khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo cpg thuộc vùng promoter gen cyclin d2 ứng dụng làm biomarker trong chuẩn đoán bệnh ung thư vú

Sự im lặng của gen ức chế khối u do sựmethyl hóa quá mức promoter là biến đổi Epigenetics bất thường có tần số cao, pháthiện sớm trong các khối u, trong đó có các khối u ở ung thư vú [1]

TỔNG QUAN 1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ

TÌNH HÌNH UNG THƯ VÚ TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Ung thư vú là dạng ung thư phổ biến nhất trên toàn thế giới, ảnh hưởng đến 23% phụ nữ bị ung thư Theo ước tính năm 2008 của Tổ chức Y tế thế giới, có 1,38 triệu ca ung thư vú mới được chẩn đoán, chia đều giữa các nước phát triển và đang phát triển với khoảng 690.000 ca mới tại mỗi khu vực.

Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 19,3 trên 100000 phụ nữ ở Đông Phi cho đến 89,7 trên 100000 phụ nữ ở Tây Âu, và lớn hơn 80 trên 100000 phụ nữ trong khu vực các nước đang phát triển.

Theo tỷ lệ tử vong thì ung thư vú vẫn là nguyên nhân tử vong thường gặp nhất của bệnh ung thư ở phụ nữ: khu vực các nước đang phát triển ước tính có

269000 ca tử vong chiếm 12,7% của tổng số ung thư ở nữ, trong khi con số ở các nước phát triển là 189000 ca.

Tại Việt Nam, ung thư vú là loại ung thư có tầng số cao nhất ở Hà Nội và đứng thứ hai sau ung thư cổ tử cung ở thành phố Hồ Chí Minh Cũng theo cơ quanNghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC), vào năm 2008 tại Việt Nam ung thư vú đứng thứ ba sau ung thư gan và phổi Ước tính có 6830 trường hợp mắc bệnh chiếm15.6% trong các loại bệnh ung thư và 2423 ca tử vong mỗi năm (chiếm 5.7% các trường hợp mắc bệnh).

UNG THƯ VÚ VÀ PHÂN LOẠI

Vú có cấu tạo cơ bản là mỡ, bầu vú không có cơ, nhưng nó bám chắc vào cơ ngực trên xương sườn Ngoài ra, vú được nâng đỡ bởi các cơ xung quanh cùng với các dây chằng liên kết nó với xương ở cổ như xương cánh tay và xương sườn Núm vú là nơi tập trung nhiều đầu mút thần kinh nhạy cảm với kích thích Bên trong vú là hệ thống sinh sữa còn được gọi tuyến sữa Tuyến sữa bao gồm tiểu thùy và ống dẫn sữa từ tiểu thùy tới núm vú Mô mỡ và mô liên kết bao quanh tuyến sữa mạch máu và các mạch bạch huyết [4].

Có nhiều dạng ung thư, nhưng mọi trường hợp ung thư đều bắt đầu khi một nhóm tế bào trong cơ thể tăng trưởng bất bình thường vượt ngoài tầm kiểm soát Tế bào ung thư cứ tiếp tục tăng lên thêm và lấn át tế bào bình thường [4]. Đa số trường hợp ung thư vú bắt đầu ở các tế bào trong ống dẫn, tiểu thùy. Còn lại một số ít trường hợp bắt đầu từ những mô khác ở vú [4].

Tùy từng giai đoạn và vị trí bệnh, ung thư vú được chia thành nhiều dạng khác nhau, dưới đây là những dạng ung thư vú thường gặp.

Ung thư ống dẫn tại chỗ (DCIS) là dạng ung thư vú không xâm lấn phổ biến nhất, trong đó các tế bào ung thư chỉ giới hạn trong ống dẫn sữa, chưa lan rộng sang các mô khác Người mắc DCIS có nguy cơ cao tiến triển thành ung thư vú xâm lấn.

Ung thư tiểu thùy tại chỗ (LCIS - Lobular carcinomain situ): tế bào ung thư bắt đầu trong tiểu thùy của tuyến sữa, ung thư tiểu thùy tại chỗ không di căn đến các

NHỮNG YẾU TỐ LÀM GIA TĂNG NGUY CƠ MẮC BỆNH UNG THƯ VÚ

Ung thư ống dẫn xâm lấn (IDC - Invasive ductal carcinoma): là ung thư vú bắt đầu tại ống dẫn sữa, tăng trưởng lan ra khỏi ống thành ống dẫn bệnh xâm nhập vào các mô mỡ của vú Ung thư cũng có thể di căn tới những bộ phận khác của cơ thể [4].

Ung thư tiểu thùy xâm lấn (ILC - Invasive Lobular Carcinoma) : là ung thư vú bắt đầu ở tiểu thùy của tuyến sữa Bệnh có thể di căn tới những bộ phận khác của cơ thể [4].

Ung thư vú dạng viêm (IBC - Inflammatory breast cancer): đây là dạng ung thư vú không phổ biến, ung thư dạng viêm chỉ chiếm 1% đến 3% trong tất cả các dạng ung thư vú Ung thư vú dạng viêm không hình thành khối u mà thay vào đó da vùng vú đỏ và ấm, da trong dày hơn và sần sùi như vỏ cam Trong giai đoạn đầu thì ung thư vú dạng viêm thường bị nhầm lẫn với nhiễm trùng [4].

1.3 NHỮNG YẾU TỐ LÀM GIA TĂNG NGUY CƠ MẮC BỆNH UNG THƯ VÚ:

Có nhiều yếu tố làm gia tăng nguy cơ mắc ung thư vú như [4]:

- Giới tính là nữ thì có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao Tuy nhiên ở nam giới cũng có thể phát triển ung thư vú.

- Khả năng bị bệnh ung thư vú tăng lên ở những phụ nữ lớn tuổi Khoảng

2 trong 3 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú xâm lấn có độ tuổi khoảng 55 tuổi hoặc lớn tuổi hơn khi được phát hiện.

- Những phụ nữ có người thân như mẹ, chị hay em gái mắc bệnh thì có nguy cơ mắc bệnh cao hơn.

Các yếu tố tiền sử bệnh ung thư vú bao gồm: tiền sử bệnh ung thư vú của bản thân là một trong những yếu tố rủi ro nghiêm trọng nhất Nếu một phụ nữ đã từng mắc ung thư vú ở một bên, nguy cơ mắc bệnh ở vú còn lại hoặc những phần khác ở cùng bên vú đó sẽ tăng cao hơn hẳn.

- Chủng tộc: phụ nữ da trắng dễ bị ung thư vú hơn phụ nữ Mỹ gốc phi, tuy nhiên lại có nhiều khả năng chết vì ung thư vú hơn Phụ nữ châu Á, Tây Ban Nha, và phụ nữ người Mỹ bản địa có nguy cơ mắc bệnh và chết vì ung thư vú thấp hơn.

- Những phụ nữ có mô vú dày đặc có nguy cơ mắc bệnh cao Mô vú dày đặc có nghĩa là mô tuyến nhiều hơn mô mỡ.

- Dinh dưỡng và rượu: ăn nhiều mỡ cũng như uống nhiều rượu làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú.

- Phụ nữ sử dụng kích thích tố sau khi tắt kinh trên năm năm có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao hơn.

TỔNG QUAN EPIGENETICS

Thuật ngữ epigenetics được sử dụng lần đầu tiên bởi nhà phôi sinh học Conrad Waddington của trường đại học Cambridge vào năm 1939 Ông đã sử dụng thuật ngữ epigenetic để diễn tả nguồn gốc sự phát triển của sinh vật Theo ông đặc tính hình thái, chức năng của một sinh vật xuất hiện liên tục dưới một chương trình được thiết lập bởi bộ gen và chịu ảnh hưởng từ môi trường sống của sinh vật [5].

Theo sinh học phân tử hiện đại thì thuật ngữ epigenetics được mở rộng hơn, Feinberg cho rằng epigenetics là những biến đổi về mặt di truyền trong biểu hiện gen không liên quan đến những biến đổi về trình tự DNA [5].

Biến đổi epigenetics bao gồm ba kiểu biển đổi: methyl hóa DNA, biến đổi histone, microRNA [6] Trong đó biến đổi methyl hóa DNA là biến đổi được đề cập nhiều đến nguyên nhân của nhiều bệnh ung thư Trong đề tài này, chúng tôi tập chỉ tập trung vào cơ chế biến đổi methyl hóa DNA.

2.2.1 Cơ chế methyl hóa DNA:

Sự methyl hóa DNA là một trong những biến đổi epigenetics nổi bật nhất. Methyl hóa DNA là gắng thêm nhóm (—CH3—) vào vị trí cacbon thứ 5 trên vòng vòng pyrimidine của cytosine [5].

Không phải tất cả cytosine trên DNA đều được methyl hóa Sự methyl hóa cytosine thường xảy ra ở những cytosine nằm cạnh guanine (CpG dinucleotides) Trong phân tử DNA, các CpG dinucleotides tập trung thành vùng được gọi là "đảo CpG" Đảo CpG thường nằm gần vị trí bắt đầu phiên mã (promoter) của gen và có kích thước trung bình khoảng 500 cặp base Trên phân tử DNA có 4 loại nucleotide (A, T, G, C), nên về mặt lý thuyết, tỉ lệ xuất hiện của CpG dinucleotides là 6,25% Tuy nhiên, trên thực tế, tỉ lệ CpG dinucleotides ở đảo CpG cao hơn nhiều so với giá trị lý thuyết này, thường lớn hơn hoặc bằng 0,6.

Có khoảng 70% CpG dinucleotides trong bộ gen có động vật có vú bị methyl hóa Có khoảng 94% CpG dinucleotides trên đảo CpG không bị methyl hóa trong những tế bào bình thường, ngoại trừ trong nhiểm sắc thể X không hoạt động và gen

Hình I.2.2.1- Sự methyl hóa cytosine

Sự methyl hóa DNA được xúc tác bởi một nhóm emzyme DNA methyltransferases (DNMTs) Nhóm enzyme DNMTs bao gồm các enzyme DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, và DNMT3L [7].

2.2.2 Vai trò sự methyl hóa DNA trong điều hòa hoạt động của gen:

Methyl hóa DNA liên quan tới sự giảm hoạt tính phiên mã của những gen chứa nhiều CG trong vùng lân cận promoter Sự methyl hóa DNA có thể ức chế hoạt động phiên mã theo hai hướng [7].

Thứ nhất, sự methyl hóa DNA có thể trực tiếp can thiệp vào vị trí bám các nhân tố phiên mã lên trình tự nhận biết của chúng Sự chuyển động của RNA polymerase dọc theo gen dường như không bị ảnh hưởng bởi sự methyl hóa, bởi vì vùng trình tự mã hóa cùng chiều promoter thường chứa dinucleotide CpG mà hầu hết CpG đều methyl hóa Điều này đã được chứng minh cho khả năng bám của AP-

2 lên trình tự nhận biết của chúng lên vùng promoter của gen proencephalin Sự methyl hóa vị trí CCGG trong vị trí bám của AP-2 trên gen làm ức chế AP-2 bám vào gen, đó giải thích sự ức chế biểu hiện của gen tổng hợp hạt nhân proencephalin- CAT [7].

Hình I.2.2.2-a) Phản ứng xúc tác của Enzyme DNA methyltransferase(DNMTs) [7] Enzyme DNA methyltransferase xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm CH 3 từ S-adenosylmethionine (SAM) đến cytosine, tạo ra5-methylcytosine và S-adenosylhomocystine (SAH)

Thứ hai, sự ức chế gián tiếp xảy ra khi protein bám lên cytosine bị methyl hóa (protein binding methylcytosine) ở trình tự nhận biết của yếu tố phiên mã Vùng DNA bị methyl hóa gần vị trí bám trên vùng khởi động của gen có thể liên kết với các protein bám lên cytosine bị methyl hóa, tạo thành các phức hợp protein lớn bao gồm các đồng ức chế và enzyme histone deacetylase Sự gắn kết này khiến cấu trúc nhiễm sắc thể chuyển từ trạng thái hoạt động sang không hoạt động Protein điển hình nhất trong số những protein bám lên cytosine bị methyl hóa là MeCP2, có khả năng liên kết với trình tự DNA chứa ít nhất một CpG bị methyl hóa.

(A) Sự giảm methyl hóa CpG dinucleotides trên vùng promoter cho phép nhân tố phiên mã bám vào và quá trình phiên mã được thực hiện.

(B) Sự methyl hóa CpG dinucleotides ức chế các nhân tố phiên mã bám vào dẫn đến gen không phiên mã.

(C) Sự hiện diện của protein bám trên cytosine bị methyl (MBP) gắng vào CpG dinucleotides trên vùng promoter cũng ngăn chặn sự liên kết của các yếu tố phiên mã gắng lên các vị trí bám của chúng.

Hình I.2.2.2-b) Cơ chế ức chế gen phiên mã do sự methyl hóa [7]. với enzyme histone deacetylases tạo thành phức hợp dẫn đến histone bị khử acetyl, chất nhiễm sắt xoắn chặt lại và chất nhiễm sắt không hoạt động phiên mã.

2.2.3 Sự methyl hóa DNA và ung thư:

Methyl hóa DNA liên quan đến sự điều hòa hoạt động gen, sự bất hoạt nhiễm sắc thể X và sự đánh dấu bộ gen Sự methyl hóa DNA cần thiết cho sự phát triển bình thường và không thể thiếu cho sự tồn tại của những tế bào bào biệt hóa. Tuy nhiên sự methyl hóa bất thường là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh lý trong đó có ung thư [8].

2.2.3.1 Giảm methyl hóa quá mức và ung thư:

Giảm methyl hóa quá mức DNA (Hypomethylation) xảy ra ở những trình tự khác nhau của bộ gen như: trình tự lặp lại nhiều lần, gen nhảy hay còn gọi là yếu tố vận động, vùng promoter nghèo CpG, intron [8].

TỔNG QUAN GEN CYCLIN D2

Theo cơ sở dữ liệu NCBI gen Cyclin D2 (CCND2) nằm trên nhiễm sắc thể

Gen Cyclin D2 nằm trên nhiễm sắc thể 12, tại vị trí 12p13 Gen này có chiều dài 31,621 kb, bao gồm vùng điều hòa phiên mã (promoter) dài khoảng 1000-1600 bp, vùng 5’UTR, 5 exon, 4 intron và vùng 3’UTR Promoter của gen Cyclin D2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã, vì nó điều khiển quá trình liên kết của enzym RNA polymerase với vị trí bắt đầu phiên mã (+1).

3.2 CHỨC NĂNG GEN CYCLIN D2 TRONG TẾ BÀO:

Gen Cyclin D2 thuộc Cyclin loại D (D type cyclin) bao gồm cyclin D1, D2,

D3 Cyclin loại D liên kết với enzyme kinase phụ thuộc protein cyclin (CDKs) tạo thành phức hợp cyclin D/CDKs, phức hợp này đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa chu trình tế bào, sự biệt hóa và biến đổi ung thư [10].

Chu trình tế bào trải qua 4 giai đoạn G1, S, G2,M để chuyển từ giai đoạn G1 sang S tế bào phải trả qua điểm giới hạn G0 ở gần cuối pha G1, tại điểm tới hạn này diễn ra sự kiểm tra quan trọng nhất trong chu trình tế bào Các loại tế bào như tế bào

Hình I.3.1-Cấu trúc gen Cyclin D2 đoan G0 Một số loại tế bào trong cơ thể trưởng thành, như các tế bào nhu mô của gan và thận giai đoạn G0 là bán vĩnh viễn, có thể để bắt đầu phân chia một lần nữa chỉ trong trường hợp nhận được các tín hiệu nội bào và ngoại bào đã sẵn sàng chuyển sang pha S Có loại tế bào như tế bào nơron sau khi được biệt hóa chuyển vào G0 thì chúng ở trạng thái đó để thực hiện chức năng dẫn truyền thần kinh suốt đời Có loại tế bào như hồng cầu ở động vật có vú sau khi được biệt hóa mất nhân, chứa Hb thì chúng chỉ hoạt động một thời gian và sẽ bị chết đi [9].

Cyclin loại D là Cyclin đầu tiên được tạo ra khi tế bào được kích thích chuyển từ giai đoạn G0chuyển sang pha S của chu trình tế bào [11].

Trong quá trình tiến triển chu trình tế bào, Cyclin D bắt đầu tích tụ ở giữa giai đoạn G1, trong khi Cyclin E xuất hiện sau đó ngay trước khi quá trình chuyển đổi từ giai đoạn G1 sang giai đoạn S [12].

Cyclin loại D kết hợp với CDK4 hoặc CDK6 (Cyclin dependent kinases – enzyme kinases phụ thuộc vào cyclin D) tạo thành phức hợp cyclin D/CDK4 hoặc cyclin D/CDK6, phức hợp này tác dụng vào protein Rb (retinoblastoma protein) và protein liên quan p107 và p130 [13] Tuy nhiên chưa có sự phân biệt rõ ràng giữa phức hệ CDK với Cyclin D1, D2, D3 [13].

Phức hợp cyclin D/CDK điều hòa chu trình tế bào bằng cách phosphoryl hóa Rb và protein p130 Sự phosphoryl hóa này bất hoạt Rb, giải phóng E2F, kích hoạt các gen tổng hợp DNA và trao đổi chất E2F cũng kích thích phiên mã E2F và Cyclin E Cyclin E liên kết với CDK2 tạo phức hợp cyclin E/CDK2, tăng cường phosphoryl hóa Rb Khi mức cyclin D giảm, tế bào vượt qua điểm giới hạn G0 và đi vào giai đoạn S.

Phức hệ cyclin D/CDKs được hình thành đến một lượng nhất định thì tế bào vượt giai đoạn G0 và chuyển sang pha S Trong điều kiện tế bào chưa chuẩn bị sẵn sàng cho một chu trình mới, chẳng hạn do môi trường thiếu dinh dưỡng hay DNA bị sai hỏng chưa được sửa chữa thì một số protein ức chế được hoạt hóa để phá hủy phức hệ cyclin D/CDKs [9].

3.3 SỰ METHYL HÓA GEN CYCLIN D2 : Đã có nhiều nghiên cứu phát hiện có sự methy hóa quá mức vùng promoter của genCyclin D2 trong những mẫu mô ung thư vú.

Trong đó theo nghiên cứu của Evron và cộng sự thì sự methyl hóa vượt mức vùng promoter của gen Cyclin D2 dẫn đến im lặng của gen này trên đa số dòng tế bào ung thư vú, trong khi đó ở những tế bào mô biểu bì vú bình thường có sự biểu hiện bình thương của gen này [2].

Theo một nghiên cứu khác của Fackler và cộng sự đã phát hiện sự methyl hóa quá mức vùng promoter của genCyclin D2trên những mẫu mô ung thư vú khác nhau, tần số methyl hóa genCyclin D2 trên bốn loại mô ung thư vú khác nhau thể hiện ở bảng I.3.2.

Hình I.3.2- Sự phosphoyl hóa Rb giải phóng E2F Đối với ung thư ống dẫn sữa tại chỗ - DCIS giai đoạn một tần số methyl hóa gen Cyclin D2 là 29%, giai đoạn hai 25% và giai đoạn ba là 39% [14] Cũng theo

Theo nghiên cứu của Facklerthì tần số methyl hóa của Cyclin D2 trong ung thư vú không cao Tuy nhiên, sự methyl hóa của gen Cyclin D2 chỉ đặc trưng trên ung thư vú.

TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT SỰ METHYL HÓA DNA

Nhiều kỹ thuật đã được phát minh để khảo sát sự methyl hóa cytosine DNA. Trong đó, phương pháp biến đổi bisulfite DNA được sử dụng rộng rãi nhất trong những năm gần đây Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh 5mC trong DNA trong bất kỳ trình tự nào Phản ứng bisulfite được mô tả đầu tiên vào đầu năm 1970 và được sử dụng bởi Frommer và cộng sự vào năm 1992 để phân biệt cytosine và 5mC [15].

Biến đổi bisulfite là phản ứng của DNA với sodium bisulfite được dùng để chuyển đổi tất cả cytosine không bị methyl hóa thành Uracil, những Cyosines bị methyl hóa (5mC) không phản ứng với sodium bisulfite vẫn được giữ nguyên sau khi phản ứng bisulfite kết thúc DNA này được PCR với mồi đặc hiệu cho DNA biến đổi bisulfite [15].

Bảng I.3.2-Tần số methyl hóa gen CyclinD2 ở những dòng tế bào ung thư vú khác nhau.

Loại ung thư vú Tần số methyl (%)

Biểu mô tại chỗ - LCIS 23

Biểu mô xâm lấn - ILC 32 Ống dẫn sữa tại chỗ - DCIS 32 Ống dẫn sữa xâm lấn - IDC 52

Nhiều phương pháp nghiên cứu 5mC được phát triển dưạ trên cơ sở biến đổi bisulfite trình tự DNA như: bisulfite sequencing PCR (BSP), methylation specific PCR (MSP)… Trong báo cáo này chúng tôi chỉ sử dụng phương pháp methylation specific PCR (MSP) để khảo sát.

4.2 PHƯƠNG PHÁP MSP (METHYLATION – SPECIFIC PCR):

MSP (methylation-specific PCR) là một phương pháp PCR mới có thể đánh giá nhanh tình trạng methyl hóa bất kỳ vị trí nhóm CpG nằm trong đảo CpG [10]. MSP chỉ yêu cầu một lượng nhỏ DNA tham gia vào phản ứng [16].

Cũng là một phương pháp PCR, tuy nhiên MSP sử dụng hai cặp mồi methyl, unmethyl và yêu cầu trình tự DNA phải qua biến đổi bisulfite Hai phản ứng PCR với hai cặp mồi methyl, unmethyl được tiến hành riêng biệt nhau Mồi methyl được thiết kế sao cho có nhiều vị trí CpG và phải có ít nhất một vị trí CpG ở đầu 3’ [16].

Trong trình tự cặp mồi methyl và unmethyl phải bao gồm những vị trí CG giống nhau Tức là nếu trình tự mồi xuôi của cặp mồi methyl là ATTTAGTTTCGTTTAAGGTTCGA thì mồi xuôi của cặp mồi unmethyl cũng phải bao gồm 3 vị trí CpG như ở mồi methyl, nhưng trong đó 5mC được đổi thành

Hình I.4.1 – Phản ứng sodium bisulfite

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 VẬT LIỆU

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

2.1 KHẢO SÁT IN SILICO GEN CYCLIN D2 :

2.1.1 Phần mềm và trang web được sử dụng:

- Phần mềm Annhyb (phiên bản 4.943, tháng 09 năm 2010).

- Cơ sở dữ liệu của trang web www.ncbi.nlm.nih.gov

- Chương trình xác định vị trí bám của nhân tố phiên mã TFSEARCH trên web http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html

- Chương trình methprimer trên web http://www.urogene.org/methprimer/

- Chương trình methblast trên trang web http://medgen.ugent.be/methBLAST/

- Chương trình Oligo Analyzer trên web www.idtdna.com

2.1.2 Thiết kế mồi in silico :

Mồi sử dụng cho phản ứng MSP được chúng tôi thiết kế theo các bước sau:

⮚ Bước 1: Thu nhận trình trự DNA và xác định vùng promoter của gen

Trình tự nucleotide genCyclin D2 được lấy từ ngân hàng gen của trang web www.ncbi.nlm.gov

⮚ Bước 2:xác định vị trí đảo CpG trên promoter:

Chúng tôi sử dụng chương trình methprimer tại địa chỉ http://www.urogene.org/methprimer/ để xác định vị trí các đảo CpG trên vùng khởi động của gen Cyclin D2 Chương trình này không chỉ hiển thị vị trí của các đảo CpG và chiều dài của đảo mà còn cung cấp trình tự khởi động sau khi xử lý bisulfit hóa.

⮚ Bước 3: xác định vị trí gắng các nhân tố phiên mã trên đảo CpG:

Với chương trình TFSEARCH trên web http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html chúng tôi xác định được vị trí bám của các nhân tố phiên mã trên các đảo CpG vừa tìm được ở bước trên.

⮚ Bước 4: Thiết kế mồi và kiểm tra các thông số mồi:

Kết hợp với kết quả của các bước trên chúng tôi sử dụng chương trình methprimer trên web http://www.urogene.org/methprimer/ để thiết kế mồi, đảm bảo mồi được thiết kế khuếch đại đoạn trình tự cần khảo sát.

Mồi sao khi được thiết kế được kiểm tra khả năng bắt cặp, độ đặc hiệu bằng phần mềm Annhyb – 4.943 Qua kiểm tra mồi bằng phần mềm Annhyb – 4.943 thu được các thông số như: độ đặc hiệu, vị trí bắt cặp của mồi, chiều dài sản phẩm tạo thành, số CpG trong đoạn sản phẩm khuếch đại.

Cuối cùng chúng tôi sử dụng chương trình Oligo Analyzer trên web www.idtdna.com kiểm tra các thông số của mồi như: nhiệt độ nóng chảy (Tm), chiều dài, phần trăm CG, khả năng tạo dimer và cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop).

Từ những kết quả đánh giá cặp mồi thiết kế, chúng tôi đã rút ra được kết luận về lựa chọn cặp mồi sử dụng khảo sát thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm.

Khảo sát thực nghiệm đề tài của chúng tôi được tiến hành theo các bước sau:tách chiết tinh sạch DNA bộ gen từ mẫu mô bệnh ung thư vú, kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng phương pháp PCR, biến đổi bisulfite DNA vừa tách bằng bộ kit epitect bisulfite kit của QIAGEN, thực hiện phản ứng MSP, điện di sản phẩm MSP,đọc kết quả điện di.

Mẫu mô bệnh dưới tác dụng của dung dịch lysis buffer màng tế bào và màng nhân bị phá vỡ, protein bị biến tính Dung dịch phenol/chloroform cho vào tạo ra sự tách lớp DNA với các thành phần khác giúp cho việc thu nhận dung dịch DNA thuận lợi Sự có mặt các cation hóa trị cùng ethanol ở nhiệt độ thấp từ -70 o C – 0 o C làm cho DNA bộ gen bị tủa lại.

Do đặc điển mẫu mô bệnh được bảo quản trong paraffin vì vậy phải xử lý với xyleneđể đuổi hết paraffin trong mẫu trước khi tiến hành tách chiết.

2.2.1.2 Hóa chất, thiết bị tách chiết:

Hình II.2.2- Sơ đồ khảo sát thực nghiệm

+ Tris HCl 1 M + EDTA 0,5 M pH 8 Việt Á + SDS 100 % Việt Á + Proteinase K Intronbio

- Máy ly tâm lạnh Hettich

- Cho mẫu mô bệnh vào eppendorf 1.5 ml thêm 1ml xylene, vortex 1 phút, ly tâm 13000 rpm/2 phút, sau khi ly tâm đỗ bỏ phần dịch nỗi, giữ lại mẫu Lặp lại 3-5 lần để loại bỏ paraffin.

- Sau đó thêm 1 ml ethanol 100 o vào mẫu, vortex kỹ, ly tâm 13000 rpm/2 phút, sau khi ly tâm đỗ bỏ phần dịch nỗi Số lần lặp lại tùy thuộc vào số lần cho xylene để loại bỏ hoàn toàn xylene.

- Làm khô mẫu, có thể để khô tự nhiên hoặc dùng máy sấy.

- Thêm 700 μl lysis buffer, vortex nhẹ, ủ ở 48 o C từ 4-16 giờ Lysis buffer được phối trộn giữa các hóa chất với nồng độ và thể tích theo bảng II.2.2.1.2.

Bảng II.2.2.1.3-Nồng độ và thể tích cách chất trong lysis buffer

Húa chất Thể tớch (àl)

Sau bước ly tâm với dung dịch phenol/chloroform (1:1) ở tốc độ 10000 rpm/3 phút, hỗn hợp trong eppendorf phân tầng thành 3 lớp Lớp trên cùng chứa DNA Dịch chiết DNA được hút ra với thể tích khoảng 500-600 μl và quá trình này được lặp lại 2 lần để thu được lượng DNA trong lớp dịch nhiều nhất.

- Thêm chloroform vào dung dịch DNA với tỉ lệ (1:1) Ly tâm 10000 rpm/3 phút, dung dịch sau ly tâm được tách lớp trong đó DNA là lớp dịch nổi phía trên. Dùng pipet hút 300 μl lớp dịch chứa DNA, tránh chạm vào lớp dịch phía dưới

- Thêm 60 μl NH4OAc 5M, 750 μl Ethanol 100 o Trộn đều, để ở nhiệt độ

- 20 o C trong 30 phút, sau đó ly tâm 13000 rpm/ 10 phút ở 4 o C Sau ly tâm DNA tủa lại ở đáy eppendorf, đổ bỏ phần dịch, thu được DNA kết tủa.

- Thêm 500 μl Ethanol 70 o vào tủa DNA, ly tâm 13000 rpm/5 phút ở 4 o C, đổ bỏ phần dịch, thu DNA kết tủa.

- Để khô tự nhiên, hoặc sấy để làm bay hơi hoàn toàn ethanol.

- Thêm 30-50 μl H2O DNA kết tủa thu được dịch DNA.

2.2.2 Xác định nồng độ và mức độ tinh sạch của DNA tách chiết:

- Ở bước sóng 260 nm thì 1 đơn vị hấp thụ tương ứng với 50 μg/ml dung dịch DNA sợi đôi.

Mức độ tinh sạch của DNA được xác định bằng tỷ số A260nm/A280nm Bước sóng 280nm là nơi protein hấp thụ mạnh nhất Nếu tỷ số OD A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1,8-2,0 thì DNA được coi là tinh sạch.

2.2.2.2 Hóa chất, thiết bị tách chiết:

- Máy đo quang phổ Bio - rad

- Cuvett trước khi đo OD phải được rửa với nước, tiếp theo ngâm với dung dịch NaOH trong 30 phút Rửa cuvet bằng cồn 70 o , rửa lại với nước cất Cuvett được đo OD với nước cất 2 lần trước khi đo OD mẫu DNA.

- Các mẫu DNA vừa tách chiết được pha loãng 6 lần trước khi kiểm tra Lấy

10 μl DNA tiếp theo cho thêm 50 μl H2O vào cuvet Đặt cuvet vào máy đo OD tiến hành đo ở bước sóng 260 nm, sau đó chuyển qua bước sóng 280 nm, ghi nhận các giá trị.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 1 KHẢO SÁT IN SILICO

KHẢO SÁT IN SILICO GEN CYCLIN D2

1.1.1 Thu nhận trình tự gen Cyclin D2 :

Với từ khóa là CCND2 hoặc Cyclin D2chúng tôi thu nhận được trình tự gen

Cyclin D2 dưới dạng graphics, trình tự này bao gồm các vùng : 5’UTR, 5 exon, 4 intron, 3’UTR.

Do trình tự trước vùng 5’UTR tìm được từ ngân hàng gen NCBI rất dài, không thể xác định được trình tự vùng promoter cần khảo sát, nên sử dụng mã số truy cập để tìm lại trình tự promoter của gen Cyclin D2.

(accession number) U47284.1 từ bài báo [11] Với mã số truy cập này thì ngân hàng gen của NCBI cho ra đoạn trình tự dài 1630 bp, đoạn trình tự này bao gồm trình tự promoter và 5’UTR Bỏ đi đoạn 5’UTR thì có được trình tự vùng promoter của genCyclin D2 dài 1324 nu.

1.1.2 Kiểm tra vị trí đảo CpG của vùng promoter:

Kết quả methprimer trình tự promoter dài 1324 bp có 2 đảo CpG Đảo thứ nhất dài 264 bp vị trí từ -967 đến -1230, đảo thứ hai dài 256 bp vị trí từ -672 đến

- 927 Cùng với kết quả vị trí đảo CpG trên vùng promter, methprimer còn xuất trình tự promoter đã được biến đổi bisulfite.

1.1.3 KIỂM TRA VỊ TRÍ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ:

Từ kết quả methprimer chúng tôi chọn thiết kế mồi khảo sát sự methyl hóa đảo CpG dài 256 bp Kết quả kiểm tra vị trí nhân tố phiên mã trên đảo CpG 256 bp bằng chương trình TFSEARCH chúng tôi xác định có sự hiện diện của các nhân tố phiên mã như: p300, GATA-2, sp1, C/EBP, E2F

Hình III.1.1.2- Methprimer trình tự promoter dài 1324 nu của gen Cyclin D2

THIẾT KẾ MỒI PHẢN ỨNG MSP

Kết hợp với những dữ liệu kiểm tra ở trên, chúng tôi thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu khảo sát sự methyl hóa trên đảo CpG 256 bp thuộc vùng promoter của gen

- Mồi ngược (UR): 5’–AACAACACAATACAACATCTAAAACCAC– 3’ Trong đó, mồi xuôi (MF) trong cặp mồi methyl khuếch đại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen Cyclin D2 do chúng tôi đã tham tham khảo mồi từ bài báo [17] Các mồi còn lại bao gồm cặp mồi unmethyl, mồi ngược (MR) trong cặp mồi methyl do chúng tôi thiết kế bằng phần mềm methprimer đã nêu ở phần trên.

Kết quả kiểm tra AnnHyb cho thấy cặp mồi methyl bắt hoàn toàn vào trình tự đảo CpG 256 bp đã qua biến đổi bisulfite, đạt mức độ đặc hiệu 100% Điều này chứng tỏ cặp mồi methyl có độ đặc hiệu cao và có thể sử dụng hiệu quả trong các nghiên cứu biểu sinh học, giúp phân biệt DNA đã bị methyl hóa và chưa bị methyl hóa.

Hình III.1.1.3-Vị trí gắng các nhân tố phiên mã trên đảo CpG 256 bp cặp mồi methyl dài 153 bp, sản phẩm mồi unmethyl dài 162 bp Sản phẩm khuếch đại của hai mồi đều có 18 vị trí CpG.

Kết quả kiểm tra đặc tính của mồi qua các thông số như: chiều dài mồi,

%GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), số CG, năng lương tự do ΔG các cấu trúc thứ cấp của mồi thiết kế được thể hiện qua bảng III.1.1.4.2

1.2.3 Kiểm tra mồi với methblast:

Vì mồi khuếch đại trình tự đảo CpG thuộc vùng promoter của genCyclin D2 nên khi kiểm tra với methblast sẽ không nhận được kết quả mồi bắt cặp đặc hiệu trên nhiễm sắc thể số 12 (nhiễm sắc thể chứa gen Cyclin D2) Mồi methyl và unmethyl tham khảo và thiết kế đều bắt cặp đặc hiệu trên nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo 12 BAC RP11-264F23 Khi kiểm tra trình tự nhiễm sắc thể nhân tạo 12 BAC RP11-264F23 thì kết quả cho thấy trong trình tự nhiễm sắc thể nhân tạo 12 BAC RP11-264F23 có chứa trình tự gen Cyclin D2 gồm vùng promoter khảo sát.

Do đó chúng tôi có thể kết luận trình tự mồi thiết kế bắt cặp đặc hiệu trên gen

1.2.4 Khảo sát đặc tính vật lý của mồi:

Trình tự mồi methyl và unmethyl thiết kế đáp ứng được những yêu cầu đối đối với mồi cho phản ứng MSP Trình tự cặp mồi methyl và unmethyl phải bao gồm những vị trí CG giống nhau Tức là nếu trình tự mồi xuôi của cặp mồi methyl là

Bảng III.1.2.2- Đặc tính mồi MSP thiết kế khuếch đại đảo CpG 256 bp

Mồi Số CG Dài %GC Tm

TCGGTGTGGTTACGTTTAGC thì mồi xuôi của cặp mồi unmethyl cũng phải bao gồm 3 vị trí CpG như ở mồi methyl, nhưng trong đó 5mC bị được đổi thành T.

Hình III.1.2.1- Vị trí CpG của trình tự mồi xuôi trong cặp mồi methyl và unmethyl.

VớiCG là vị trí CG giống nhau ở hai mồi MF và UF.

Sự thay thế 5mC bằng T trong mồi unmethyl làm cho số base GC trong mồi unmethyl thấp hơn mồi methyl, điều này đồng nghĩa với nhiệt độ nóng chảy của mồi unmethyl thấp hơn so với mồi methyl Vì vậy khi thiết kế mồi cho phản ứng MSP cần phải chú ý đến %GC cũng như chiều dài mồi unmethyl để đảm bảo nhiệt độ nóng chảy của hai cặp mồi methyl và unmethyl tốt nhất.

1.2.4.3 Nhiệt độ nóng chảy của mồi:

Nhiệt độ nóng chảy của mồi có vai trò quan trọng vì từ nhiệt độ nóng sẽ có được nhiệt độ ủ mồi, thông thường nhiệt độ ủ của mồi thấp hơn nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy tối ưu cho mồi nằm trong khoảng 52-58 độ C, với nhiệt độ này thường cho kết quả tốt hơn so với nhiệt độ thấp hơn Nhiệt độ nóng chảy trên 65 độ C có xu hướng hình thành các cấu trúc thứ cấp Theo Bảng III.1.1.4.2, hai cặp mồi được thiết kế có giá trị nhiệt độ nóng chảy tốt, với nhiệt độ nóng chảy của từng mồi trong cặp không chênh lệch quá nhiều.

Nhiệt đội nóng chảy của hai cặp mồi gần bằng nhau thì thốt hơn, và điều này là bắt buộc khi mồi được thiết kết cho phản ứng PCR của hai cặp mồi được đặc trong cùng một máy PCR với cùng một chu kỳ nhiệt độ, nhiệt độ hai cặp mồi methyl và unmethyl không được khác biệt quá 5 o C.

Cấu trúc này bao gồm cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop – tự bắt cặp giữa các tự bắt cặp) và hetero dimer (các oligonucleotide khác nhau bắt cặp với nhau) Nếu cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ càng thấp vì nó sẽ góp phần cản trở khả năng bắt cặp của các primer vào trình tự đích [9] Để xác định độ bền vững của các liên kết trên, người ta dùng một khái niệm là sự biến đổi năng lương tự do ΔG (kcal/mole) Theo trang IDT, giá trị tuyệt đối của ΔG liên kết thứ cấp càng nhỏ hơn 9 kcal/mole thì liên kết ở mức kém bền vững và không ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR, kết quả khảo sát đặc tính mồi tham khảo thể hiện ở bảng 3.1 và mồi thiết kế thể hiện ở bảng 3.2

Kí hiệu Mồi Trình tự (5’-3’) Sản phẩm

KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM

Các mẫu tách chiết DNA được đo OD với kết quả thu được ở bảng III.4.2

Bảng III.2.1- Kết quả đo OD 27 mẫu DNA tách chiết

Mẫu A 260nm A 260nm /A 280nm Nồng độ

(ng/μl) Mẫu A 260nm A 260nm /A 280nm Nồng độ

Bảng số liệu ghi nhận kết quả đo OD 27 mẫu DNA tách chiết từ 27 mẫu mô bệnh bằng phương pháp phenol/chloroform cho thấy: tỷ số OD A260nm/A280nm dao động từ 1,56 đến 1,89 đây là khoảng giá trị có thể chấp nhận được mức độ tinh sạch của DNA tách chiết Từ kết quả trên chúng tôi thấy nồng độ DNA đạt giá trị cao và đảm bảo được yêu cầu về nồng độ DNA cho quá trình biến đổi bisulfite.

Cùng với kết quả đo OD, kết quả PCR với cặp mồi hoang dạiDcR1 cũng tạo ra sản phẩm PCR có kích thước sản phẩm 127 bp theo yêu cầu (dữ liệu không trình bày).

Kết quả đo OD và PCR mẫu DNA tách chiết cho thấy DNA đạt độ tinh sạch, nồng độ và chất lượng đảm bảo cho quá trình biến đổi bisulfite.

2.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG MSP:

Phản ứng MSP được tiến hành trên 27 mẫu DNA đã qua xử lý bisulfite, sử dụng cặp mồi methyl khuếch đại trình tự thuộc đảo CpG 256 bp vùng promoter của gen Cyclin D2 Sau phản ứng MSP với mồi methyl khuếch đại gen Cyclin D2, kết quả điện di cho thấy vạch kích thước 153 bp như mong đợi.

Thống kê từ hình chụp điện di sản phẩm phản ứng MSP với mồi methyl khuếch đại genCyclin D2 của 27 mẫu DNA chúng tôi có được kết quả khảo sát sự methyl trên 27 mẫu bệnh được thể hiện ở bảng III.2.2

Hình III.2.2- Điện di sản phẩm MSP từ mẫu Fx14 – Fx22, chứng dương (DNA methyl), chứng âm với cặp mồi methyl CD2M khuếch đại gen Cyclin D2

Từ kết quả thống kê ở bảng III.2.3 chúng tôi kết luận có hiện tượng methyl hóa bất thường đảo CpG thuộc vùng promoter của genCyclin D2 xảy ra trong 7/27 mẫu mô bệnh (chiếm tỉ lệ 25,93%) Tuy kết quả khảo sát chưa cao nhưng do sự methyl hóa gen Cyclin D2 chỉ đặc trưng cho ung thư vú, nên có thể sử dụng khảo sát này trong phát hiện sớm ung thư vú.

Bảng III.2.2- Kết quả khảo sát sự methyl hóa gen Cyclin D2 trên 27 mẫu bệnh. Với (-) mẫu mô bệnh không bị methyl hóa, (+) mẫu mô bệnh bị methyl hóa.

Mẫu Methyl Mẫu Methyl Mẫu Methyl

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Từ kết quả của đề tài khảo sát sự methyl hóa đảo CpG thuộc vùng promoter của gen Cyclin D2ứng dụng làm biomarker trong chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

- Xác định được vùng promoter, các đảo CpG và vùng cần khảo sát mức độ methyl hóa của genCyclin D2.

- Thiết kế được cặp mồi cho phản ứng MSP nhằm xác định mức độ methyl hóa của đảo CpG.

- Các cặp mồi thiết kế có độ đặc hiệu cao và có các thông số hoàn toàn phù hợp với yêu cầu đối với mồi thiết kế cho phản ứng MSP.

- Xây dựng được quy trình khảo sát thực nghiệm Đã thực hiện phản ứng MSP trên 27 mẫu mô bệnh, ghị nhận và thống kê được kết quả.

Thiết kế mồi cho phản ứng bisulfite sequencing để giải trình tự vùng đảo CpG của genCyclin D2.

Tối ưu hóa quy trình tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết mô vú ung thư.

Tiến hành thực hiện phản ứng MSP trên số lượng mẫu mô bệnh nhiều hơn.Khảo sát trên mẫu mô bệnh ở những giai đoạn khác nhau của quá trình tiến triển bệnh.

1 Brooks, J., P Cairns, and A Zeleniuch-Jacquotte, Promoter methylation and the detection of breast cancer Cancer Causes Control 2009 20: p 1539-1550.

2 Evron, E., et al., Loss of Cyclin D2 Expression in the Majority of Breast Cancers Is Associated with Promoter Hypermethylation CANCER RESEARCH

3 D.G.Johnson and C.L.Walker, Cyclins and Cell Cycle Checkpoints.

4 American cancer society (2010), Breast Cancer Overview, www.cancer.org.

5 Feinberg, A.P., Genome-scale approaches to the epigenetics of common human disease Virchows Arch, 2010 456: p 13–21.

6 Hirst, M and M.A Marra., Epigenetics and human disease The

International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2009 41: p 136-146.

7 Attwood, J.T., R L.Yung, and B.C Richardson, DNA methylation and the regulation of gene transcription CMLS, Cell Mol Life Sci, 2002 59 p 241-

8 Manel Esteller, M.D., Ph.D., Epigenetics in Cancer The new england journal of medicine, 2008 358: p 1148-1159.

9 Hiền, N.N.,Di Truyền Tế Bào2005: Đại học quốc gia Hà Nội.

10 Meyyappan, M., et al., Increased Expression of Cyclin D2 during Multiple States of Growth Arrest in Primary and Established Cells Molecular and cellular biology,, 1998 18: p 3163 - 3172.

11 D.G.Johnson and C.L.Walker, Cyclins and Cell Cycle Checkpoints.

12 Blagosklonny, M.V and A.B Pardee, The Restriction Point of the CellCycle Landes Bioscience, 2002 1(2): p 103-110.