khảo sát mức độ methyl hóa các đảo cpg thuộc vùng promoter của gen p16 trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung

QUAN

Sơ lược về ung thư cổ tử cung

Những nguy cơ có thể gây ung thư cổ tử cung như: quan hệ tình dục sớm hoặc quan hệ với nhiều người, yếu tố nguy cơ tăng thêm nếu bạn tình cũng có quan hệ tình dục với nhiều người khác; sinh đẻ nhiều (từ trên bốn lần); hút thuốc lá; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục; suy giảm hệ thống miễn dịch, rối loạn nội tiết (mắc bệnh HIV/AIDS, viêm gan, tiểu đường…); các yếu tố khác như nghèo nàn, lạc hậu, vệ sinh kém; mắc các bệnh lây truyền qua đường tình dục, đặc biệt là viêm sinh dục do nhiễm các vi sinh vật như: Human Papilloma Virus (HPV), Trichomonas, Chlamydiae trachomatis, Herpes simplex virus type 2 (HSV2) Trong đó, nhiễm HPV là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến Biểu hiện lâm sàng là hình ảnh u sùi điển hình vùng hậu môn - sinh dục như âm hộ, âm đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật, vùng hầu họng và ung thư cổ tử cung Tháng 10/1999, hội thảo do IARC và WHO khẳng định HPV là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành và phát triển ung thư cổ tử cung

HPV có nhân DNA sợi đôi thuộc họ Papillomaviridae, trọng lượng phân tử 8kb, là một trong những tác nhân lây nhiễm qua da, niêm mạc và phổ biến nhất là lây nhiễm qua đường tình dục Có trên 100 type HPV khác nhau, trong đó có khoảng 40% tác động lên đường sinh dục và 15% có nguy cơ gây ung thư cổ tử cung Dựa vào tính gây ung thư, HPV được chia làm hai nhóm: [5]

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 6

✔ Nhóm nguy cơ thấp: hiếm gặp trong các trường hợp ung thư gồm các type: HPV-6, 11, 42, 43, 44 gây ra các nhiễm trùng nhẹ như mụn cóc ở da, bộ phận sinh dục, niêm mạc miệng

✔ Nhóm nguy cơ cao: liên quan trực tiếp đến bệnh lý ung thư, bao gồm các type: HPV-16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66, 68 Trong đó, HPV-16 và HPV-18 là hai type được xác định có nguy cơ cao nhất gây ung thư cổ tử cung (chiếm hơn 70%)

Cơ chế phân biệt nhóm nguy cơ thấp và cao vẫn chưa được rõ ràng Tuy nhiên, ghi nhận nhóm nguy cơ cao thường gây tình trạng nhiễm virus kéo dài hơn nhóm nguy cơ thấp (thời gian hiện diện virus tại mô cổ tử cung dài hơn) Người ta nghĩ rằng có thể trong nhóm nguy cơ cao, các gen gây ung thư có hoạt tính mạnh hơn và khả năng lây lan cao hơn nhóm nguy cơ thấp

Hình I.1: Hình ảnh tổng thể (a) và cấu trúc (b) của HPV-16 a ) b)

GVHD:TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp

I.1.2/ Cơ chế gây bệnh của HPV:

HPV tác động chủ yếu vào các tế bào biểu mô lát tầng không sừng hóa của cổ tử cung tại nơi tiếp giáp giữa cổ trong và cổ ngoài (nơi tiếp giáp hai loại mô khác nhau: biểu mô tế bào trụ tuyến và biểu mô lát tầng không sừng hóa) Biểu mô lát tầng không sừng hóa vốn được tổ chức với chức năng che chở, bảo vệ và được quy định sẽ phát triển dần lên hướng bề mặt và sau đó bong ra ngoài Virus sẽ tấn công vào lớp tế bào đáy của biểu mô vốn có khả năng sinh sản cao và gây ra hiện tượng phát triển mạnh hơn bình thường của một rồi tiến tới nhiều lớp tế bào sau đó Khi tế bào bất thường chiếm toàn bộ các lớp tế bào biểu mô lát gây hiện tượng dị sản còn gọi là ung thư tại chỗ, có khả năng phát triển lan rộng đến các lớp tế bào biểu mô lát khác gây dị sản nặng lan ra khỏi màng đáy vào các lớp sâu hơn biểu mô lát và hình thành ung thư cổ tử cung xâm lấn Tuy nhiên, những tổn thương ban đầu chỉ xảy ra ở tế bào biểu mô lát vốn không tiếp xúc với mạch máu, HPV hầu như chỉ hiện diện tại chỗ và không đi vào máu, do đó không gây ra tình trạng viêm, không hoạt hóa hệ miễn dịch và hầu như không gây miễn nhiễm sau khi đã nhiễm tự nhiên [6]

HPV hoạt động chủ yếu nhờ các oncogene E6 và E7, sau khi HPV xâm nhập vào tế bào, E6 và E7 xác nhập vào bộ gen tế bào kí chủ và điều khiển tổng hợp protein E6, E7 gây bất lợi cho tế bào kí chủ E6 gắn lên p53 - protein 53 có vai trò ức chế khối u, có thể đồng thời tham gia vào ba quá trình: (1) thúc đẩy sự phiên mã của các gen đích làm dừng chu trình tế bào ở các điểm kiểm soát G1/S và G2/M , (2) kích hoạt hệ thống sửa chữa DNA hư hỏng, (3) hoạt hóa một số gen đích mà sản phẩm của chúng dẫn tới con đường apoptosis Việc E6 có thể gắn lên p53 gây mất kiểm soát chu trình tế bào, ngăn chặn con đường apoptosis dẫn tới tế bào được tái tạo liên tục và mang theo những DNA hư hỏng Trong khi đó, E7 gắn lên pRb (protein Retinoplastoma - điều hòa tăng trưởng tế bào) gây thoái hóa phức hợp pRb-

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 8 E2F dẫn tới E2F được tự do hoạt hóa phiên mã, tế bào với bộ gen đã bị biến đổi tăng sinh một cách liên tục và tiến triển thành ung thư [5, 7]

Tế bào bình thường Tổn thương tế bào biểu mô lát Ung thư xâm lấn

Dị sản tế bào biểu mô cổ tử cung (CIN)

CIN I CIN II CIN III

Tế bào biểu mô lát

Nhân cùng với bổ thể DNA virus

Nhân với sự tích hợp DNA virus

Biểu hiện vượt mức của E6, E7

Biểu hiện của gen sớm và trễ

Nguồn: Nat Rev Cancer 2007 Nature Publishing Group

Hình I.2: Sự xâm nhiễm, tiến trình gây ung thư cổ tử cung của

Human Papilloma Virus (HPV) và các giai đoạn bệnh

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 9 Quá trình từ nhiễm virus HPV đến ung thư thường kéo dài từ 15-25 năm, trãi qua nhiều giai đoạn khác nhau (hình I.2):

- Tổn thương tế bào biểu mô lát cấp thấp hay dị sản nhẹ, viết tắt là CIN I (cervical intraepithelial neoplasia I): có thể phục hồi và chữa khỏi hoàn toàn, khả năng chữa khỏi là hơn 90 %

- Tổn thương tế bào biểu mô lát cấp cao (hay còn gọi là ung thư tại chỗ - CIS (Carcinoma In Situ)) gồm hai giai đoạn là dị sản vừa (CIN II) và dị sản nặng (CIN III): khoảng 10 % sẽ tiến triển nặng hơn trong vòng 2-4 năm, tế bào dị sản dày đặc trong lớp biểu mô nhưng chưa qua khỏi màng đáy, dễ dàng tiến tới giai đoạn ung thư xâm lấn

- Ung thư xâm lấn (ICC-Invasive Cervical Cancer): là giai đoạn cuối cùng với các triệu chứng đau bụng dưới, đau lưng và tử vong rất nhanh, hầu như không có khả năng phục hồi Có thể điều trị bằng phẫu thuật, xạ trị hoặc kết hợp cả hai phương pháp Tuy nhiên, quá trình điều trị rất phức tạp, tốn kém và dễ bị tai biến

I.1.3/ Các phương pháp phòng ngừa, chẩn đoán, điều trị bệnh hiện nay: I.1.3.1/ Vaccine phòng ngừa:

Bệnh lý ung thư cổ tử cung xuất phát từ sự lây lan virus HPV, vì vậy việc ngăn ngừa các căn bệnh lây lan qua đường tình dục bằng cách sử dụng bao cao su khi quan hệ và giữ gìn vệ sinh sạch sẽ, đúng cách sẽ làm giảm rủi ro nhiễm virus gây bệnh Hiện nay, trên thị trường đã có vaccine phòng ngừa cho việc lây nhiễm HPV Vaccine có hiệu quả cao nhất khi tiêm ngừa vaccine cho các thiếu nữ trước khi quan hệ tình dục lần đầu tiên Hiện nay, có hai loại vaccine đã được công nhận và cho phép sử dụng phổ biến: Cervarix tạo miễn dịch với hai type nguy hiểm nhất hiện nay là HPV-16/18 và Gardasil tạo miễn dịch chống HPV-16/18 và HPV-6/11 Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng cho thấy nồng độ kháng thể còn có tác dụng với các nhóm

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 10 HPV tương ứng Vaccine sử dụng các thành phần gây miễn dịch của virus là L1, L2 Khi vaccine vào cơ thể, hệ thống miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể sẽ được kích hoạt Kháng thể chống HPV và các tế bào miễn dịch HPV sẽ thâm nhập qua biểu mô cổ tử cung và có tác dụng bảo vệ lớp tế bào nhạy cảm với HPV tại cổ tử cung Do không sử dụng các yếu tố gây ung thư, vaccine không gây ra những thay đổi bất thường trên tế bào cổ tử cung như khi bị nhiễm HPV

Nên tiêm vaccine này cho trẻ em gái tuổi vị thành niên, chưa có quan hệ tình dục để chuẩn bị đầy đủ hệ miễn dịch trước khi nhiễm HPV qua đường tình dục Phụ nữ lớn tuổi, khi xét nghiệm HPV âm tính vẫn có thể sử dụng Tuy nhiên, đối với những trường hợp đã từng bị nhiễm HPV hoặc có những tổn thương tại cổ tử cung do HPV thì vaccine có vẻ không có hiệu quả

Tại Việt Nam, hiện nay, kiến thức về ung thư cổ tử cung chưa được phổ biến rộng rãi, đặc biệt là những vùng sâu vùng xa, phụ nữ chưa thật sự quan tâm đến sức khỏe của bản thân Bên cạnh đó, chi phí vaccine vẫn còn cao so với mức sống bình quân của người dân Vì vậy, phương pháp phòng ngừa chủ yếu hiện nay vẫn là khuyến cáo mọi người thực hiện giữ gìn vệ sinh sạch sẽ và đúng cách, tránh quan hệ tình dục quá sớm và với nhiều người, kiểm tra sức khỏe định kỳ …

Tổng quan về Epigenetics

Epigenetics là hiện tượng thay đổi cấu trúc DNA có thể di truyền được mà không có sự thay đổi trình tự base trên DNA [2] Trong tế bào

Eukaryote, sự biến đổi epigenetics gồm hai yếu tố chính là sự methyl hóa

DNA (DNA methylation) và sự biến đổi histone (Histone modification) Trong giới hạn đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào sự methyl hóa DNA.

Sự methyl hóa DNA giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát tế bào bao gồm các quá trình: phát triển phôi (embryonic development), phiên mã, bất hoạt nhiễm sắc thể X (X chromosome inactivation) và “in dấu bộ gen” (imprinting gene) [10] Ở người, methyl hóa DNA là sự gắn nhóm CH3 vào vị trí Cacbon số 5 của Cytosine (Cytosine này đứng liền trước Guanine – gọi là dinucleotide CpG) chuyển Cytosine thành 5-Methylcytosine, được bảo tồn qua quá trình tái tạo DNA và phân chia tế bào [10, 11] Methyl hóa được thực hiện với sự xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), enzyme này thúc đẩy phản ứng chuyển nhóm CH3 từ S- adenosylmethionine (SAM) đến Cytosine tạo 5’-Methylcytosine và S- adenosylhomosystine (SAH) (hình III.3) [12] Trong đó, DNMT3a và DNMT3b là các de- novo DNA methyltransferase có nhiệm vụ thiết lập

DNA methyl hóa đầu tiên từ những DNA chưa methyl hóa, DNMT1 có

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 14 nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở Cytosine trên sợi đơn DNA mới được tổng hợp trong quá trình phân chia tế bào nhờ đặc tính methyl hóa DNA mạch bổ sung Do đó, sự methyl hóa DNA là di truyền cho các thế hệ tế bào tiếp theo nhờ vào cơ chế methyl hóa DNA mạch khuôn [10, 11]

Methyl hóa Cytosine thuộc dinucleotide CpG diễn ra khắp bộ gen, nhưng đáng kể nhất là những vùng giàu CG - được gọi là đảo CpG Đảo CpG là những đoạn ngắn DNA có kích thước khoảng 0,5–4 kb, có sự lặp lại trình tự dinucleotide CG cao hơn những vùng khác (hơn 50%) CpG phân bố ngẫu nhiên trong bộ gen nhưng đảo CpG thường nằm trong những vùng nhỏ riêng biệt của gen (khoảng 40% đảo CpG nằm trong và gần vùng

Hình I.3: Methyl hóa DNA được thực hiện với sự xúc tác của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs) chuyển nhóm CH 3 của S – adenosylmethionine đến Cytosine, kết quả phản ứng:

GVHD:TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY Khóa luận tốt nghiệp promoter) Trong điều kiện bình thường, phần lớn các đảo CpG đều bị methyl hóa, ngoại trừ đảo CpG thuộc vùng promoter đến exon 1.[2] Methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter có liên quan chặt chẽ với biến đổi histone và cơ chế sữa chữa nhiễm sắc thể dẫn tới im lặng gen [2], có thể gây ảnh hưởng đến quá trình hoạt động của các nhân tố phiên mã liên quan tới biểu hiện gen, có thể dẫn tới gen im lặng không thích hợp như gen ức chế khối u trong tế bào ung thư [11] (hình I.4).

O - ► J!fr^—^—V Tế bào bình thường a)

0 Vị trí CpG methyl ì-: Vị trí CpG không methyl

Hình I.4: Ảnh hưởng của sự methyl hóa DNA đến quá trình phiên mãgen:

- Trong tế bào bình thường: methyl hóa CpG trãi dài khắp bộ gen, ngoại trừ đảo CpG thuộc vùng promoter đếnexon 1, điều này không làm ảnh hưởng đến quá trình phiên mã.

- Trong tế bào ung thư: methyl hóa CpGxảy ra ngay trên đảo CpG thuộc vùngpromoter đến exon 1, quá trình phiên mã bị ngăn chặn.

Sự methyl hóa DNA có thể ức chế trực tiếp phiên mã gen theo hai cách nói chung (hình I.5) Thứ nhất, sự methyl hóa dinucleotide CG có thể trực tiếp can thiệp vào vị trí bám của các nhân tố phiên mã lên trình tự nhận biết của chúng Sự chuyển động của RNA polymerase dọc theo gen dường như

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 16 không bị ảnh hưởng bởi sự methyl hóa, bởi vì vùng trình tự mã hóa cùng chiều promoter thường chứa dinucleotide CpG mà hầu hết CpG đều methyl hóa Điều này đã được chứng minh cho sự bám của AP-2 lên trình tự nhận biết của chúng trong vị trí promoter của gen proencephalin Sự methyl của vị trí CCGG trong trình tự bám của AP-2 và ức chế sự bám của AP-2 điều đó giải thích sự ức chế biểu hiện của gen tổng hợp hạt nhân proencephalin-

CAT Thứ hai, sự ức chế gián tiếp do sự bám của protein lên Cytosine bị methyl (MBP - methylcytosine binding protein) trên trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã Các vùng DNA bị methyl hóa liền kề các vị trí bám trên promoter của các gen có thể gắng các protein bám lên Cytosine bị methyl hóa như những phân tử protein lớn phức tạp bao gồm các nhân tố đồng ức chế và enzyme histone deacetylase Việc các phân tử phức tạp này gắng lên DNA dẫn đến thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể từ hoạt động sang không hoạt động Các protein đặc trưng nhất bám lên Cytosine bị methyl là MeCP2, protein này có thể gắn vào trình tự DNA có chứa ít nhất một dinucleotide CG bị methyl hóa.[12]

Methyl hóa thích hợp được xác định là cần thiết cho sự phân biệt tế bào và phát triển phôi thai Hơn nữa, methyl hóa DNA còn giữ vai trò quan trọng trong việc làm trung gian cho sự biểu hiện gen Bằng chứng về điều này được tìm thấy trong các nghiên cứu chỉ ra rằng methyl hóa đảo CpG gần vùng promoter của gen khác nhau đáng kể ở các loại tế bào, methyl nhiều ở vùng promoter tương quan với phiên mã ở mức thấp hoặc không phiên mã Ngoài ra, trong khi mức độ methyl hóa tổng thể và đầy đủ của vùng promoter đặc biệt tương tự ở cá nhân mỗi người, thì có sự khác biệt đáng kể trong mức độ methyl hóa tổng thể và cụ thể giữa các loại mô khác nhau, giữa các tế bào bình thường và tế bào ung thư từ các mô tương tự [11]

Sự hình thành và tiến trình bệnh ung thư là do tích lũy những biến đổi DNA [2] Với vai trò quan trọng trong biểu hiện gen và phân biệt tế bào của methyl hóa DNA, khi xảy ra lỗi trong quá trình methyl hóa có thể dẫn tới hậu quả tàn phá, gây ra các bệnh khác nhau [11] Enzyme DNMTs tham gia xúc tác methyl hóa DNA được cho là có đóng góp vào sự de novo methyl hóa bất thường và dẫn tới phát triển ung thư Biểu hiện quá mức của tất cả DNMTs ở mức độ mRNA đã được chỉ ra ở một vài bệnh ung thư và tăng biểu hiện DNMT1 trong tế bào bình thường có thể là nguyên nhân của de novo methyl hóa đảo CpG và làm tăng chuyển đổi tế bào Mức độ mRNA và biểu hiện DNMTs được quy định khác nhau trong suốt chu trình tế bào và biểu hiện của DNMTs không phù hợp sẽ góp phần thay đổi dạng methyl hóa trong tế bào ung thư [13] Sự phá vỡ dạng methyl hóa bình thường được tìm thấy trở thành một sự kiện quan trọng trong tác nhân gây ung thư [2] Methyl hóa bất thường được thành lập khi methyl bắt đầu chiếm khoảng 1,4% của 45000 đảo CpG trong bộ gen người và có thể tiếp tục tăng lên 10% trong tiến trình bệnh ung thư Vì vậy, de-novo methyl hóa bất thường đảo CpG trong tế bào ung thư ở người biểu hiện là một trong những phân tử marker ưu việt cần được nghiên cứu [13]

Hiện nay, rất nhiều nghiên cứu về DNA và bệnh tật đã tập trung vào gen ức chế khối u và gen gây ung thư Gen ức chế khối u thường im lặng trong các tế bào ung thư do hypermethylation (tăng cường methyl hóa).[11] Hypermethylation xảy ra trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen ức chế khối u thường xuyên được tìm thấy trong giai đoạn đầu phát sinh ung thư, được coi là sự kiện chủ yếu trong nguồn gốc phát sinh ung thư [10] Ví dụ: hypermethylation gen p16 thường xuyên được tìm thấy trong suốt tiến trình bệnh ung thư thực quản Barrett’s [14, 15], phổi [16], cổ tử cung [16], dạ dày [17] Chúng cản trở hoạt động của các nhân tố phiên mã dẫn tới gen ức chế khối u không biểu hiện tạo thuận lợi cho khối u tăng sinh Trong

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 18 thực tế, với mỗi loại ung thư nhất định, hypermethylation được phát hiện sớm có thể phục vụ như là một biomarker của bệnh [11]

Hình I.5: Cơ chế ức chế phiên mã gen do sự methyl hóa:

(A) Sự giảm methyl hóa những dinucleotide CpG trên vùng promoter cho phép nhân tố phiên mã bám vào, quá trình phiên mã được thực hiện

(B) Sự methyl hóa dinucleotide CpG ức chế các nhân tố phiên mã bám vào dẫn đến gen không phiên mã

(C) Sự hiện diện của protein bám trên Cytosine bị methyl (MBP) gắn vào dinucleotide CpG trên vùng promoter cũng ngăn chặn sự liên kết của các yếu tố phiên mã lên các vị trí bám của chúng

(D) MBP liên kết với với CpG dinucleotides trong vùng promoter cùng với enzyme histone deacetylases đồng kiềm hãm, dẫn đến histone bị khử acetyl, chất nhiễm sắc đóng xoắn và ở trạng thái cấu trúc bất hoạt phiên mã

Sự phiên mã trên gen của Eukaryote liên quan chặt chẽ đến sự thay đổi cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc mà cụ thể là sự biến đổi histone, một thành phần chính của sợi nhiễm sắc Nucleosome, đơn vị cơ sở cấu tạo nên sợi nhiễm sắc, gồm một đoạn DNA quấn quanh phần protein gồm 8 phân tử histone lõi (2H2A, 2H2B, 2H3,

2H4), với 1 phân tử histone nối (H1)

[10] Các histone chứa nhiều acid amin tích điện dương nên nó có thể liên kết ổn định với phân tử DNA tích điện âm tạo nên cấu trúc nucleosome (hình I.6).[18]

Tổng quan về gen p16

I.3.1/ Cấu trúc và chức năng:

Gen CDKN2A nằm trên nhiễm sắc thể 9p21, mã hóa cho hai protein p16 (còn gọi là p16INK4a) và p14 (còn gọi là p14ARF) (hình I.8) [19]

Trong đó, p16 được mã hóa bởi exon 1α, 2 và 3, có vai trò điều hòa chu trình tế bào với chức năng điều hòa âm tính chu trình tế bào thông qua sự ức chế các CDK4, CDK6 (CDK – cyclin dependent kinase) tương tác với cyclin D1 [19] Sự biểu hiện p16 gia tăng theo tuổi tác, quá trình biểu hiện này liên quan đến quá trình già hoá của tế bào Khi càng lớn tuổi thì nồng

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 23 độ p16 sẽ càng cao p16 chi phối quá trình lão hoá bằng cách giới hạn sự tự làm mới của các tế bào có khả năng nhân đôi

CDK và cyclin là hai nhóm protein có vai trò quan trọng tại các điểm kiểm soát (checkpoint) [20] Khi không có mặt p16, CDK cùng cyclin tạo phức hợp cyclin/CDK thực hiện phosphoryl hóa pRb (protein Retinoblastoma) Bình thường, pRb không bị phosphoryl hóa và ở trạng thái liên kết với nhân tố phiên mã E2F, E2F bị bất hoạt không thể bật các gen sao chép DNA dẫn đến tế bào không vượt qua điểm kiểm soát G1/S [20] Vào cuối pha G1, phức hệ cyclin/CDK tăng thực hiện phosphoryl hóa pRb, pRb nhã E2F ra và E2F được tự do hoạt hóa các gen sao chép DNA thúc đẩy chu trình tế bào đi qua điểm kiểm soát G1/S (hình I.9) Tuy nhiên, khi qua điểm kiểm soát này nếu phát hiện DNA hư hỏng, chu trình tế bào sẽ tạm ngưng lại để sửa chữa Quá trình tạm ngưng này được thực kiện nhờ

Hình I.8: a) Vị trí CDKN2A trên nhiễm sắc thể số 9 (9p21) b) P16INK4a được mã hóa bởi 3 vùng exon 1α, 2 và 3 a) b)

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 24 p16 tương tác với các thành phần CDK4/6 cản trở sự hình thành phức hợp cyclin/CDK dẫn tới pRb không được phosphoryl hóa hoặc phosphoryl hóa ở mức thấp và không nhã E2F, quá trình sao chép DNA không diễn ra, chu trình tế bào ngưng lại tại điểm kiểm soát G1/S, lúc này các gen chịu trách nhiệm sửa chữa DNA hư hỏng sẽ làm việc [21, 22] Vì vậy, khi p16 bị bất hoạt sẽ làm cho các tế bào hư hỏng sao chép một cách không kiểm soát đến một lúc nào đó sẽ chuyển sang trạng thái ung thư

I.3.2/ Methyl hóa p16 trong ung thư và ung thư cổ tử cung:

Methyl hóa đảo CpG trong vùng promoter gen biểu hiện im lặng là một sự kiện bình thường xảy ra trong tế bào để điều hòa biểu hiện gen Tuy nhiên, khi methyl hóa DNA bất thường trên gen ức chế khối u xảy ra trong tế bào khối u thì nó có liên quan đến chuyển đổi ung thư Methyl hóa bất thường trên các gen ngăn chặn xu hướng hình thành khối u xuất hiện sớm trong quá trình phát triển và tăng sinh khối u, cuối cùng dẫn đến các dạng khối u ác tính điển hình.[23] Trong nhiều loại ung thư, p16 được tìm thấy ở trạng thái bị bất hoạt do hai nguyên nhân đột biến và biến đổi epigenetic [7] p16 thường xuyên được tìm thấy ở trạng thái mất biểu hiện với tầng xuất khác nhau trong nhiều loại ung thư Methyl hóa đảo CpG trong vùng exon 1α của CDKN2A được tìm thấy trong nhiều loại khối u ác tính như:

Hình I.9: Cơ chế điều hòa của p16 trong chu trình tế bào

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 25 NSCLC (ung thư phổi không phải tế bào nhỏ - non small cell lung cancer), ruột kết, tuyến tụy [7] Ung thư tế bào vảy xảy ra sự methyl hóa đảo CpG nằm gần giữa vùng promoter gen p16 liên quan đến bất hoạt phiên mã p16

[24], u màng não dạng không điển hình cũng được xác định có sự methyl hóa đảo CpG trên p16 và không tìm thấy biểu hiện của gen này [25] Trong ung thư cổ tử cung và ung thư phổi, bằng phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) người ta chỉ ra rằng methyl hóa bất thường p16 xảy ra sớm với cả khối u tại chỗ và khối u xâm lấn [26]

Trong ung thư cổ tử cung, gen gây ung thư E6, E7 của HPV tác động qua lại với gen điều khiển chu trình tế bào Biểu hiện của E6 và E7 gây ra hiện tượng bất tử của tế bào qua việc ngăn chặn ảnh hưởng lên protein ức chế khối u pRb và p53, thay đổi kiểm soát chu trình tế bào và dẫn tới mất ổn định NST E7 gây thoái hóa pRb - ức chế vai trò pRb với việc giải phóng nhân tố phiên mã E2F làm cho tế bào phân chia liên tục, p16 biểu hiện vượt mức nhưng không thực hiện chức năng của chính nó (hình I.10) [27]

Hình I.10: Cơ chế biểu hiện quá mức của p16 trong tế bào tiền ung thư và ung thư

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 26 Tuy nhiên, sự xuất hiện của các gen gây ung thư E6 và E7 không đủ để khẳng định là tác nhân gây ung thư cổ tử cung vì bệnh này có thời gian ủ bệnh dài và chỉ biểu hiện ở dạng u ác tính Như đã trình bày ở trên, sự phát triển và tiến trình gây ung thư cổ tử cung được xác định phụ thuộc vào các sự kiện khác nhau về gen và epigenetic, đặc biệt những thay đổi trong cơ chế điểm kiểm soát chu trình tế bào [28] Một vài nghiên cứu đã xác định rằng hypermethylation vùng promoter gen p16 là một sự kiện xảy ra thường xuyên trong ung thư cổ tử cung, ảnh hưởng đến quá trình sao chép và biểu hiện gen [29] Sự vắng mặt của sự kiện hypermethylation promoter p16 trong mẫu mô bình thường cũng chứng minh được giá trị của sự kiện này như một biomarker dùng chẩn đoán ung thư cổ tử cung

Phương pháp MSP

MSP (Methylation Specific PCR) là phương pháp PCR đặc biệt dùng cho việc xác định nhanh chóng tình trạng methyl hóa các vùng đảo CpG trên DNA [30] Phương pháp này chỉ cần lượng nhỏ DNA, độ nhạy lên đến 0,1 % alen methyl hóa tại vị trí đảo CpG [31] Điểm khác biệt của phương pháp này so với phương pháp PCR thông thường là DNA được xử lý với sodium bisulfite (NaHSO3) và khuếch đại với các cặp mồi methyl và unmethyl, dựa vào kết quả có thể phân biệt DNA có methyl hóa hay không (hình I.11) Hiện nay, phương pháp này được đánh giá là cho hiệu quả cao nhất trong các khảo nghiệm phân tích tình trạng methyl hóa DNA [32]

I.4.2/ Phản ứng biến đổi DNA bằng sodium bisulfite: Đây là phản ứng cơ bản để phân biệt DNA methyl hóa và DNA không methyl Toàn bộ Cytosine không methyl sẽ chuyển đổi thành Uracil và sau đó chuyển thành Thymine, những Cytosine methyl hóa sẽ không phản ứng và không bị chuyển đổi trong quá trình xử lí (hình I.12) [32, 33]

Hình I.12: Phản ứng biến đổi bisulfite

(NaHSO 3 ) trình tự dinucleotide CpG

I.4.3/ Đọc kết quả phản ứng MSP:

Ví dụ: điện di kết quả phản ứng MSP thu được hình ảnh như sau:

- Mẫu A: Kết quả điện di có hai vạch Như vậy, các cặp mồi methylation và unmethylation đều đều bắt cặp đặc hiệu trong phản ứng MSP Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát bị methyl hóa không hoàn toàn

- Mẫu B: Kết quả điện di chỉ có cặp mồi unmethylation cho kết quả Trường hợp này kết luận các đảo CpG khảo sát không bị methyl hóa.

- Mẫu C: Kết quả điện di có một vạch cho cặp mồi methylation Kết luận mẫu này bị methyl hóa hoàn toàn

Hình I.13: Đọc kết quả phản ứng MSP

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

II.1.1/ Các phần mềm và trang web sử dụng:

- Các phần mềm trực tuyến như: o IDT: www.idtdna.com o MethPrimer: www.urogen.org o MethBlast: www.medgen.ugent.be/methBLAST o Tfsearch: http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html

- Các trang web: www.ncbi.nlm.nih.gov, www.urogen.org

II.1.2/ Các mẫu sử dụng:

Mẫu DNA control được cung cấp bởi hãng Qiagen bao gồm hai nguồn DNA người: DNA đã bị methyl hóa và DNA chưa bị methyl hóa Sử dụng nguồn DNA control này sẽ giúp chúng tôi đánh giá được độ đặc hiệu của cặp mồi trong phản ứng MSP

Mẫu bệnh phẩm mà chúng tôi sử dụng để phân tích được cung cấp từ công ty Việt Á Những mẫu này đã được khẳng định nhiễm HPV type độc (HPV16, 18) Tổng số mẫu thu được là 32 mẫu, trong đó có 5 mẫu mô tươi và 27 mẫu dịch phết Các mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -30 o C trước khi tiến hành tách chiết DNA.

Phương pháp

Chúng tôi bố trí nghiên cứu gồm hai phần (hình II.1) Đầu tiên, chúng tôi tiến hành thu thập, khai thác dữ liệu của các nghiên cứu thực hiện trước đó Từ những dữ liệu này, chúng tôi sử dụng làm cơ sở để thiết kế cặp mồi đặc hiệu methyl và unmethyl cho phản ứng MSP Tiếp theo, phần thực nghiệm sẽ được tiến hành nhằm khảo sát mức độ methyl hóa gen p16 trên

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 30 các mẫu bệnh nhằm đánh giá sự tương quan giữa mức độ methyl hóa trên gen này và bệnh ung thư cổ tử cung

II.2.1/ Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico:

II.2.1.1/ Khai thác dữ liệu: Để thiết kế bộ mồi methyl và unmethyl khuếch đại đặc hiệu vùng promoter gen p16 cho phản ứng MSP, tìm hiểu về mối tương quan giữa sự methyl hóa DNA gen p16 và bệnh ung thư cổ tử cung Đầu tiên, chúng tôi khai thác thông tin, dữ liệu về gen p16 trên ngân hàng dữ liệu PubMed của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) PubMed là cở sở dữ liệu được phát triển và quản lí bởi Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ

Hình II.1: Sơ đồ bố trí nghiên cứu Khai thác dữ liệu

Khảo sát in silico gen p16

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng Q-MSP trên DNA control

Thiết kế mồi cho phản ứng MSP

Giải trình tự kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Kiểm tra chất lượng DNA bằng đo OD, điện di, PCR

Kiểm tra mức độ methyl gen p16 trên mẫu bệnh Biến đổi Bisulfite DNA và tinh sạch sau biến đổi

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 31 sinh học (National Center for Biotechnology Information - NCBI) thuộc Thư viện quốc gia Hoa Kỳ (National Library of Medicine - NLM) PubMed là một cở sở dữ liệu khổng lồ, bao gồm nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới Để tìm kiếm dữ liệu trong PubMed, Chúng tôi dùng các từ khóa như cervical cancer, DNA methylation, epigenetics, p16INK4a gene, cyclin dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) gene …

II.2.1.2/ Khảo sát in silico gen p16: a Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG:

- Thu nhận trình tự gen p16 từ ngân hàng gen NCBI Tiến hành xác định vị trí một số vùng quan trọng trong cấu trúc của gen như vùng promoter, 5’UTR, exon 1α Chúng tôi chỉ tập trung khảo sát vùng gen kéo dài từ promoter 1 đến exon 1 vì sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG thuộc vùng này có thể ảnh hưởng đến quá trình phiên mã của gen gây nên sự im lặng của gen dẫn đến ung thư

- Sử dụng phần mềm Methprimer với các thông số mặc định sẵn trong chương trình để xác định các đảo CpG thuộc vùng promoter kéo dài đến exon 1α

- Ghi nhận các CpG được xem là hot spot mà khi sự methyl hóa xảy ra tại các vị trí này sẽ có khả năng làm thay đổi chức năng của gen ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của ung thư Tiến hành phân tích, xác định vị trí gắn các nhân tố phiên mã bằng phần mềm TFSEARCH b Thiết kế và đánh giá mồi:

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thiết kế và đánh giá mồi bằng một số công cụ tin sinh học:

- Biến đổi bisulfite in silico đối với vùng cần khảo sát của gen p16 bằng phần mềm MethPrimer

- Tiến hành thu thập các cặp mồi từ các công trình nghiên cứu đã công bố

- Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi với trình tự vùng gen cần khảo sát bằng phần mềm Annhyb, MethBlast

- Xác định thông số của các cặp mồi: Tm (nhiệt độ nóng chảy), chiều dài, tỷ lệ % GC, kích thước sản phẩm tạo thành, khả năng tạo self-dimer, hetero-dimer và hairpin loop bằng phần mềm Annhyb, IDT

II.2.2/ Khảo sát thực nghiệm:

II.2.2.1/ Tách chiết DNA: a Nguyên tắc:

Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng phenol/chloroform Màng tế bào và màng nhân được biến tính bằng chất tẩy mạnh Sau đó, protein sẽ được biến tính bằng phenol/chloroform và bị loại bỏ DNA bộ gen sẽ được tủa với ethanol lạnh b Thiết bị và hóa chất:

- Máy ly tâm lạnh Hettich

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 33 c Các bước tiến hành:

- Bước 1: Cho mẫu bệnh phẩm vào ống eppendorf loại 1,5ml o Đối với mẫu mô:

▪ Thờm 700àl hỗn hợp gồm 14àl NaCl 5M, 14àl Tris HCl 1M (pH=8), 14 àl dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8),

33 àl SDS 10%, và 615àl H2O Cắt nhuyễn mụ bệnh phẩm

Bổ sung 10àl protein K (nồng độ 20mg/ml) o Đối với mẫu dịch phết:

▪ Ép tâm bông vào thành ống eppendorf

▪ Chuyển tõm bụng sang eppendorf chứa 500 àl nước cất và tiếp tục ép tâm bông vào thành để thu toàn bộ tế bào

▪ Thờm 700àl hỗn hợp gồm 14àl NaCl 5M, 14àl Tris HCl 1M (pH=8), 14 àl dung dịch đệm EDTA 0,5M (pH=8),

33 àl SDS 10%, và 615àl H2O, 10àl protein K (nồng độ 20mg/ml)

- Bước 2: Trộn đều hỗn hợp ủ 48 o C trong 2h, thỉnh thoảng lắc nhẹ

- Bước 3: Thờm 700àl phenol:chloroform (1:1) Trộn đều Ly tõm

15000 vòng/phút trong 3 phút Thu phần dịch nổi phía trên và chuyển sang ống eppendorf mới

- Bước 4: Lặp lại bước 3 thêm một lần

- Bước 5: Thêm một thể tích dung dịch chloroform bằng thể tích dịch nổi thu được Trộn nhẹ Ly tâm 15000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển phần dịch nổi phía trên sang ống eppendorf mới

- Bước 6: Thêm một lượng sodium acetate (NH4OAc) 5M bằng 0,2 lần và một lượng cồn ethylic 100% bằng 2,5 lần thể tích dịch nổi thu được

- Bước 7: Trộn đều Để kết tủa DNA ở -20 0 C trong 30 phút Ly tâm

15000 vòng/phút ở 4 0 C trong 10 phút Thu lấy kết tủa, loại bỏ phần dịch trong ống

- Bước 8: Thờm 500àl cồn Ethylic 70% lạnh để rửa sạch kết tủa Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4 0 C trong 5 phút Thu kết tủa loại bỏ Ethylic phía trên

- Bước 9: Hũa tan DNA kết tủa trong 30-50 àl nước Bảo quản DNA ở -20 0 C

II.2.2.2/ Kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết: a Phương pháp đo quang phổ:

Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các nucleotide Giá trị mật độ quang ở bước song 260 nm (OD260nm - Optical Density 260 nm) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch (một đơn vị OD260nm tương ứng với 50 àg/ml một dung dịch DNA sợi đụi) Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ OD260nm/OD280nm (280 nm là bước sóng mà các protein có độ hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu ánh sáng ở

260 nm dẫn tới làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleotide) Một dung dịch DNA có tỉ số OD260nm/OD280nm dao động từ 1,8-2 được xem là sạch (không tạp nhiễm protein).[34]

❖ Thiết bị và hóa chất:

- Máy đo quang phổ Bio Rad

DNA sau khi tách chiết được pha loãng 7 lần bằng nước cất vô trùng Sau đó chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và thực hiện đo các giá trị:

OD260nm, OD260nm/OD280nm

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 35 b Phương pháp điện di:

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, trong điện trường các phân tử DNA sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng và cấu trúc của phân tử DNA (nếu phổ điện di của dung dịch DNA cho một dải băng rộng hoặc cho nhiều vạch thì chứng tỏ DNA đã bị gãy đoạn nhiều, hoặc lẫn DNA với RNA; nếu phổ điện di là băng gọn, rõ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy và không lẫn tạp

Các acid nucleic trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các bazơ của acid nucleic và phát quang dưới tác dụng của tia tử ngoại (λ00nm) Kích thước của các acid nucleic sẽ được xác định khi so sánh với kích thước đã biết trước của thang chuẩn

❖ Thiết bị và hóa chất:

- Máy đọc gel……… Bio Rad

- Ethidium bromide (10 mg/ml).……… Bio Rad

- Sau khi đo quang phổ, DNA đã pha loãng được thu nhận lại để thực hiện điện di

- Hỗn hợp 15àl DNA đó pha loóng và 3àl dung dịch nạp mẫu được chạy điện di với gel agarose 2% ở hiệu điện thế 80V trong 30 phút

- Ghi nhận hình ảnh điện di bằng máy đọc gel

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 36 c Kiểm tra chất lượng DNA bằng phản ứng PCR:

Sau khi xác định nồng độ và chất lượng DNA bộ gen bằng điện di và đo quang phổ như trên, chúng tôi tiến hành chạy phản ứng PCR bằng cặp mồi DcR1 hoang dại (DcR1-W) đã được thiết kế từ nghiên cứu trước đây của nhóm [35] để đánh giá hiệu quả của quá trình tách chiết DNA Nếu kết quả cho ra vạch sản phẩm như mong đợi chứng tỏ trong dịch chiết thu được có chứa DNA bộ gen và có thể sử dụng DNA thu nhận này cho các bước thực nghiệm tiếp theo

- Premium PCR master mix 2X Việt Á

Phản ứng PCR được tiến hành trong thể tớch 25àl với mồi DcR1-W (bảng III.5), thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR như bảng II.1 và II.2

Bảng II.1: Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W

Thành phần Thể tớch (àl)

Bảng II.2: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W

Chúng tôi sử dụng bộ “Epitect Bisulfite Kit” của hãng Qiagen để biến đổi bisulfite DNA vừa tách chiết a Nguyên tắc:

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico

III.1.1/ Khai thác dữ liệu:

Sau khi tiến hành khai thác dữ liệu trên PubMed (NCBI) bằng các từ khóa trên, chúng tôi đã thu được khoảng 10 bài báo liên quan đến sự phân tích mức độ methyl hóa trên vùng promoter gen p16 trên mẫu bệnh phẩm ung thư cồ tử cung Mức độ methyl hóa của gen bất kỳ có thể được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật trên nhiều loại mẫu khác nhau Tuy nhiên, chính kỹ thuật dùng để đánh giá mức độ methyl hóa và nguồn mẫu sử dụng là hai nguyên nhân chính dẫn đến tần số methyl hóa khác nhau giữa các nghiên cứu Để phát triển quy trình thực nghiệm nhằm xác định mức độ methyl hóa, đầu tiên chúng tôi tiến hành thống kê các kỹ thuật và các loại mẫu để đánh giá mức độ phổ biến của các kỹ thuật và loại mẫu sử dụng trong các nghiên cứu Trong 10 bài báo chúng tôi sẽ phân tích từng bài dựa vào kĩ thuật và nguồn mẫu sử dụng để đánh giá mức độ methyl hóa trên gen p16 Trong đó, có một số bài báo sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá mức độ methyl trên một hoặc nhiều nguồn mẫu khác nhau Vì vậy, chúng tôi thu nhận được 22 nghiên cứu thống kê ở bảng III.1 Kĩ thuật MSP được sử dụng nhiều nhất chiếm 54,5 % (12/22), các phương pháp còn lại ít được sử dụng hơn Nguyên nhân có thể là do ưu điểm của phương pháp MSP được sử dụng rộng rãi hơn, cho phép xác định nhiều vị trí CpG trong vùng trình tự cần khảo sát và cũng không đòi hỏi nhiều về thiết bị so với các phương pháp khác Về nguồn mẫu sử dụng, phổ biến nhất là mẫu mô tươi chiếm 59,1 % (13/22), kế đến là mẫu paraffin chiếm 36,4 % (8/22), mẫu sinh thiết được sử dụng rất ít Theo chúng tôi, mẫu mô tươi được sử dụng nhiều là do đặc điểm của loại mẫu này là một vùng mô được cắt ra khỏi cơ thể của bệnh nhân được chẩn đoán có dấu hiệu ung thư, mẫu mô này chắc chắn có chứa các tế bào có dấu hiệu bất thường, đặc biệt có thể có

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 44 các tế bào đã chuyển thành ung thư và các tế bào ở giai đoạn tiền ung thư Như vậy, để phát hiện mức độ methyl hóa DNA theo tiến trình phát triển của ung thư thì mẫu mô tươi là đối tượng thích hợp

Bảng III.1: Phương pháp phân tích và nguồn mẫu sử dụng trong 10 bài báo

Như trên đã đề cập kỹ thuật phân tích và loại mẫu sử dụng sẽ ảnh hưởng đến mức độ methyl hóa của gen Vì vậy chúng tôi tập trung đánh giá ảnh hưởng của yếu tố kỹ thuật và yếu tố loại mẫu đến tần số methyl hóa bao gồm: phương pháp dùng để đánh giá mức độ methyl hóa (MSP); nguồn mẫu sử dụng (mô tươi, mô đúc); các giai đoạn ung thư cổ tử cung (LSIL, HSIL); hai dạng ung thư cổ tử cung phổ biến (SCC và AC) và các mẫu tế bào bình thường (bảng III.2)

MSP QMSP BSP Khác Tổng Tài liệu tham khảo Nguồn mẫu

Bảng III.2: Số liệu tần số methyl hóa của các nghiên cứu khác nhau dựa trên phương pháp MSP và hai loại mẫu mô đúc và mô tươi ở các giai đoạn và các dạng bệnh khác nhau

Giai đoạn và dạng bệnh

Mẫu mô khảo sát Tài liệu tham khảo

Số liệu phần trăm (%) thể hiện tần số methyl hóa tính trên số mẫu khảo sát được hiền thị trong dấu ngoặc LSIL: Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions (tổn thương bên trong biểu mô vảy mức độ thấp); HSIL: High-grade Squamous Intraepithelial Lesions (tổn thương bên trong biểu mô vảy mức độ cao); SCC: Squamous cell carcinoma (ung thư tế bào biểu mô vảy); AC: Adenoma carcinoma (ung thư tế bào tuyến).

Số liệu thống kê trong bảng III.2 cho thấy có sự khác biệt về mức độ methyl hóa của gen p16 trong từng giai đoạn khác nhau và ở các loại mẫu khác nhau Ngay cả tế bào bình thường, cũng không tìm thấy sự thống nhất giữa các nghiên cứu Tuy nhiên, để đánh giá tiềm năng làm dấu chuẩn sinh học trong phát hiện sớm bệnh, phân biệt các giai đoạn, cũng như phân biệt hai loại ung thư tế bào tuyến (AC) và tế bào biểu mô vảy (SCC), cần phải có tiêu chuẩn, số liệu cụ thể Do vậy, chúng tôi tiến hành tính tần số methyl hóa trung bình có trọng số (để loại bỏ sự khác biệt về mức độ methyl hóa) Kết quả thể hiện trong bảng III.3 và hình III.1 sau

Bảng III.3: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của gen p16 trong ung thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường

Giai đoạn và dạng bệnh Bình thường LSIL HSIL SCC AC

Hình III.1: Tần số methyl hóa của gen p16 trong ung thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường.

Tâm của các vòng tròn thể hiện tần số methyl hóa đã được báo cáo trong các nghiên cứu được thống kê (bảng III.2) Kích thước của vòng tròn thể hiện số lượng mẫu trong nghiên cứu Đường thẳng nằm ngang thể hiện tần số methyl hóa trung bình có trọng số dựa trên các nghiên cứu mà chúng tôi phân tích (bảng III.3).

Từ kết quả khảo sát trên và dựa vào cơ sở vật chất hiện có, chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp MSP để đánh giá mức độ methyl hóa trong các mẫu mô tươi của bệnh nhân ung thư cổ tử cung trong nghiên cứu của chúng tôi Tuy nhiên, do hạn chế về nguồn mẫu mô tươi vì mẫu này phải lấy từ những bệnh nhân phẫu thuật cổ tử cung nên chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thêm trên một số mẫu dịch phết âm đạo mà nguồn mẫu này có đặc điểm là chứa các tế bào biến đổi bất thường ở giai đoạn đầu của ung thư và ưu điểm là dễ dàng thu nhận và có số lượng nhiều

III.1.2/ Khảo sát in silico:

III.1.2.1/ Xác định trình tự, cấu trúc gen p16 và đảo CpG:

Trình tự gen p16 được thu nhận từ ngân hàng gen NCBI với mã số truy cập: “>gi|21886808|gb|AF527803.1|” Dựa vào NCBI, chúng tôi xác định được vùng promoter, 5’-UTR, 3’-UTR

Dựa vào bài báo số [49], chúng tôi xác định được vị trí, kích thước các exon như sau: exon 1α dài 339 bp (203 - 542); exon 2 dài 508 bp (3776 - 4284); exon 3 dài 168 bp (6801 - 6969) Cấu trúc gen p16 được mô tả cụ thể ở hình III.2

Bằng phần mềm MethPrimer, chúng tôi đã xác định được p16 có 7 đảo CpG ở kích thước như sau: Đảo 1: 126 bp (-1313 → -1187) Đảo 2: 130 bp (-206 → -76) Đảo 3: 142 bp (24 → 165) Đảo 4: 362 bp (196 → 557) Đảo 5: 279 bp (3920 → 4216) Đảo 6: 154 bp (4300 → 4453) Đảo 7: 335 bp (6518 → 6852)

Promoter là vùng khởi đầu phiên mã, chứa trình tự đặc hiệu được ARN polymerase và các nhân tố phiên mã quan trọng nhận biết để gắn vào trong quá trình phiên mã của gen, đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện gen Như vậy, với mục đích khảo sát ảnh hưởng methyl hóa các đảo CpG đến mức độ biểu hiện gen thì việc khảo sát trên vùng promoter là việc làm cần thiết và quan trọng Chúng tôi đã xác định được trong vùng promoter kéo dài đến exon 1α gen p16 có 4 đảo CpG (đảo 1 đến đảo 4 theo thứ tự liệt kê ở trên) Trong đó, đảo số 4 thuộc vùng bắt đầu khởi động phiên mã, có các trình tự nhận biết để các nhân tố phiên mã gắn vào Bên cạnh đó, kế thừa những nghiên cứu trên thế giới về ảnh hưởng của methyl hóa p16 đến sự biểu hiện gen trong quá trình hình thành và phát triển của nhiều loại ung

Hình III.2: Cấu trúc gen p16 và vùng đảo CpG khảo sát

Chú thích: Cặp mồi methyl

Vị trí gắn các nhân tố phiên mã

Vị trí bắt đầu phiên mã (+1)

8871 bp Đảo CpG số 4 (362 bp)

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 49 thư khác nhau cũng như ung thư cổ tử cung đã thực hiện khảo sát methyl hóa vùng đảo CpG số 4 này Một vài nghiên cứu có thể kể tên như sau:

- Seung Myung Dong và các cộng sự phân tích tình trạng methyl hóa promoter gen p16, DAPK, MGMT, APC, HIC-1 và E-cadherin trên các mẫu bệnh phẩm ung thư cổ tử cung và trong mẫu mô cổ tử cung bình thường (năm 2001) Kết quả hypermethylation bất thường diễn ra ở vùng promoter của 6 gen (p16, DAPK, MGMT, APC, HIC-1 và E-cadherin) trong mẫu ung thư cổ tử cung là 79 % (42/53); hypermethylation promoter gen p16 chiếm

- Dae Hoon Jeong và các cộng sự thực hiện khảo sát tình trạng methyl hóa vùng promoter gen p16 đối với bệnh ung thư cổ tử cung (năm 2005) Kết quả cho thấy methyl hóa vùng promoter gen p16 là sự kiện thường xuyên trong ung thư cổ tử cung chiếm 57 % (45/78), và tầng xuất methyl hóa promoter trong mẫu kiểm chứng là 8,3 % (2/24) [39]

- Arvind K Virmani và các cộng sự phân tích methyl hóa bất thường

Kết quả khảo sát thực nghiệm

III.2.1/ Tách chiết DNA và kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết:

Bằng phương pháp phenol-chloroform, chúng tôi đã tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm và thu nhận được kết quả ở bảng III.6

Nồng độ DNA thu nhận từ các mẫu có sự khác nhau và không đồng đều, nồng độ DNA cao nhất là 574,8 ng/àl và một số mẫu nồng độ thấp dưới 20 ng/àl Chớnh vỡ nồng độ DNA và chất lượng DNA khụng đều nhau nên quy trình biến đổi bisulfite áp dụng cũng khác nhau (như đã trình bày ở mục II.2.2.3) Chỉ số OD260/OD280 thể hiện độ tinh sạch DNA sau tách chiết khá tốt, phần lớn các mẫu đều có độ tinh sạch 1,7 - 1,9 Tuy nhiên, vẫn có một số mẫu cho độ tinh sạch không cao như mẫu H9, H10, H11, H12, 285 cho chỉ số OD260/OD280 dưới 1,5

Trình tự (5’-3’) Sản phẩm (bp)

Bảng III.6: Kết quả tách chiết DNA từ các mẫu bệnh phẩm

STT Mẫu bệnh phẩm Nguồn mẫu Đặc điểm nguồn mẫu Nồng độ

7 31 Dịch phết HPV 18, 33 Rất thấp -

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 57 Tiếp theo, chúng tôi tiến hành điện di một số mẫu để kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết có nguyên vẹn hay không, thu được một số hình ảnh điện di như sau (hình III.4)

Kết quả ở hình III.4 cho thấy phương pháp phenol/chloroform cho chất lượng DNA bộ gen khá tốt Sản phẩm DNA bộ gen tách chiết được cho băng gọn, rõ nhưng một số mẫu do có nồng độ thấp nên vẫn không phát hiện được trên điện di

Tiếp theo, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W với trình tự tham khảo ở bảng III.5 trên một số mẫu bệnh phẩm để kiểm tra hiệu quả của quá trình tách chiết DNA với thành phần phản ứng và chu kì nhiệt như bảng II.1 và II.2

Hình III.4 : Kết quả điện di một số mẫu DNA sau tách chiết

Hình III.5: Kết quả chạy phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W trên các mẫu bệnh phẩm Thang chuẩn 100 bp

Kết quả ở hình III.5 trên cho thấy những mẫu chúng tôi chọn đều cho sản phẩm PCR với kích thước đúng như mong đợi Trong đó, mẫu H9, H10 có chất lượng DNA có OD260/0D280 chỉ là 1,4 nhưng cũng cho kết quả khá tốt, mẫu 477 cú nồng độ DNA thấp (11,4 ng/àl) nhưng cho sản phẩm khuếch đại rất tốt Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã thành công trong việc tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/choloroform và chúng tôi có thể sử dụng dịch DNA thu được trên cho các khảo nghiệm tiếp theo

Các mẫu bệnh sau khi kiểm tra độ tinh sạch DNA, chúng tôi tiến hành biến đổi bisulfite bằng Epitect Bisulfite Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được thu lại trong 40 àl dung dịch đệm EB

III.2.2/ Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi p16-M và p16-U bằng phương pháp QMSP (Quantitive MSP): Để dễ dàng hơn cho việc tối ứu hóa điều kiện phản ứng MSP, chúng tôi sử dụng hai nguồn DNA kiểm chứng được cung cấp bởi Qiagen: bao gồm DNA bộ gen đã biết chắc chắn bị methyl hóa và một loại khác chắc chắn chưa bị methyl hóa Ngoài ra, để hạn chế hiện tượng âm tính giả của phản ứng MSP (mà cụ thể là việc không phát hiện được sản phẩm phản ứng PCR

SVTH: LÊ THỊ ĐANG UYÊN 59 do nồng độ của sản phẩm không đủ để phát hiện trong điện di), chúng tôi dùng kỹ thuật MSP định lượng-QMSP (Quantitive MSP) nhằm phát hiện chính xác theo thời gian lượng sản phẩm phản ứng được tạo thành

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như bảng II.5 và II.6 Kết quả được khái quát trong bảng III.7

Bảng III.7: Kết quả kiểm tra trên DNA chứng bằng phương pháp QMSP

Cặp mồi Chu kì ngưỡng Tm ( 0 C) Kích thước sản phẩm (bp) p16-M 28 86 149

83 Primer dimer p16-U 25 81 150 Đối với mỗi cặp mồi hình được thể hiện lần lượt là:

(a) Biểu đồ khuếch đại của real time PCR: với trục hoành là các chu kì nhiệt, trục tung là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích

(b) Biểu đồ đường cong nóng chảy: với trục hoành thể hiện các giá trị biến thiên nhiệt độ của buồng ủ, trục tung là các giá trị biến thiên cường độ huỳnh quang

(c) Kết quả chạy điện di sản phẩm realtime-PCR Ở hình III.6, dựa vào biểu đồ khuếch đại ta nhận thấy chu kì ngưỡng đối với hai cặp mồi p16-M và p16-U lần lượt có giá trị là 28 và 25 Đường cong nóng chảy ở phản ứng với cặp mồi p16-M có hai đỉnh tương ứng với sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của phản ứng PCR (Tm o C) và sản phẩm primer dimer (Tm o C) Đối với cặp mồi p16-U thì chỉ có một đỉnh đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại mong đợi (Tm o C)

Sản phẩm real-time PCR được chạy điện di, kết quả thu được là vạch sản phẩm khuếch đại mong đợi với kích thước 149 bp đối với cặp mồi p16-

M và một vạch có kích thước nhỏ hơn 100 bp là do sự hiện diện của primer dimer nhưng sẽ không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng Cặp mồi p16-U cho ra một vạch có kích thước sản phẫm như mong đợi 150 bp Từ kết quả trên chứng tỏ cặp mồi p16-M và p16-U bắt cặp đặc hiệu trên mẫu DNA control

III.2.3/ Phản ứng MSP với các cặp mồi p16-M và p16-U kiểm tra mức độ methyl hóa gen p16:

Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR trên 32 mẫu bệnh phẩm đã biến đổi bisulfite, mẫu chứng dương PC (positive control), mẫu chứng âm NC (negative control), thang chuẩn LD (ladder) 100bp đối với cặp mồi p16-M và p16-U Kết quả điện di sản phẩm PCR thể hiện trong hình III.7

Từ kết quả điện di, chúng tôi nhận thấy ngoài các vạch có kích thước mong đợi còn có các vạch kích thước nhỏ hơn 100 bp là do sự hình thành primer dimer trong quá trình chạy PCR Tiếp theo, chúng tôi tiến hành thống kê số mẫu bệnh phẩm bị methyl hóa và không bị methyl hóa ở bảng III.8

Hình III.6: Kết quả chạy phản ứng QMSP và kết quả điện di của cặp mồi p16-M và p16-U

Hình III.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi p16-M và p16-U trên mẫu PC, NC và các mẫu bệnh phẩm đã biến đổi bisulfite Sử dụng thang chuẩn 100 bp

Tiêu đề	Khảo Sát Mức Độ Methyl Hóa Các Đảo CpG Thuộc Vùng Promoter Của Gen P16 Trên Bệnh Nhân Ung Thư Cổ Tử Cung
Tác giả	Lê Thị Đang Uyên
Người hướng dẫn	TS. Lê Huyền Ái Thúy, ThS. Lê Thị Trúc Linh
Trường học	Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	Báo cáo Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Tp. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	76
Dung lượng	1,33 MB