Đánh giá đặc điểm nhiễm sắc thể philadelphia ở bệnh nhân lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt tại viện huyết học – truyền máu trung ương từ 2022 đến tháng 2 năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THANH HIỂU ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI KINH DÒNG BẠCH CẦU HẠT TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ 2022 ĐẾN THÁNG NĂM 2023 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ THANH HIỂU ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI KINH DÒNG BẠCH CẦU HẠT TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ 2022 ĐẾN THÁNG NĂM 2023 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khóa: QH.2019.Y Người hướng dẫn: TS Dương Quốc Chính ThS.BSNT Nguyễn Minh Thu Hà Nội - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Dương Quốc Chính - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, TS Phạm Thị Hồng Nhung - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành đề tài khóa luận này, ln hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét q báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn ThS.BSNT Nguyễn Minh Thu - Khoa Di truyền Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương ln tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, cung cấp cho kiến thức, liệu, thơng tin cần thiết, nhiệt tình góp ý, sẵn sàng giải đáp thắc mắc tạo điều kiện thuận lợi cho việc lập kế hoạch, triển khai hồn thành khóa luận cách tốt Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn giúp đỡ, cho phép Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương thực đề tài viện Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ quý thầy cô, anh chị bạn sinh viên làm việc thực tập Khoa Di truyền - Sinh học phân tử Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường, toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội truyền đạt cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2023 Nguyễn Thị Thanh Hiểu DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT (-) Âm tính (+) Dương tính BCR-ABL Breakpoint cluster region - Abelson leukemia virus CML Chronic Myeloid Leukemia DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine tetraacetic) FISH Fluorescence in situ hybridization Kb kilobase (=1000 bp) LXM Lơ xê mi LXMKDH Lơ xê mi kinh dòng hạt MRD Minimal residual disease NST Nhiễm sắc thể NST Ph Nhiễm sắc thể Philadelphia PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic Acid RQ-PCR Realtime quantitative - Polymerase chain reaction RT-PCR Reverse transcriptase - Polymerase chain reaction SHPT Sinh học phân tử DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.1 Tuổi bệnh nhân 24 Bảng 3.2 Kết xét nghiệm NST Ph 25 Bảng 3.3 Tỷ lệ kiểu bất thường di truyền tế bào bệnh nhân LXMKDH kỹ thuật NST đồ 26 Bảng 3.4 Đặc điểm NST Ph không điển hình bệnh nhân LXMKDH 27 Bảng 3.5 Đặc điểm NST Ph kèm theo bất thường NST khác bệnh nhân LXMKDH 27 Bảng 3.6 Kết phát gen BCR-ABL 31 Bảng 3.7 Tỷ lệ dạng gen BCR-ABL 31 Bảng 3.8 So sánh kết xét nghiệm gen BCR-ABL với NST Ph 32 Bảng 4.1 So sánh tỷ lệ nam/nữ theo số tác giả 34 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh CML Hình 1.2 Chuyển đoạn tương hỗ t(9;22)(q34;q11) Hình 1.3 Gen hỗn hợp BCR-ABL 10 Hình 1.4 Nhiễm sắc thể đồ bệnh nhân LXMKDH có NST Ph điển hình 12 Hình 1.5 Chuyển vị phức tạp t(9;6;19;22) bệnh nhân LXMKDH 12 Hình 1.6 Kĩ thuật FISH giúp phát tổ hợp gen BCR-ABL 13 Hình 1.7 Liên quan mức độ đáp ứng với nồng độ BCR-ABL 16 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi 24 Hình 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính 25 Hình 3.3 Karyotype 46,XY,t(9;22)(q34;q11) 29 Hình 3.4 Kết NST đồ bệnh nhân LXMKDH có NST Ph khơng điển hình 30 Hình 3.5 Kết NST đồ bệnh nhân LXMKDH có NST Ph kèm theo bất thường nhiễm sắc khác 30 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUÁT VỀ BỆNH LƠ XÊ MI KINH DÒNG BẠCH CẦU HẠT 1.1.1 Khái quát chung bệnh Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt 1.1.2 Dịch tễ học bệnh LXMKDH 1.1.3 Biểu lâm sàng bệnh LXMKDH 1.1.3.1 Giai đoạn mạn tính 1.1.3.2 Giai đoạn tăng tốc 1.1.3.3 Giai đoạn chuyển cấp 1.1.4 Biểu cận lâm sàng bệnh LXMKDH 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh 1.1.5.1 Nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph) 1.1.5.2 Gen hỗn hợp BCR-ABL 1.1.5.3 Protein P210 BCR-ABL 11 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NST Ph VÀ BẢN SAO BCRABL Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI KINH DÒNG BẠCH CẦU HẠT 11 1.2.1 Phương pháp Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype) 11 1.2.2 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ (Fluorescence in situ hybridization - FISH) 13 1.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 14 1.2.4 Multiplex PCR 15 1.2.5 RT-PCR (Reverse transcriptase - Polymerase chain reaction) 15 1.2.6 RQ-PCR (Real time quantitative - Polymerase chain reaction) 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 17 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 17 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 17 2.3 VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Bệnh phẩm 17 2.3.2 Dụng cụ, trang thiết bị 18 2.3.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị cho xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ 18 2.3.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị cho xét nghiệm PCR 18 2.3.3 Hóa chất 19 2.3.3.1 Hóa chất cho xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ 19 2.3.3.2 Hóa chất cho xét nghiệm PCR 19 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 19 2.4.2 Cỡ mẫu 19 2.4.3 Các biến số, số nghiên cứu 20 2.4.4 Quy trình nghiên cứu 21 2.4.5 Các kĩ thuật xét nghiệm sử dụng nghiên cứu 22 2.4.5.1 Xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ 22 2.4.5.2 Xét nghiệm PCR 22 2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ, PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 22 2.6 ĐẠO ĐỨC Y HỌC 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ 24 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA BỆNH NHÂN 24 3.1.1 Tuổi 24 3.1.1.1 Tuổi trung bình 24 3.1.1.2 Phân bố nhóm tuổi 24 3.1.2 Giới 25 3.2 ĐẶC ĐIỂM NST Ph CỦA BỆNH NHÂN DỰA TRÊN KẾT QUẢ CỦA XÉT NGHIỆM NST ĐỒ 25 3.3 KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM PCR XÁC ĐỊNH GEN BCR-ABL 31 3.4 SO SÁNH KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CỦA HAI PHƯƠNG PHÁP NST ĐỒ VÀ PCR 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 33 4.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA BỆNH NHÂN 33 4.1.1 Tuổi bệnh nhân 33 4.1.2 Giới tính bệnh nhân 33 4.2 ĐẶC ĐIỂM NST Ph CỦA BỆNH NHÂN DỰA TRÊN KẾT QUẢ CỦA XÉT NGHIỆM NST ĐỒ 34 4.3 KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM PCR XÁC ĐỊNH GEN BCR-ABL 36 4.4 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CỦA HAI PHƯƠNG PHÁP NST ĐỒ VÀ PCR 37 KẾT LUẬN 39 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt (LXMKDH) (Chronic Myeloid Leukemia - CML) bệnh lý ác tính hệ tạo máu đặc trưng tăng sinh mức dịng bạch cầu hạt, biệt hóa nhiều chất lượng khơng bình thường: số lượng bạch cầu tăng cao máu ngoại vi tủy xương, công thức bạch cầu gặp đủ lứa tuổi từ non đến già dòng bạch cầu hạt [1] LXMKDH chiếm khoảng 3% tổng số ung thư toàn giới chiếm khoảng 20% bệnh bạch cầu người lớn [2] Tỷ lệ mắc hàng năm vào khoảng 0,7-1,0/100.000 người Tỷ lệ mắc bệnh tăng lên theo độ tuổi bệnh xảy lứa tuổi chiếm tỷ lệ cao từ 3060 tuổi Bệnh phổ biến nam giới với tỷ lệ nam/nữ 1,2-1,7 [3] Vào năm 2020, ước tính có khoảng 8450 trường hợp mắc LXMKDH chẩn đoán Hoa Kỳ khoảng 1080 bệnh nhân tử vong [4] Bệnh diễn biến qua ba giai đoạn giai đoạn mạn tính, tăng tốc chuyển cấp Thời gian từ chẩn đoán giai đoạn mạn tính đến chuyển thành LXM cấp bệnh nhân LXMKDH 3-5 năm, trung bình 42 tháng Nếu bệnh nhân khơng chẩn đốn điều trị kịp thời bệnh nhanh chóng chuyển sang giai đoạn cấp, bệnh nhân thường sống thêm khoảng thời gian ngắn, trung bình khoảng tháng chuyển cấp dòng tủy khoảng tháng chuyển cấp dòng lympho Khi chuyển sang giai đoạn cấp bệnh nhân phải sử dụng đa hóa trị liệu kết hợp với hồi sức huyết học tích cực [5] Điều ảnh hưởng đến chất lượng sống bệnh nhân trở thành gánh nặng kinh tế cho gia đình xã hội phải chịu chi phí điều trị tốn LXMKDH bệnh lý ác tính nhà nghiên cứu quan tâm nhiều, phần có chế bệnh sinh điển hình Một biến đổi nhiễm sắc thể LXMKDH đặc trưng, nhiễm sắc thể Philadelphia (NST Ph), kết chuyển vị nhánh dài NST băng q34 nhánh dài NST 22 băng q11 tạo hỗn hợp gen BCR-ABL mà exon gen ABL 9q34 thay exon đầu 5’ gen BCR Gen hỗn hợp BCR-ABL tạo thành mã hóa tổng hợp protein BCR-ABL, có hoạt tính tyrosin kinase nội sinh mạnh Sự ảnh hưởng protein BCR-ABL tới đường truyền tín hiệu tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Văn Nam Nghiên cứu số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh LXMKDH giai đoạn tăng tốc Khóa luận tốt nghiệp Bác sĩ Y khoa, Trường Đại học Y Hà Nội 2013 Cao Sỹ Luân, Nguyễn Hữu Nhân, Huỳnh Thị Bích Huyền Khảo sát bất thường nhiễm sắc thể bệnh bạch cầu mạn dịng tủy Tạp chí nghiên cứu y học 2021;7:52-53 Höglund M, Sandin F, Simonsson B Epidemiology of chronic myeloid leukaemia: an update Ann Hematol 2015;94 Suppl 2:S241-247 Jabbour E, Kantarjian H Chronic myeloid leukemia: 2020 update on diagnosis, therapy and monitoring American Journal of Hematology 2020;95(6):691-709 Nguyễn Ngọc Dũng Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm, phân loại kết điều trị công Lơ xê mi cấp chuyển từ Lơ xê mi kinh dòng hạt Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 2015 Lê Quý Châu Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt Bệnh Học Nội Khoa Tập Nhà xuất Y học; 2012 Minciacchi VR, Kumar R, Krause DS Chronic Myeloid Leukemia: A Model Disease of the Past, Present and Future Cells 2021;10(1):117 Bennour A, Saad A, Sennana H Chronic myeloid leukemia: Relevance of cytogenetic and molecular assays Crit Rev Oncol Hematol 2016;97:263-274 Druker BJ Translation of the Philadelphia chromosome into therapy for CML Blood 2008;112(13):4808-4817 10 Phù Chí Dũng Đánh giá hiệu Nilotinib người bệnh bạch cầu mạn dịng tủy giai đoạn mạn đề kháng khơng dung nạp với Imatinib Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 2020 11 Nguyễn Trường Sơn, Bùi Lê Cường, Nguyễn Thị Bé Út cộng Bước đầu đánh giá hiệu Imatinib (Glivec) điều trị bạch cầu mạn dòng tủy Ph (+) Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2011-2012 Tạp chí nghiên cứu y học 2013;3:50-51 12 Emole J, Talabi T, Pinilla-Ibarz J Update on the management of Philadelphia chromosome positive chronic myelogenous leukemia: role of nilotinib Biologics 2016;10:23-31 13 Đỗ Trung Phấn Lơ xê mi kinh dòng hạt Bài giảng Huyết học- Truyền máu Nhà xuất Y học 2006:148-151 14 Eden RE, Coviello JM Chronic Myelogenous Leukemia In: StatPearls StatPearls Publishing; 2023 Accessed May 21, 2023 15 Smith DL, Burthem J, Whetton AD Molecular pathogenesis of chronic myeloid leukaemia Expert Rev Mol Med 2003;5(27):1-27 16 van der Plas DC, Hermans AB, Soekarman D, et al Cytogenetic and molecular analysis in Philadelphia negative CML Blood 1989;73(4):1038-1044 17 Faderl S, Talpaz M, Estrov Z, O’Brien S, Kurzrock R, Kantarjian HM The biology of chronic myeloid leukemia N Engl J Med 1999;341(3):164-172 18 Cortes JE, Talpaz M, Giles F, et al Prognostic significance of cytogenetic clonal evolution in patients with chronic myelogenous leukemia on imatinib mesylate therapy Blood 2003;101(10):37943800 19 Zhou T, Medeiros LJ, Hu S Chronic Myeloid Leukemia: Beyond BCRABL1 Curr Hematol Malig Rep 2018;13(6):435-445 20 Inokuchi K Chronic myelogenous leukemia: from molecular biology to clinical aspects and novel targeted therapies J Nippon Med Sch 2006;73(4):178-192 21 Nguyễn Quốc Thành Đánh giá kết Imatinib Mesylate điều trị bệnh Bạch cầu mạn dòng tủy giai đoạn mạn trẻ em Luận án Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 2020 22 Ujjan ID, Akhund AA, Saboor M, Qureshi MA, Khan S Cytogenetic and Molecular Analyses of Philadelphia Chromosome Variants in CML (chronic myeloid leukemia) Patients from Sindh using Karyotyping and RT-PCR Pak J Med Sci 2015;31(4):936-940 23 Manaflouyan Khajehmarjany S, Rahmani SA, Chavoshi SH, Esfahani A, Movassaghpour Akbari AA Reliability Evaluation of Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and G-Banding on Bone Marrow and Peripheral Blood Cells in Chronic Myelogenous Leukemia Patients Cell J 2015;17(1):171-180 24 Trịnh Văn Bảo Phản Ứng Chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction PCR) Di Truyền Y Học Nhà xuất Giáo dục Việt Nam; 2011 25 Nguyễn Thị Kim Định, Phan Thị Xinh Ứng dụng kỹ thuật Multiplex RT-PCR khảo sát kiểu BCR/ABL Bệnh viện Truyền máu Huyết học Tạp chí nghiên cứu y học 2013;17:2 26 Haferlach C, Rieder H, Lillington DM, et al Proposals for standardized protocols for cytogenetic analyses of acute leukemias, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic myeloproliferative disorders, and myelodysplastic syndromes Genes Chromosomes Cancer 2007;46(5):494-499 27 Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results Blood 2006;108(1):28-37 28 Trần Văn Bé Lơ xê mi kinh dòng hạt Lâm sàng Huyết học Nhà xuất Y học 1998:143 29 Phạm Ngọc Hà Nghiên cứu số đặc điểm huyết học đột biến gen bệnh nhân Lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt kháng thuốc ức chế hoạt tính Tyrosine kinase Viện Huyết học - Truyền máu Trung uơng giai đoạn 2015-2016 Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 2019:37 30 Rabinowitz I, Larson R Chronic Myeloid Leukemia Wintrobe’s Clinical Hematology, Lippincott Williams and Wilkins 2004:2235-2258 31 Agarwal MB, Agarwal UM, Rathi SS, Masurkar S, Zaveri B Report of chronic myeloid leukemia in chronic phase from Ashirwad Hematology Centre, Mumbai, 2002-2009 Indian J Med Paediatr Oncol 2013;34(3):199-203 32 Paramita DK, Hutajulu SH, Syifarahmah A, et al BCR-ABL Gene Transcript Types of Patients with Chronic Myelogenous Leukemia in Yogyakarta, Indonesia Asian Pac J Cancer Prev 2020;21(6):15451550 33 Nguyễn Ngọc Dũng Nghiên cứu số đặc điểm lâm sàng huyết học lơ xê mi cấp chuyển từ lơ xê mi kinh dòng hạt Luận văn Thạc sĩ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội 2006 34 Kumar S, Gupta VK, Bharti A, Meena LP, Gupta V, Shukla J A study to determine the clinical, hematological, cytogenetic, and molecular profile in CML patient in and around Eastern UP, India J Family Med Prim Care 2019;8(7):2450-2455 35 Asif M, Hussain A, Wali A, et al Molecular, Cytogenetic, and Hematological Analysis of Chronic Myeloid Leukemia Patients and Discovery of Two Novel Translocations Anal Cell Pathol (Amst) 2021;2021:4909012 36 Nguyễn Thiên Lữ Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định bất thường gen đặc trưng bệnh lơ xê mi kinh dòng bạch cầu hạt người lớn Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương Luận văn Bác sỹ Nội trú Bệnh viện 2007 37 Marzocchi G, Castagnetti F, Luatti S, et al Variant Philadelphia translocations: molecular-cytogenetic characterization and prognostic influence on frontline imatinib therapy, a GIMEMA Working Party on CML analysis Blood 2011;117(25):6793-6800 38 Alhuraiji A Prognostic signficance of addtional chromosomal aNBormalities at the time of diagnosis in patients with chronic myeloid leukemia treated with frontline tyrosine kinase inhibitors Am J Hematol 2018;93:84-90 39 Ben-Neriah Y, Daley GQ, Mes-Masson AM, Witte ON, Baltimore D The chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the product of the bcr/abl hybrid gene Science 1986;233(4760):212-214 40 Mantzourani M Prognostic Significance of the type BCR-ABL transcript in chronic myelogenous leukemia British Journal of Haematology 1996;6:70-72 41 Marmont A Recurrence of Ph1-positive leukemia in donor cells after marrow transplantation for chronic granulocytic leukemia The New England Journal of Medicine 1984;9:903-905 42 Yaghmaie M, Ghaffari SH, Ghavamzadeh A, et al Frequency of BCRABL fusion transcripts in Iranian patients with chronic myeloid leukemia Arch Iran Med 2008;11(3):247-251 43 Rerkamnuaychoke B, Kangwanpong D, Jootar S, Puranakanitstha C Detection of BCR/ABL fusion gene in CML: a preliminary report Southeast Asian J Trop Med Public Health 1995;26 Suppl 1:197-200 44 Ganesan TS, Rassool F, Guo AP, et al Rearrangement of the bcr gene in Philadelphia chromosome-negative chronic myeloid leukemia Blood 1986;68(4):957-960 45 Fitzerald P, Beard M, Morris C Ph- negative myeloid leukaemia British Journal of Haematology 1987;66:311-314 46 Smith J, Heerema N, Provisor A Leukaemic transformation of engrafled bone marrow cells British Journal of Haematology 1985;60:415-422 PHỤ LỤC Phụ lục Quy trình xét nghiệm NST đồ Ni cấy Bước Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Rã đông môi trường nuôi cấy 370C Bước Đếm số lượng tế bào: Ly tâm 1000 vòng/phút phút lấy lớp buffy-coat cho vào ml môi trường trộn đếm số lượng tế bào tủy hỗn dịch Tính tốn số lượng tế bào cho vào chai ni cấy cho số lượng tế bào đạt từ 1- 4x106 tế bào/ml môi trường nuôi cấy Bước Chuẩn bị chai nuôi cấy: Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch Trong chai nuôi cấy cho 10 ml môi trường nuôi cấy Bước Nuôi cấy tế bào: Nhỏ lượng tế bào tính tốn vào chai ni cấy chuẩn bị Lắc nhẹ cho mẫu tan vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm tủ ấm 37°C, 5% CO2/24 Thu hoạch Bước Nhỏ colcemide: Sau 24 cho vào chai ni cấy 50 µl dung dịch colcemide 0,01% (10 µg/ml), đặt lại tủ ấm 15 phút Bước Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ: Bật tủ ấm 37 0C, làm ấm dung dịch KCL 0,075M (số lượng đủ ml/mẫu); Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: methanol : acid acetic; Chuẩn bị ống falcon 15 ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy Bước Chuyển tồn huyền dịch chai ni cấy vào ống falcon 15 ml, ly tâm máy ly tâm ngang 1000 vòng/phút phút Bước Sau ly tâm hút bỏ phần dịch trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt cặn tế bảo khoảng mm) Bước Cho thêm 8ml dung dịch nhược trương để ấm 37 0C vào ống ly tâm, trộn nhẹ vài lần ủ bể ấm 370C 18 phút Bước 6: Sau ủ 18 phút cho thêm vào ống 0,5-1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5-10 phút Bước Lấy ống ly tâm lấy cặn, hút bỏ dịch phía Cho thêm vào ống 10 ml dung dịch carnoy trộn để nhiệt độ phòng 10 phút Bước Lập lại bước đến cặn tế bào trắng Tái huyền dịch carnoy Nhỏ tiêu + Các lam kính rửa ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô + Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau lấy để nghiêng 20-300 giấy thấm + Nhỏ giọt truyền dịch vừa pha lên lam kính Chú ý nhỏ tiêu để đầu pipet cao mặt làm kính từ 10-20 cm + Để tiêu khơ tự nhiên trước nhuộm Lưu ý: Trong trường hợp cịn huyền dịch lưu vào ống eppendorf để nhỏ thêm tiêu cần Nhuộm Giemsa + Pha Giemsa 10% từ Giemsa mẹ + Nhuộm tiêu 5-10 phút + Rửa vịi nước + Sấy khơ tủ sấy 60°C Nhuộm băng G + Chuẩn bị tiêu bản: Tiêu sau thu hoạch cho vào tủ sấy 5060oC 24 để khô tự nhiên ngày trở lên + Chuẩn bị hóa chất :  Cốc 1: Pha 0,05 g trypsin bột vào 50 ml nước muối 0,9%  Cốc 2: 100 ml FBS 2%  Cốc 3: Nước muối 0,9%  Cốc 4: Nước muối 0,9%  Cốc 5: Pha Giemsa 10% đệm pH 6,8  Cốc 6: Đệm pH 6,8 + Tiến hành kĩ thuật:  Nhúng tiêu cốc từ 1-2 phút  Chuyển sang cốc 2: 30 giây  Chuyển sang cốc 3: 15 giây  Chuyển sang cốc 4: 15 giây  Chuyển sang cốc 5: 10 giây  Chuyển sang cốc 6: 15 giây  Rủa vòi nước chảy Nhận định kết quả: Tiêu nhuộm Giemsa băng G, số lượng cấu trúc cặp nhiễm sắc thể khảo sát kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần phân tích phần mềm chuyên dụng Đối với bệnh nhân, phân tích 20 NST để phát bất thường số lượng cấu trúc NST Phụ lục Quy trình xét nghiệm Multiplex PCR xác định gen BCR-ABL Tách chiết RNA tổng số hạt từ: Sử dụng Mag-Bind Total RNA kit (hãng Omega Bio-tek) theo quy trình khuyến cáo hãng Bước Tách bạch cầu ly giải theo quy trình Lưu ý: µl cặn bạch cầu ly giải OTRK gồm: (450 µl OTRK Lysis Bufer+ 20 µl Proteinase K)/mẫu Bước Ly tâm dung dịch bạch cầu ly giải 4000g phút Bước Chuẩn bị dung dịch Mag-Bind Mix gồm: (20 µl Mag-Bind Particles CNR + 300 µl EtOH 100%) x Số mẫu Bước Chuẩn bị dung dịch DNase Mix gồm: + 100 µl RNA Elution Buffer + 50 µl DNase Digestion Bufer x Số mẫu + µl Mag-Bind DNase I Bước Chuẩn bị plate bổ sung hóa chất theo hướng dẫn sau: Tên plate Thực Thêm 320 µl Mag-Bind Mix (ở bước 3) Lysate Thêm 350 µl dịch dung dịch bạch cầu ly giải (ở bước 2) DNase Digestion Thêm 150 µl DNase Mix (ở bước 4) VHB Wash Thêm 400 µl VHB Wash Buffer RWB II-1 Thêm 400 µl RNA Wash Bufer II RWB II-2 Thêm 400 µl RNA Wash Bufer II RWB II-3 Thêm 400 µl RNA Wash Bufer II Elution Tipcomb Thêm 90 µl RNA Elution Buffer Tipcomb Bước Chạy chương trình Leukocyte_RNA_M6731_v21 máy KingFisher Plex Bước Lần lượt đưa plate vào máy theo thứ tự yêu cầu Bước Khi máy tạm dừng, thêm vào giếng plate DNase Digestion hóa chất sau: 150 µl PHM Buffer, 400µl RNA Wash Buffer II Bước Chuẩn bị ống 1,5 ml ghi mã số xét nghiệm lên thành nắp ống Bước 10 Khi máy kết thúc, hút dung dịch RNA vào ống 1,5 ml tương ứng Pha hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2X Reaction Mix, Primer mix, Tap Platium, RNA Tương tự, đặt test cho chứng dương, test cho chứng âm H2O Thực phản ứng PCR: Mở máy PCR đặt ống chứa mẫu vào máy vị trí tương ứng với plate hình (cài đặt chu trình nhiệt 450-30 phút, 94oC-1phút, 57 oC-50 giây, 72 oC-50 giây x35, 72 oC-8 phút) Điện di kiểm tra sản phẩm: Sản phẩm phản ứng PCR điện di thạch Agarose 2% với thời gian điện di 100V/40 phút Chiếu tia sáng UV, đoạn DNA nhuộm màu thành băng tương ứng chụp Kết dương tính biểu kích thước băng tương ứng với kiểu hỗn hợp gen BCR-ABL Phụ lục Hồ sơ nghiên cứu I Thơng tin hành Họ tên:……………………………………………… Mã số lưu: Năm sinh:……………………………………………….Giới tính: Địa chỉ:………………………………………………………………………… Ngày nhập viện lần đầu:……………………… II Tiền sử - Tiền sử chẩn đoán, điều trị bệnh ác tính: Có Khơng - Mắc bệnh khác thuộc hội chứng tăng sinh tủy ác tính (đa hồng cầu, xơ tủy, tăng tiểu cầu tiên phát): Có Khơng III Kết XN Xét nghiệm huyết đồ, tủy đồ: - Dựa vào kết XN huyết đồ, tủy đồ bệnh nhân chẩn đoán mắc LXMKDH: Có Khơng - Giai đoạn bệnh: Mạn Tăng tốc Chuyển cấp Xét nghiệm NST đồ: NST Ph (+) - Kiểu bất thường NST đơn dòng : + NST Ph điển hình Karyotype: + NST Ph khơng điển hình Karyotype: + NST Ph kèm theo bất thường NST khác Karyotype: - Kiểu bất thường NST đa dòng: + NST Ph khơng điển hình/NST Ph khơng điển hình kèm theo bất thường NST khác Karyotype: + NST Ph/NST Ph kèm theo với bất thường NST khác Karyotype: + NST bất thường/NST Ph kèm theo bất thường NST khác Karyotype: NST Ph (-) Xét nghiệm PCR xác định gen BCR-ABL Gen BCR-ABL (+): Major BCR-ABL Gen BCR-ABL (-) a j o r B C R A B L a minor BCR-ABL j o r B C R A B L a j o r B C R A B L DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 MÃ NC CML1 CML2 CML3 CML4 CML5 CML6 CML7 CML8 CML9 CML10 CML11 CML12 CML13 CML14 CML15 CML16 CML17 CML18 CML19 CML20 CML21 CML22 CML23 CML24 CML25 CML26 CML27 CML28 CML29 CML30 CML31 CML32 CML33 CML34 Họ tên PHẠM VĂN Y BÙI THỊ T PHẠM VĂN P NGUYỄN ĐỨC D NGUYỄN THỊ P NGUYỄN THANH H LÊ ĐỨC T THÁI THỊ C BÙI MẠNH H TRỊNH QUANG T NƠNG ĐÌNH P PHẠM VĂN N HỒ QUANG T HOÀNG VĂN T VŨ THỊ H DƯƠNG THỊ M BÙI THỊ PHƯƠNG Đ BÙI QUỐC Đ ĐỖ NGỌC S NGUYỄN THỊ S NGUYỄN HƯƠNG T TRẦN VĂN T ĐINH THỊ T NGUYỄN VĂN C ĐẶNG THỊ L VŨ ĐÌNH T TRẦN THỊ S NGUYỄN THỊ L HỒNG THỊ N LẠI THỊ M PHẠM THỊ T TRẦN VĂN P NGUYỄN ĐĂNG H PHẠM THỊ Y Giới tính M F M M F M M F M M M M M M F F F M M F F M F F F M F F F F F M M F Năm sinh 1955 1979 1992 1986 1985 1996 1995 1980 1986 1971 1958 1988 1971 1982 1995 1966 1971 1974 1971 1959 2003 1939 1942 1975 1955 1983 1963 1973 1998 1974 1973 1995 1987 1968 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 CML35 CML36 CML37 CML38 CML39 CML40 CML41 CML42 CML43 CML44 CML45 CML46 CML47 CML48 CML49 CML50 CML51 CML52 CML53 CML54 CML55 CML56 CML57 CML58 CML59 CML60 CML61 CML62 CML63 CML64 CML65 CML66 CML67 CML68 CML69 CML70 CML71 ĐÀO ĐỨC G GIÁP VĂN H TRẦN VĂN Đ NGUYỄN VĂN B NGUYỄN THỊ X NGUYỄN THỊ M NGUYỄN THỊ N CAO VĂN S HÀ TRỌNG H NGUYỄN MINH K NGUYỄN THU D ĐẶNG KHẮC T BÀN VĂN T BÙI THỊ N NGUYỄN ĐÌNH H NGUYỄN VĂN Q LÙ VĂN V PHÙNG VĂN H BẠCH DUY Đ NGUYỄN THỊ M ĐINH VĂN Đ CHU THỊ H VŨ VĂN L BÙI VĂN K NGUYỄN THỊ H NGUYỄN THỊ S NGUYỄN THỊ T NGUYỄN VĂN T PHÀN XÀNH H NGÔ XUÂN T GIÁP VĂN Đ HÀ DUYÊN T NGUYỄN VĂN Đ PHAN THỊ M KIM THỊ H NGUYỄN THỊ G NGUYỄN THỊ S M M M M F F F M M M F M M F M M M M M M M F M M F F F M M M M M M F F F F 1978 1976 1938 1974 1945 1952 1982 1938 2002 1966 2001 1955 1973 1979 1969 1989 1976 1975 1972 1982 1961 1961 1974 1965 1961 1950 1982 1989 1975 1952 1985 1966 1995 1947 1966 1949 1957 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 CML72 CML73 CML74 CML75 CML76 CML77 CML78 CML79 CML80 CML81 CML82 CML83 CML84 CML85 CML86 CML87 CML88 CML89 CML90 CML91 CML92 CML93 CML94 CML95 CML96 CML97 CML98 CML99 CML100 CML101 CML102 CML103 CML104 CML105 CML106 CML107 NGUYỄN HỒNG A NGUYỄN THỊ Q PHẠM THỊ Đ TRIỆU VĂN S NGUYỄN TẤT T PHẠM KIỀU L MAI ĐĂNG T BÙI VĂN T TRẦN QUỐC T HỒNG ĐÌNH C NƠNG THỊ H NGUYỄN THỊ N TRẦN THỊ C VŨ BÁ C LẦU MÍ L ĐẶNG QUẦY T HỒNG THỊ B TRẦN ĐÌNH P NGUYỄN THỊ M NGUYỄN THỊ HUYỀN T ĐỖ THỊ M NGUYỄN DUY H LÊ ĐÌNH M VŨ VĂN T LẠI THỊ D NGUYỄN T NGUYỄN THỊ P ĐỖ THỊ T NGUYỄN MINH P BÙI THỊ N DƯƠNG TRỌNG H VƯƠNG TÚ L LÊ THỊ H DƯƠNG KHẮC H KHÚC THỊ T NGUYỄN VĂN L F F F M M F M M M M F F F M M M F M F F F M M M F M F F F F M F F M F M 2001 1939 1994 1963 1967 2003 1987 1981 1966 1964 1992 1973 1963 1952 1998 2003 1992 1955 1988 1979 1959 1974 1942 1981 1982 1968 1958 1984 1977 1942 1962 1978 1969 1957 1967 1960