm quan trọng chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia 11 1.7 Phương pháp xác định đột biến gen alpha thalassemia 12 1.7.1 GAP - PCR (GAP - Polymerase Chain Reaction) 12 1.7.2 Strip Assay .13 1.7.3 Giải trình tự Sanger 14 1.7.4 MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .17 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 17 2.2.2 Cỡ mẫu cách chọn mẫu .17 2.2.3 Tiến trình nghiên cứu .18 2.2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu .18 2.2.3.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 19 2.2.3.3 Các phương pháp kỹ thuật xét nghiệm .19 2.3 Các biến số số nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 22 2.5 Đạo đức nghiên cứu 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ 23 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu .23 3.1.1 Tuổi thai phụ 23 3.1.2 Tiền sử sản khoa thai phụ 24 3.1.3 Đặc điểm thai làm xét nghiệm .24 3.2 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng thai phụ có nguy cao sinh mắc bệnh alpha thalassemia 25 3.2.1 Tỷ lệ thiếu máu thai phụ 25 3.2.2 Kết xét nghiệm đột biến gen mẹ 26 3.2.3 Một số số huyết học thai phụ có nguy cao 26 3.3 Kết xét nghiệm đột biến gen α-globin từ bệnh phẩm nước ối thai phụ có nguy cao sinh mắc bệnh alpha thalassemia 28 3.3.1 Về số lượng đột biến gen thai nhi 28 3.3.2 Kiểu gen alpha thalassemia thai nhi 29 3.3.3 Số lượng alen đột biến thai nhi 30 CHƯƠNG BÀN LUẬN .31 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 31 4.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng thai phụ có nguy cao sinh mắc bệnh alpha thalassemia 33 4.3 Kết xét nghiệm đột biến gen thai nhi 37 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC khơng có khả tổng hợp chuỗi α globin Khi mức tổng hợp chuỗi α globin giảm 70%, chuỗi  globin tăng tổng hợp từ thời kỳ bào thai, tạo 4 Hb Bart’s, phát điện di hemgolobin giai đoạn sau sinh Những trường hợp có biểu lâm sàng bệnh phù thai Hb Bart’s, thai chết tử cung chết sau sinh, người mẹ có nguy tiền sản giật băng huyết sau sinh Thai phụ gia đình tư vấn ngừng thai nghén cho lần có thai tư vấn bệnh lý alpha thalassemia giải pháp cho lần có thai sau tùy thuộc vào tiền sử sản khoa gia đình Tỷ lệ thai bị phù thai Hb Bart’s cho lần có thai gia đình 25% theo quy luật di truyền Khuyên thai phụ chồng nên chọc ối chẩn đoán bệnh thalassemia sớm lần có thai sau Giải pháp giúp chẩn đoán sớm kiểu gen thai để xử trí sớm, khơng giúp dự phịng để không sinh trẻ mang đột biến gen thể nặng Theo nghiên cứu quốc tế, hầu hết trường hợp thai chẩn đoán xác định mắc Hb Bart’s có định đình thai nghén gia đình có nguyện vọng Chỉ có số trường hợp thai truyền máu từ tử cung giai đoạn sớm sau chẩn đoán mắc Hb Bart’s đồng hợp tử 0, có hội sinh mà khơng bị phù thai Theo báo cáo quốc tế Duantida Songdej cộng năm 2017, có 69 bệnh nhân sống sót với hội chứng phù thai Hb Bart’s cải tiến can thiệp tử cung chăm sóc tích cực thời kì mang thai Tuy vậy, việc khơng mang lại hiệu tăng trưởng phát triển hệ thần kinh nên bệnh nhân có biểu chậm tăng trưởng bất thường hệ thống thần kinh [28] Một giải pháp hiệu để không mang thai bị kiểu gen đồng hợp tử đột biến 0-thalassemia làm thụ tinh ống nghiệm với phơi chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi Q trình phức tạp có chi phí tốn hai vợ chồng phải làm thụ tinh ống nghiệm sinh thiết phơi để chẩn đốn loại trừ phơi mang bệnh thalassemia, sau chuyển phơi vào tử cung người vợ 24 trường hợp lại mang kiểu gen dị hợp tử SEA (21 trường hợp) α3.7 (3 trường hợp) biểu kiểu hình alpha thalassemia thể nhẹ thể ẩn, trường hợp dị hợp tử kép SEA α3.7/αCsa THAI a3.7a biểu kiểu hình bệnh HbH Những trường hợp tư vấn tiếp tục theo dõi thai kỳ khơng cần ngừng thai nghén nhiều nghiên cứu khơng tìm thấy mối tương quan kiểu hình bệnh HbH phụ thuộc truyền máu kiểu gen bệnh Đồng thời, nên tư vấn cho gia đình có mang kiểu gen dị hợp tử SEA, α3.7 α4.2 sau sàng lọc bệnh thalassemia tiền hôn nhân sàng lọc trước sinh 38 4.3.3 Tỷ lệ loại alen đột biến thai nhi Trong nghiên cứu, thai nhi 56 thai phụ tiến hành khảo sát loại đột biến đoạn gen α-globin phổ biến Việt Nam bao gồm: SEA, THAI, -α3.7, α4.2, aCs, aQs Viện huyết học - Truyền máu Trung ương Kết khảo sát ghi nhận 39 trường hợp (69,7%) thai nhi có mang đột biến gen alpha globin với tổng số 54 alen đột biến Trong đó, xuất loại alen đột biến phổ biến Đông Nam Á đột biến SEA 79,6%, đột biến -a3.7với 14,8%, đột biến aCs với 3,7% đột biến THAI vó tỷ lệ 1,9% alen có đột biến (Hình 3.5) Kết tương đồng với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Hà (2017) với tỷ lệ alen đột biến SEA (70,9%), aCs (15,0%), a3.7 (10,2%) Như vậy, alen đột biến thường gặp SEA Nghiên cứu ghi nhận trường hợp mang đột biến đoạn hai gen THAI không phát đột biến a4.2 Theo tác giả Bùi Thị Kim Lý, tỷ lệ đột biến THAI miền Nam Việt Nam tương đối thấp với 0,6%, a4.2 2,41% [55] Điều cho thấy đột biến đoạn THAI -a4.2 không phổ biến Việt Nam Vì thế, với cỡ mẫu cịn hạn chế 56 đối tượng nghiên cứu phát thấy trường hợp đột biến THAI không phát đột biến a4.2 39 KẾT LUẬN Về số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng thai phụ có nguy cao sinh mắc bệnh alpha thalassemia Thai phụ được thực chọc ối thời điểm 16-20 tuần thai, đa số tuần thai 16 (71,5%) Siêu âm thai tuần thai 12 chưa phát bất thường phù thai Hb Bart’s mà thời điểm chủ yếu phát bất thường hình thái thai nhi mà phần lớn liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Kết xét nghiệm đột biến gen thai phụ: hầu hết thai phụ mắc alpha thalassemia thể nhẹ, chủ yếu mang kiểu gen dị hợp tử SEA (46 trường hợp) Tỷ lệ thiếu máu thai phụ 62,5%, hầu hết thiếu máu vừa nhẹ (97,2%) Số lượng hồng cầu trung bình nhóm chung, thể ẩn thể nhẹ nằm giới hạn bình thường Các số thể tích trung bình hồng cầu (MCV) thai phụ