khảo sát sự methyl hóa tại đảo cpg thuộc vùng promoter của gen rassf1a bằng phương pháp msp trong mẫu bệnh ung thư biểu mô vòm họng ở người việt nam

Đáng chú ý, sự mất biểu hiện hoặc sự biểu hiện bất thường của gen RASSF1A có liên quan đến sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter và có liên quan đến sinh bệnh học của

Tổng quan về ung thư vòm họng

Giải phẫu vòm họng

Họng là ngã tư của đường ăn và đường thở, nối liền với mũi ở phía trên, với miệng ở phía trước, với thanh quản và thực quản ở phía dưới [58] Họng được chia làm 3 phần: họng mũi (vòm mũi họng) - mũi hầu, miệng hầu, hạ hầu Họng mũi là phần cao nhất của họng hầu, ở sau dưới của hai lỗ mũi sau Thành sau họng mũi hợp với thành trên và hai thành bên làm thành hình vòm Phía dưới của họng - mũi được thở thông với họng – miệng [58]

Định nghĩa, triệu chứng, phân loại ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là một khối u biểu mô ác tính, khởi phát từ niêm mạc của khoang mũi họng [8, 53] Những bệnh nhân ở giai đoạn đầu của bệnh thường không có triệu chứng bị bệnh hoặc xuất hiện với các triệu chứng bình thường [8] Triệu chứng phổ biến nhất trong ung thư vòm họng là hạch cổ (neck lump) Ngoài ra, UTVH còn có các triệu chứng ở mũi như: đờm có lẫn máu, ngạt mũi, chảy dịch mũi và những triệu chứng ở tai như ù tai, viêm tai, mất khả năng nghe Đồng thời, thường xuyên đau đầu [35]

Hố Rosenmuller của vòm họng và vòi Eustachian là vị trí khởi đầu phổ biến nhất của ung thư vòm họng [8, 35] UTVH thường lan truyền bằng mạch bạch huyết đến các hạch bạch huyết ở cổ UTVH có thể lan truyền thông qua đường máu để đến những vị trí xa như xương, phổi và gan [8]

Phân loại ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng là một loại ung thư đặc biệt của ung thư cổ và đầu [35] Năm 1978, Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) đã đưa ra sự phân loại dựa vào mô bệnh học, phân chia ung thư vòm họng thành 3 loại Loại I là ung thư biểu mô tế bào vảy hóa sừng (keratinizing squamous cell carcinoma) Loại II là ung thư biểu mô không hóa sừng (nonkeratinizing carcinoma) và loại III là ung thư biểu mô không biệt hóa (undifferentiated carcinoma) [9, 12, 35]

UTVH có khác biệt rõ ràng về sự phân bố địa lý và theo dân tộc [35] UTVH phân bố ở hầu hết các khu vực trên thế giới, nhưng phổ biến nhiều ở các khu vực như Đông Nam Á, các nước Bắc Phi (Algeria, Morocco và Tunisia) và vùng phía Bắc của Bắc Mỹ và Greenland (Đan Mạch) [7, 53] Ở Đông Nam Á, dân cư gồm nhiều loại khác nhau và có nguy cơ mắc bệnh UTVH khác nhau Giống như các nước khác trong khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có nhiều loại người chung sống với nhau như người Hokkien và nhiều loại người khác của Trung Quốc có nguồn gốc từ tỉnh Fujian Những vùng đặc hữu như phía Nam Trung Quốc, theo thống kê của WHO, UTVH loại III chiếm hơn 97% [35] Tỉnh Quảng Đông có nguy cơ mắc UTVH cao gấp 2 lần so với các tỉnh khác ở Trung Quốc và các nước khác

So với Trung Quốc, các nước như Thái Lan, Việt Nam, Malaysia và Philippin cũng được biết là các nước có nguy cơ mắc UTVH ở mức trung bình đến mức cao, có khoảng biến thiên của xuất độ chuẩn hóa theo tuổi (ASR) từ 2,5 đến 15 đối với nam giới [7]

Tình trạng ung thu vòm họng trên thế giới và ở Việt Nam

Theo thống kê của Globocan năm 2012, trên toàn thế giới, ung thư vòm họng có 86691 trường hợp mắc bệnh, chiếm 0,6% và xuất độ chuẩn hóa theo tuổi là 1,2

Tỷ lệ tử vong là 50831 trường hợp, chiếm 0,6% và ASR là 0,7 Ước tính đến năm

2017, số ca mắc bệnh tăng lên tới 228698 ca ở cả nam và nữ trên toàn thế giới, chiếm 0,7%

Tại Việt Nam, UTVH được xếp là một trong năm loại ung thư phổ biến ở nam giới theo thống kê của Globocan 2012 Trong đó, số ca mắc bệnh là 3301 ca, chiếm 4,7%, có chỉ số ASR 7,7 và có 1931 ca tử vong, chiếm 3,3%, có ASR là 4,8 Ở nữ giới, số ca tử vong là 954 ca, chiếm 2,7% và có ASR là 2 Có 1630 trường hợp mắc bệnh, chiếm 3% và ASR là 3,4.

Nguyên nhân gây ung thư vòm họng

Sự phát triển của UTVH là một quá trình gồm nhiều giai đoạn, liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh, trong đó có 3 yếu tố chính: yếu tố môi trường, sự xâm nhiễm của Epstein – Barr virus, di truyền [9, 12, 35, 50]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, ở Trung Quốc, Greenland và Tunisia, điều kiện kinh tế xã hội thấp (nơi ở đông đúc, thiếu sự thông khí, vệ sinh kém, lối sống) có sự liên kết với bệnh UTVH [9] Đáng chú ý nhất là lối sống, việc sử dụng cá muối và các thực phẩm truyền thống bảo quản lâu ngày có chứa hợp chất N-nitrosamine - một yếu tố gây UTVH chủ yếu [9, 35] Ở Việt Nam, đặc biệt ở các vùng có thói quen sử dụng nhiều cá muối, cá khô, tương và các thực phẩm muối chua lâu ngày (nhất là miền Nam) đều có nguy cơ mắc UTVH cao, do các loại thực phẩm này chứa nhiều hợp chất N-nitrosamine – chất gây ung thư Hơn nữa, độ tuổi sử dụng cá muối, cách chế biến và loại cá sử dụng là những yếu tố quan trọng liên quan đến nguy cơ mắc UTVH [35]

Qua thử nghiệm cho thấy việc sự dụng cá muối ở giai đoạn thiếu nhi làm tăng nguy cơ bị UTVH ở Nam Trung Quốc, trong khi sự tiêu thụ cá muối ở giai đoạn người trưởng thành thì không tăng nguy cơ bị UTVH [9, 35] Ngoài độ tuổi sử dụng, loại cá cũng quan trọng như cá biển muối chứa nguy cơ mắc bệnh UTVH cao hơn cá nước ngọt… Những thử nghiệm trên chuột, cho thấy những khối u ở mũi và vòm họng đã xuất hiện ở chuột sử dụng cá muối Trung Quốc [35]

Tóm lại, do chế độ dinh dưỡng, việc sử dụng cá muối và các thực phẩm truyền thống bảo quan lâu ngày, chúng tác động như các chất gây ung thư, gây nên những tổn thương di truyền trong các tế bào biểu mô vòm họng Bên cạnh đó, việc dụng thuốc lá, rượu, các chất độc hại khác, khi tiếp xúc với các chất thải công nghiệp và lượng khói… cũng là một trong số các yếu tố dẫn đến việc hình thành UTVH [9, 35]

Virus Epstein Barr là một trong những nguyên nhân gây UTVH EBV là một loại Herpes virus, có DNA mạch đôi, dạng thẳng, xâm nhiễm hơn 90% dân số trên toàn thế giới và sống lâu dài trong tế bào vật chủ Trong hầu hết các trường hợp, EBV tồn tại ở dạng tiềm tàng trong các tế bào bạch huyết máu ngoại vi nên không ảnh hưởng nghiêm trọng, khi có điều kiện, EBV bắt đầu hoạt động và có thể góp phần vào sự tạo thành một vài khối u ác tính [7]

Sau khi xâm nhiễm, EBV có thể làm giảm sự điều hòa của một loạt các protein quan trọng liên quan đến sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis), điểm kiểm soát chu kì tế bào, sự di căn và hoạt đông như một tác nhân kích thích khối u hơn là một yếu tố khởi đầu của quá trình hình thành ung thư [7]

Trong suốt quá trình tiến triển của UTVH, sự bất thường của nhiễm sắc thể (NST) như việc lặp đoạn, mất đoạn NST xảy ra ở giai đoạn sớm của UTVH Mất đoạn nhiễm sắc thể ở nhánh 3p được xác định là sự bất thường trong UTVH và được xem như là một sự kiện sớm của bộ gen liên quan đến sự phát triển của UTVH

[7] Sự gián đoạn của các gen ức chế khối u định vị ở 3p, 9p là rất quan trọng trong suốt giai đoạn khởi đầu của UTVH, bao gồm các gen CDKN2A, CDKN2B ở vị trí 9p21 và RASSF1A, ZMYDN10/ BLU ở vị trí 3p21.3 [7] Bên cạnh đó, việc mất DNA bộ gen hay đột biến xảy ra trong suốt quá trình phát sinh bệnh UTVH, cũng là một cơ chế chính, đại diện cho sự bất hoạt của các gen ức chế khối u [12, 26] Trong nhiều trường hợp, việc mất đoạn của gen ức chế khối u được xác định như những dấu chứng chỉ thị trong tiên lượng và chẩn đoán ung thư [12]

Sự im lặng của những gen ức chế khối u do sự biến đổi epigenetics là một cơ chế chủ yếu gây bất hoạt của các gen liên quan đến ung thư Đặc biệt sự methyl hóa của vùng promoter đóng một vai trò thiết yếu trong việc làm mất chức năng của các gen ức chế khối u [15] Trong UTVH, sự methyl hóa vượt mức bất thường ở vùng promoter của gen RASSF1A xảy ra thường xuyên và sự bất hoạt biểu hiện gen của hai gen ức chế khối u p16 Ink4a , RASSF1A được xác định ở tần số cao [32] Sự bất hoạt của gen RASSF1A có mối liên quan với sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A Mối tương quan trực tiếp giữa sự methyl hóa vùng promoter và sự mất biểu hiện của gen RASSF1A đã được tìm thấy trong nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư vòm họng, ung thư phổ tế bào nhỏ, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư thận, ung thư vú, buồng trứng và nhiều loại ung thư khác nữa [2]

Tổng quan về epigenetics

Epigenetics

Epigenetics được định nghĩa là những thay đổi có tính di truyền trong biểu hiện gen, nhưng không liên quan đến những thay đổi trong trình tự DNA [16, 29, 36, 42,

Theo Davies P F và cộng sự (2014), sự biến đổi epigenetic có tính ổn định và di truyền (hình 1.2)

Hình 1.2 Sự bán bảo tồn của kiểu methyl hóa DNA đối xứng thông qua quá trình sao chép DNA [13]

Chú thích: Trong suốt quá trình phát triển phôi ở giai đoạn sớm, sự methyl hóa DNA được thực hiện bởi các enzyme DNA methyltransferase nhóm de novo

DNMT3A, DNMT3B Sau mỗi chu kì sao chép DNA, enzyme DNA methyltransferase duy trì DNMT1 tiến hành sao chép kiểu methyl hóa CpG từ chuỗi DNA của bố mẹ truyền sang chuỗi DNA con

Những cơ chế điều hòa chủ yếu của epigenetic là sự methyl hóa DNA (methyl hóa vượt mức, giải methyl hóa), sự biến đổi histone (acetyl hóa, methyl hóa), tổ chức lại chất nhiễm sắc và sự điều hòa sau phiên mã bởi các RNA ngắn và dài (chủ yếu là các microRNA và RNA dài không mã hóa (hình 1.3) [16, 30, 42, 49]

Hình1.3 Sơ đồ cơ chế điều hòa của epigenentics [30]

Theo Vaissie`re T và cộng sự (2008), những cơ chế của epigenetics rất cần thiết cho sự phát triển, biệt hóa tế bào và sự bảo vệ chống lại các bộ gen của virus ký sinh Tuy nhiên, sự mất điều hòa của các cơ chế epigenetic có liên quan đến nhiều bệnh khác nhau ở người, đáng chú ý là ung thư [49]

Methyl hóa DNA

Đảo CpG (Cytosine phosphate guanine dinucleotides)

Trong bộ gen người, có 1% chứa vùng DNA giàu CpG - được gọi là đảo CpG CpG có nghĩa là nucleotide C gắn với nucleotide G bằng liên kết phosphodiester [16, 29] Đảo CpG phải có độ dài lớn hơn 200 bp và có %GC ít nhất 55% [29] Các đảo CpG thường được tìm thấy trong vùng promoter của gen và có khoảng gần 40 - 50% các promoter của hầu hết gen người chứa đảo CpG [16, 29] Một phần của các đảo CpG (chiếm khoảng 37%) định vị ở đầu 5’ vùng promoter của các gen [38] Khoảng 70% các gen có chứa đảo CpG trong vùng -2 kb đến +1 kb của vị trí khởi đầu phiên mã của chúng [38]

Hiện tượng methyl hóa DNA là một quá trình xảy ra ngay lập tức sau qua trình sao chép DNA và được hoàn thành trong khoảng 1 phút sau khi hoàn thành quá trình sao chép [43] Sự methyl hóa DNA là hiện tượng gắn một nhóm methyl (-

CH 3 ) vào vị trí carbon số 5 trong vòng pyrimidine của một phân tử cystosine (5’C) để hình thành 5-methylcytosine (5mC) Quá trình methyl hóa DNA được xúc tác bởi emzym DNA methyltransferase (DNMTs) (hình 1.4) [16, 43, 49]

Hình 1.4 Cơ chế của sự methyl hóa DNA [21]

DNMTs là một hệ enzyme xúc tác sự vận chuyển nhóm methyl (-CH 3 ) từ một phân tử cho như S - adenosyl methionine (SAM) đến vị trí carbon số 5 của vòng pyrimidine của một cytosine (hình 1.4) [27] Ở động vật có vú, đã phát hiện ra có 5 thành viên của họ enzyme DNA methyltransferase liên quan đến sự methyl hóa của các vị trí CpG, đó là DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B và DNMT3L [6,

21, 43] Trong đó, ba loại DNMT1, DNMT3A, DNMT3B là tham gia trực tiếp và đóng vai trò chủ yếu trong việc thúc đẩy sự methyl hóa [16] DNMTs gồm có 2 nhóm là: nhóm de novo methyltransferase và nhóm methyltranferase duy trì [16, 43, 49]

Nhóm enzyme methyltranferase duy trì (mammalian DNA methyltransferases) phổ biến trong tế bào là DNMT1 Theo Davies P F và cộng sự (2014), DNMT1 chịu trách nhiệm duy trì sự methyl hóa trong suốt quá trình phân bào của tế bào soma và DNMT1 sử dụng để làm tăng hoạt tính methyl hóa de novo trong giai đoạn phân chia phôi [16]

Nhóm de novo methyltransferase gắn thêm nhóm methyl (-CH 3 ) vào 5- cystosine hình thành 5-methylcytosine (5mC) tạo vị trí methyl hóa mới (hình 1.5) DNMT3A, DNMT3B thuộc nhóm này, điều hòa sự methyl hóa de novo trong suốt quá trình phát triển của phôi [16, 38] Một enzyme khác, DNMT3L thiếu hoạt tính xúc tác, bị bất hoạt nhưng nó lại quan trọng cho sự ổn định của DNMT3A và có liên kết với các phức hợp trong suốt sự methyl hóa de novo trong tế bào mầm [16]

Hình 1.5 Chức năng của các DNA methyltransferase và demethylase [46]

Những emzym DNMTs có vai trò điều hòa sự methyl hóa DNA Sự biểu hiện vượt mức của tất cả các loại DNMTs ở mức độ mRNA đã biểu hiện trong một số loại ung thư [40] Trong các tế bào bình thường, sự tăng biểu hiện của DNMT1 là nguyên nhân dẫn đến sự methyl hóa de novo bất thường ở đảo CpG, thúc đẩy sự biến đổi tế bào và dẫn đến sự hình thành ung thư [40]

Vai trò của sự methyl hóa DNA

Sự methyl hóa DNA (sự methyl hóa cytosine) là một cơ chế cần thiết cho sự phát triển bình thường của các sinh vật bao gồm thực vật và động vật [49] Sự methyl hóa có thể kiểm soát sự biểu hiện gen ở động vật có xương sống và đóng vai trò thiết yếu trong quá trình phát triển bình thường của tế bào, của phôi [38, 43] Sự methyl hóa thường liên quan đến sự im lặng phiên mã của gen, điều hòa sự biểu hiện của gen dấu vết và một số gen ức chế khối u trong ung thư và liên quan đến sự im lặng của các gen định vị trên NTS X [38, 43] Trong suốt quá trình phát triển phôi hoặc quá trình biệt hóa tế bào, trạng thái methyl luôn được điều hòa [32] Do đó, sự methyl hóa bất thường (việc giảm sự methyl hóa cũng như sự methyl hóa vượt mức) có thế góp phần hình thành các bệnh, đáng chý ý là ung thư [36].

Methyl hóa DNA và ung thư

Sự rối loạn điều hòa epigenetics là trung tâm để khởi xướng và tiến triển của một số ung thư Những cơ chế epigenetics trong tế bào ung thư bao gồm những biến đổi bất thường của histone và sự methyl hóa DNA bất thường [36] Sự methyl hóa DNA bất thường là sự giảm methyl hóa DNA (DNA hypomethylation) và sự methyl hóa DNA vượt mức (DNA hypermethylation) ở vùng đảo CpG [36]

Trong tế bào bình thường, đảo CpG hầu như không bị methyl hóa, không đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát sự phiên mã của gen [29] Tuy nhiên, khi các đảo CpG ở gần vùng promoter hoặc tại vùng promoter xảy ra sự methyl hóa thì dẫn đến kết quả cuối cùng là làm im lặng gen (hình 1.6) [16, 29]

Hình 1.6 Sự im lặng của gen do epigenetic trong suốt quá trình hình thành khối u [49]

Qua hình 1.6 cho biết, khi một gen biểu hiện ở mô bình thường, đảo CpG ở vùng promoter chủ yếu không bị methyl hóa và histon tại NST đó bị acetyl hóa Trong quá trình hình thành khối u từ mô bình thường sang tiền khối u và tới giai đoạn khối u, dần dần xảy ra sự khử acetyl hóa ở đuôi histon và lan truyền sự methyl hóa cytosine ở các đảo CpG, hai quá trình này đi kèm với nhau, làm giảm sự biểu hiện gen và tiến dần đến sự mất biểu hiện gen

Sự giảm methyl hóa (hypomethylation) chủ yếu xảy ra ở các vị trí CpG định vị ở các trình tự DNA lặp lại [ 29, 36]

, xảy ra phổ biến trong nhiều ung thư như ung thư tuyến giáp, ung thư vú, ung thư cổ tử cung, [36] Một số cơ chế của sự giảm methyl hóa có thể dẫn đến ung thư

Thứ nhất là sự giảm methyl hóa ở đảo CpG của vùng promoter có thể làm tăng sự biểu hiện của gen, hoạt hóa các gen tiền ung thư (proto-oncogenes) và thúc đẩy sự biểu hiện của các gen gây ung thư (oncogenes) [29, 36] Các gen gây ung thư mã hóa tạo protein, khi mà có đột biến hoặc sự biểu hiện vượt mức của protein thì làm biến đổi một tế bào bình thường thành một tế bào ung thư [29]

Thứ hai, việc giảm sự methyl hóa DNA làm thúc đẩy sự tái sắp xếp bất thường của NST trong suốt quá trình phân bào, điều này có thể làm tăng khả năng mất gen [29] Do đó, sự giảm methyl hóa DNA có thể làm giảm sự ổn định của bộ gen và dẫn đến kết quả cuối cùng là hình thành và phát triển khối u [21]

Sự methyl hóa DNA vượt mức (DNA hypermethylation) có thể làm bất hoạt các gen ức chế khối u và góp phần hình thành và phát triển ung thư [29, 36] Một số gen ức chế khối u bị im lặng do sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG như VHL, p16 Ink4a , hMLH 1 [29] Sự methyl hóa vượt mức làm kìm hãm hoạt động của các gen sửa chữa DNA, đây là môi trường lý tưởng để lan truyền các đột biến DNA và biến đổi tế bào [29] Ngoài ra, sự methyl hóa vượt mức có liên quan đến sự im lặng của các gen liên quan đến kiểm soát chu kỳ tế bào, apoptosis, các gen giải độc và gen chuyển hóa Cholesterol [36]

Sự methyl hóa DNA vượt mức ở các đảo CpG thuộc vùng promoter có xu hướng làm im lặng gen, do các cytosine bị methyl hóa có khả năng gắn vào các họ protein liên kết với 5’mC như MeCP1, MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 và MBD4, điều này “khóa” các yếu tố phiên mã gắn vào vùng promoter của gen, vì thế ức chế sự phiên mã của gen (hình 1.7) [29, 36] Đồng thời, sự liên kết với những protein MeCPs và MBDs trên, giúp thu hút và gắn bổ sung các phức hợp làm bất hoạt chất nhiễm sắc bao gồm deacetylase (HDACs) và histone methyltransferase (HMTs) vào các đoạn trình tự bị methyl hóa và thúc đẩy sự cô đặc của chất nhiễm sắc, dẫn đến làm bất hoạt sự phiên mã (hình 1.7) [36, 46] Sự methyl hóa DNA còn can thiệt vào sự liên kết của một số yếu tố phiên mã Do đó, nó ức chế sự phiên mã, làm bất hoạt các gen ức chế khối u và góp phần vào sự phần khởi xướng, tiến triển tạo u và hình thành ung thư [21, 29]

Hình 1.7 Sự methyl hóa DNA ở promoter làm im lặng sự biểu hiện gen bằng các cơ chế khác nhau [46]

Chú thích: Cơ chế đầu tiên, sự can thiệt vào sự liên kết của các yếu tố phiên mã (phía trên bên phải) Cơ chế thứ hai liên quan đến sự bổ sung các enzyme biến đổi chất nhiễm sắc và thiết lập sự bất hoạt của chất nhiễm sắc (phần phía dưới bên phải) AC: sự acetyl hóa histon, mũi tên ngang: sự phiên mã, MeCP2 là một protein liên kết với 5’mC, HDAC: là enzyme khử sự acetyl hóa histon, SUV39 là một ezyme methyltrasferase histon, Sin3A là chất kìm hãm (a co-repressor), HPI là một protein liên kết với histon bị methyl hóa.

Tổng quan về gen RASSF1A

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sự methyl hóa của gen

Hiện tượng methyl hóa DNA vượt mức thuộc vùng promoter của gen

RASSF1A được xem như là một dấu chứng sinh học cho việc chẩn đoán ung thư

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự methyl của gen này trong ung thư vòm họng (UTVH)

Một số nghiên cứu tiêu biểu như nghiên cứu của Kwok- Wai Lo và cộng sự (2001), đã nghiên cứu về sự methyl vượt mức ở vùng promoter của gen RASSF1A trên 21 mẫu mô của các bệnh nhân UTVH giai đoạn đầu, đã xác định tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong 21 mẫu này là 66,7%, không xảy ra sự methyl hóa ở mẫu mô vòm họng bình thường [31] Năm 2005, Zhou L và cộng sự đã nghiên cứu về tần số methyl hóa của gen RASSF1A, kết quả thu được dựa vào sự phân chia theo vị trí lấy mẫu, tại vị trí ung thư vòm họng, tần số methyl hóa RASSF1A chiếm 82%, ở vị trí xung quanh cách khối u 0,5 cm tần số methyl hóa RASSF1A là 75%, cách vị trí khối u 1,0 cm là 46% Theo Fendri A và cộng sự (2009) nghiên cứu về sự methyl hóa RASSF1A trên 68 mẫu sinh thiết UTVH ở giai đoạn đầu thì đã xác định được tần số methyl hóa của các gen từ 88% của cả hai gen RARβ2và DAP-kinase đến 91% của gen RASSF1A [22] Ngoài ra, còn nhiều công trình nghiên cứu tiêu biểu khác trên thế giới như Thian-Sze Wong và cộng sự (2004) [47] , Wang T và cộng sự (2009) [50] , Zhi-Gang Pan và cộng sự (2005) [55] , Challouf S và cộng sự (2012) [10] , Zhang Z và cộng sự (2012) [54] , Nawaz I và cộng sự (2015) [39] , cũng nghiên cứu về tần số methyl hóa của gen RASSF1A trên các loại mẫu UTVH khác nhau Ở Việt Nam, chỉ tìm thấy được công trình nghiên cứu của Lê Thanh Hà và cộng sự (2012), công trình nghiên cứu về “Khảo sát đặc điểm phân tử của gen

LMP-1 của virus Epstein-Barr và liên quan methyl hóa của gen RASSF1A trên bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam”, được đăng trên Tạp chí Y học thực hành, số 849/850, trang 128-133 vào năm 2012 Kết quả của công trình này xác định được

12 mẫu (chiếm 80%) có sự methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A trong 15 mẫu bệnh phẩm UTVH [1]

Vị trí, tên gọi và cấu trúc gen RASS1A trên NST

RASSF1A có tên gọi đầy đủ là Ras association domain family 1 isoform A, được gọi với các tên khác như: 123F2, NORE2A, RAD32, REH3P21, định vị tại vị trí 21.3 trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 3 thuộc bộ gen người (hình 1.8) [ 63, 62]

Hình 1.8 Vị trí gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3 [62]

Gen RASSF1 có độ dài 11151 bp, có 8 exon, tạo ra 8 vùng phiên mã khác nhau và được đặt tên từ RASSF1A đến RASSF1H thông qua việc sử dụng các promoter khác nhau và sự ghép nối xen kẽ của các exon [2, 18] Hai isoform chính của gen RASSF1 là RASSF1A và RASSF1C được sao chép từ 2 vùng promoter ở các đảo CpG riêng lẻ [15, 18, 26] Trong đó, RASSF1A có các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5 và 6, mã hóa cho một chuỗi polypeptide ngắn với 340 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 39 kDa (hình 1.9) [15, 26, 34]

Hình 1.9 A: Bản đồ của gen RASSF1 [57] ; B: Cấu trúc phân tử protein RASSF1A [18]

Chú thích hình A: Hình vuông màu xám: exon 1α, hình chữ nhật màu xanh lá: exon 1β, hình chữ nhật màu xanh dương: exon 2αβ, hình chữ nhật màu vàng: exon 2γ, các hình chữ nhật màu nâu: exon 3, 4, 5 và 6 Các mũi tên là những vị trí bắt đầu sự phiên mã Các CpG: vị trí của các đảo CpG RASSF1A và RASSF1B lần lượt bắt đầu từ exon 1α và exon 1β Exon thứ hai (exon 2αβ) là exon chung của cả RASSF1A và

RASSF1B Exon 2γ là exon đầu tiên của RASSF1C và chỉ hiện diện ở RASSF1C

Chú thích hình B: C 1 : conserved region 1 DAG: diacylglycerol/phorbol ester binding domain – domain gắn ester diacylglycerol/phorbol ATM: ATM–kinase consensus phosphorylation sequence ; RA: RalGDS/AF6 Ras association domain – domain liên kết Ras RalGDS/AF6 SARAH: Sav/RASSF/Hpo interaction Domain – domain tương tác với Sav/RASSF/Hpo.

Vai trò và chức năng của gen RASSF1A

Trong tế bào bình thường, gen RASSF1A là một gen ức chế khối u, nó mã hóa tạo ra protein RASSF1A, có khả năng điều chỉnh một loạt các chức năng tế bào cần thiết cho sự kiểm soát phát triển bình thường như điều hòa các vi ống, duy trì sự ổn định của bộ gen, điều hòa chu kì tế bào và quá trình nguyên phân, điều hòa apoptosis, tính di động và sự xâm lấn của tế bào, …(hình 1.10) [4, 18, 34, 41,51]

Hình 1.10 Sự tương tác và chức năng ức chế khối u của RASSF1A [51]

Chú thích: RASSF1A có thể điều hòa mạng lưới vi ống, diễn tiến của chu kì tế bào và apoptosis thông qua các yếu tố tác động và các con đường truyền tín hiệu của chúng Những protein tương tác trực tiếp với RASSF1A được hiển thị màu xanh lá, đối với những protein tác động xuôi dòng, sự tương tác này được hiển thị bằng màu xanh dương

Hình 1.10 cho thấy, RASSF1A gây ra apoptosis thông qua sự tương tác của nó với Ras, với yếu tố tác động Ras (NORE1), với CNK1, kinase tiền apoptosis (MST1) và với yếu tố điều biến của apoptosis-1 (MAP-1) (K-Ras hoạt hóa, RASSF1A và MAP-1 hợp lực để hoạt hóa Bax và sự chết của tế bào) RASSF1A điều hóa quá trình tăng sinh thông qua sự tương tác của nó với những vị ống và Cdc20 (bằng cách ức chế phức hợp APC–Cdc20 và làm thoái biến các cyclin A, cyclin B), tương tác với những protein 1B liên kết với vi ống (MAP1B), tương tác với Aurora-A (làm phosphoryl hóa RASSF1A) và C19ORF5 (sự tương tác giữa C19ORF5 – RASSF1A tại trung thể đã được biết là cần thiết cho sự kiểm soát chính xác phức hợp APC–Cdc20 trong suốt quá trình phân bào), tương tác với yếu tố phiên mã p120 E4F (RASSF1A gây ra sự ngưng chu kì tế bào tại pha G 1 và sự kìm hãm pha S là nhờ sự thúc đẩy p120 E4F ) và ức chế sự tích lũy cyclin D 1 [51] RASSF1A ức chế sự hoạt động phụ thuộc vào yếu tố tăng trưởng biểu bì của Erk thông qua PMCA4b [15, 51] Tóm lại, tất cả các hoạt động trên đều hỗ trợ cho vai trò ức chế khối u của RASSF1A [51]

Protein RASSF1A điều hòa sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis- programmed cell death)

RASSF1A gây ra sự chết theo chương trình của tế bào thông qua sự tương tác của nó với Ras, với NORE1, với CNK1, MST1 và MAP-1 [15, 51] Do RASSF1A và NORE1 đã tương tác với kinase tiền apoptosis (MST1) để hình thành phức hợp NORE1/RASSF1A - MST1 và để liên kết với những protein kìm hãm RAS, gây ra sự chết theo chương trình của tế bào (hình 1.10) [15, 51] Do đó, RASSF1A và NORE1 đáp ứng như các mô đun cảm ứng để xác định tín hiệu tiền apoptosis được khởi nguồn thông qua con đường Ras [51] Bên cạnh đó, RASSF1A tương tác với CNK1 thông qua việc liên kết với các domain CRIC và PDZ của CDK1và thúc đẩy RASSF1A gây ra sự chết của tế bào CNK1 có chức năng ngăn cản sự phát triển của những dòng tế bào ung thư đang phân chia và khởi đầu sự chết theo chương trình của tế bào thông qua con đường MST1 hoặc MST2 [15] , từ đó dẫn tới kìm hãm sự phát triển của khối u Hơn nữa, CNK1 cũng tham gia vào con đường tiền apoptosis thông qua sự tương tác của nó với phức hợp RASSF1A – MST1 [15]

RASSF1A cũng có thể điều hòa sự chết theo chương trình của tế bào thông qua con đường tín hiệu của thụ thể chết Những thụ chết đã hoạt hóa gây biến đổi cấu hình Bax, giải phóng cytochrome c và gây ra sự chết của tế bào [3, 51] Bax là một thành viên của họ protein Bcl2 có khả năng điều hòa apoptosis RASSF1A được biết là thành phần cần thiết cho thụ thể chết biến đổi cấu hình Bax và gây ra sự chết theo chương trình của tế bào [3, 51] Sự kích thích của yếu tố hoại tử khối u α (TNFα) hoặc TRAIL đều dẫn đến sự gắn bổ sung RASSF1A và MAP-1 vào các phức hợp thụ thể và thúc đẩy sự hình thành phức hợp giữa RASSF1A và MAP-1 Bình thường, MAP-1 bị kìm hãm bởi sự tương tác nội phân tử Tuy nhiên, việc gắn RASSF1A vào MAP-1 làm giảm sự kìm hãm trên, dẫn đến MAP-1có thể gắn vào Bax Sau đó, K -Ras ở dạng hoạt động, RASSF1A và MAP-1 hợp lực để hoạt hóa Bax và gây ra sự chết của tế bào (hình 1.11) [51]

Hình1.11 RASSF1A điều hòa apoptosis thông qua con đường tín hiệu thụ thể chết [24]

Hình 1.11 cho biết: Sự chết của tế bào do thụ thể chết gây ra (thông qua sự kích thích của TNFα) có thể dẫn đến sự bổ sung của phức hợp protein để hoạt hóa Bax và thúc đẩy apoptosis Cơ bản, RASSF1A là phức hợp liên kết với 14-3-3 thông qua sự phosphoryl hóa GS3K-β để mà ngăn cản sự bổ sung không mong muốn của RASSF1A vào thụ thể chết và làm mất kiểm soát sự kích thích của Bax và apoptosis Một khi, mà kích thích của thụ thể chết được tiếp nhận (TNFα), phức hợp TNFR1/MOAP-1/RASSF1A thúc đẩy “sự mở” cấu hình của MOAP-1để liên kết với Bax Điều này làm thay đổi cấu hình Bax và bổ sung vào ty thể để bắt đầu sự chết của tế bào Theo sao, giải phóng RASSF1A khỏi phức hợp TNFR1/MOAP-

1, sau khi được giải phóng, RASSF1A có thế tái liên kết với 14-3-3 để ngăn cản sự khích thích liên tục của quá trình chết của tế bào [24]

RASSF1A điều hòa vi ống

RASSF1A định vị vào vi ống và thúc đẩy sự ổn định của vi ống Trong suốt kì trung gian, RASSF1A định vị vào vi ống của bào chất Trong suốt kì đầu, nó định vị vào trung thể Trong suốt kì giữa và kì sau, nó được định vị vào cả vi ống và thoi phân cực [18] Động học của vi ống có thể được điều hòa thông qua một loạt các protein liên kết với vi ống, chúng liên kết trực tiếp với tubulin Trong đó, 3 protein sau: MAP1B, C19ORF5 và MAP4 là thành phần liên kết trực tiếp của RASSF1A (hình 1.10) Do đó, RASSF1A có thể liên kết với vi ống thông qua MAPs MAP1B có khả năng thúc đẩy sự polyme hóa tubulin và bảo vệ vi ống chống lại các tác nhân khử polyme hóa do nocodazole gây ra [14, 18] Còn C19ORF5 thúc đẩy sự polyme hóa vi ống và ngược lại, MAP4 ngăn cản sự khử polyme hóa của vi ống Qua đây, cho thấy RASSF1A có ảnh hưởng sâu sắc đến cân bằng động học của vi ống [18]

Mặt khác, do RASSF1A có thể liên kết với α, γ và β tubulin và các protein liên kết vi ống (MAPs) [18, 19] Các liên kết này có chức năng duy trì sự ổn định của tubulin và cho phép vi ống thực hiện các vai trò của nó trong suốt quá trình phân bào, để cho phép sự phân tách của các nhiễm sắc tử chị em diễn ra [19]

Protein RASSF1A điều hòa chu kì tế bào

Sự mất điều hòa của chu kì tế bào là một yêu cần thiết cho quá trình hình thành khối u Trong tế bào bình thường, chu kì tế bào được kiểm soát chặt chẽ thông qua một số phức hợp protein- hoạt động của chúng cần thiết để tế bào vượt qua các điểm kiểm soát đặc hiệu [51] RASSF1A điều hòa chu kì tế bào thông qua sự ngưng chu kì tế bào ở pha G 1 , pha G 2 /M, điều hòa diễn tiến phân bào thông qua sự điều hòa phức hợp xúc tiến kì sau - anaphase promoting complex, viết tắt là APC và sự tích lũy cyclin A, B và D 1 [51]

RASSF1A có khả năng tác động vào sự chuyển tiếp pha G 1 thông qua sự tương tác trực tiếp của nó với p120 E4F , p120 E4F là một yếu tố phiên mã, tương tác với protein Rb (retinoblastoma- ung thư võng mạc), p14 ARF , p53 và nó liên quan đến sự kiểm soát việc ngưng chu kì tế bào ở gần giai đoạn chuyển tiếp pha G 1 [51]

Sự ngưng chu kì tế bào ở pha G 1 và sự ức chế pha S được đẩy mạnh bởi p120 E4F khi có sự hiện diện của RASSF1A [15] Do RASSF1A thúc đẩy khả năng của p120 E4F để loại bỏ cyclin A2 và hợp lực với p120 E4F để làm ngưng chu kì tế bào [18] Tuy nhiên, vai trò điều hòa cylin A2 của RASSF1A là một quá trình phức tạp, tại vì RASSF1A chỉ có khả năng làm tăng nồng độ protein cyclin A2 trong một số trường hợp [18]

Mặt khác, do p120 E4F có khả năng điều hòa âm tính sự phiên mã của cyclin A2, có nghĩa là sự biểu hiện của p120 E4F dẫn đến sự ức chế phiên mã của gen Cyclin A, điều này có liên quan đến sự ngưng chu kì tế bào tại pha G 1 [14, 18, 20] Tại vì, cyclin

A đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển sang pha S Quá trình tích lũy protein cyclin A và mRNA cyclin A tại điểm kết thúc của pha G 1 là cần thiết cho quá trình đi vào pha S và sự sao chép DNA [20] Mặt khác, RASSF1A có khả năng ức chế sự tích lũy protein cyclin D 1 thông qua việc ức chế dịch mã mRNA của gen

Cyclin D 1 , dẫn đến làm ngưng chu kì tế bào tại pha G 1 [51]

RASSF1A có liên quan đến việc kiểm soát làm ngưng chu kì tế bào trong giai đoạn kì đầu muộn (prometaphase) Do chức năng của RASSF1A phụ thuộc vào Emi1 (early mitotic inhibitor 1)- một chất ức chế hoạt tính phức hợp APC-Cd20 để ngăn cản sự thoái biến của các cyclin phân bào trong pha M [15, 45] , vì thế RASSF1A hoạt động ở giai đoạn kì đầu muộn, trước sự hoạt động của điểm kiểm soát thoi phân bào và sau sự phá hủy Emi1 để ngăn cản sự thoái biến của các cyclin phân bào và làm trì hoãn quá trình phân bào [15] Việc làm ngưng chu kì tế bào trong giai đoạn kì đầu muộn có liên quan đến sự tương tác trực tiếp của RASSF1A với Cdc20 Cdc20 là một yếu tố điều hòa chu kì tế bào cần thiết cho việc hoàn thành quá trình nguyên phân [18] Cdc20 gắn và hoạt hóa hoạt tính ligase ubiquitin của phân tử APC Điều này thúc đẩy ubiquitin hóa và sự thoái biến của cyclin A, cyclin B, dẫn đến tế bào không đi vào kì sau và không phân bào tiếp [18] Khi Cdc20 tương tác với RASSF1A thì sẽ làm mất khả năng hoạt hóa APC của Cdc20, sự ổn định của các cyclin A, cyclin B làm “ khóa” quá trình phân bào và theo sau là sự thoái biến của chúng (hình 1.12) [18] Hơn nữa, RASSF1A liên kết với Cdc20 và định vị trên thoi phân bào trong suốt giai đoạn kì đầu muộn, do đó ức chế khả năng của RASSF1A để thúc đẩy sự thoái biến của các cyclin phân bào (đáng chú ý là cyclin A) Điều này cho thấy, vai trò của RASSF1A trong sự điều hòa APC là độc lập với các điểm khiểm soát phụ thuộc Mad2 và các phức hợp ức chế Emi1-Cdc20 (hình 1.12) [45]

Sử dụng RNA can thiệp làm suy yếu RASSF1A thì sẽ thúc đẩy quá trình phân bào

Hình 1.12 Sự ức chế hoạt động của APC/C trong suốt chu kì tế bào [37]

(a) Từ pha S cho đến kì đầu, Emi1 ức chế APC/C bằng cách gắn vào Cdc20

(b) Trong suốt thời kì đầu muộn, RASSF1A liên kết với Cdc20 và ức chế APC/C Tại điểm kết thúc thời kì đầu muộn, sự ức chế này ngưng lại và khởi đầu sự thoái biến cyclin A

Sự im lặng của gen RASSF1A và ung thư

Sự methyl hóa vượt mức tại đảo CpG trong vùng promoter gen RASSF1A làm im lặng sự biểu hiện của gen trong nhiều loại ung thư Sự im lặng gen

RASSF1A trong ung thư chủ yếu do 2 nguyên nhân sau: (1) sự methyl hóa DNA ở vùng promoter của gen RASSF1A, (2) những đột biến gen RASSF1A [51] Sự bất hoạt của gen RASSF1A có liên quan đến sự phát triển của hơn 40 loại ung thư khác nhau, trong đó có ung thư biểu mô vòm họng [41] Nguyên nhân phổ biến nhất của sự mất chức năng gen RASSF1A là sự im lặng quá trình phiên mã thông qua sự methyl hóa vượt mức ở promoter [51] Sự bất hoạt của RASSF1A có sự liên kết với một số giai đoạn tiến triển của khối u và tiên lượng sớm [15] Hơn nữa, sự bất hoạt gen RASSF1A có mối tương quan với sự di căn của hạch bạch huyết và giai đoạn khối u trong ung thư vòm họng [50] Ở các tế bào ung thư, gen RASSF1A bị methyl hóa vượt mức tại vùng promoter làm quá trình phiên mã gen RASSF1A im lặng, dẫn đến làm mất chức năng điều hòa các con đường tín hiệu và sự tạo u

Sự im lặng gen RASSF1A cần đến protein HOXB3 [41] HOXB3 làm im lặng

RASSF1A thông qua con đường liên quan trực tiếp đến việc gắn DNMT3B vào promoter của RASSF1A Theo Palakurthy R K và cộng sự (2009), HOXB3 gắn vào gen DNA Methyltransferase (DNMT3B) và làm tăng sự biểu hiện của gen này Sau đó, DNMT3B được bổ sung vào vùng promoter của RASSF1A, dẫn đến sự methyl hóa vượt mức và làm im lặng sự biểu hiện của gen RASSF1A DNMT3B được bổ sung rất dễ dàng thông qua sự tương tác với phức hợp chất kìm hãm Polycom 2 (POL2) và MYC, hai phức hợp này đã được gắn vào promoter của RASSF1A (hình 1.13) [41] Ngược lại, nếu “khóa” MYC thông qua sự tác động của các RNA can thiệp (RNAi), dẫn đến làm giảm sự bổ sung DNTM3B và EZH2 vào promoter của gen RASSF1A, cũng như giải phóng sự biểu hiện của gen RASSF1A [41]

Hình 1.13 Sự im lặng của gen RASSF1A gián tiếp qua HOXB3 [41]

Chú thích: EZH2 là một enzyme methyl hóa histone, nó methyl hóa histone H3 trên lysine 27 (H3K27), MYC là một protein gây ung thư (oncoprotein), có chức năng như là một chất kìm hãm sự phiên mã và có khả năng tương tác trực tiếp với DNA methyltransferase, PRC2: phức hợp chất kìm hãm Polycom 2

Bên cạnh đó, sự mất biểu hiện gen RASSF1A cũng có thể là do các đột biến soma của nó, nhưng rất ít Các đột biến này làm suy yếu chức năng của RASSF1A, như đột biến A133S hoặc S131F không thể làm ngưng chu kì tế bào bằng cách ngăn chặn sự tích lũy cyclin D 1 [24, 51] Đột biến S131F làm giảm sự phosphoryl, dẫn đến làm yếu khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào Các đột biến C65R và R257Q làm giảm khả năng liên kết với các vi ống [24, 51]

Sự methyl hóa RASSF1A là một dấu chứng sinh học của ung thư

Sự methyl hóa gen RASSF1A được xem như là một dấu chứng sinh học lý tưởng cho bệnh ung thư vì ba lí do chủ yếu: (1) sự methyl hóa xảy ra trong nhiều loại khối u khác nhau (2) tần số methyl hóa luôn ở trong khoảng trung bình đến cao, do đó cung cấp thông tin khá chính xác cho chẩn đoán.(3) sự methyl hóa gen

RASSF1A ít có xảy ra ở các mô bình thường, nên nó là một dấu chứng sinh học có độ đặc hiệu cao [26, 51] Vì vậy, nó được sử dụng như một dấu chứng chẩn đoán ung thư có tiềm năng.

Phương pháp phát hiện sự methyl hóa DNA

Quá trình xử lý DNA bằng sodium bisulfite

Việc đánh giá sự methyl hóa DNA được tiến hành với bước đầu tiên là biến đổi bisulfite DNA bộ gen Biến đổi bisulfite là phản ứng của DNA với sodium bisulfite được dùng để chuyển đổi tất cả cytosine không bị methyl hóa thành uracil Quá trình biến đổi bisulfite DNA diễn ra qua 3 giai đoạn sau (hình 1.14) [60] :

(1): Quá trình sulfonat hóa DNA (Sulfonation): gắn nhóm SO 3 - vào vị trí carbon số 6 của cytosine, hình thành phân tử cytosine-6-sulfonate

(2): Quá trình khử nhóm amin (Deaminonation): khử nhóm -NH 2 của cytosine-6-sulfonate để tạo ra uracil-6-sulfonate

(3): Quá trình khử nhóm sulfonate (Desulfonate): khử nhóm SO 3 - của uracil-6-sulfonate trong điều kiện kiềm để biến đổi Uracil-6-sulfonate thành uracil

Mặt khác, các 5mC không bị biến đổi sau khi phản ứng bisulfite kết thúc [60]

Hình 1.14 Quá trình biến đổi bisulfite của DNA [60]

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xác định tình trạng methyl hóa DNA dựa trên cơ sở biến đổi bisulfite DNA như: MSP (methylation-specific PCR), MMSP (Multiplex Methylation Specific PCR), Real – time Quantitative PCR, COBRA (Combined bisulfite restriction analysis), … Trong các phương pháp này, phương pháp MSP là phương pháp được lựa chọn phổ biến nhất.

Phương pháp MSP (methylation-specific PCR)

Theo Herman J G và cộng sự (1996), MSP là một phương pháp đánh giá nhanh tính trạng methyl hóa của hầu hết các vị trí CpG trong một đảo CpG Phương pháp này được thực hiện theo thứ thự sau: khởi đầu là sự biến đổi DNA bằng muối bisulfite, sau khi xử lý DNA với muối bisulfite, tất cả các cytosine không bị methyl hóa sẽ biến đổi thành uracil, còn các cytosine bị methyl hóa vẫn giữ nguyên, không thay đổi Tiếp theo, thực hiện khuếch đại DNA đã xử lý với hai cặp mồi đặc hiệu cho DNA bị methyl hóa và DNA không bị methyl hóa (hình 1.15) [25] Độ nhạy của kỹ thuật này cho phép định tính sự methyl hóa của các DNA thu nhận không chỉ ở các mẫu mô tươi đông lạnh, máu ngoại vị, tủy xương hay dịch cơ thể mà cả các mẫu đúc paraffin [23] MSP là một phương pháp nhanh, có hiệu quả, không đòi hỏi các chất cảm ứng phóng xạ và có thể phân tích một số lượng lớn các mẫu lâm sàng [25] Hơn nữa, phương pháp MSP cho phép xác định một bản sao gen bị methyl hóa trong số 1000 bản sao gen không bị methyl hóa [25, 39] Vì thế, MSP vẫn được sử dụng phổ biến nhất

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Mẫu thí nghiêm

Nghiên cứu sử dụng 10 mẫu thí nghiệm thu nhận từ Bệnh viện Chợ Rẫy vào ngày 28 tháng 1 năm 2016 và lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, khoa Công Nghệ Sinh Học, ĐH Mở TP HCM Trong 10 mẫu thí nghiệm bao gồm 8 mẫu mô (được kí hiệu lần lượt là T1-T8) và 2 mẫu dịch phết (được kí hiệu là S1, S2) Tám mẫu mô đã được chẩn đoán là bị UTVH và hai mẫu dịch phết được chẩn đoán không bị UTVH (mẫu lành) theo chẩn đoán của bác sĩ Bệnh viện Chợ Rẫy Các mẫu trên được bảo quản trong dung dịch PBS khi đưa về phòng thí nghiệm được lưu giữ ở nhiệt độ - 20 0 C đến khi sử dụng.

Các phần mềm và chương trình sử dụng trong nghiên cứu

Khai thác dữ liệu trên trang web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Thu nhận trình tự gen khảo sát trên web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

Phần mềm trực tuyến Methprimer: http://www.urogene.org/methprimer/ được dùng để xác định trình tự gen cần khảo sát có đảo CpG hay không

Phần mềm trực tuyến TFBIND: http://tfbind.hgc.jp/ được dùng để xác định vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã Đánh giá các thông số vật lý của mồi bằng phần mềm trực tuyến IDT: http://sg.idtdna.com/calc/analyzer

Phần mềm AnnHyb-4.944, phiên bản năm 2012 được dùng để kiểm tra lại khả năng bắt cặp của cặp mồi tham khảo trên trình tự gen cần khảo sát, xác định vị trí bắt cặp của mồi, đồng thời xác định kích thước sản phẩm khuếch đại

Phần mềm trực tuyến Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi được dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi với gen đích.

Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Các dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử bao gồm micropipette, đầu típ, eppendorf, kẹp lấy mẫu, kéo cắt mẫu, đèn cồn, ống đong, erlen, …

− Bể ổn nhiệt (Multitemp III)

− Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

− Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)

− Tủ hút khí độc (Ascent Max)

− Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)

− Máy luân nhiệt (My-Cycler Thermal, BioRad)

− Cân kỹ thuật (Satorious, Đức)

− Bộ điện di DNA (BioRad)

− Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, BioRad)

Hóa chất dùng trong quá trình tách chiết DNA bao gồm:

− Dung dịch ly giải tế bào (Lysis buffer): Tris – HCl 1M (pH = 8), EDTA 0,5M, SDS 10%, NaCl 5M (đó hấp), dd H 2 O (đó hấp), 100 àg/ml Proteinase K

− Dung dịch loại bỏ protein: dung dịch PCI (Phenol/Choroform/Isoamylalcohol với tỷ lệ theo thể tích là 25:24:1) và Chloroform

− Dung dịch tủa và rửa tủa DNA: Isopropanol, Ethanol 70%

− Dung dịch bảo quản DNA: TE buffer 1X (Tris 1M, pH=8, EDTA 0,5M)

Hóa chất dùng trong quá trình biến đổi bisulfite DNA:

− Bộ kít biến đổi bisulfite MethylEdge™ N1301 của Promega

Hóa chất dùng đặt phản ứng MSP:

− Dung dịch H 2 O cất hai lần (đã hấp)

− Cặp mồi methyl và unmethyl

− DNA đã biến đổi bisulfite

Hóa chất dùng điện di:

− Dung dịch load mẫu: loading dye 6X

− Thang chuẩn DNA 50bp (Biolabs).

Phương pháp

Khai thác cơ sở dữ liệu

Tiến hành khai thác cơ sở dữ liệu trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) bằng một số từ khóa chính như: nasopharyngeal carcinoma (ung thư vòm họng),

RASSF1A hypermethylation nasopharyngeal carcinoma (sự methyl hóa vượt mức gen RASSF1A trong ung thư vòm họng), frequent hypermethylation RASSF1A nasopharyngeal carcinoma (tần số methyl hóa vượt mức gen RASSF1A trong ung thư vòm họng), RASSF1A methylation in nasopharyngeal carcinoma (sự methyl hóa gen RASSF1A trong ung thư vòm họng), RASSF1A, epigenetics, DNA methylation (sự methyl hóa DNA),

Trình tự các cặp mồi của gen RASSF1A được tham khảo trong các bài báo nghiên cứu thực nghiệm về mức độ methyl hóa của gen RASSF1A trong UTVH trên ngân hàng dữ liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Khảo sát in silico

Thu nhận trình tự vùng promoter gen RASSF1A, xác định cấu trúc gen và 2.2.2.1 đảo CpG

Thu nhận trình tự vùng promoter gen RASSF1A từ ngân hàng gen trên cơ sở dữ liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) bằng mã số truy cập (accession number) DQ444319 Sau đó sử dụng phần mềm trực tuyến Methprimer trên trang web: http://www.urogene.org/methprimer/ để xác định vị trí các đảo CpG (nếu có) trên vùng gen khảo sát và kiểm tra vùng đảo CpG có nằm trong vùng promoter của gen khảo sát hay không Sử dụng phần mềm trực tuyến TFBIND (http://tfbind.hgc.jp/) để xác định vị trí nhận biết của các yếu tố phiên mã trên vùng promoter của gen khảo sát

Khảo sát, đánh giá bộ mồi cho phản ứng MSP

2.2.2.2 Đầu tiên, tiến hành khảo sát các tính chất vật lý (nhiệt độ nóng chảy, %GC, chiều dài, mức năng lượng để hình thành các cấu trúc thứ cấp, …) của các cặp mồi bằng phần mềm trực tuyến IDT: http://sg.idtdna.com/calc/analyzer

Sau đó, kiểm tra lại khả năng bắt cặp của cặp mồi trên trình tự gen khảo sát, xác định vị trí bắt cặp của mồi, đồng thời xác định kích thước sản phẩm khuếch đại bằng phần mềm AnnHyb-4.944 (2012)

Cuối cùng, sử dụng phần mềm trực tuyến Blast trên cơ sở dữ liệu NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) để kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi với gen đích khảo sát.

Khảo sát thực nghiệm

Nghiên cứu này được tiến hành theo quy trình thực nghiệm, được mô tả trong sơ đồ 1

Sơ đồ 1 Quy trình thực nghiệm tổng quát của nghiên cứu

Tách chiết DNA từ các mẫu bệnh

Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp phenol/chloroform(Sacchi, 1987) để tách chiết DNA Đầu tiên, với tác động của SDS 10% và proteinase K, màng tế bào, màng nhân bị phá vỡ, giải phóng DNA ra môi trường Sau đó, các phân tử protein cấu trúc và enzyme nội bào bị biến tính và được loại bỏ bằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyalcohol (PCI) với tỷ lệ theo thể tích 25:24:1 Tiếp theo, DNA bộ gen được “cô đặc/tủa” với isopropanol và rửa tủa trong ethanol 70% nhằm loại bỏ muối và isopropanol Cuối cùng, DNA được hòa tan và bảo quản trong dung dịch TE 1X, ở -20 o C

Quy trình tách chiết DNA:

− Mẫu mô được cắt nhỏ và cho vào một eppendorf

− Cho thờm 100 àl dung dịch đệm PBS bảo quản mẫu, vortex nhẹ Đọc kết quả MSP bằng phương pháp điện di Đặt phản ứng MSP với DNA đã biến đổi bisulfite

Xử lý DNA bằng muối bisulfite Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA sau tách chiết Tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform (Sacchi, 1987)

Tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform với phenol pH=8 (Sacchi, 1987)

Bước 1: Phá vỡ tế bào

− Thờm 700 àl lysis buffer, vortex nhẹ, ủ qua đờm (lớn hơn 12 giờ) ở 56 o C Lưu ý: Lysis buffer được phối trộn giữa các hóa chất với nồng độ và thể tích theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Nồng độ và thể tích các chất trong lysis buffer

Húa chất Thể tớch (àl)

Dung dịch H 2 O (đã hấp) 618 Proteinase K (100 àg/ml) 7

− Tiến hành ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 20 phút, sau đó, thu dịch nổi vào một eppendorf mới

− Bổ sung 700 àl dung dịch PCI (Phenol/Choroform/Isoamylalcohol với tỷ lệ theo thể tích 25:24:1), lắc đều ống và ly tâm 13,000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi lớp trên cùng Lặp lại bước này 2 hoặc 3 lần (tùy vào thao tác thí nghiệm)

− Bổ sung 1V chloroform (V: là thể tích dịch nổi thu được), đảo trộn nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch nổi

− Tiến hành bổ sung 1/10V dung dịch NaOAc 3M (hoặc NH 4 OAc 5M) và thêm 1V isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4 o C trong vòng 2 giờ

− Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu tủa

Bước 4: Rửa tủa và bảo quản DNA

− Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, loại dịch nổi, thu DNA kết tủa

− Phơi khô tự nhiên DNA qua đêm, hoặc sấy

− Bổ sung 150 àl TE 1X và bảo quản ở -20 o C đến khi sử dụng

Xác định độ tinh sạch và nồng độ của DNA sau tách chiết bằng phương

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 (Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (với A 260 = 1OD = 50 μg/ml DNA sợi đôi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A 260 /A 280 nằm trong khoảng giá trị từ 1,8 - 2,0 Đồng thời, chỉ số A 230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số A 260 và A 280 Chỉ số A 230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu DNA (bị nhiễm carbohydrate hoặc phenol)

DNA sau khi tỏch chiết được pha loóng 50 lần bằng TE (pha 2 àl DNA với

98 àl TE) Sau đú, chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở cỏc bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm Độ tinh sạch của DNA được xác định bằng tỷ số A 260 /A 280

Quá trình biến đổi bisulfite DNA bằng bộ kít

Sử dụng bộ kit biến đổi bisulfite MethylEdge™ N1301 của Promega để biến đổi bisulfite DNA đã tách chiết Sodium bisulfite sẽ biến đổi những cytosine không bị methyl hóa của DNA thành uracil, 5-methyl cytosine không thay đổi sau khi xử lý với sodium bisulfite DNA được cố định trên màng của cột xoay, trải qua các bước rửa sạch muối, cuối cùng, DNA được rửa giải khỏi màng bằng ME Elution Buffer

− Pha ME - Wash Buffer 1X bằng cách thêm 24 ml ethanol 95 – 99% vào chai ME

- Wash Buffer 6ml 5X và đảo trộn

− Chuõ̉n bị 20àl DNA: cỏc mẫu nhỏ hơn 20àl nờn cho thờm nước khụng cú nuclease cho đủ 20àl, cỏc mẫu lớn thỡ nờn chia nhỏ ra thành cỏc phần 20àl và lặp lại các phản ứng

− Cho 20 àl DNA vào eppendorf

− Thờm 130 àl Bisulfite ME Conversion Buffer vào mỗi mẫu DNA và hỳt trộn nhẹ nhàng bằng pipet

− Ly tâm nhanh (spin mẫu) và cho vào máy luân nhiệt với chu trình:

− Tiến hành ủ mẫu ở 4 o C hoặc trong nước đá, tránh ánh sáng, trong 20 giờ

Khử sulfite và tinh sạch DNA:

− Đặt cột xoay ME vào ống thu nhận

− Bổ sung 600 àl ME Binding Buffer vào cột xoay ME Chuyển toàn bộ mẫu đó được xử lý bisulfite vào cột, đậy nắp và đảo trộn

− Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ phần dịch và gắn cột xoay ME trở lại ống thu nhận

− Bổ sung 100 àl ME Wash Buffer 1X Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy

− Bổ sung 200 àl ME Desulfonation Buffer vào mỗi cột xoay ME, đúng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sau đó, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây

− Thờm 200 àl ME Wash Buffer Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 30 giõy (lặp lại hai lần)

− Đặt cột xoay ME vào trong eppendorf 1.5 ml, thờm 20 àl ME Elution Buffer và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 giây ME Elution Buffer có thể thay thế bằng nước không có nuclease hoặc TE Buffer (pH ≥6)

− Loại bỏ cột xoay ME, đậy nắp ống, bảo quản ở 4 o C và tránh được ánh sáng

MSP bản chất là phản ứng PCR bình thường Điểm khác biệt chủ yếu ở MSP là sử dụng DNA mạch khuôn đã qua xử lý sodium bisulfite Làm tất cả các cytosine không bị methyl hóa chuyển thành uracil, còn 5-methyl cytosine thì giữ nguyên Phản ứng MSP sử dụng hai cặp mồi methyl và unmethyl trong hai phản ứng PCR riêng biệt Sản phẩm sau khi PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose, nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới tia UV

Tiến hành đặt phản ứng MSP trên các mẫu DNA đã biến đổi bisulfite với hai cặp mồi methyl và unmethyl của gen RASSF1A tham khảo từ nghiên cứu của Zhi-

Gang Pan và cộng sự (2005) Trình tự hai cặp mồi methyl và unmethyl gen

RASSF1A được mô tả ở bảng 2.2 Phản ứng MSP được tiến hành với tổng thể tích phản ứng 15 àl với cỏc thành phần phản ứng được mụ tả trong bảng 2.3

Bảng 2.2 Mồi methyl và unmethyl của gen RASSF1A trong phản ứng MSP

Kí hiệu mồi Trình tự mồi chiều 5’-3’ Sản phẩm

M_RASSF1A_F CGA GAG CGC GTT TAG TTT CGT T

192 M_RASSF1A_R CGA TTA AAC CCG TAC TTC GCT AA

U_RASSF1A _F GGG GGT TTT GTG AGA GTG TGT TT

204 U_RASSF1A_R CCC AAT TAA ACC CAT ACT TCA CTA A

Chú thích: M- mồi methyl, U- mồi unmethyl Cặp nucleotide được in màu đỏ là cặp nucleotide CG thuộc đảo CpG

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng MSP

Thành phần Thể tớch (àl)

DNA đã biến đổi bisulfite 1,0

Tổng Vphản ứng 15,0 Để đảm bảo độ chính xác, cần tiến hành phản ứng MSP với chứng âm: thay DNA bằng nước cất hai lần Chu kì nhiệt của phản ứng MSP đối với cả hai cặp mồi được mô tả ở hình 2.1

Hình 2.1 Chu kì nhiệt của phản ứng MSP đối với hai cặp mồi gen RASSF1A

Chú thích: X là nhiệt độ bắt cặp của mồi ( o C) X này có thể thay đổi trong quá trình làm để tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của mồi Mồi methyl của gen RASSF1A có

XP o C Đọc kết quả MSP bằng phương pháp điện di

DNA là phân tử tích điện âm đồng đều khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA

Các phân tử DNA trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của DNA mạch đôi và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ = 300 nm) Kích thước của phân tử DNA (kích thước sản phẩm mong đợi) sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn

− Cho 1,5 g agarose và 100 ml đệm TBE 1X vào erlen, đun trong 4 phút Trong khi đun lấy ra lắc nhẹ, đều tay mỗi khi hỗn hợp sôi Đun xong lấy erlen ra lắc nhẹ, để nguội đến nhiệt độ khoảng 55 o C, thờm 1,7 àl Ethidium bromide, lắc nhẹ cho Ethidium bromide tan đều Đỗ hỗn hợp vào khuôn, tránh để gel có bọt khí

Kết quả Khai thác dữ liệu

Mục đích khai thác dữ liệu từ các nghiên cứu trên thế giới liên quan đến sự đánh giá mức độ methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A, nhằm xây dựng cơ sở lý thuyết khoa học để khẳng định sự methyl hóa vượt mức tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A có tiềm năng làm dấu chứng sinh học để chẩn đoán cho việc phát hiện ung thư và tiên lượng bệnh cho các bệnh nhân UTVH

Qua khai thác dữ liệu từ 17 công trình nghiên cứu trên thế giới, được cập nhật từ tháng 5 năm 2001 đến tháng 8 năm 2015, liên quan đến việc đánh giá mức độ methyl hóa vượt mức tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A trên các mẫu bệnh ung thư vòm họng Kết quả khai thác dữ liệu cho thấy tần số methyl hóa của gen RASSF1A trên các mẫu ung thư vòm họng khá cao và có sự khác biệt lớn so với mẫu mô vòm họng bình thường

Sau khi tiến hành khảo sát dữ liệu trên Pubmed và Pubmed Central (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ ) với các từ khóa đã được đề cập ở trên, kết quả khảo sát cho thấy trong 17 công trình nghiên cứu sử dụng đa dạng các loại mẫu, kích thước mẫu khác nhau và nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện sự methyl hóa của gen RASSF1A

Tần số methyl hóa của gen RASSF1A, phương pháp phát hiện và loại mẫu sử dụng trong 17 công trình nghiên cứu đã khảo sát, được tổng hợp ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Tần số methyl hóa của gen RASSF1A , phương phát phát hiện và loại mẫu sử dụng trong 17 nghiên cứu khảo sát được

TLTK Phương pháp phát hiện Loại mẫu Số lượng mẫu ung thư/bình thường

Tần số methyl hóa trên mẫu ung thư /bình thường

Mô sinh thiết Dịch phết Dịch M & T

[28] MSP Mô đúc paraffin và mẫu Brushing 53/25 75,5/4

Mô sinh thiết dương tính với EBNA1

Mô sinh thiết Dòng tế bào

Mô sinh thiết Dịch phết

Chú thích: TLTK: tài liệu tham khảo, MSP: Methylation-Specific Polymerase chain reaction, MMSP: Multiplex Methylation Specific PCR, COBRA: Combined bisulfite restriction analysis, NP Brushinng: Nasopharyngeal Brushing, dịch M&T: mouth and throat rinsing (-): bài báo không đề cập

Bảng 3.1 cho thấy sự methyl hóa của một gen bất kỳ có thể được phát hiện bằng nhiều phương pháp và trên nhiều loại mẫu khác nhau Phương pháp dùng để đánh giá mức độ methyl hóa và nguồn mẫu sử dụng là hai nguyên nhân chính dẫn đến tần số methyl hóa khác nhau giữa 17 nghiên cứu khảo sát được Ngoài ra, còn có nhiều nguyên nhân khác (cỡ mẫu thử nghiệm, thời gian thử nghiệm, …) dẫn đến sự khác nhau về tần số methyl hóa gen RASSF1A trong 17 công trình nghiên cứu khảo sát được

Do vậy, cần tiến hành tính tần số methyl hóa trung bình có trọng số nhằm loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thống kê (kỹ thuật phân tích mức độ methyl hóa, loại mẫu thử nghiệm, kích thước mẫu thử nghiệm và thời gian thử nghiệm)

Bảng 3.2 Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh ung thư vòm họng phân theo loại tế bào

Chú thích: TBTS là trung bình có trọng số

Loại tế bào Số lượng mẫu

Tần số methyl hóa TBTS (%)

Hình 3.1 Biểu đồ tần số methyl hóa và tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A trong tế bào ung thư vòm họng và tế bào bình thường

Chú thích: n là cỡ mẫu sử dụng Kích thước đường tròn thể hiện số lượng mẫu sử dụng trong các nghiên cứu Tâm các đường tròn thể hiện sự methyl hóa gen

RASSF1A đã đề cập trong các nghiên cứu khảo sát được Đường thẳng nằm ngang hiển thị tần số methyl hóa trung bình có trọng số của mỗi loại tế bào trong tất cả 17 công trình nghiên cứu khảo sát được

Hình 3.1 cho thấy tần số methyl hóa của gen RASSF1A ở tế bào ung thư vòm họng trong 17 nghiên cứu khảo sát dao động từ 5% đến 91,26% trong khi tần số methyl hóa của gen RASSF1A ở tế bào bình thường là từ 0% đến 5,6% Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A trong tế bào UTVH khá cao

(59,15%), cao gấp12,45 lần so với tần số methyl hóa trung bình có trọng số trong tế bào vòm họng bình thường (4,76%) và có sự khác biệt so với tế bào vòm họng bình thường Điều này cho thấy tính trạng methyl hóa của gen RASSF1A liên quan chặt chẽ với bệnh lý ung thư vòm họng Để có thể phát triển quy trình thực nghiệm về sau, cần phải tiến hành thống kê để đánh giá mức độ phổ biến của các phương pháp phát hiện sự methyl hóa và loại mẫu sử dụng trong 17 nghiên cứu khảo sát được Kết quả thống kê được mô tả trong bảng 3.3 và bảng 3.4

Bảng 3.3 Các phương pháp phát hiện sự methyl hóa được sử dụng trong 17 nghiên cứu đã khảo sát

Phương pháp Thống kê Tài liệu tham khảo

Từ kết quả bảng 3.3, cho thấy trong số 17 công trình nghiên cứu, có công trình nghiên cứu của Nawaz I và cộng sự (2015), sử dụng cùng lúc hai phương pháp khác nhau (MSP và MMSP) để so sánh và đánh giá mức độ methyl hóa trên hai nguồn mẫu (mẫu sinh thiết, mẫu sinh thiết dương tính với EBNA1) [39] Qua đây, cho thấy có thể sử dụng cùng một lúc nhiều phương pháp khác nhau để so sánh và đánh giá mức độ methyl hóa của một gen bất kỳ trên cùng một nguồn mẫu hoặc nhiều nguồn mẫu khác nhau Trong tất cả các nghiên cứu, MSP là phương pháp được sử dụng nhiều nhất để phân tích mức độ methyl hóa của gen RASSF1A trong các mẫu bệnh UTVH, chiếm tỷ lệ 82,35% trong 17 công trình nghiên cứu khảo sát được Ngoài ra, các kĩ thuật khác như MMSP, Real – time Quantitative PCR và COBRA cũng được sử dụng, chiếm tỷ lệ lần lượt là 11,76%, 5,88% và 5,88% trong

17 công trình nghiên cứu khảo sát được

Tuy có nhiều kĩ thuật phát hiện sự methyl hóa, nhưng MSP vẫn được sử dụng nhiều nhất Do độ nhạy của kỹ thuật này cho phép định tính sự methyl hóa của các DNA thu nhận không chỉ ở các mẫu mô tươi đông lạnh, máu ngoại vị, tủy xương hay dịch cơ thể mà cả các mẫu đúc paraffin [23] Đồng thời, MSP là một phương pháp nhanh, có hiệu quả, không đòi hỏi các chất cảm ứng phóng xạ hay mẫu dò như phương pháp Real–time Quantitative PCR hoặc các emzyme giới hạn như phương pháp COBRA và có thể phân tích một số lượng lớn các mẫu lâm sàng

[25] Kể cả các nghiên cứu rất mới của các tác giả như Imran Nawaz (2015) [39] , Challouf S (2012) [10] và Fangyun T (2012) [21] đều sử dụng phương pháp MSP

Vì đây là phương pháp cho phép xác định nhanh và chính xác tình trạng methyl hóa của DNA và cho phép xác định một bản sao gen bị methyl hóa trong số 1000 bản sao gen không bị methyl hóa [39]

Bảng 3.4: Loại mẫu được sự dụng trong 17 nghiên cứu khảo sát được

Loại mẫu Thống kê Tài liệu tham khảo

Khác (dịch M&T, mô sinh thiết dương tính

Qua phân tích loại mẫu sử dụng trong 17 nghiên cứu khảo sát được, cho thấy mẫu bệnh phẩm UTVH được các nhà khoa học sử dụng nhiều nhất là mẫu mô sinh thiết, chiếm 47,06%, do mẫu thử nghiệm được lấy ngay tại vị trí khối u ung thư, nên trong mẫu thử nghiệm sẽ chứa số lượng tế bào ung thư cao hơn nhiều so với số lượng tế bào bình thường Tiếp theo, mẫu mô và mẫu đúc paraffin (đều chiếm 17,65%) cũng được sử dụng khá nhiều Bên cạnh đó, dòng tế bào và xenograft cũng được lựa chọn nhiều (chiếm 29,41%), có thể là do các tính chất của dòng tế bào ổn định Một số loại mẫu khác như mẫu dịch phết (17,65%), mẫu máu chiếm 11,76% và các dịch từ miệng, vòm họng của các bệnh nhân bị UTVH cũng được sử dụng, nhưng ít hơn các loại mẫu khác, do trong các loại mẫu này có chứa ít các tế bào có dấu hiệu bất thường và hiếm khi có các tế bào đạt tới giai đoạn ung thư nên ít được sử dụng

Bảng 3.5 Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A ở bệnh ung thư vòm họng phân theo loại mẫu

Loại mẫu Số lượng mẫu Tần số methyl hóa TBTS (%) Tài liệu tham khảo

Chú thích: TBTS là trung bình có trọng số

Kết quả khảo sát in silico

Khảo sát in silico gen RASSF1A

Gen RASSF1A định vị tại vị trí 21.3 trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 3 thuộc bộ gen người (hình 3.3) RASSF1A phiên mã tạo ra phân tử mRNA có kích thước 1949 bp, dịch mã tạo ra 1 phân tử protein có 340 aa, có trọng lượng phân tử

39 kD Nó có các exon 1α, 2αβ, 3, 4, 5, 6 [26, 34]

Hình 3.3 Vị trí gen RASSF1A trên nhiễm sắc thể số 3 [63]

Thu nhận trình tự gen RASSF1A và xác định vùng promoter cần khảo sát

Tiến hành thu nhận trình tự vùng promoter của gen RASSF1A từ ngân hàng gen trên cơ sở dữ liệu NCBI dưới dạng graphics theo mã số truy cập DQ444319 Trình tự này gồm có vùng promoter và vùng exon của gen RASSF1A.Vùng promoter thứ nhất nằm từ vị trí nucleotide 1 đến vị trí nucleotide 760, vùng exon bắt đầu từ vị trí nucleotide 761 Vùng promoter thứ hai định vị từ vị trí nucleotide

1011 đến vị trí nucleotide 2001 (hình 3.4)

Hình 3.4.Trình tự của gen RASSF1A theo mã số truy cập DQ 444 319

Chú thích: vùng trình tự màu xanh lá là vùng promoter, vùng trình tự màu hồng là exon

Sau đó, đưa trình tự có mã số truy cập DQ444319 vào phần mềm Methprimer để xác định các đảo CpG trong trình tự gen khảo sát (nếu có) Kết quả có 2 đảo CpG định vị trong trình tự khảo sát này, đảo CpG 1 có độ dài 133 bp, nằm từ vị trí nucleotide 424 – 556 Đảo CpG 1 nằm hoàn toàn trong vùng promoter thứ nhất của trình tự gen khảo sát Đảo CpG 2 có độ dài 636 bp, kéo dài từ vị trí nucleotide 564 – 1199 Đảo này vừa nằm trong vùng promoter, vừa nằm trong vùng exon của gen RASSF1A Một phần đảo CpG 2 nằm trong vùng promoter, với độ dài

197 bp (vị trí nucleotide 564 – 760) Một phần đảo CpG 2 nằm trong vùng exon, kéo dài từ vị trí nucleotide 761 – 1010 (250 bp) (hình 3.5 A)

Dựa trên một số nghiên cứu đã công bố trên thế giới về gen RASSF1A trong UTVH như của tác giả Kwok- wai Lo năm 2001 [31] , Zhi-Gang Pan năm 2005 [55] , … đều tập trung thiết kế mồi cho phản ứng MSP trong vùng trình tự promoter chứa đảo CpG để tiến hành đánh giá tính trạng methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A Do các yếu tố phiên mã thường hiện diện trong vùng promoter, có liên quan đến sự biểu hiện gen

Tiếp theo, sử dụng phần mềm TFBIND để xác định vị trí nhận biết của các nhân tố phiên mã quan trọng tại vùng promoter của trình tự gen khảo sát Một số yếu tố phiên mã quan trọng đã được nhận diện thuộc vùng promoter thứ nhất của trình tự khảo sát như là E2F, GATA1, GATA2, HSF2, SP1, P300, ALM1, MZF1,

… Các nhân tố phiên mã này hiện diện nhiều trong vùng trình tự dài 337 nucleotide bắt đầu từ vị trí nucleotide 424 đến vị trí nucleotide 760 (đảo CpG1 và một đoạn của đảo CpG2 từ vị trí nucleotide 564-760) của trình tự DQ 444 319 Các nhân tố phiên mã kể trên đều hiện diện trong vùng trình tự ở vị trí nucleotide 424 đến vị trí nucleotide 760 thuộc promoter nên sẽ quyết định đến sự phiên mã và biểu hiện của gen RASSF1A

Do đó, vùng đảo CpG1 và một phần đảo CpG 2 (từ vị trí nucleotide 564-760) thuộc vùng promoter thứ nhất của trình tự DQ 444 319 được chọn để khảo sát và đánh giá các bộ mồi kế thừa từ nghiên cứu đã công bố trên NCBI như: tác giả Zhi- Gang Pan và cộng sự (2005) [55] , Fendri A và cộng sự (2009) [22] , Wang T và cộng sự (2009) [50] , Kwok-Wai Li và cộng sự (2001) [31]

Qua quá trình khảo sát và đánh giá các cặp mồi thu thập được, kết quả khảo sát cho thấy hai cặp mồi của tác giả Zhi-Gang Pan và cộng sự (2005) là thích hợp nhất cho phản ứng MSP của gen RASSF1A Do các vị trí CpG trong trình tự mồi và bên trong sản phẩm MSP tạo ra giữa hai mồi hoặc các nucleotide kế cận các vị trí CpG đều là các ví trí “nóng” (hot spot): chúng chính là các trình tự mồi hoặc một phần của trình tự nhận biết của các nhân tố điều hòa phiên mã quan trọng Những vị trí nóng này dễ bị đột biến hay methyl hóa dẫn đến làm ngưng phiên mã của gen và làm mất chức năng ức chế khối u của gen RASSF1A Mồi xuôi và mồi ngược của bộ mồi methyl được kí hiệu là M_RASSF1A, M_RASSF1A_R và bộ mồi không methyl là U_RASSF1A_F, U_RASSF1A_R Cả hai cặp mồi tham khảo của tác giả Zhi-Gang Pan và cộng sự (2005) đều được xác định bắt cặp với trình tự gen khảo sát tại vùng trình tự của đảo CpG1 và một đoạn của đảo CpG2 (từ vị trí nucleotide 564-760), bởi phần mềm AnnHyb, nằm từ vị trí nucleotide 565- vị trí nucleotide

586 là mồi xuôi methyl, mồi ngược methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 734 - vị trí nucleotide 756, khuyếch đại đoạn gen có kích thước 192bp Mồi xuôi không methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 555 - 577 và mồi ngược không methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 734 – 758, sản phẩm khuếch đại 204bp

Sau khi chọn được vùng trình tự mục tiêu (vùng trình tự từ vị trí nucleotide 424-760) cho việc khuếch đại vùng promoter của gen RASSF1A nhằm kiếm tra sự methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen, tiếp theo tiến hành mô tả vị trí của các yếu tố phiên mã và vị trí bắt cặp của hai bộ mồi trên đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A, được trình bày trong hình 3.5 B Để dễ vẽ thì nên chọn mở rộng cả hai đầu của vùng trình tự trên, bắt đầu từ vị trí nucleotide 400 – 800

Hình 3.5 A: Biểu đồ thể hiện vị trí các đảo CpG trên trình tự khảo sát B: trình tự promoter chứa đảo CpG, vị trí bắt cặp mồi unmethyl, mồi methyl và vị trí nhận biết của các nhấn tố phiên mã

Chú thích: Các nucleotide nằm trong khung hình chữ nhật màu đen là nhân tố phiên mã Vùng trình tự được gạch dưới bằng thanh ngang màu đen là vị trí bắt cặp của cặp mồi methyl (M_RASSF1A_F, M_RASSF1A_R) Vùng trình tự được gạch ở phía trên đầu bằng thanh ngang màu xanh lá là vị trí bắt cặp của cặp mồi không methyl (U_RASSF1A_F, U_RASSF1A_R) Vị trí CG được tô màu đỏ là vị trí CG thuộc đảo CpG1, CpG2 thuộc vùng promoter thứ nhất của trình tự khảo sát, vùng trình tự được tô màu tím là vùng exon Dấu >, < thể hiện chiều của trình tự nhận biết của nhân tố phiên mã.

Đánh giá mồi

Kiểm tra thông số vật lý của mồi bằng chương trình IDT

Từ cặp mồi methyl và không methyl của gen RASSF1A tham khảo từ nghiên cứu của Zhi-Gang Pan và cộng sự, năm 2005, tiến hành kiểm tra và phân tích các thông số vật lý của mồi bằng chương trình IDT (http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)

Việc đánh giá mồi dựa trên các thông số vật lý sau:

Thành phần nucleotide A, T, C, G trong trình tự mồi là một thông số quan trọng cho một phản ứng PCR, nó ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA cũng như nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA Cặp mồi methyl và không methyl tỉ lệ A, T,

C, G có thể không nằm trong khoảng tối ưu như các mồi chuẩn dành cho một phản ứng PCR, vì mồi thiết kế cho MSP chứa nhiều cytosine tự do (để phân biệt DNA đã biến đổi hay không biến đổi bisufite), đồng thời có ít nhất một cặp CpG nằm ở vị trí đầu 3’của mồi (để phân biệt sự khác nhau của các allen bị methyl hóa và không methyl hóa) Các cytosine tự do sẽ bị biến đổi thành uracil sau khi biến đổi sodium bisulfite Do đó, thành phần (G + C) trung bình thường thấp hơn khoảng 50 – 60%

Hai cặp mồi khảo sát là mồi methyl: M_RASSF1A_F, M_RASSF1A_R, mồi không methyl: U_RASSF1A_F, U_RASSF1A _R đều có %CG nằm trong khoảng từ 36 đến 50% nên đều phù hợp dùng cho phản ứng MSP (bảng 3.6)

Chiều dài của mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR, thông thường dao động từ 20 bp – 25 bp Thực tế, trong nhiều trường hợp cụ thể thì chiều dài có thể dài hơn hoặc ngắn hơn chiều dài chuẩn, dao động 15 bp – 30 bp Hai cặp mồi khảo sát đều có chiều dài hoàn toàn phù hợp, dao động từ 22- 25 nucleotide

Nhiệt độ nóng chảy của các mồi (Tm) cũng là một thông số ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả của phản ứng PCR, được tính theo công thức: Tm = 69,3 + 0,41 *

%CG Dựa vào Tm mà ta có thể quyết định nhiệt độ bắt cặp (Ta) của mồi với DNA khuôn trong phản ứng PCR cho thích hợp Thông thường, nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược nên tương đương nhau, không nên chênh lệch nhau quá 5 0 C

Cả hai cặp mồi khảo sát đều có nhiệt độ nóng chảy chênh lệch không quá

5 0 C, cụ thể là cặp mồi methyl chênh lệch nhau 3,2 0 C, cặp mồi không methyl chênh lêch nhau 4,8 0 C (xem bảng 3.6)

Khả năng liên kết tạo cấu trúc thứ cấp của mồi cũng là một tiêu chí quan trọng để đánh giá mồi Cấu trúc này bao gồm: hairpin loop (tự bắt cặp giữa các base trong cùng một oligonucleotide), self - dimer (các oligonucleotide giống nhau tự bắt cặp với nhau) và hetero dimer (hai oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau) Nếu cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của mồi vào trình tự DNA đích Để xác định độ bền vững của các liên kết trên, người ta dùng một khái niệm là giá trị biến đổi năng lượng tự do G (kcal/mole) Theo hãng IDT, giá trị G của các mồi lớn hơn âm 9 (kcal/mole) thì sẽ không ảnh hưởng đến hiệu quả của phản ứng PCR Khả năng liên kết tạo cấu trúc thứ cấp của hai cặp mồi khảo sát Đối với cặp mồi không methyl: cấu trúc kẹp tóc của mồi xuôi, mồi ngược và khả năng tự bắt cặp (Self-Dimer) đều có mức năng lượng G lớn hơn âm 9 (kcal/mole) Các chỉ tiêu về cấu trúc thứ cấp này đều đạt yêu cầu Chỉ có mồi xuôi bắt cặp với mồi ngược (Hetero Dimer) có mức năng lượng G không đạt yêu cầu (- 11,37), nhỏ hơn âm 9 (kcal/mole) Điều này làm ảnh hưởng đến quá trình PCR nhưng chúng ta có thể kiểm soát được bằng cách chỉnh nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA đích để hạn chế hình thành các cấu trúc thứ cấp này Đối với cặp mồi methyl: cấu trúc kẹp tóc (Hairpin) của mồi xuôi và mồi ngược lần lượt là -0,2 và -0,67 kcal/mole đều lớn hơn -9 kcal/mole, mồi xuôi bắt cặp mồi ngược cũng có mức năng lượng G lớn hơn -9 kcal/mole, nên chúng đều đạt yêu cầu Tuy nhiên, khả năng tự bắt cặp (Self-Dimer) của mồi xuôi có mức năng lượng G (-10,36) không đạt yêu cầu, điều này làm ảnh hưởng đến quá trình PCR nhưng chúng ta có thể kiểm soát được bằng cách chỉnh nhiệt độ bắt cặp của mồi với DNA đích để hạn chế hình thành các cấu trúc thứ cấp này Δ Δ Δ Δ Δ Δ

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát các đặc tính vật lý của hai cặp mồi khảo sát bằng chương trình IDT

Chú thích: Ký tự F-mồi xuôi, R-mồi ngược, M-methyl, U-unmethyl (-) là ký hiệu mồi không hình thành cấu trúc kẹp tóc Nucleotide được tô màu đỏ là nucleotide C thuộc đảo CpG L: chiều dài, bp : base pair, Tm : nhiệt độ nóng chảy

Kí hiệu mồi Trình tự mồi: 5’-3’

CGA GAG CGC GTT TAG TTT CGT T

CGA TTA AAC CCG TAC TTC GCT AA

GGG GGT TTT GTG AGA GTG TGT TT

CCC AAT TAA ACC CAT ACT TCA CTA

(1) G Hair-pin (kcal/mole): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc

(2) G Self dimer (kcal/mole): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self dimer

(3) G Hetero dimer (kcal/mole): mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc hetero dimer

Kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi

Vùng trình tự promoter thứ nhất của trình tự DQ 444 319 được chọn để khảo sát mồi, nên phải tiến hành biến đổi bisufite vùng promoter này bằng phần mềm Methprimer Sau đó tiến hành kiểm tra lại khả năng bắt cặp của 2 cặp mồi khảo sát trên vùng promoter thứ nhất của trình tự DQ 444 319 đã được biến đổi bisufite bằng phần mềm Annhyb, 2012 Kết quả cho thấy hai cặp mồi có khả năng bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu Đồng thời Annhyb cũng cho thấy vị trí bắt cặp của hai cặp mồi trên vùng trình tự promoter của gen RASSF1A, từ đó, suy ra được kích thước sản phẩm được khuếch đại bởi hai cặp mồi này (hình 3.6 và hình 3.7)

Hình 3.6 Kết quả bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược methyl trên vùng promoter gen RASSF1A đã biến đổi bisulfite Δ Δ Δ

Chú thích: Màu đỏ là vị trí mồi xuôi methyl bắt cặp trên vùng promoter gen

RASSF1A, màu xanh lá là vị trí mồi ngược methyl bắt cặp trên vùng promoter gen RASSF1A

Nhận xét: Hình 3.6 cho thấy cặp mồi methyl (M_RASSF1A_F, M_RASSF1A_R) bắt cặp đặc hiệu 100% với trình tự vùng promoter của gen

RASSF1A đã biến đổi bisulfite, không có mismatch Mồi xuôi methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 565- vị trí nucleotide 586, mồi ngược methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 734 - vị trí nucleotide 756 Cặp mồi methy này khuyếch đại đoạn gen có kích thước 192 bp giống với kích thước sản phẩm của công trình nghiên cứu Zhi- Gang Pan và cộng sự (2005) đã công bố

Hình 3.7 Kết quả bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không methyl trên vùng promoter gen RASSF1A đã biến đổi bisulfite

Chú thích: Màu đỏ là vị trí mồi xuôi không methyl bắt cặp trên vùng promoter gen

RASSF1A, màu xanh lá là vị trí mồi ngược không methyl bắt cặp trên vùng promoter gen RASSF1A Màu hồng là mismatch ở các C thuộc CpG

Nhận xét: Cặp mồi không methyl không bắt cặp đặc hiệu 100% với trình tự vùng promoter gen RASSF1A đã biến đổi bisulfite và có ba mismacth ở mỗi mồi

Chỉ xuất hiện mismatch ở các vị trí C thuộc CpG do trình tự promoter đã được chuyển sang dạng biến đổi bisulfite nhưng các C thuộc CpG thì vẫn được giữ nguyên Nếu trình tự gen làm thực nghiệm không có sự methyl hóa thì các C thuộc CpG sẽ bị biến đổi thành T, mồi không methyl vẫn sẽ bắt cặp tốt (bắt cặp đặc hiệu 100%), không ảnh hưởng tới tính đặc hiệu của mồi Mồi xuôi không methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide 555 - 577 và mồi ngược không methyl bắt cặp từ vị trí nucleotide

734 - 758 Sản phẩm khuếch đại bởi cặp mồi không methyl có chiều dài là 204 bp giống với kích thước sản phẩm của công trình nghiên cứu Zhi-Gang Pan và cộng sự (2005) đã công bố

Kiểm tra độ đặc hiệu của hai cặp mồi khảo sát

Hai cặp mồi dùng cho phản ứng MSP, được tham khảo từ nghiên cứu Zhi- Gang Pan và cộng sự năm 2005, sẽ được kiểm tra độ đặc hiệu với gen mục tiêu bằng chương trình Blast Qua kết quả phân tích nhận thấy hai cặp mồi đều đặc hiệu với trình tự gen có mã số truy cập trên NCBI là NC_000003, do đó hai cặp mồi này đều đặc hiệu với trình tự gen của người (homo sapiens) (phụ lục 1)

Kết luận: Từ kết quả đánh giá mồi bằng chương trình IDT cho thấy cả cặp mồi methyl và không methyl đều có các thông số vật lý cơ bản có thể chấp nhận được so với các quy định để đánh giá mồi Bên cạnh đó, cả hai cặp mồi methyl và không methyl đều bắt cặp đặc hiệu với trình tự bị methyl hóa và trình tự không bị methyl hóa thông qua việc đánh giá bằng phần mềm Annhyb và Blast Đồng thời cả hai cặp mồi methyl và không methyl đều bắt cặp đúng vào vùng promoter mục tiêu cần khảo sát (vùng trình tự từ vị trí nucleotide 424-760 trong trình tự DQ 444 319) (hình 3.5 B) Từ những kết quả khảo sát trên, cơ bản có thể sử dụng hai cặp mồi methyl và không methyl cho phản ứng MSP trong quá trình làm thực nghiệm về sau.

Kết quả thực nghiệm

Kết quả tách chiết DNA

Mười mẫu thí nghiệm sau khi tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform, kết quả tách chiết DNA sẽ được kiểm tra thông qua phương pháp đo quang phổ ở các bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm Mẫu DNA được pha loóng 50 lần (hỳt 2 àl DNA, bổ sung thờm 98 àl H 2 O khụng chứa nuclease) trước khi đo mật độ quang Kết quả được trình bày trong bảng 3.7

Bảng 3.7 Nồng đồ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết

Chú tích: Các mẫu từ T1-T8 là 8 mẫu mô bị UTVH và hai mẫu S1, S2 là mẫu dịch phết không bị UTVH (mẫu lành) theo chẩn đoán của bác sỹ bệnh viện Chợ Rẫy

Nhận xét: Giá trị tỉ số A 260 /A 280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 cho biết DNA tách chiết tinh sạch, nếu giá trị tỉ số A 260 /A 280 thấp hơn hoặc cao hơn khoảng giá trị trên, có nghĩa là mẫu DNA tách chiết đã bị nhiễm protein hoặc RNA Trong 10 mẫu, giá trị

A 260 /A 280 dao động từ 1,688 – 2,083, đây là khoảng giá trị chấp nhận được về mức

Mẫu A 230 (nm) A 260 (nm) A 280 (nm) A 260 / A 230 A 260/ A 280 Nồng độ

S2 0,573 0,086 0,042 0,150 2,048 215,0 độ tinh sạch của DNA tách chiết Năm mẫu T1, T2, T3,T4, T7 có giá trị tỉ số

A 260 /A 280 nằm trong khoảng 1,8 -2 nên 5 mẫu DNA này có độ tinh sạch cao Bên cạnh đó, các mẫu T5, T6, S1, S2 có giá trị tỉ số A 260 /A 280 dao động từ 2,048-2,083 các giá trị này đều nằm gần 2 cho thấy mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch tạm chấp nhận được và mẫu có nhiễm ít RNA Mẫu T8 có chỉ số A 260 /A 280 là 1,688 thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu này tách chiết bị nhiễm protein

Giá trị tỉ số A260/A 230 thấp hơn khoảng giá trị 2,0 -2,2 cho biết mẫu còn bị nhiễm carbohydrate hoặc cặn phenol (sử dụng trong quá trình tách chiết DNA) [59]

Trong 10 mẫu dùng trong nghiên cứu nay, giá tri tỉ số A 260 /A 230 dao động từ 0,119 – 0,280 đều thấp hơn rất nhiều so với khoảng giá trị mong đợi từ 2,0-2,2 Điều này cho thấy các mẫu DNA tách chiết vẫn còn dư phenol hoặc là carbohydrate [59] , thao tác thực hiện vẫn chưa được tốt Ngoài ra, 10 mẫu DNA trên có nồng độ DNA khá cao, dao động từ 160 – 460 (àg/ml) và khụng đồng đều Nguyờn nhõn chủ yếu là do lượng tế bào trong mỗi mẫu bệnh phẩm không đều nhau

Tóm lại, thông qua bảng 3.7 cho thấy DNA tách chiết đảm bảo độ tinh sạch và nồng độ cho quá trình biến đổi bisulfite DNA.

Kết quả phản ứng MSP

Sau khi tách chiết và biến đổi bisulfite DNA, tiến hành thực hiện phản ứng MSP để khảo sát mức độ methyl hóa của 10 mẫu DNA bệnh phẩm với cặp mồi methyl (kí hiệu mồi: M_RASSF1A_F, R) đặc hiệu và khuếch đại cho vùng promoter khảo sát của gen RASSF1A Do giới hạn về mặt thời gian nên không thể tiến hành khảo sát thực nghiệm MSP với mồi không methyl: U_RASSF1A_F, R

Phản ứng MSP với cặp mồi methyl của gen RASSF1A được tiến hành với các thành phần được đề cập trong bảng 2.3 và chạy với chu kỳ nhiệt như hình 2.1 Kết quả của phản ứng MSP sẽ được đọc bằng phương pháp điện di trên gel argarose 1,5%, chạy với hiệu điện thế 100V trong 30 phút Kết quả phản ứng MSP trên 10 mẫu bệnh phẩm nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.8

Hình 3.8 Kết quả sản phẩm MSP với cặp mồi M_RASSF1A _F, R trên 10 mẫu DNA đã biến đổi bisulfite

Chú thích: L: thang chuẩn, thang 50 bp N là chứng âm Các mẫu T1-T8 là 8 mẫu mô bị UTVH Hai mẫu S1, S1 là mẫu dịch phết không bị UTVH

Nhận xét: hình 3.8 cho thấy, trên gel, ở tất cả các giếng đều không có xuất hiện băng kí sinh Tuy nhiên, ở tất cả các giếng loại trừ giếng thang, đều có xuất hiện băng sáng mờ có kích thước dưới 50 bp, băng sáng này là do mồi hình thành cấu trúc dimer, tuy nhiên, các băng này không làm ảnh hưởng đến việc đọc kết quả điện di của phản ứng MSP Mẫu chứng âm không xuất hiện băng sáng, chứng tỏ phản ứng MSP này không bị nhiễm Ở các giếng lót mẫu T1, T2, T3, T4, T8 và S2 đều chỉ xuất hiện một băng sáng có kích thước nằm trong khoảng từ 150 bp đến 200 bp và nằm gần với băng 200bp của thang hơn, vì vậy, băng sáng này phù hợp với kích thước 192 bp Đây chính là kích thước sản phẩm MSP mong đợi và đúng như kích thước khảo sát in silico Do đó, 6 mẫu này đều có kết quả dương tính với cặp mồi methyl khảo sát, có nghĩa là chúng đều bị methyl hóa ở đảo CpC thuộc vùng promoter của gen

RASSF1A Ở các giếng lót mẫu T5, T6, T7 và S1 không xuất hiện băng sản phẩm có kích thước 192 bp, chỉ có băng sáng do cấu trúc dimer mồi tạo ra, nằm ở kích thước dưới 50bp Do đó, 4 mẫu này có kết quả âm tính với mồi methyl hoặc cũng có thể là do DNA đã biến đổi bisulfite được bảo quản ở thời gian khá lâu nên dẫn đến âm tính Vì thế, bước đầu ghi nhận, 4 mẫu trên không bị methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A

Từ kết quả trên hình điện di sản phẩm MSP, tiến hành ghi nhận kết quả của phương pháp MSP trên 10 mẫu, kết quả được trình bày ở bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả sơ bộ của phương pháp MSP trên 10 mẫu nghiên cứu

Loại mẫu Mẫu Methyl hóa

Tỷ lệ methyl hóa 5/8 (chiếm 62,5%)

Mẫu dịch phết không bị

Tỷ lệ methyl húa ẵ (chiếm 50%)

Tổng (10 mẫu) Tỷ lệ methyl hóa 6/10 (chiếm 60%)

Chú thích: + là mẫu bị methyl hóa, - là mẫu không bị methyl hóa

Từ bảng 3.8, có thể kết luận rằng, trong 8 mẫu mô bị UTVH, có 5 mẫu xảy ra sự methyl hóa tại các CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A và chiếm

62,5% Trong hai mẫu không bị UTVH (mẫu S1, S2), có 1mẫu (chiếm 50%) bị methyl hóa tại CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A Tóm lại, 10 mẫu nghiên cứu được khảo sát mức độ methyl hóa của gen RASSF1A, có 6/10 (chiếm

60%) mẫu bị methyl hóa tại CpG thuộc vùng promoter

Kết luận: Tần số methyl hóa bất thường của gen RASSF1A trong 10 mẫu khảo sát là 60%, tỷ lệ methyl hóa khá cao Đồng thời khi so sánh tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong 8 mẫu bị UTVH (62,5%) của nghiên cứu này với tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen RASSF1A trong 17 nghiên cứu đã khảo sát ở phần khai thác dữ liệu (59,15%), cho thấy tần số methyl hóa gen RASSF1A trong nghiên cứu này cao hơn, cụ thể là cao hơn 3,35%

Mặt khác, khi so sánh tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong 8 mẫu bị

UTVH (62,5%) của nghiên cứu này với một số công trình nghiên cứu trên thế giới, nhận thấy tần số methyl hóa gen RASSF1A của nghiên cứu này cao hơn, cụ thể là trong nghiên cứu của Fangygun T (2012), tấn số methyl hóa của gen RASSF1A là 17,5% [21] , nghiên cứu của Thian-Sze Wong và cộng sự (2004), tần số methyl hóa gen RASSF1A trong các mẫu khảo sát là 5% [47] và Wong T S và cộng sự (2003), tần số methyl hóa gen RASSF1A chiếm 46% Trái lại, tần số methyl hóa của gen RASSF1A trong 8 mẫu bị UTVH (62,5%) của nghiên cứu này lại thấp hơn so với một số công trình nghiên cứu khác, chẳng hạn như công trình nghiên cứu của Fendri

A (2009), tần số methyl hóa gen RASSF1A chiếm 91% [22] , Zhou L và cộng sự (2005) tần số methyl hóa gen RASSF1A chiếm 82% [56] … Sự khác nhau về tần số methyl hóa gen RASSF1A trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu khác trên thế giới, chủ yếu là do nguồn mẫu và phương pháp phát hiện methyl hóa

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Đề nghị

− Tiến hành phản ứng MSP với cặp mồi unmethyl để xác định sự methyl hóa hoàn toàn, methyl không hoàn toàn hoặc không methyl hóa trên 10 mẫu bệnh phẩm này

− Tiếp tục khảo sát sự methyl hóa của gen RASSF1A trên cỡ mẫu nghiên cứu lớn hơn và trên nhiều loại mẫu khác nhau

− Tiến hành giải trình tự sản phẩm MSP để đánh giá chính xác tình trạng methyl hóa tại từng vị trí CpG trong vùng khảo sát của gen RASSF1A

Tài liệu tham khảo tiếng Việt

[1] Lê Thanh Hà, Lê Thanh Hòa,Võ Thị Thương Lan, Nguyễn Đình Phúc và Nguyễn Lĩnh Toàn (2012),“Khảo sát đặc điểm phân tử của gen LMP-1 của virus Epstein-Barr và liên quan methyl hóa của gen RASSF1A trên bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành, số 849/850, tr

Tài liệu tham khảo tiếng Anh

[2] Agathanggelou A., Cooper W N., Latif F (2005), ‘Role of the Ras- association domain family 1 tumor suppressor gene in human cancers’,

[3] Baksh S., Tommasi S., Fenton S and at el (2005), ‘The tumor suppressor RASSF1A and MAP-1 link Death receptor signaling to Bax conformational change and cell death’, Molecular Cell, 18, pp 637- 650

[4] Beckedorff F C., Ayupe A C., Renan Crocci-Souza, Amaral M S., Nakaya

H I., Soltys D T, Menck C F M., Reis E M., Sergio Verjovski-Almeida, (2013), ‘The Intronic Long Noncoding RNA ANRASSF1 Recruits PRC2 to the RASSF1A Promoter, Reducing the Expression of RASSF1A and

Increasing Cell Proliferation’, PLoS Genet, 8, e1003705

[5] Beier V., Mund C., Hoheisel J D (2006), ‘Monitoring Methylation Changes in Cancer’, Biochem Engin/Biotechnol, 104, pp 1–11

[6] Bestor T H (2000), ‘The DNA methyltransferase of mammals’, Human Molecular Genetics, 9(16), pp 2395- 2402

[7] Busson P (2013), “Descriptive enrinomental and genetic epidemiology of Nasopharyngeal Carcinoma”, Nasopharyngeal Carcinoma Keys for Translational Medicine and Biology, 778, pp.44 - 62

[8] Busson P (2013), “Diagnosis and clinical evaluation of Nasopharyngeal carcinoma”, Nasopharyngeal Carcinoma Keys for Translational Medicine and Biology, 778, pp 22-30

[9] Busson P (2013), “Histopal thological diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma”, Nasopharyngeal Carcinoma Keys for Translational Medicine and Biology, 778, pp 31- 43

[10] Challouf S and et al (2012), ‘Patterns of aberrant DNA hypermethylation in nasopharyngeal carcinoma in Tunisian patients’, Clinica Chimica Acta, 413, pp 795–802

[11] Chang H W., Chan A., Kwong D L W., Wei W I., Sham J S T., Yuen A

P W (2003), ‘Evalution of hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and peripheral blood of Nasopharyngeal carcinoma patient’, UICC, 105, pp 851– 855

[12] Chen J., Fu L., Zhoang L Y., Kwong D L., Yan L., Xin- Yuan Guan, (2012), ‘Tumor suppressor genes on frequently deleted chromosome 3p in nasopharyngeal carcinoma’, Chin J Cancer, 31(5), pp 215- 222

[13] Chen T., Dent S Y R (2014), ‘Chromatin modifiers: regulators of cellular differentiation’, Nat Rev Genet, 15(2), pp 93–106

[14] Dallol A., Agathanggelou A., Fenton S.L., Ahmed-Choudhury J., Hesson L., Vos M D., Clark G J., Downward J., Maher E R., Latif F (2004),

‘RASSF1A interacts with microtubule-associated proteins and modulates microtubule dynamics’, Cancer Res, 64(12), pp 4112-6

[15] Dammann R., Schagdarsurengin U., Seidel C., Strunnikova M., Rastetter M., Baier1 K., Pfeifer G P (2005), ‘The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis: an update’, Histol Histopathol, 20, pp 645-663

[16] Davies P F, Manduchi E., Stoeckert C J., Jiménez J M., Yi-Zhou Jiang, (2014), ‘Emerging topic: flow-related epigenetic regulation of endothelial phenotype through DNA methylation’, Vascul Pharmacol, 62(2), pp 88–93

[17] Donninger H., Clark W N., Rinaldo F., Nelson N., Barnoud M., Schmidt M L., Hobbing K R., Vos M D., Sils B., Clarkc G J (2015), ‘The RASSF1A

Tumor Suppressor Regulates XPA-Mediated DNA Repair’, MCB , 35

[18] Donninger M K., Vos M D., Clark1 G J (2007), ‘The RASSF1A tumor suppressor’, J Cell Sci, 120, pp 3163-3172

[19] El-Kalla M., Onyskiw C., Baksh S (2010), ‘Functional importance of RASSF1A microtubule localization and polymorphisms’, Oncogene, 9(42), pp 5729-40

[20] Fajas L., Paul C., Vié A., Estrach S., Medema R., Blanchard J M., Sardet C., Vignais M L (2001), ‘Cyclin A is a mediator of p120 E4F -dependent cell cycle arrest in G1’, Mol Cell Biol, 21(8), pp 2956-66

[21] Fangyun T (2012), ‘A study on the hypermethylation of tumor suppressor gens in Nasopharyngeal Carcinoma’, The Hong Kong Polytachnic University, pp 1-176

[22] Fendri A (2009), ‘Inactivation of RASSF1A, RARβ2 and DAPkinase by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma’, Cancer Biology & Therapy, 8(5), pp 1 – 8 [23] Galm O., Herman J G (2005), ‘Methylation-specific polymerase chain reaction’, Methods Mol Med, 113, pp 279-91

[24] Gordon M., Baksh S (2011), “RASSF1A, Not a prototypical Ras effector”,

[25] Herman J G and et al (1996), ‘Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands’, Proc Natl Acad Sci, 93, pp 9821-9826

[26] Hessona L B., Coopera W N., Latifa F (2007), ‘The role of RASSF1A methylation in cancer’, Dis Markers, 23, pp.73–87

[27] Holloway A F., Oakford P C (2007), ‘Targeting Epigenetic Modifiers in Cancer’, Curr Med Chem, 14, pp 2540-2547

[28] Hutajulu S H and et al (2011), ‘Epigenetic markers for early detection of nasopharyngeal carcinoma in a high risk population’, Molecular Cancer, 10, pp 48

[29] Johnson A R (2011), “Epigenetics, Nutrition, and Cancer”, Epigenetic Mechanisms in Disease, (C)7, pp 129- 143

[30] Kim G H., Ryan J J., Marsboom G., Archer S L (2011), ‘Epigenetic mechanisms of pulmonary hypertension’, Pulm Circ, 1(3), pp 347-56

[31] Kwok- Wai Lo, (2001), ‘High frequency of promoter hypermethylation of

RASSF1A in Nasopharyngeal carcinoma’, Cancer Research, 61, pp 3877-

[32] Kwong J and et al (2002), ‘Promoter hypermethylation of multiple genes in Nasopharyngeal carcinoma’, Clinical Cancer Research, 8, pp 131 – 137 [33] Lillian Shuk-Nga Chow, Kwok-Wai Lo và cộng sự (2004), ‘RASSF1A is a target tumor suppressor from 3p21.3 in Nasopharyngeal Carcinoma’, Int J Cancer, 109, pp 839–847

[34] Liu L., Tommasi S., Dong-Hyun Lee, Dammann R., Pfeifer G P (2003),

‘Control of microtubule stability by the RASSF1A tumor suppressor’, Oncogene, 22, pp 8125–8136

[35] Lo K W., To K F., Dolly P Huang (2004), ‘Focus on nasopharyngeal carcinoma’, Cancer Cell, 5, pp 413- 441

[36] Lu Q., Qiu X., Hu N., Wen H., Su Y., Richardson B.C (2006), ‘Epigenetics, disease, and therapeutic interventions’, Ageing Res Rev, 5, pp 449–467 [37] Máthé E (2004), ‘RASSF1A, the new guardian of mitosis’, Nature Genetics,

[38] McCabe M T., Brandes J C., Vertino P V (2009), ‘Cancer DNA Methylation: Molecular Mechanisms and Clinical Implications’, Clin Cancer

[39] Nawaz I and et al (2015), ‘Detection of nasopharyngeal carcinoma in Morocco (North Africa) using a multiplex methylation-specific PCR biomarker assay’, Clinical Epigenetics, 7 (89), pp 89

[40] Nephew K P., Huang T H (2003), ‘Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression’, Cancer Lett, 190(2), pp 125-33

[41] Palakurthy R K., Wajapeyee N., Santra M K., Gazin C., Lin L., Gobeil L., Green M K (2009), ‘Epigenetic Silencing of the RASSF1A Tumor

Suppressor Gene through HOXB3-Mediated Induction of DNMT3B Expression’, Molecular Cell, 36, pp 219–230

[42] Peedicayil J., (2012), ‘A comparison of Erikson’s Epigenetic Principle with epigenetics’, Journal of Theoretical Biology, 315, pp 144–145

[43] Serman A., Vlahovic M., Serman M., Floriana Bulic-Jakus, (2006), ‘DNA Methylation as a Regulatory Mechanism for Gene Expression in Mammals’,

[44] Sing–Huang Tan and et al (2006), ‘Analyses of promoter hypermethylation for RUNX3 and other tumor suppressor genes in Nasopharyngeal carcinoma’,

[45] Song M S., Chang J S., Song S J., Yang T H., Lee H., Lim D S (2005),

‘The centrosomal protein RAS association domain family protein 1A (RASSF1A)-binding protein 1 regulates mitotic progression by recruiting RASSF1A to spindle poles’, J Biol Chem, 280(5), pp 3920-7

[46] Szyf M., Bick J (2013), ‘DNA Methylation: A Mechanism for Embedding Early Life Experiences in the Genome’, Child Dev, 84(1), pp 49–57

[47] Thian – Sze Wong and et al (2004), ‘Quantitative plasma hypermethylated DNA markers of undifferentiated Nasopharyngeal carcinoma’, Clinical Cancer Research, 10, pp 2401 – 2406

[48] Tong J H M and et al (2002), ‘Quantitative Epstein – Barr – Virus DNA analysis and gene promoter hypermethylation in Nasopharyngeal carcinoma (NP) brushing samples from patient with NP carcinoma’, Clinical Cancer Research, 8, pp 2612 – 2619

[49] Vaissie`re T., Sawan C., Herceg Z (2008), ‘Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing’, Mutation Research, 659, pp 40 - 48

[50] Wang T (2009), ‘Methylation associated inactivation of RASSF1A and its synergistic effect with activated K-Ras in nasopharyngeal carcinoma’,

Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 8, pp 160

[51] Weyden L V D, Adams D.J (2007), ‘The Ras-association domain family (RASSF) members and their role in human tumourigenesis’, Biochimica et Biophysica Acta, 1776, pp 58–85

[52] Wong T S and et al (2003), ‘Differential gene methylation in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma’, Int J Oncol, 22(4), pp 869-74 [53] Yap Y Y., Hassan J., Pulau P P and at el (2007), ‘Epstein-Barr virus DNA detection in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma’, Otolaryngology– Head and Neck Surgery, 136, pp 986-991

[54] Zhang Z., Sun D., Hutajulu S H., Nawaz I., Nguyen Van D and et al (2012),

‘Development of a Non-Invasive Method, Multiplex Methylation Specific PCR (MMSP), for Early Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma’, PLoS xONE, 7(11), pp e45908

[55] Zhi-Gang Pan and et al (2005), ‘High frequency somatic mutations in

RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma’, Cancer Biology & Therapy, 4(10), pp 1116-1122

[56] Zhou L., Jiang W., Ren C., Yin Z., Feng X., Liu W., Tao Q., Yao K (2005),

‘Frequent hypermethylation of RASSF1A and TSLC11, and high viral load of Epstein Barr virus DNA in Nasopharyngeal Carcinoma and matched tumor- Adjacent tissues’, Neoplasia, 7(9), pp 809 – 815

Tài liệu tham khảo Internet

[57] http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/RASSF1ID377.html

[58] http://dieuduongchuyennghiep.vn/News/Default.aspx?Mod=ViewNews&Cat eID=5&NewsID31

[59] http://nanodrop.com/Library/T042-NanoDrop-Spectrophotometers-Nucleic- Acid-Purity-Ratios.pdf

[60] http://sg.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/synthetic- biology/decoded/2014/01/14/epigenetic-biomarkers-for-prostate-cancer

[61] http://www.chuatribenhungthu.com/bieu-hien-cua-ung-thu-vom-hong.html [62] http://www.genecards.org/

[63] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

Phụ lục 1 Kết quả các thông số Blast các mồi của gen RASSF1A

Tên mồi Trình tự mồi

CGA GAG CGC GTT TAG TTT

CGA TTA AAC CCG TAC TTC GCT AA

GGG GGT TTT GTG AGA GTG TGT TT

CCC AAT TAA ACC CAT ACT TCA CTA