khảo sát tính chất biểu hiện của microrna 141 và tính đa hình gene rpms1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại việt nam

Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận tình chu đáo của thầy cô, đến nay em đã có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, với đề tài:“Khảo sát tinh chất biểu hiện của microRNA-141 và tính đa

TỔNG QUAN 1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ

Khái niệm về ung thư

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách mất kiểm soát (uncontrolled division) Các tế bào ung thư có khả năng di chuyển, xâm lấn đến các cơ quan khác, phát triển khối u mới thông qua hệ bạch huyết và mạch máu, tiến trình này gọi là di căn [1].

Về phân loại ung thư được chia làm năm nhóm chính sau: [1] Ung thư biểu mô (Carcinoma): ung thư bắt nguồn trong da hay các mô lót phủ trong các cơ quan của cơ thể, chẳng hạn như ung thư da, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, ung thư gan,… [2] Bệnh bạch cầu (Leukemia): ung thư bắt nguồn từ trong mô máu như tủy xương, sản xuất lượng lớn các tế bào máu bất thường; [3] Ung thư mô liên kết (Sarcoma): đây là loại ung thư hiếm gặp, bắt nguồn từ xương, sụn, mạch máu hay các mô liên kết khác; [4] Ung thư hệ thần kinh: ung thư bắt nguồn từ trong các mô hệ thần kinh, não và tủy sống [5] U lympho bào, tủy (Lymphoma): ung thư bắt nguồn từ các tế bào thuộc hệ miễn dịch của cơ thể [1].

Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam

Theo thống kê của Globocan năm 2018, số ca ung thư mắc mới trên thế giới đạt khoảng 18 triệu ca, số ca tử vong lên đến 9,6 triệu [2] Đứng đầu trong các quốc gia có tỉ lệ mắc và tử vong do ung thư là Trung Quốc Các quốc gia tiếp theo là: Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản và Đức [2]

Hình 1.1 Tỷ lệ tử vong do các loại ung thư năm 2018.

TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÒM HỌNG

Đến nay, số lượng ca ung thư trên thế giới ngày càng tăng và trở thành một vấn đề cấp thiết toàn cầu Tại Việt Nam, theo thống kê của Globocan năm 2018, Việt Nam có khoảng 164.671 ca mắc mới và trên 114.871 trường hợp tử vong do ung thư Theo dự đoán của Globocan 2018, ước tính đến năm 2040 số ca mắc mới và tử vong do ung thư tại Việt Nam lần lượt là 285.347 và 214.269 ca [2]

2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG

2.1 Sơ lược về ung thư vòm họng

Ung thư vòm họng (UTVH) là khối u ác tính xuất phát từ lớp biểu mô vòm họng [3] UTVH chiếm tỷ lệ cao trong các loại ung thư ở vùng đầu, cổ và họng Về vị trí của ung thư ở vùng vòm mũi họng, là nơi tiếp giáp mũi, họng và chỗ đổ của ống vòi nhĩ (ống thông giữa tai và mũi họng), nên khi ung thư xâm lấn sẽ có triệu chứng liên quan đến các cơ quan này Một số triệu chứng ở tai bao gồm: nghe kém, ù tai, đặc biệt chỉ xảy ra một bên; triệu chứng ở mũi bao gồm chảy máu mũi, nghẹt; triệu chứng ở họng được ghi nhận là khạc ra máu [3]

Hình 1.2 Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng

Phần lớn các trường hợp phát hiện UTVH hầu hết ở giai đoạn muộn Tại Indonesia (quốc gia có số ca mắc UTVH đứng thứ 2 trên thế giới), hơn 80% bệnh nhân phát hiện bệnh đang ở giai đoạn muộn [4] Tại Singapore, phần lớn bệnh nhân lớn tuổi thường được chẩn đoán mắc UTVH ở giai đoạn 2 hoặc giai đoạn 3, có nguy cơ tái phát cao hơn và tỷ lệ sống sót thấp hơn [5] Trong các thập kỷ vừa qua, việc điều trị UTVH đã được cải thiện đáng kể với sự ra đời đồng thời của các phương pháp hóa trị và xạ trị Tuy nhiên, tỷ lệ bệnh nhân di căn vẫn còn khoảng 25-34% và tỷ lệ sống sót của những bệnh nhân này vẫn còn thấp [6, 7] Một điều quan trọng là UTVH có khả năng

7 chữa lành hoàn toàn trong giai đoạn đầu Do đó, việc tìm kiếm một dấu chứng sinh học để chẩn đoán sớm UTVH trong giai đoạn đầu là rất cần thiết

Bệnh ung thư vòm họng mũi (UTVH) có tỷ lệ mắc khác nhau tùy theo khu vực địa lý và chủng tộc Một số dân tộc có nguy cơ cao mắc UTVH, như người Bidayuh trên đảo Borneo, người Nagas ở miền Bắc Ấn Độ và người Inuit ở Bắc Cực Tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cao gấp 2-3 lần so với nữ giới Độ tuổi mắc bệnh cao nhất là 50-60 Người cao tuổi có nguy cơ tái phát cao hơn và tỷ lệ sống thấp hơn Ngược lại, tỷ lệ tử vong do UTVH cao nhất ở những người trên 85 tuổi.

Cùng với đó, UTVH có sự phân bố địa lý không đồng đều trên thế giới, chủ yếu tập trung tại khu vực Châu Á và Châu Phi [4] Theo thống kê của Globocan 2018, 84,7% trường hợp mắc ung thư vòm họng xảy ra ở châu Á và 5,4% ở châu Phi [2] UTVH rất phổ biến tại Châu Á (đặc biệt là Trung Quốc và Đông Nam Á) [8] [8] [8] [9] [8] (8) Theo Globocan năm 2018, số ca UTVH trên thế giới là 129.079 ca, số lượng ca tử vong lên đến 72.987 ca Quốc gia có số ca UTVH cao nhất là Trung Quốc (60.558 ca), Indonesia (17.992 ca), Việt Nam (6.212 ca) và India (5.086 ca) [1]

Hình 1.3 Các quốc gia có tỷ lệ mắc UTVH cao nhất [2] Ở Việt Nam, ung thư vòm họng là loại ung thư đứng đầu trong các loại ung thư vùng đầu cổ Ngoài ra, UTVH nằm trong 10 loại ung thư phổ biến nhất Việt Nam, với tỉ lệ mắc bệnh tính đến năm 2018 là 5,7% và tỉ lệ tử vong hằng năm là 3,9% [1]

Hình 1.4 Tỷ lệ số ca mắc và tỷ lệ tử vong do ung thư tại Việt Nam

Ba nguyên nhân chính gây nên ung thư vòm họng, bao gồm: [1] sự xâm nhiễm của EBV (Epstein-Barr Virus); [2] yếu tố di truyền, hiện tượng epigenetics; [3] yếu tố môi trường [9]

Trong các nghiên cứu gần đây, mối liên quan giữa EBV và ung thư vòm họng đã được làm sáng tỏ Theo nghiên cứu của Chou và cộng sự (2008), khoảng 95% khối u vòm họng được xác định có liên quan đến sự hiện diện của EBV Ban đầu, EBV tồn tại ở trạng thái tiềm ẩn, chỉ chuyển sang giai đoạn hoạt động biểu hiện bệnh khi các gen vi-rút (EBNA-1, LMPs, BARTs, ) được kích hoạt.

(dạng tan) nhằm giúp chúng nhân lên và gây nhiễm Lúc này, chúng sẽ gây biến đổi mô, tế bào của cơ thể, phát triển thành khối u ác tính [10]

Yếu tố môi trường cũng được nhiều công trình nghiên cứu chứng minh có vai trò trong việc hình thành ung thư vòm họng Điển hình, sự khác biệt về khu vực địa lý, thói quen sinh hoạt,… dẫn đến ung thư vòm họng tại các khu vực khác nhau trên thế giới Chẳng hạn, ung thư vòm họng hiếm ở người da trắng nhưng lại rất phổ biến ở Quảng Đông (Trung Quốc), ngườiEskimo ở Alaska và thổ dân ở Greenland Ngoài ra, các thói quen như tiêu thụ cá muối, rau củ quả không tươi, hút thuốc lá, tiếp xúc với hóa chất độc hại,… đều làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng [10]

Các yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của ung thư, bao gồm các hiện tượng epigenetic (methyl hóa, biến đổi protein histone và miRNA), đột biến và tính đa hình (SNPs) Các nghiên cứu về yếu tố đa hình của một số gen của EBV đã chỉ ra rằng các biến thể ở một số gen này có thể liên quan đến nguy cơ phát triển ung thư.

9 của EBV liên quan đến khả năng phát sinh khối u vòm họng và đẩy nhanh tiến trình hình thành ung thư Cùng với đó, miRNA điều hòa biểu hiện gene bằng cách gắn vào vùng 3'-UTR của các mRNA đích (target mRNA) của chúng, kết quả là ức chế hoặc giảm chức năng của mRNA đích, được chứng minh là có liên quan đến một loạt các quá trình sinh học như tế bào phân chia, tăng sinh, biệt hóa, apoptosis, di căn, phản ứng stress,… [13-16] Trong những thập kỷ qua, các bằng chứng ngày càng nhiều, cho thấy các miRNA liên quan đến các quá trình oncogene và tumor suppressor Sự biểu hiện bất thường (theo cơ chế điều hoà dương tính hoặc âm tính) của miRNA góp phần tạo ra các khối u ở người [16-21] Các nghiên cứu gần đây cho thấy miRNA-141 tăng cường điều hòa ở các mẫu ung thư vòm họng khi so sánh với mẫu lành [16, 22, 23] Sự ức chế của miRNA-141 lên trên các gene đích có thể ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, quá trình apoptosis và sự di căn của tế bào ung thư [22].

EPSTEIN-BARR VIRUS

3.1 Cấu trúc và đặc điểm

Virus Epstein-Barr (EBV), phát hiện năm 1964, là một loại Herpesvirus phổ biến, thuộc nhóm Herpesvirus type 4 Cấu trúc di truyền của EBV là chuỗi DNA xoắn kép mạch hở dài 173kb, tồn tại dưới hai dạng: dạng vòng (episome) và dạng mạch thẳng Virion EBV có cấu trúc khối cầu gồm vỏ capsid, vỏ ngoài và bộ gene virus.

Bộ gene của EBV bao gồm sáu gene mã hóa cho protein kháng nguyên nhân EBNAs (EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A,3B,3C và EBNA-LP) liên quan đến quá trình xâm nhiễm và nhân lên của EBV ở giai đoạn đầu; ba gene mã hóa cho protein màng LMP-1, LMP-

2A, LMP-2B liên quan đến chu trình tăng trưởng của EBV trong tế bào B; hai gene không mã hóa RNA EBER (EBER-1, EBER-2) ngăn chặn quá trình apoptosis và sản sinh IL-10 (interleukin 10) [24, 26] và ba protein thuộc họ BARTs (RPMS1, A73, BARF0) liên quan đến đường truyền tín hiệu Notch, điều hòa lượng Ca 2+ trong tế bào [27-29]

Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người EBV có 3 hướng tiến triển Thứ nhất là EBV xâm nhập vào tế bào biểu mô và nhân lên, thứ hai là EBV gây sơ nhiễm và xâm

10 nhập vào tế bào lympho B thực hiện sự nhân lên, thứ ba là EBV tàng nhiễm và tiến triển thành ung thư khi có điều kiện Ngoài ra quá trình nhiễm EBV cũng có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, chủ yếu là loại hình miễn dịch trung gian tế bào có vai trò của Lympho T [30] EBV gây sơ nhiễm và có thể tồn tại lâu dài trong cơ thể mà không gây bệnh Bên cạnh đó, EBV cũng là nguyên nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn (một loại bệnh tăng sinh lympho hạn chế ở người, tăng sinh lympho

B hay Burkitt lymphoma, bệnh Hodgkin, ung thư dạ dày… Đặc trưng của các khối u này là các tế bào khối u chứa một lượng lớn các bản sao hệ gene của EBV và xuất hiện sự biểu hiện các gene protein màng tàng nhiễm (LMP) cho một lượng lớn các protein mà nó có thể đóng vai trò chuyển hóa khối u lành thành ác tính [31]

Hình 1.5 Cấu trúc hệ gene của EBV [25]

Một số gene có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ sự tồn tại EBV trong cơ thể người, chẳng hạn như: LMP-1, EBNA-1 Gene EBNA-1 thể hiện chức năng duy trì dạng episome của EBV hay EBNA-1 thể hiện chức năng trong phiên mã thông qua việc bám lên vùng oriP – vùng khởi đầu phiên mã của DNA hệ gene EBV [32] Đối với gene LMP-1, theo Aristides và cộng sự (2001) có các chức năng nổi bật bao gồm: ngăn cản quá trình apoptosis thông qua việc điều chỉnh các protein Bcl-2, MCL-1, BFL-1, A20 và cIAPs; ảnh hưởng đến quá trình tạo mạch và di căn khối u trong UTVH liên quan đến EBV [33] Ngoài ra, họ gene BARTs cũng đóng góp vào quá trình sinh ung liên quan tới EBV; RPMS1 có khả năng làm gián đoạn tín hiệu của Notch ở tế bào, góp phần gây ra sự hình thành UTVH [34, 35]; A73 có thể thay đổi tín hiệu làm trung gian cho sự đóng góp của EBV vào sự phát triển tế bào khối u [29]; BARF0 giúp ngăn chặn quá trình tái kích hoạt của EBV [36]

3.2 Vị trí và cấu trúc các gene RPMS1

BamHI-A rightward transcripts (BARTs), cũng được gọi là Complementary Strand Transcripts (CST), được xác định là trình tự đọc mở về phía bên phải của vùng

BamHI-A, định vị từ nucleotide 138.352 đến nucleotide 160.531 trên bản đồ hệ gene EBV hoang dại (wild-type) [29, 37, 38] Họ gene BARTs bao gồm một số gene như:

BARF0, RK-BARF0, A73, RPMS1, RPMS1-A Các thành viên trong họ gene BARTs lần đầu tiên được xác định trong các mô UTVH [38-41], sau đó được phát hiện trong tất cả các khối u ác tính liên quan đến EBV, bao gồm bệnh Hodgkin và ung thư dạ dày[35] BARTs cũng được phát hiện ở mức thấp trong tất cả các dòng tế bào B bị nhiễm EBV trong nuôi cấy [35] và trong các tế bào B máu ngoại vi từ những người tình nguyện khỏe mạnh dương tính với EBV

Hình 1.7 Vị trí các khung đọc mở (ORF) của gene RPMS1

Biểu đồ thể hiện vị trí và cấu trúc gen RPMS1 trên bộ gen Gen RPMS1 gồm các exon (hình hộp) và intron (đường thẳng) Khung đọc mở (ORF) được biểu thị bằng hộp xám đậm, với số lượng acid amin được ghi rõ.

RPMS1 thuộc họ gene BARTs RPMS1 bắt đầu từ vị trí 138.325 và kết thúc tại vị trí 160.531 trên bộ gene EBV hoang dại (mã số truy cập V01555) Vùng gene

RPMS1 kéo dài từ exon I đến gần hết exon VII bao phủ gần như toàn vùng gene BARTs, đây là vùng gene dài nhất trong họ gene BARTs Tuy nhiên, khung đọc mở của

Hình 1.6 Cấu trúc gene và exon của họ gene BARTs

RPMS1 chỉ kéo dài từ cuối exon IV đến đầu exon V; mã hóa cho protein có độ dài trình tự 103 amino acid.

TÍNH ĐA HÌNH GENE

4.1 Định nghĩa về tính đa hình gene

Tính đa hình là sự xuất hiện hai hay nhiều biến thể hoặc các hình thức khác nhau được gọi là kiểu hình thay thế trong một quần thể loài Có 3 dạng: đa hình cân bằng (balanced polymorphism), đa hình di truyền (genetic polymorphism), đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism- SNP)

SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) là sự thay đổi của một nucleotide ở một vị trí xác định trên trình tự bộ gene Trong một quần thể, số cá thể mang biến thể này lớn hơn 1% tổng số cá thể

Hình 1.8 Một đột biến điểm xảy ra dẫn đến thay thế một cặp nucleotide G-C bằng A-

T hoặc ngược lại tạo ra một SNP

SNP xảy ra thường xuyên hơn ở vùng không mã hóa so với vùng mã hóa do ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên, tỷ lệ tái tổ hợp và đột biến di truyền Các SNP trong vùng mã hóa bao gồm đa hình đồng nghĩa (không làm thay đổi chuỗi protein) và đa hình thay thế (làm thay đổi trình tự amino acid) Mặc dù không nằm trong vùng mã hóa protein, SNP vẫn có thể ảnh hưởng đến liên kết gen, sự gắn kết yếu tố sao chép và sự thoái hóa RNA.

SNPs xảy ra thường xuyên trong bộ gene người Trung bình xảy ra một lần trong mỗi 300 nucleotide, có nghĩa là có khoảng 10 triệu SNPs trong hệ gene của con người Thông thường, những biến thể này được tìm thấy trong DNA giữa các gene Nó được xem như là dấu chứng sinh học giúp xác định các vị trí gene liên quan đến bệnh Khi SNPs xảy ra trong gene hoặc trong khu vực gần một gene quy định nó có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự xuất hiện của bệnh bằng cách ảnh hưởng đến chức năng của gene

Vai trò của các SNPs trong nghiên cứu y học là để so sánh các vùng của hệ gene giữa các nhóm (nhóm người bệnh và nhóm người lành) Xác định các thay đổi của một nucleotide vô cùng có ý nghĩa trong nghiên cứu cơ sở di truyền của bệnh Các thay đổi này có thể trở thành các điểm xác định cho thí nghiệm về bản đồ gene và nghiên cứu về toàn bộ hệ gene

4.2 Tính đa hình gene của EBV

Nghiên cứu tính đa hình các gene của EBV là một trong các hướng nghiên cứu mới trong định hướng xây dựng và phát triển một dấu chứng sinh học tiềm năng nhằm phát triển một phương pháp hiện đại trong chẩn đoán các ung thư liên quan đến EBV Nghiên cứu tính đa hình có thể xác định mối tương quan của EBV với cơ chế hình thành ung thư Dựa vào tần số xuất hiện của các biến thể có thể xác định được các chủng EBV đặc trưng cho từng loại ung thư, từng vùng địa lý khác nhau

Ngoài ra, giới hạn kiến thức về đa dạng di truyền vi-rút Epstein-Barr (EBV) chủ yếu do tập trung nghiên cứu vào các họ gen EBNAs, LMPs và EBERs, bỏ qua họ gen BARTs Vì vậy, nghiên cứu đa hình gen RPMS1 đóng vai trò quan trọng trong việc mở rộng hiểu biết về đa dạng toàn bộ bộ gen của EBV.

4.3 Vai trò gene RPMS1 trong ung thư vòm họng

RPMS1 thuộc họ gene BARTs của Epstein-Barr virus, biểu hiện bất thường trong hầu hết các mô ung thư vòm họng được nghiên cứu ở mức độ RNA và có thể góp phần vào sự phát triển của UTVH [28, 43] Tuy nhiên, không phát hiện được protein RPMS1 nội sinh trong các công bố nghiên cứu các tế bào ung thư vòm họng nuôi cấy hoặc mô sinh thiết ung thư vòm họng [27], và do đó, RPMS1 có thể được

14 dịch mã thành protein ở mức rất thấp, hoặc protein RPMS1 bị thoái hóa rất nhanh (chu kì bán rã ngắn) [44]

Với khả năng sinh ung thư (oncogenic), RPMS1 đã được chứng minh tương tác với vùng domain nội bào trên protein Notch và điều hòa âm tính con đường tín hiệu Notch nhằm thúc đẩy sự biệt hóa và phát triển của tế bào RPMS1 có khả năng tương tác với protein CBF1, RPMS1 sẽ gắn vào vùng lõi của CBF1 [34, 35] CBF1 (CSL, RBP-Jk), một yếu tố trung gian của con đường tín hiệu Notch và là một protein mục tiêu cho protein EBNA-2 của EBV EBNA-2 là một protein có chức năng tương đồng với Notch ở trạng thái hoạt hóa trong các tế bào bị nhiễm EBV CBF1 liên kết với vùng trình tự GTGGGAA trên vùng promoter [45] và hình thành một phức hợp lõi bao gồm SMRT / NCR, SAP30, CIR, SKIP, HDAC1 / 2 và MINT/ SHARP [46] EBNA-2 và dạng hoạt hóa của Notch (NotchIC) có khả năng chuyển đổi CBF1 từ chất ức chế phiên mã sang trạng thái kích hoạt phiên mã bằng cách loại bỏ các liên kết của SMRT với CBF1 và SKIP Việc liên kết SMRT với SKIP và liên kết SMRT với CBF1 bị loại bỏ làm tăng khả năng gắn của CBF1 với protein EBNA2 hoặc NotchIC CBF1 liên kết với các yếu tố phiên mã cơ bản [47], EBNA2 [48] và NotchIC [49] hoàn thành quá trình chuyển đổi của CBF1 từ trạng thái ức chế phiên mã sang kích hoạt RPMS1 cạnh tranh với EBNA2 và NotchIC, bằng cách RPMS1 sẽ gắn vào vùng lõi của CIR (CIR thuộc phức hợp SMRT-HDAC) Liên kết này ngăn cản sự thay thế của phức hợp SMRT-HDAC bằng EBNA2 và NotchIC Điều này nhằm khẳng định vai trò của RPMS1 trong các tế bào bị nhiễm virus trong quá trình điều hòa âm tính con đường tín hiệu Notch

Hình 1.9 Ảnh hưởng của RPMS1 trên con đường tín hiệu Notch [31]

Chú thích: (A) Trạng thái ức chế phiên mã, CBF1 liên kết với phức hợp SMRT-HDAC góp phần vào sự ức chế phiên mã bằng cách loại bỏ yếu tố phiên mã khác (21, 26) (B) Trạng thái kích hoạt xảy

15 ra khi EBNA2 hoặc NotchIC thay thế phức hợp SMRT-HDAC và liên kết với CBF1 và SKIP [50] (C)

“Ổn định ức chế”, một trạng thái được tạo ra thông qua tương tác RPMS1 với vùng lõi của CIR Liên kết này ngăn cản sự thay thế của phức hợp SMRT-HDAC bằng EBNA2 và NotchIC

Con đường Notch điều khiển sự phát triển và quyết định “số phận” của tế bào thông qua việc kiểm soát các cơ chế như tăng sinh, bắt giữ chu kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào và quá trình apoptosis [51] Do chức năng đa dạng của Notch, sự gián đoạn hoạt động kiểm soát, hoặc thông qua kích hoạt cấu trúc hay thông qua sự hạn chế các cấu trúc của Notch bởi mRNA RPMS1, có thể dẫn đến rối loạn sự biến nạp, oncogene và góp phần gây ra sự hình thành UTVH [51]

Hình 1.10 Con đường tín hiệu Notch ở tế bào

4.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về tính đa hình gene

4.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, tại Việt Nam việc nghiên cứu về tính đa hình của gene RPMS1 là một hướng đi mới trong việc phân tích tính chất đa hình trên bộ gene EBV Tới nay, vẫn chưa có công trình nào công bố về tính đa hình trên gene RPMS1 tại Việt Nam Mặt khác, các nghiên cứu ở Việt Nam tập trung về tính đa hình của một số gene đặc trưng của EBV (như: EBNAs,…) Vì vậy, hướng nghiên cứu tính đa hình trên họ gene RPMS1 mở ra tầm nhìn về sự đa dạng của toàn bộ gene EBV

4.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các công trình nghiên cứu về tính đa hình của họ gene BARTs chủ yếu tập trung ở Trung Quốc – quốc gia có tỷ lệ mắc ung thư vòm họng khá cao Ngoài Trung Quốc, vẫn chưa có bất kì quốc gia nào nghiên cứu về tính đa hình trên họ gene này, kể cả Việt Nam Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung phân tích tính đa hình hai gene và RPMS1 (thuộc họ gene BARTs) Do đó, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam phân tích tính đa hình họ gene BARTs, cũng như là nghiên cứu đầu tiên ngoài khu vực Trung Quốc nghiên cứu tính đa hình trên họ gene này

4.4.3 Nghiên cứu về gene RPMS1

Gen RPMS1 thuộc họ gen BART của Epstein-Barr virus (EBV) và được biểu hiện trong tất cả các khối u liên quan đến EBV Các nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide (SNP) của RPMS1 đã xác định rằng SNP G155391A là đặc trưng cho các khối u lympho học liên quan đến EBV.

UTVH, liên quan đến sự hình thành UTVH [44, 52, 53]

MicroRNA

5.1 Sơ nét về miRNA microRNA (miRNA) là một họ các phân tử RNA không mã hóa (non-coding RNAs), chiều dài khoảng 21 nucleotide, tham gia vào quá trình điều hòa sau phiên mã, sự biểu hiện gene ở tế bào eukaryote [15, 54, 55] Theo ước tính, gene mã hóa cho miRNA chiếm khoảng 1 – 5% bộ gene người và tham gia sự điều hòa ít nhất 30% tổng lượng miRNA [19, 55] Ngay sau khi phân tử miRNA đầu tiên được phát hiện vào năm 1993 bởi Ambros và cộng sự có tên là miRNA lin-4 trên loài Caenorhabditis elegans, hơn 20.000 phân tử miRNA được phát hiện trên 193 loài khác nhau và trong đó gần 1.000 miRNA được phát hiện ở người Toàn bộ thông tin về miRNA được lưu trữ trên cơ sở dữ liệu miRBase (http://www.mirbase.org/)

Hình 1.11 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pri-miRNA

Quá trình sinh tổng hợp miRNA bao gồm các sự kiện xảy ra trong nhân và sau đó xảy ra trong tế bào chất [19, 56] Ở giai đoạn trong nhân, các gene mã hóa cho miRNA hay các vùng intron mã hóa (coding intron) được phiên mã bởi RNA polymerase II tạo thành phân tử miRNA sơ cấp (primary miRNA, pri-miRNA) Về cấu trúc, phân tử pri-miRNA chứa một đến hai cấu trúc kẹp tóc [57] Các phân tử pri- miRNA có đầu 5’ được gắn mũ chụp và đầu 3’ có cấu trúc dạng poly(A) [58] Sau đó các phân tử pri-miRNA được biến đổi thành phân tử pre-miRNA (precursor miRNA) với cấu trúc thứ cấp có chiều dài khoảng 70 nucleotide với đầu 5’ phosphate và 3’ nhô ra 2 nucleotide [19, 56] Quá trình biến đổi này cần thiết phải có sự hỗ trợ của phân tử Drosha [56, 59] Drosha chỉ thể hiện hoạt tính phân cắt khi hình thành phức hợp với

18 một phân tử protein dsRBD có tên là Pasha (trong Drosophila) hay DGCR8 (trong động vật có vú), để phân cắt pri-miRNA thành pre-miRNA [15, 56, 59] Phân tử pre- miRNA được tạo thành, đầu 3’ có 2 nucleotide nhô ra, sẽ được phân tử exportin-5 nhận diện và vận chuyển ra khỏi nhân, vào trong tế bào chất Ở giai đoạn xảy ra trong tế bào chất, pre-miRNA biến đổi tiếp theo thông qua con đường RAN-GTP (RAs- related Nuclear – GTP pathway) [54, 60] Khi đi vào trong tế bào chất, pre-miRNA tiếp tục bị cắt bởi phân tử Dicer tạo thành miRNA dạng mạch đôi có chiều dài khoảng

18 - 25bp [15] Tiếp theo, phân tử miRNA mạch đôi được tháo xoắn, một trong hai mạch sẽ bị phân hủy nhanh chóng, mạch còn lại chính là miRNA trưởng thành [15, 61]

5.2 Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA tác động đến mRNA

Cơ chế phân tử của miRNA thể hiện ở hai trạng thái: Oncogene và Tumor suppressor Sự giảm biểu hiện hay mất đi các phân tử miRNA đóng vai trò là Tumor suppressor hoặc sự tăng biểu hiện của các phân tử miRNA đóng vai trò Oncogene dẫn đến tăng cường sự phân chia tế bào, xâm lấn hay sự tạo thành mạch máu, kết quả là dẫn đến sự tăng sinh của khối u thông qua sự biểu hiện các oncoprotein Chẳng hạn, trên các bệnh nhân bạch cầu mãn tính dòng lympho B, phần lớn có sự mất đi hay giảm biểu hiện của hai miRNA là miR-15a và miR-16-1 Sự giảm này dẫn đến sự tăng biểu hiện của gene Bcl2 (gene ức chế quá trình apoptosis của tế bào và biểu hiện cao ở các tế bào khối u) [62, 63] Một nghiên cứu khác cho thấy miRNA-21 liên quan đến u nguyên bào đệm như một oncogene, biểu hiện vượt mức cao gấp 5-100 lần so với mô bình thường và ức chế quá trình apoptosis [64]

Các phân tử miRNA tham gia vào quá trình điều hòa âm sự biểu hiện gene bằng gắn vào đầu 3’ không dịch mã (3’UTR) của mRNA, làm cho mRNA bị phân hủy hoặc sự dịch mã xảy ra trên phân tử mRNA này bị khóa [13-15]

Giai đoạn đoạn đầu tiên, miRNA trưởng thành gắn kết với protein Ago (là nhân tố khởi đầu dịch mã 2C2 – eIF2C2 ở eukaryote) và phức hợp RISC để tạo thành phức hợp miRNA-RISC (RNA-induced silencing complex) [19] Phức hợp miRNA-RISC gắn lên vùng 3’UTR của mRNA thông qua sự bắt cặp bổ sung của các base giữa mRNA với trình tự trên mạch dẫn (guide strand) của phân tử miRNA theo nguyên tắc bổ sung [65] Sự nhận diện này phụ thuộc rất nhiều vào sự bắt cặp bổ sung của base

19 giữa vùng “seed” (vùng trung tâm) trên phân tử miRNA với mRNA [15, 19] Vùng

“trung tâm” là vùng trình tự nằm ở đầu 5’ phân tử miRNA có kích thước 2-7 nucleotide [15, 19, 65]

Sự bắt cặp giữa các cặp base giữa vùng “trung tâm” với vùng trình tự trên mRNA có thể trùng khớp hoàn toàn hoặc không trùng khớp hoàn toàn và quyết định tính ổn định tương tác giữa miRNA với mRNA [19, 66] Một phân tử miRNA có khả năng điều hòa nhiều trình tự mRNA đích [19]

5.3 Cấu trúc của miRNA-141 (has-mir-141) miRNA-141 (accession MI0000457/ NC_000012) có chiều dài là 22 nucleotide, có vị trí tại 12p13.31 (bắt đầu từ vị trí 6964097bp và kết thúc tại vị trí 6964191bp)

Chú thích: Vùng “seed” được gạch chân và hai phân họ được biểu thị bằng thanh màu xanh/ đỏ

Hình 1.12 Sự bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA đích

Hình 1.13 Vị trí trình tự miRNA-141 trên nhiễm sắc thế số 12 ở người.

Hình 1.14 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pre-miR-141

20 miRNA-141 thuộc họ phân tử miRNA-200 [67, 68] Họ phân tử này gồm 5 miRNA khác nhau, được phân thành hai phân họ theo sự tương đồng trình tự trong vùng

“seed” (trình tự miRNA xác định độ đặc hiệu đích tương ứng với nucleotide 2-7) [68, 69] Phân họ đầu tiên bao gồm miRNA-141 và miRNA-200a, phân họ thứ hai là miRNA-200b, miRNA-200c và miRNA-429 [68, 69] Các miRNA nằm trong hai cụm trên các locus gene khác nhau: miR-200b, miR-200a và miRNA-429 nằm trên nhiễm sắc thể số 1 trong bộ gene người (NST số 4 ở chuột) và miRNA-141 và miRNA-200c trên nhiễm sắc thể người số 12 (nhiễm sắc thể số 6 ở chuột) [68, 69]

Các nghiên cứu gần đây cho thấy miRNA-141 được biểu hiện cao trong ung thư vòm họng, thúc đẩy sự phát triển, di chuyển và xâm lấn tế bào, đồng thời gây mất cân bằng chu kỳ tế bào và ức chế quá trình apoptosis miRNA-141 thực hiện điều hòa này bằng cách liên kết với các gen đích của nó, bao gồm phosphatase and tensin homolog (PTEN), ubiquitin-associated protein 1 (UBAP1) và bromodomain containing 3 (BRD3) trong ung thư vòm họng Trong đó, BRD3 và UBAP1 đều liên quan đến sự phát triển khối u của ung thư vòm họng, trong khi PTEN là gen ức chế khối u BRD3 điều hòa thông qua con đường Rb/E2F, trong khi PTEN điều hòa âm tính phosphatidylinositol 3-kinase/Akt.

3,4,5-trisphosphate trong tế bào và có chức năng ức chế khối u bằng cách điều hòa âm tính con đường tín hiệu AKT [71]

Ngoài ra, sự biểu hiện của miRNA-141 cũng được điều hòa bởi các oncogene, như: c-Myc và SPLUNC1 (short palate, lung and nasal epithelium clone 1), làm nổi bật mạng lưới điều hòa liên quan chặt chẽ đến miRNA-141 trong UTVH [22]

5.4 Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau

Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh biểu hiện của miRNA là một đặc điểm đặc trưng của sự hình thành khối u Sự biểu hiện quá mức của miRNA có vai

Hình 1.15 Trình tự của năm phân tử của họ phân tử miRNA-200

21 trò như Tumor suppressor, điều hòa làm giảm các protein có hoạt tính sinh ung thư Ngoài ra, miRNA hoạt động như Oncogene, ức chế các hoạt động của các gene ức chế khối u dẫn tới quá trình tăng sinh, hình thành mạch máu và sự xâm lấn [72, 73] Trong đó, có nhiều nghiên cứu chứng minh miRNA-141 có liên quan đến các loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vòm họng [16, 22, 23], ung thư gan [74-76], ung thư đại tràng [77, 78], ung thư tuyến tiền liệt [79, 80], ung thư bàng quang [81, 82], ung thư buồng trứng [83-85], ung thư vú [86-88], Nói chung, miRNA-141 có vai trò kép trong sự hình thành khối u của người, có chức năng như là các Oncogene và Tumor suppressor ở các khối u ác tính ở người (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau

5.5 Các tính chất của miRNA - một dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán sớm ung thư

Việc tìm ra các dấu chứng sinh học tiềm năng, có tính chất ổn định, đánh giá dễ dàng trên các mẫu bệnh phẩm, dành cho tiên lượng và chẩn đoán ung thư đã trở thành một việc cần thiết để tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân Từ khi khám phá ra các miRNA đầu tiên vào năm 2007, kể từ đó, sự rối loạn biểu hiện của miRNA được phát

Loại ung thư Sự biểu hiện miR-141/ vai trò Gene đích Con đường tín hiệu TLTK

Ung thư vòm họng Tăng / Oncogene BDR3, PTEN,

[16, 22, 23] Ung thư đại tràng Tăng / Oncogene MAP2K4; SIP1 miR-141- MAP2K4;

Ung thư tuyến tiền liệt Tăng / Oncogene KLF9, shp miR-141-

3p/KLF9 [79, 80] Ung thư bàng quang Tăng / Oncogene [81, 82]

Ung thư buồng trứng Tăng / Oncogene KEAP1, p38α NF-kB, Nrf2 [83-85]

Ung thư gan Giảm / tumor suppressor

Ung thư thận Giảm / tumor suppressor EphA2 EphA2/p-FAK/p-

AKT/MMPs [89, 90] Ung thư vú

22 hiện trong nhiều khối u của người, do đó việc phân tích các đặc tính của miRNA có thể cho phép dự đoán tốt hơn sự phát triển của ung thư

Mối liên hệ giữa EBV và microRNA

Các gen EBNA1, LMP2A của EBV và các microRNA ức chế dịch mã protein từ mRNA của cả virus và tế bào chủ Sự nhiễm EBV làm giảm mức độ biểu hiện của miR-200, miR-143-3p và miR-146b, gây ra biểu hiện thấp miRNA.

23 mình có liên quan đến tiên lượng bệnh ung thư [62] Dicer là một yếu tố thiết yếu trong việc tạo ra miRNA, chẳng hạn như miR-200, và biểu hiện thấp của Dicer giúp tăng cường sự di căn của khối u thông qua việc tạo ra EMT [63] EBV có thể mã hóa ra miR-BART6, miR-BART6 gắn trực tiếp và gene mục tiêu Dicer và giảm biểu hiện của protein Dicer [54] Các nghiên cứu này cho thấy rằng sự xâm nhiễm EBV làm thay đổi cấu trúc miRNA của tế bào và những thay đổi trong cấu trúc này có thể tăng cường hoạt động di căn của các tế bào khối u bị nhiễm EBV Đặc biệt, một số thành viên của họ gene miRNA-200 giảm biểu hiện sau khi nhiễm EBV và biểu hiện của chúng bị giảm trong một số bệnh ung thư ở người bao gồm ung thư dạ dày liên quan đến EBV và UTVH [67] Họ gene này đã được chứng minh là rất quan trọng để duy trì kiểu hình biểu mô bằng cách nhắm mục tiêu ZEB1 và ZEB2, hai chất ức chế E-cadherin và chất kích hoạt EMT, kích hoạt sự di động của tế bào và thúc đẩy di căn [63 điều66] Thật vậy, Shinozaki et al đã chứng minh rằng mức độ biểu hiện miR-200a và miR-200b đã giảm trong ung thư biểu mô dạ dày liên quan đến EBV cũng như trong các dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày bị nhiễm EBV [67] Hơn nữa, họ đã chứng minh rằng giảm biểu hiện này chủ yếu được gây ra bởi sự ức chế phiên mã của miRNA, qua trung gian một phần bởi các gen tiềm tan của EBV như: BARF0, EBNA1 và LMP2A thông qua các cơ chế chưa được làm rõ Sự giảm biểu hiện này dẫn đến giảm biểu hiện E-cadherin do sự hiện diện của ZEB1 và ZEB2 cao hơn, dẫn đến mất sự kết dính giữa tế bào và thay đổi mạnh mẽ hình thái biểu mô, thúc đẩy di căn và xâm lấn tế bào Vì cả ZEB1 và ZEB2 đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự chuyển đổi trạng thái tiềm tan/ tan của EBV thông qua ức chế yếu tố phiên mã trên vùng promoter gen BZLF1 [68, 69], hai nhóm gần đây đã nghiên cứu về vai trò của họ phân tử miR -200 trong quá trình tái kích hoạt trạng thái tan của EBV [70, 71] Ellis-Connel et al nhận thấy rằng biểu hiện của miR-200b và miR-429 cả trong các tế bào biểu mô và tế bào B bị nhiễm EBV có thể thúc đẩy trạng thái tan của EBV bằng cách nhắm mục tiêu ZEB1 và ZEB2 và chặn hoạt động ức chế của trên vùng promoter Zp của gene BZLF1 Do đó, sự giảm biểu hiện của họ miRNA này hoặc biểu hiện quá mức của ZEB1 hoặc ZEB2 đã dẫn đến việc giảm kích hoạt lại trạng thái tan của EBV Tương tự như vậy, Lin et al đi đến kết luận tương tự Họ đã chỉ ra rằng biểu hiện miR-429 trong các nguyên bào sợi bị nhiễm EBV và các tế bào B

24 đã làm thay đổi trạng thái cân bằng giữa trạng thái tiềm tan/ trạng thái thông qua sự ức chế ZEB1 và ZEB2

Ngoài ra, các gen của EBV còn tham gia điều hòa sự biểu hiện của các phân tử miRNA Cụ thể, trong nghiên cứu của Zhu et al., (2014), nhóm nghiên cứu đã chứng minh vai trò của gen LMP1 trong việc thúc đẩy sự biểu hiện của phân tử miRNA-155 Không chỉ vậy, gen LMP1 của EBV còn được chứng minh có liên quan đến sự gia tăng biểu hiện của một số miRNA như: miR-21, miR-155, miR-146 trên bệnh nhân u lympho Burkitt.

Tuy nhiên, mối liên hệ giữa kiểu hình biểu hiện của miR-141 và gen RPMS1 vẫn chưa được bất kỳ nghiên cứu nào trên thế giới làm rõ Nghiên cứu này là tiền đề đầu tiên xác định đồng thời tính đa hình trên gen RPMS1 và tính chất biểu hiện của miRNA (cụ thể là miRNA-141).

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐA HÌNH GENE RPMS1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Các phần mềm và trang web được sử dụng

Cơ sở dữ liệu sinh học NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): phần mềm dùng cho việc khai thác thông tin Dịch vụ Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.pubmed/): khai thác tất cả các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố về Y – Sinh trong MEDLINE Dịch vụ Genbank: tìm kiếm các thông tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, mapping, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed

Phần mềm trực tuyến BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên trang web NCBI: các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)

Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm dùng để thực hiện các thao tác xử lí trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự oligonucleotide,…

Phần mềm SeaView phiên bản 4.2.12: phần mềm có các tính năng hỗ trợ sắp gióng cột các trình tự, phân tích tương đồng

Chromas Lite 2.1.1 là phần mềm miễn phí giúp hiển thị các đường peak, thể hiện sự bắt màu của các nucleotide trong trình tự DNA

MEGA (phiên bản 6.0 Kumar, 1993): phần mềm miễn phí dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining

Bioedit: là phần mềm dùng để so sánh nhiều trình tự nucleotide hay amino acid.

Mẫu thí nghiệm

Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng, bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh Bộ

26 mẫu gồm 20 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE) Trong trường hợp kết quả nhuộm HE cho kết quả nghi ngờ sẽ được đề nghị thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch để phát hiện kháng nguyên Ki67 trong nhân tế bào Đồng thời, 20 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả nhuộm HE Các mẫu sau khi thu nhận được bảo quản trong dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline), dùng để đối chứng Bộ mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS, ở nhiệt độ thấp và chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành các phương pháp thực nghiệm sau này

Tất cả các mẫu nghiên cứu (bao gồm các mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết lành tính) đều kế thừa bộ mẫu nghiên cứu được sự đồng ý cho phép từ Hội Đồng

Y Đức Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh: 516/BVCR-HDDD, và sự đồng ý của bệnh nhân tham gia nghiên cứu.

Dụng cụ - thiết bị - hóa chất

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử Các dụng cụ chính bao gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, micro pipette, đầu tip, ống đong, erlen,…

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức), bộ điện di DNA (Biorad), tủ lạnh (LG), tủ đông (Sanyo), tủ ủ nhiệt (Multitemp III), cân kỹ thuật (Satorious, Đức), tủ hút khí độc (Ascent Max), máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS), máy luân nhiệt (My-cycle Thermal, Biorad), máy đọc gel (Gel Doc XR System, Biorad), lò vi sóng (Sharp)

1.3.3 Hóa chất cần cho quy trình tách chiết DNA

Tris-HCl pH 8 1M, EDTA 0,5M; SDS 10%; NaCl 0,5M (đã hấp); H 2 O (đã hấp); Proteinase K 1mg/ml; Phenol; Chloroform; Isoamyl acolhol; TE 1X, Ethanol 70%, Ethanol tuyệt đối; Isopropanol; NaOAc 3M

Quá trình nghiên cứu thực nghiệm

Hình 2.1 Tóm tắt quy trình nghiên cứu tính chất đa hình gene RPMS1

Tối ưu hóa cặp mồi

Giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự

Ghi nhận các biến thể và tần số xuất hiện trên từng gene

Nhận xét và biện luận kết quả

Xử lí thống kê tần số phát hiện

Ghi nhận các biến thể chủ đạo và tần số xuất hiện biến thể này trên từng gene

Thu thập dữ liệu từ các nghiên cứu trước

Ghi nhận cặp mồi khuếch đại gene mục tiêu

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Tiêu chuẩn chọn lọc, loại bỏ công bố khoa học phục vụ cho khảo sát in silico

Tiến hành tìm kiếm các thông tin về tính đa hình của gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng Các công trình nghiên cứu được thu nhận trên các cơ sở dữ liệu, bao gồm: PUBMED, Web of Science, Embase Database bằng một số từ khóa như: Nasopharyngeal carcinoma, BARTs, RPMS1, SNP, variation, structure, mechanism,…

Các công bố khoa học được chọn vào phân tích tổng hợp theo một số tiêu chuẩn như sau: [1] Nghiên cứu ca-chứng (case-control study)/ hoặc nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) trong khảo sát tính đa hình gene RPMS1 với các đặc điểm lâm sàng: giai đoạn bệnh, độ tuổi,…; [2] Mối quan hệ giữa tính đa hình gene RPMS1 trên bệnh UTVH; [3] Các nghiên cứu liên quan đến phương pháp phân tích tính đa hình gene RPMS1

Tiêu chí loại bỏ: các công bố khoa học không trình bày dưới ngôn ngữ Anh; các công bố chỉ có phần tóm tắt (abstract), các bài tổng quan (review), các bài thư gửi tạp chí (letter to editor), … đều không được đưa vào dữ liệu thống kê

Dựa vào các công trình nghiên cứu đề cập đến tính đa hình, các biến thể của

RPMS1 tiến hành thu nhận thông tin về tác giả, năm xuất bản, đặc điểm mẫu bệnh và mẫu lành, tần số xuất hiện của từng biến thể trong mẫu bệnh và mẫu lành (Trình bày theo bảng 2.1) Sau đó, tiến hành thống kê trung bình có trọng số tần số xuất hiện các biến thể, loại mẫu và phương pháp phát hiện biến thể

Bảng 2.1 Tần số phát hiện các biến thể của các gene

STT Tác giả Năm Quốc gia

Tần số xuất hiện trên mẫu bệnh

Tần số xuất hiện trên mẫu lành

Chú thích: STT – số thứ tự; TLTK – tài liệu tham khảo

Sau khi xác định tần suất xuất hiện các biến thể gen RPMS1, nhóm nghiên cứu đã tiến hành tính toán tần số trung bình có trọng số Phương pháp này giúp loại bỏ các yếu tố có thể gây nhiễu kết quả thống kê, đảm bảo tính chính xác và tin cậy của dữ liệu.

Tiến hành thống kê phân loại tần số xuất hiện các biến thể theo phương pháp, loại mẫu được sử dụng Sau đó tính toán tần số trung bình có trọng số để đưa ra phương pháp và loại mẫu tối ưu.

2.3 Phương pháp đánh giá mồi

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu được kế thừa từ các công trình nghiên cứu đã công bố Sau đó, sẽ được khảo sát các thông số vật lý, vị trí bắt cặp trên trình tự đích, độ đặc hiệu của mồi

Các thông số vật lý của mồi được khảo sát bằng phần mềm trực tuyến IDT OligoAnalyzer 3.1 Các thông số của mồi phải đạt các tiêu chí sau: chiều dài mồi trong khoảng 17-28 bps, %GC nằm trong khoảng 40-60%, T m nằm trong khoảng 50-60 o C, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (ΔG) phải lớn hoặc bằng -9Kcal/mol -1

Phần mềm Annhyb v.4.946 dùng để khảo sát vị trí bắt cặp của mồi trên trình tự đích, độ dài sản phẩm PCR Yêu cầu mồi đạt được là trình tự mồi bắt cặp với trình tự đích trên 90% tổng số nucleotide của mồi.

Phần mềm trực tuyến Primer-BLAST trên trang web NCBI Các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

2.4 Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/ Chloroform

Bước 1: Ly giải tế bào

Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu mô sinh thiết:

Dùng kéo (vô trùng) cắt một phần mô nhỏ (khoảng 1 mm 2 ), cho mẫu mô vào eppendorf sạch cắt nhuyễn mẫu mụ (càng nhỏ càng tốt) Thờm 50 àl dung dịch trữ mẫu

Vortex ống mẫu trong 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong vòng 20 phút

Loại dịch nổi, bổ sung 700 àl dịch lysis buffer (14 àl Tris-HCl 1M, 14àl EDTA

0,5M, 33àl SDS 10%, 14àl NaCl 0,5M; 618àl H 2 O, 7 àl Proteinase K 1mg/ml) đảo ống Ủ qua đêm ở nhiệt độ 56 o C

Trường hợp tách chiết DNA từ mẫu dịch phết:

Dùng kẹp vô trùng kẹp que tăm bông, giũ nhẹ để mẫu rớt ra khỏi que tăm hoặc vortex nhẹ

Hỳt 5 àl, bổ sung 700 àl dung dịch lysis buffer, đảo đều ống Ủ qua đêm ở nhiệt độ 56 o C

Bước 2: Loại bỏ protein và các thành phần phụ khác

Tiến hành ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 20 phút

Loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 700 àl dung dịch PCI, lắc đều ống và ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút

Thu V àl dịch nổi, bổ sung V àl dung dịch PCI, lắc đều ống và ly tõm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút

Thu V 1 dịch nổi, bổ sung V 1 àl Chloroform, lắc đều Ly tõm 13.000 vũng/ phỳt trong 10 phút

Thu V 2 dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10 V 2 dung dịch NaOAc 3M, V 2 dung dịch Isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4 o C trong vòng 2 giờ

Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi và thu tủa

Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C, loại bỏ dịch nổi

Phơi qua đêm ở nhiệt độ phòng (loại bỏ ethanol)

2.5 Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA

Nguyên tắc: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 (Optical Density 260nm) của cỏc mẫu DNA cho phộp xỏc định nồng độ DNA trong dung dịch (với A 260 = 1 = 50àg/ ml DNA sợi đôi) Cùng với đó, protein hấp thu ánh sáng mạnh ở bước sóng 280nm Vì vậy, tiến hành đo OD ở các bước sóng 260 và 280 nm để xác định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số liên quan Tỷ số A260/A 280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của DNA

Tỷ số A 260 /A 280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0 cho thấy DNA đã tinh sạch Trường hợp tỷ số nhỏ hơn 1,8 thì mẫu bị nhiễm protein Chỉ số A 230 cũng được tiến hành đo chung với chỉ số A 260 và A 280 Chỉ số A 230 cho thấy khả năng nhiễm tạp chất của mẫu DNA (bị nhiễm carbonhydrate hoặc phenol)

Quy trình thực hiện: DNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng TE 1X (pha 2 àl DNA với 98 àl TE 1X) Sau đú, chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260 nm, 280 nm, 230 nm Độ tinh sạch của DNA được xác định bằng tỷ số A260/ A 280

2.6 Khuếch đại trình tự mong muốn và giải trình tự các mẫu đại diện

Sau khi thực hiện tách chiết DNA, phản ứng PCR được thực hiện để khuếch đại trình tự gene RPMS1, nhằm xác định các biến thể trên gene này

Lưu ý rằng: nồng độ DNA đưa vào phản ứng là 200 ng

Hình 2.2 Chu trình nhiệt chung của các phản ứng PCR

Sản phẩm PCR được quan sát bằng cách điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TBE 1X, điện thế 100V – 30 phút Xem kết quả bằng máy đọc gel Bio-rad

Sản phẩm PCR được kiểm tra dựa vào thang chuẩn 100 bp Xem xét băng kích thước sáng rõ, kích thước có đúng với kết quả đã khảo sát Sau đó, sản phẩm khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Kết quả sau khi giải trình tự được tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu GenBank

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả khảo sát in silico tính đa hình gene RPMS1

3.1.1 Cở sở dữ liệu về các biến thể trên gene mục tiêu

Theo các công trình nghiên cứu công bố từ năm 2005 đến 2018, tính đa hình của RPMS1 được chia thành 4 loại biến thể: RPMS1-A, RPMS1-B, RPMS1-C, RPMS1-D [46] Trong đó, RPMS1-A gồm các đột biến ở các vị trí nucleotide ngẫu nhiên trên vùng gene RPMS1, ví dụ: G155284T, G155307T, C155358T, C155481A,

C155525T, A155545G [46] Biến thể RPMS1-B gồm vị trí đột biến ở các nucleotide G155377A (RPMS1-B1) và C155389T (RPMS1-B2) [46] Biến thể RPMS1-C gồm vị trí đột biến G155391A [46] Biến thể RPMS1-D gồm vị trí đột biến G155325T và G155326A [46]

Bảng 2.2 Vị trí đột biến các biến thể trên gene RPMS1 trong UTVH

Biến thể Vị trí Nucleotide thay đổi Amino acid thay đổi

Chú thích: “* ” những nucleotide bị thay đổi là ngẫu nhiên trên vùng gene RPMS1 (từ nucleotide 155277 – 155546), trừ các vị trí nucleotide của các biến thể RPMS1-B, C, D

Nghiên cứu năm 2018 của Wu và cộng sự đã chỉ ra sự liên quan giữa Epstein Barr virus (EBV) và các loại ung thư khác nhau, bao gồm ung thư dạ dày, u lympho và ung thư vòm họng Trong ung thư vòm họng, biến thể RPMS1-C và RPMS1-D xuất hiện phổ biến Các nhà nghiên cứu cho rằng biến thể RPMS1-A có liên quan đến sự hình thành khối u và tăng khả năng gây ung thư của EBV Tuy nhiên, cơ chế chính xác vẫn chưa được biết rõ Ngoài ra, biến thể RPMS1-B là đặc trưng của các mẫu ung thư vòm họng ở Miền Bắc Trung Quốc.

Trong các nghiên cứu còn lại về biến thể trên gene RPMS1, các nghiên cứu này tập trung phân tích vị trí SNP G155391A (thuộc biến thể RPMS1-C) Kết quả nghiên

36 cứu đều cho thấy, vị trí SNP này là biến thể đặc trưng cho ung vòm họng, với tần số xuất hiện khá cao Trong nghiên cứu của Feng và cộng sự (2015), tác giả đã phát hiện rằng biến thể G155391A chuyển từ Guanine (G) sang Adenine (A) đã dẫn đến sự thay đổi amino acid từ Asp (D) sang Asn (N) Sự biến đổi này ảnh hưởng đến các quá trình phiên mã và biểu hiện RPMS1, SNP G155391A có chức năng ổn định cấu trúc protein của RPMS1

Qua các tài liệu thống kê, nhóm nghiên cứu thu nhận 3 nghiên cứu về tính đa hình của gene RPMS1 trên bệnh nhân ung thư vòm họng Kết quả về tần số phát hiện các biến thể được trình bày trong bảng sau

Bảng 2.3 Tần số xuất hiện các biến thể trên gene RPMS1 trong UTVH

TLTK Loại mẫu Mẫu bệnh

Bệnh Lành Bệnh Lành Bệnh Lành Bệnh Lành

Mô sinh thiết, dịch phết

Mô sinh thiết, dịch phết

Mô sinh thiết, dịch phết

Tần số trung bình trọng số của các loại biến thể ở các gene mục tiêu được xác định nhằm loại bỏ tính không đồng nhất trong các nghiên cứu Kết quả trung bình có trọng số được trình bày ở bảng sau

Bảng 2.4 Kết quả trung bình có trọng số các biến thể của RPMS1

Gene Biến thể TBTS mẫu bệnh (%) TBTS mẫu lành (%)

Hình 2.9 Tần số phát hiện các biến thể trên gene RPMS1

Chú thích: Tâm vòng tròn thể hiện tần số ghi nhận từ các bài báo Ký hiệu n là cỡ mẫu sử dụng Kích thước vòng thể hiện số lượng mẫu trong nghiên cứu Đường thẳng nằm ngang hiển thị tần số phát hiện trung bình có trọng số trên tất cả các nghiên cứu thu thập

Tần số phát hiện trung bình có trọng số của các biến thể RPMS1-A, RPMS1-B, RPMS1-C, RPMS1-D được xác định trên mẫu ung thư vòm họng Biến thể RPMS1-C có tần số phát hiện dao động từ 17 – 84%, có trung bình trọng số là 74% trên mẫu ung thư vòm họng; và dao động từ 7 – 61%, có trung bình trọng số là 37% trên mẫu lành Bên cạnh đó, các loại biến thể khác cũng được phát hiện với tần số thấp như RPMS1-

A, RPMS1-B, RPMS1-D Trong đó, biến thể RPMS1-B là một biến thể theo khu vực địa lý và tập trung chủ yếu tại khu vực miền Bắc Trung Quốc.

Biến thể RPMS1-C (G155391A) là các biến thể nổi trội trên gene RPMS1 ở khu vực Trung Quốc xuất hiện với tần số khá cao Biến thể RPMS1-C (G155391A) được khẳng định rằng liên quan đến khả năng phát sinh ung thư vòm họng [41,58,57] Đồng thời, biến thể này cũng được khẳng định là dạng đặc thù liên quan đến sự phân bố địa lý (dịch tễ UTVH), tập trung chủ yếu tại khu vực miền Bắc Trung Quốc

3.1.2 Phương pháp xác định tính đa hình

Dựa trên bảng thống kê các phương pháp nghiên cứu tính đa hình trên hai gene mục tiêu cho thấy: Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng phương pháp Nested-PCR (chiếm 100%) Điều này có thể được giải thích: phương pháp Nested-PCR sử dụng hai cặp mồi (một cặp mồi ngoài và một cặp mồi trong) để khuếch đại trình tự gene đích Việc sử dụng này làm tăng tính đặc hiệu (Specificity) và tần số khuếch đại

(Amplification rate) của phản ứng PCR Như vậy, Nested-PCR có tính nhạy cao (Sensitivity) so với phương pháp PCR thông thường và có thể khuếch đại trình tự gene mục tiêu trên một lượng mẫu rất ít [60]

Bảng 2.5 Tỉ lệ nghiên cứu sử dụng phương pháp Nested-PCR

Chú thích: Khác: Các phương pháp RT-PCR, HRM, PCR,…

3.1.3 Các loại mẫu sử dụng

Xét về loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu, mẫu mô sinh thiết được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về tính đa hình gene mục tiêu (Bảng 2.6) Điều này được giải thích là do mẫu mô sinh thiết được chẩn đoán chắc chắn là UTVH và cho kết quả có độ chính xác cao Đối với mẫu lành: mẫu dịch phết được sử dụng hầu hết trong các nghiên cứu bởi lý do lấy mẫu sinh thiết (mẫu xâm lấn) khó được thực hiện ở người lành Mẫu dịch phết là mẫu không xâm lấn, không tổn hại đến tình nguyện viên và thu nhận dễ dàng Do đó, việc sử dụng mẫu lành (dịch phết) vẫn được xem như mẫu chứng cho các nghiên cứu ca – chứng trong nghiên cứu bệnh ung thư nói chung và UTVH nói riêng [11, 98-100]

Bảng 2.6 Tỉ lệ loại mẫu sử dụng trong các nghiên cứu

Mẫu ung thư Mẫu lành

Do đó, trong nghiên cứu này, mẫu mẫu mô sinh thiết và mẫu dịch phết lành được chọn để thực hiện phân tích thực nghiệm sau này.

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các biến thể trên gene RPMS1

Utilizing the DISULFIND-Cysteines Disulfide Bonding State and Connectivity Predictor software, disulfide bonds within RPMS1 variants were predicted and the estimated connectivity is presented below.

Hình 2.10 Cấu trúc liên kết disulfite của các biến thể RPMS1 (Wt), RPMS1-B,

Chú thích: DB_state: dự đoán trạng thái liên kết disulfide (1 = liên kết, 0 = không liên kết); DB_conf: độ tin cậy của dự đoán trạng thái liên kết disulfide (0 = thấp đến 9 = cao)

KẾT LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát in silico

Qua kết quả khảo sát in silico nhóm nghiên cứu đã tạo ra được cơ sở lý thuyết, hướng đến khảo sát sự đa hình các gene của EBV, cụ thể là gene RPMS1 Qua quá trình thu thập dữ liệu từ 3 bài báo nghiên cứu về gene RPMS1, kết quả cho thấy tần số xuất hiện biến thể RPMS1-C trên gene RPMS1 đối với ung thư vòm họng khá cao (với tần số xuất hiện trung bình có trọng số là 74%), trong khi ở mẫu lành tần số xuất hiện các biến thể này chỉ có 37% trên gene RPMS1 Trong tổng số các công trình nghiên cứu thu nhận được, phương pháp PCR là phương pháp được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu về tính đa hình gene RPMS1 Mẫu thường được sử dụng trong các bài báo là mẫu mô sinh thiết, ngoài ra nhằm hướng tới việc chẩn đoán sớm nên các loại mẫu khác: dịch phết vòm họng cũng được sử dụng

Nhóm nghiên cứu đã ghi nhận, thừa kế và tiến hành đánh giá về thông số vật lí cũng như độ đặc hiệu của các cặp mồi được sử dụng trong các công trình nghiên cứu về tính đa hình của các gene mục tiêu, thu nhận các cặp mồi phù hợp sử dụng trong thực nghiệm phân tích trình tự gene RPMS1

Xây dựng thành công quy trình PCR phát hiện các biến thể của gene RPMS1 trên bệnh nhân UTVH người Việt Nam Biến thể A155391G, C155384T và T155389C là biến thể đặc trưng trên gene RPSM1 trên cộng đồng người Việt Nam Kết quả thực nghiệm về tính đa hình trên gene RPMS1 thu được tần số xuất hiện của từng biến thể A155391G, C155384T và T155389C là 50%, 5% và 5% Trong đó, biến thể C155384T là hai biến thể mới trên gene RPMS1 được ghi nhận trên người bệnh UTVH Việt Nam Dựa trên kết quả phân tích phả hệ di truyền, EBV xâm nhiễm trên cộng đồng người Việt Nam có quan hệ/ nguồn gốc từ khu vực Châu Á như: Trung Quốc, Nhật Bản và HongKong.

ĐỀ NGHỊ

Qua quá trình nghiên cứu, một số kiến nghị như sau được đưa ra để hoàn thành công trình nghiên cứu tốt hơn:

 Mở rộng cỡ mẫu thí nghiệm dựa trên quy trình thực nghiệm và các cặp mồi thừa kế đã được tối ưu hóa Kiểm tra trên nhiều loại mẫu khác nhau để hoàn thiện quy trình phát hiện các biến thể các gene của EBV Khảo sát các yếu tố về lâm sàng (bao gồm: độ tuổi, giai đoạn bệnh,…) nhằm phân tích mối quan hệ giữa miR-141 với các yếu tố

 Tiến hành các nghiên cứu về chức năng cũng như về ảnh hưởng đến miễn dịch của các biến thể để làm sáng tỏ hơn mối liên hệ giữa các tính đa hình gene của EBV và UTVH.

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT BIỂU HIỆN CỦA MIR-141 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM 1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Khai thác cơ sở dữ liệu

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lọc, loại bỏ công bố khoa học phục vụ cho phân tích tổng hợp (Meta - analysis)/ hoặc khảo sát in silico

Để tìm hiểu về vai trò của miRNA-141 trong ung thư vòm họng, các nghiên cứu đã được thu thập từ các cơ sở dữ liệu lớn như PUBMED, Web of Science và Embase Database Những nghiên cứu này điều tra cấu trúc, cơ chế và các thông số liên quan đến miRNA-141 trong bối cảnh ung thư vòm họng.

Các công bố khoa học được chọn vào phân tích tổng hợp theo một số tiêu chuẩn như sau: [1] Nghiên cứu ca-chứng (case-control study)/ hoặc nghiên cứu đoàn hệ (cohort study) trong khảo sát sự biểu hiện của miRNA-141 với các đặc điểm lâm sàng: giai đoạn bệnh, độ tuổi,…; [2] Mối quan hệ giữa tính chất biểu hiện miRNA-141 trên bệnh UTVH; [3] Các nghiên cứu liên quan đến phương pháp phân tích, phát hiện sự biểu hiện của miRNA-141

Tiêu chí loại bỏ: các công bố khoa học không trình bày dưới ngôn ngữ Anh; các công bố chỉ có phần tóm tắt (abstract), các bài tổng quan (review), các bài thư gửi tạp chí (letter to editor), … đều không được đưa vào dữ liệu thống kê

Bước trích xuất dữ liệu được tiến hành ghi nhận độc lập bởi hai thành viên trong nhóm nghiên cứu Dữ liệu trích xuất bao gồm: tác giả, năm xuất bản, các thông tin về bệnh nhân bao gồm chủng tộc, phương pháp phân tích sự biểu hiện, tần số biểu hiện trên mẫu bệnh và mẫu chứng, các đặc điểm lâm sàng như giai đoạn bệnh, sự xuất hiện hạch bạch huyết Các dữ liệu được trích xuất được trình bày dưới dạng bảng 3.1

Bảng 3.1 Mẫu bảng ghi nhận trích xuất dữ liệu từ các công bố trên thế giới

STT Tác giả Năm Quốc gia Loại mẫu

Quy trình thực nghiệm

Các quy trình thực nghiệm liên quan đến tách chiết miRNA, chuyển đổi miRNA thành cDNA tuân theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể như sau:

2.2.1 Tách chiết miRNA bằng bộ kit mirVana™ miRNA Isolation Kit

Bước 1: Chuẩn bị các hóa chất

Thêm 21 ml ethanol 100% vào chai có nhãn miRNA Wash Solution 1, sau đó trộn đều

Thêm 40 ml ethanol 100% vào chai có nhãn Wash Solution 2/3, sau đó trộn đều

Làm nóng dung dịch Elution Solution hoặc nước nuclease-free tới 95°C để sử dụng để tách RNA ra từ bộ lọc ở cuối quy trình

Ethanol 100% sử dụng cho quy trình này được giữ lạnh, sau đó làm nóng đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng

Bước 2: Phá màng tế bào và màng nhân Đo lường hoặc ước tính trọng lượng của mẫu

Cho vào 10 lần thể tích Lysis Buffer (ví dụ 1ml Lysis Buffer cho 0,1g mẫu), sau đó ủ lạnh

Bước 3: Tách chiết chất hữu cơ (protein, carbonhydrate,…)

Thêm 1/10 thể tích miRNA Homogenate Additive và trộn đều bằng cách vortex hoặc đảo ngược ống nhiều lần (Ví dụ, nếu tổng thể tích là 300 μl, thêm 30 μl miRNA Homogenate Additive) Để hỗn hợp ở nhiệt độ lạnh trong 10 phút

Thêm một lượng Phenol: Chloroform tương đương với thể tích trước khi thêm hỗn hợp Homogenate miRNA Sau đó, vortex trong 30 – 60 giây Ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 10.0000 vòng/ phút

Thu V μl dịch nổi sang một eppendorf mới

Thêm 1/3 thể tích 100% ethanol vào dịch nổi thu được từ các bước ở trên Trộn đều bằng cách vortex hoặc đảo ngược ống nhiều lần

64 Đối với mỗi mẫu, đặt bộ lọc Filter Cartridge vào một trong Collection Tube (được cung cấp theo bộ kit)

Cho hỗn hợp dung dịch (dịch nổi và ethanol từ bước trước) vào bộ lọc Filter Cartridge Bổ sung dung dịch đến 700 μl cho mỗi lần Ly tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới (Nếu hỗn hợp dung dịch lớn hơn 700 μl, tiếp tục cho phần dung dịch còn lại vào Filter Cartridge, ly tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới)

* Có thể lặp lại các bước trên với phần dung dịch đã qua bộ lọc để thu nhận tối đa miRNA

Thêm 700 μl miRNA Wash Solution 1 (đã bổ sung ethanol 100%) vào Filter Cartridge và ly tâm 5 – 10 giây với 10.000 vòng/phút Loại bỏ dung dịch qua màng lọc, đưa Filter Cartridge và một Collection Tube mới

Thêm 500 μl dung dịch Wash Solution 2 (đã bổ sung ethanol 100%) và ly tâm 5 – 10 giây với 10.000 vòng/phút sao cho dung dịch qua bộ lọc

Lặp lại bước trên với lượng Wash Solution 2 đã qua bộ lọc một lần nữa

Transfer the Filter Cartridge to a new Collection Tube (provided in the kit) Add 100 µl of Elution Solution or nuclease-free water (95 o C) to the filter and close the cap Spin for about 20 – 30 seconds at 10,000 rpm.

Thu nhận cột lọc Filter Cartridge và lưu trữ ở -20 o C hoặc thấp hơn

2.2.2 Chuyển đổi trình tự mRNA thành cDNA bằng bộ chuyển đổi

Bước 1: Chuẩn bị Mastermix được ủ lạnh

Bước 2: Lắc đều dung dịch, sau đó ly tâm dung dịch trong 5 giây

Bước 3: Cho vào 1 eppendorf (0,2 ml) các thành phần sau:

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng phản ứng RT-PCR mRNA (1àg) n àl

DNase/RNase free-water m àl

Bước 4: Trộn đều bằng pipet

Hình 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR

Bước 5: Chạy chu trình nhiệt

2.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu cDNA

Nguyên tắc: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang OD 260 (Optical Density 260nm) của cỏc mẫu DNA cho phộp xỏc định nồng độ DNA trong dung dịch (với A 260 = 1 = 50àg/ ml DNA sợi đôi) Cùng với đó, protein hấp thu ánh sáng mạnh ở bước sóng 280nm Vì vậy, tiến hành đo OD ở các bước sóng 260 và 280 nm để xác định độ tinh sạch, nồng độ và các thông số liên quan Tỷ số A 260 /A 280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của DNA

Tỷ số hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trên bước sóng 280 nm (A280) trong khoảng 1,8 đến 2,0 là chỉ số đánh giá độ tinh sạch của DNA Khi tỷ số này nhỏ hơn 1,8, mẫu DNA có thể bị nhiễm protein Tỷ số hấp thụ tại bước sóng 230 nm (A230) cũng được đo cùng lúc với A260 và A280 A230 cho biết khả năng nhiễm tạp chất của mẫu DNA, đặc biệt là carbohydrate hoặc phenol.

Quy trình thực hiện: DNA sau khi tách chiết được pha loãng 50 lần bằng TE 1X (pha 2 àl DNA với 98 àl TE 1X) Sau đú, chuyển tất cả dung dịch vào cuvette và đo nồng độ DNA ở các bước sóng 260 nm, 280 nm, 230 nm Độ tinh sạch của DNA được xác định bằng tỷ số A 260 / A 280

2.2.4 Khuếch đại trình tự mong muốn và giải trình tự các mẫu đại diện

Sau khi thực hiện tách chiết miRNA và chuyển đổi miRNA thành cDNA, thực hiện phản ứng PCR bao gồm các nội dung: xác định tính đặc hiệu, nhiệt độ bắt cặp tối ưu của các cặp mồi Đồng thời, chúng tôi tiến hành phản ứng Realtime PCR nhằm khảo sát mức độ biểu hiện của miRNA-141, U6 với nhiệt độ bắt cặp và chu trình nhiệt đã được tối ưu

Lưu ý rằng: nồng độ cDNA đưa vào phản ứng là 200 ng

Hình 3.3 Chu trình nhiệt chung của các phản ứng Realtime PCR

Bảng 3.3 Thông tin nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài của các cặp mồi

Thời gian kéo dài (Y) 20 giây 20 giây

Sản phẩm PCR được quan sát bằng cách điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TBE 1X, điện thế 100V – 30 phút Xem kết quả bằng máy đọc gel Bio-rad

Sản phẩm PCR được kiểm tra dựa vào thang chuẩn 100 bp Xem xét băng kích thước sáng rõ, kích thước có đúng với kết quả đã khảo sát Sau đó, sản phẩm khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Kết quả sau khi giải trình tự được tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu GenBank

Các giá trị phân tích thống kê được tiến hành thực hiện trên phần mềm Mecalc ® version 16 Phân tích thống kê được tiến hành theo mô hình phân tích tổng ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta - analysis) cho một tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) nhằm đánh giá tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất biểu hiện của miRNA-141) và nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng Ƣớc tính chỉ số bất đồng nhất (Index of Heterogeneity - I 2 ) giữa các nghiên cứu được tiến hành dựa vào thuật Chi bình phương Ngoài ra, tính bất đồng nhất thống kê giữa các nghiên cứu được kiểm tra dựa trên các chỉ số Cochran’s Q and

I 2 Mô hình phân tích ngẫu nhiên được sử dụng khi giá trị p nhỏ hơn 0,1 trong Q-test, cho thấy tính bất đồng nhất đáng kể

2.2.5.2 Phân tích tần số biểu hiện của miRNA-141

Kết quả phân tích bằng phần mềm Mecalc ® version 16 Tần số biểu hiện của các phân tử miRNA-141 được tính toán và sử dụng phép tính chi bình phương (Chi-square test) để so sánh tần số biểu hiện giữa các nhóm bệnh và lành Ngoài ra, phân tích dữ liệu còn xác định được độ nhạy (sentitive), độ đặc hiệu (specificity), chỉ số κ (Kappa),… Sự khác biệt về tần số của các phân tử trong các nhóm được coi là có ý nghĩa với p ≤ 0,05

2.2.5.3 Phân tích mức biểu hiện của miRNA-141 qua giá trị 2 -ΔΔCt

Phân tích sự biểu hiện của miRNA-141 giữa mẫu bệnh và mẫu lành được dựa trên phương pháp định lượng tương đối 2 -∆∆Ct của Livak [101]

Kết quả khai thác dữ liệu khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-

3.1.1 Kết quả trích xuất dữ liệu và đặc điểm bộ dữ liệu nghiên cứu

Tổng số công trình nghiên cứu thu nhận ban đầu là 18 công trình Dựa vào các tiêu chí chọn lọc, các công trình không phù hợp với tiêu chí sẽ được loại bỏ, tổng số công trình phù hợp chỉ tiêu chọn lọc là 3 công trình Quy trình chọn lọc được trình bày chi tiết ở hình 3.4

Hình 3.4 Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu vào bộ dữ liệu phân tích tổng hợp

Lựa chọn công trình nghiên cứu thích hợp

Tổng số công bố khoa học thu thập trên cơ sở dữ liệu trực tuyến (NCBI)

Tổng số công bố khoa học thu thập từ các nguồn dữ liệu khác

Tổng số công bố khoa học sau khi loại bỏ trùng lặp

Tổng số công bố khoa học được sàng lọc (N = 18)

Tổng số công bố khoa học thích hợp (N = 4)

Tổng số công bố khoa học thích hợp được nhận vào phân tích tổng hợp

Tổng số công bố khoa học không được nhận vào phân tích tổng hợp (N = 16)

Không nghiên cứu trên ung thư vòm họng (N = 16)

Tổng số công bố khoa học không được nhận vào phân tích tổng hợp (N = 1)

Dạng bài báo khoa học tổng quan (N = 1)

Sau khi loại trừ các nghiên cứu không đáp ứng tiêu chí, hiện chỉ có ba nghiên cứu được thực hiện để phân tích sự biểu hiện của miRNA-141 trong ung thư vòm họng Những nghiên cứu này bao gồm nghiên cứu của Cui và cộng sự (2014) với 70 mẫu vật, nghiên cứu của Wang và cộng sự (2015) với 90 mẫu vật và nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2016) với 110 mẫu vật.

Bảng 3.4 Đặc điểm của bộ dữ liệu 3 nghiên cứu ca chứng về tính chất biểu hiện cao miRNA-141

Ghi chú: qRT-PCR: Quantitative Reverse Transcription PCR; IHC: Immunohistochemistry

3.1.2 Phân tích tương quan giữa tính chất biểu hiện của miRNA-141 với giá trị tỷ suất chênh và nguy cơ mắc bệnh trên bộ dữ liệu từ 3 nghiên cứu bệnh – ca chứng

Bộ dữ liệu thích hợp cho phân tích tổng hợp từ 3 nghiên cứu ca-chứng công bố về sự biểu hiện của miRNA-141, bao gồm 155 mẫu ung thư và 93 mẫu chứng (Bảng 3.4) Tính tương quan giữa tính chất biểu hiện của miRNA-141 với ung thư vòm họng được tính toán thông qua giá trị tỷ suất chênh (Odd Ratios: OR) và nguy cơ mắc bệnh (Relative risk: RR) Kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.5 Dựa trên kết quả phân tích (bảng 3.5) cho thấy biểu hiện cao của miRNA-141 ở mẫu bệnh (96/155 mẫu miR-

141 biểu hiện cao; chiếm 61,94%) so với ở mẫu lành (30/93 mẫu miR-141 biểu hiện cao; chiếm 32,26%) làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với chỉ số OR 3,51 (95%CI = 2,028 – 6,062; mô hình phân tích ngẫu nhiên) và giá trị RR = 1,93 (95%CI = 1,404 – 2,658 mô hình phân tích ngẫu nhiên)

Tác giả Quốc gia Chủng tộc

Bảng 3.5 Giá trị OR và RR tính chất biểu hiện cao của miRNA-141 mô hình phân tích tổng ảnh hưởng ngẫu nhiên dựa trên các nghiên cứu đã công bố

Tác giả OR 95% CI P W (%) RR 95% CI P W (%)

Ghi chú: OR: chỉ số tỷ suất chênh (Odd Ratio); RR: chỉ số nguy cơ mắc bệnh (Relative Risk); W: trọng số (Weight); P: chỉ số p-value; 95% CI: khoảng tin cậy 95% Điều đáng lưu ý là các công trình nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miR-

141, cụ thể là các nghiên cứu dạng mẫu bệnh – ca chứng, vẫn còn khá hạn chế và chỉ tập trung ở chủng tộc Châu Á được thực hiện bởi nhà khoa học, nhà nghiên cứu ở Trung Quốc Do đó, nhằm hướng tới một sự quan sát chung nhất về tính chất biểu hiện miR-141 trên bệnh nhân ung thư vòm họng Một điều nhận thấy rằng, tại Việt Nam, vẫn chưa có bất kỳ một công trình nghiên cứu nào liên quan đến tính chất biểu hiện của miR-141 Do đó, kết quả nghiên cứu này sẽ là nghiên cứu đầu tiên, cụ thể nghiên cứu trên ca bệnh – chứng và là cơ sở khoa học – đề tài đầu tiên cho những nghiên cứu mở rộng và sâu hơn sau này

Khảo sát ảnh hưởng của miRNA-141 bằng phần mềm / công cụ tin sinh học

Các phần mềm PicTar, TargetScan và miRDB được sử dụng để khảo sát gene đích của miRNA-141 Kết quả khảo sát cho thấy 98 gene đích trùng lắp nhau (overlap) 98 gene đích này được tiến hành phân loại chức năng thông qua việc phân tích KEGG pathways, reactome pathways bằng DAVID 2008 Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis Tools và PANTHER pathways bằng PANTHER

Hình 3.5 Các gene và con đường tín hiệu liên quan đến miRNA-141

72 classification system để phân loại chức năng của các gene đích Kết quả phân tích được thể hiện ở hình 3.5 và tóm tắt ở bảng 3.6.

Bảng 3.6 Các gene và con đường tín hiệu có liên quan đến miRNA-141

Pathways Related Genes Total pathway hits

Percent (%) FoxO signaling pathway PTEN, SIRT1, TGFB2 3 3%

Cell cycle CCNE2,E2F3,CDC14A,STAG1,

PPP2CA, E2F3 6 7% mTOR signaling pathway PTEN, TSC1 2 2%

EPHA2, CCNE2, PTEN, PPP2CA, PPP2R2A, TSC1,

Tight junction MYH10, PTEN, PPP2CA,

E2F3, CCNE2, PTEN, PRKACB, RARB, STAT5A, STAT5B, TGFB2, UBAP1

Wnt signaling pathway PRKACB, SIAH1 2 2%

ErbB signaling pathway MAP2K4, STAT5B, STAT4 3 1%

Jak-STAT signaling pathway MAP2K4, STAT5B, STAT4 3 1%

APBB2, ARNTL, BRD3, CHD9, CHP1, CTNND2, CUL3, DDX5, DLC1, ELAVL2, EPHA7, FOXA1, FUS, GLRX, GRIN3A, H2AFZ, KPNA3, NFASC, NRP1, NRXN1, PEX5, PITX2, PPT2, RAP2C, SEMA6A, SLC16A7, SLC20A1, SPAG9, STXBP1, STXBP5, SYT4, TAF12, TFAP2C, TNKS2, TRAM1, TTR, TTYH2,

Kết quả khảo sát cho thấy hơn 50% gene đích của miRNA-141 tham gia vào con đường truyền tín hiệu (signaling pathways) liên quan đến việc tăng trưởng tế bào, liên kết giữa tế bào, … chẳng hạn như Wnt, JAK-STAT, tight junction, cell cycle, và các con đường này đều quan trọng trong việc tiến triển khối u (tumorigenesis)

Trong ung thư vòm họng, miRNA-141 là một oncogene làm tăng sự tiến triển, di cư và xâm lấn của tế bào ung thư thông qua quá trình Rb/ E2F và AKT được điều hòa dương tính bằng cách nhắm vào các gene mục tiêu, bao gồm: BRD3, PTEN, UBAP1 [22] Con đường Rb/ E2F là cần thiết cho chu kỳ tế bào bình thường, trong pha G 1 tiến triển đến pha S [102] Con đường AKT đóng một vai trò quan trọng trong việc kích hoạt sự kết hợp của các protein mục tiêu khác nhau liên quan đến sự phát triển, tăng sinh và di cư của tế bào Quá trình phosphoryl hóa của AKT được điều hòa âm tính bởi PTEN, là một gene ức chế khối u AKT đóng một vai trò quan trọng trong việc kích hoạt / điều hòa các con đường tín hiệu trong tăng trưởng tế bào, sự tăng sinh và xâm lấn, và thúc đẩy sự hình thành khối u [22] Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2010), biểu hiện của miR-141 có thể làm tăng phosphoryl hóa AKT thông qua sự ức chế biểu hiện PTEN BDR3 đóng một vai trò trong việc điều chỉnh quá trình phiên mã, do tái cấu trúc nhiễm sắc thể và tương tác với các yếu tố phiên mã, cũng đã

74 được chứng minh có vai trò điều hòa âm tính con đường Rb/E2F, đồng thời gen liên quan đến khối u c-MYC, SPLUNC1 có thể tạo nên một mạng lưới thúc đẩy sự phát triển của ung thư vòm họng Sau khi tổng hợp các thông tin có liên quan, chúng tôi minh họa con đường tín hiệu của miR-141 có vai trò như một oncogene ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, di cư và xâm nhập bằng cách điều hòa dương tính của con đường Rb/E2F và AKT.

Hình 3.6 Con đường tín hiệu liên quan đến ung thư vòm họng

3.3 Kết quả khảo sát mồi

Trình tự mồi được thu nhận trong quá trình khảo sát in silico Các cặp mồi được nhóm nghiên cứu thực nghiệm ghi nhận và kiểm tra các thông số vật lý cũng như độ đặc hiệu của mồi Cặp mồi U6-F-R thu nhận từ nghiên cứu của Chang và cộng sự năm

3.3.1 Kết quả kiểm tra thông số vật lý của các cặp mồi

Bảng 3.7 Các thông số vật lý của các cặp mồi

Chú thích: F – mồi xuôi, R – mồi ngược, Các giá trị vật lý này được đánh giá bằng phần mềm đánh giá mồi trực tuyến IDT, L: giá trị chiều dài của mồi (bp), chiều dài của mồi tốt nhất là ở khoảng 18 – 25bp Tm: là nhiệt độ nóng chảy của mồi ( o C),

Tm nằm trong khoảng 55 – 65 o C, %GC: là giá trị về phần trăm số lượng base G và C có trong mồi, %GC nằm trong khoảng 45 – 55% (1) mức năng lượng liên kết tự do (∆G) cho khả năng hình thành cấu trúc hairpin, (2) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc homodimer, (3) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc heterodimer Giá trị ∆G lớn hơn hoặc bằng -9 Kcal/mol -1 , (4) là chiều dài sản phẩm PCR

Nhận xét về cặp mồi U6-F-R: Chiều dài của mồi xuôi là 23bp, mồi ngược là 19bp, giá trị này nằm trong khoảng thông số vật lí cho phép của mồi, nên chiều dài mồi đạt yêu cầu Tm của mồi xuôi là 51,7 o C và mồi ngược là 52,3 o C; chênh lệch nhiệt độ giữa hai mồi là 0,6 o C trong khoảng cho phép %GC của mồi xuôi là 34,8%; số lượng base G và C trong mồi thấp, %GC của mồi ngược 47,4% nằm trong khoảng giá trị cho phép, nên mồi đạt yêu cầu Khảo sát về năng lượng liên kết tự do hình thành các cấu trúc thứ cấp (∆G) của cặp mồi cho các giá trị đều lớn hơn -9 Kcal/mol -1 , mồi đạt yêu cầu %GC của mồi xuôi là 34,8%, số lượng base G và C trong mồi thấp, nằm ngoài ngưỡng cho phép Tuy nhiên, điều này không ảnh đến kết quả PCR khuếch đại sản phẩm vì khả năng bắt cặp của mồi còn phụ thuộc vào nồng độ muối của môi trường

3.3.2 Kết quả kiểm tra cặp mồi U6 trên Annhyb và BLAST

Theo nghiên cứu của Chang và cộng sự (năm 2014), cặp mồi khuếch đại sản phẩm có kích thước là 70bp [103] Thu nhận trình tự U6 từ NCBI với mã số Accession NR_125730

Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu mồi trên Annhyb

Chú thích: Màu đỏ là vị trí bắt cặp của mồi xuôi, màu xanh là vị trí bắt cặp của mồi ngược

Hình trên thể hiện kết quả sắp xếp của trình tự mồi và trình tự RNA-U6 trên NCBI (accession number: NR_125730) Kết quả Annhyb cho thấy cho thấy mồi xuôi bắt cặp 100% với trình tự từ 30bp – 52bp, mồi ngược bắt cặp 100% với trình tự từ 81bp – 99bp Thu được sản phẩm khuếch đại có chiều dài 70bp phù hợp với nghiên cứu của Chang và cộng sự (năm 2014)

Hình 3.7 Kết quả Annhyb của cặp mồi RNA-U6

Theo kết quả BLAST thì cặp mồi trên khuếch đại được trình tự RNA-U6 của loài Homo sapiens Từ đó cho thấy cặp mồi RNA-U6 là cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại trình tự RNA-U6, có độ tương đồng khá cao giữa trình tự RNA-U6 và trình tự truy vấn (accession number: NR_125730) với các điểm số: E value = 0,029; Score = 78,3; Query cover = 67%; Max ident = 100%

Hình 3.8 Kết quả BLAST của cặp mồi RNA-U6

Kết quả khuếch đại trình tự bằng phương pháp Realtime PCR

Sau khi tách chiết mRNA từ các mẫu bệnh phẩm và mẫu lành Các mẫu sẽ được chuyển thành cDNA Sau đó, tiến hành kiểm tra sự biểu hiện của các phân tử cần khảo sát với nhiệt độ bắt cặp và chu trình nhiệt đã được tối ưu Lưu ý rằng: nồng độ cDNA đưa vào phản ứng là 200 ng

Tiến hành khuếch đại trình tự miRNA-141 bằng phương pháp Realtime-PCR, kết quả có 11/20 (55%) mẫu bệnh phẩm dương tính với miRNA-141 Trong nhóm 20 mẫu lành, có 2/20 (10%) mẫu dương tính với miRNA-141.

Chu trình nhiệt sử dụng cho cặp mồi U6 được khuếch đại trong 40 chu kì, nhiệt độ bắt cặp 55 o C trong 15 giây, kéo dài ở 72 o C trong 20 giây Tiến hành trên 20 mẫu bệnh phẩm và 20 mẫu lành (tiến hành trên các mẫu đã thử nghiệm với miRNA-141) có 20/20 (100%) mẫu bệnh dương tính với U6, 20/20 (100%) mẫu lành dương tính với U6

Hình 3.9 Sự biểu hiện miRNA-141 được phát hiện / không bị phát hiện trên các mẫu đại diện.

Kết quả phân tích thống kê

3.5.1 Tần số biểu hiện của miRNA-141

Bảng 3.8 Kết quả phân tích giá trị tần số biểu hiện của miRNA-141

Chú thích: p-value (Probability value): giá trị tin cậy

AUC (Accuracy): diện tích dưới đường cong ROC

Hình 3.10 Sự biểu hiện của U6 được phát hiện trên các mẫu đại diện

Sp (Specificity): độ đặc hiệu

Pp (Positive Predictive value): giá trị tiên đoán dương tính

Np (giá trị tiên đoán âm tính): xác định khả năng của xét nghiệm trong phát hiện ca bệnh âm tính thực sự.LR- (tỷ lệ khả năng âm tính): so sánh khả năng kết quả xét nghiệm âm tính ở người bệnh với khả năng kết quả xét nghiệm âm tính ở người không bệnh.LR+ (tỷ lệ khả năng dương tính): so sánh khả năng kết quả xét nghiệm dương tính ở người bệnh với khả năng kết quả xét nghiệm dương tính ở người không bệnh.

OR (Odd ratio): tỷ suất chênh

RR (Risk relative): chỉ số nguy cơ tương đối

Bằng kĩ thuật Realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả cho thấy sự biểu hiện của miRNA-141 tăng ở mẫu bệnh, cụ thể như sau: ở mẫu bệnh là 55%, ở mẫu lành là 10% Giá trị p = 0,0027 nhỏ hơn 0,05; điều này chứng tỏ sự biểu hiện của miRNA-141 có mối liên hệ chặt chẽ với ung thư vòm họng Kết quả phân tích cho độ nhạy, độ đặc hiệu, Pp, Np đều từ 55% đến 90% Điều này có nghĩa phương pháp xét biểu hiện gene mục tiêu bằng Realtime PCR so với phương pháp chẩn đoán lâm sàng và có thể áp dụng trong việc tiên lượng, sàng lọc và chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng Bởi lẽ, với độ đặc hiệu 90% có nghĩa là phép xét nghiệm có thể nhận ra hầu hết các trường hợp âm tính thật sự Thêm vào đó, kết quả dương tính cao trong khi độ đặc hiệu của phương pháp cao sẽ giúp cho phát hiện khiếm khuyết rất hiệu quả Ngược lại, trong nghiên cứu này, chúng tôi có độ nhạy phương pháp là 55%; khi đó phương pháp này có thể nhận ra các trường hợp dương tính thật và những trường hợp khi kết quả âm tính từ một phương pháp có độ nhạy cao sẽ giúp chúng ta sàng lọc bệnh Các giá trị Pp và Np ở đây rất cao lần lượt là 84% và 67% (đối với miRNA-141) chứng tỏ phương pháp phát hiện phân tử có thể giúp chẩn đoán đối tượng bị bệnh ung thư vòm họng chắc chắn hơn Giá trị AUC của miRNA-141 là 0,725 cho thấy mức độ chính xác của phương pháp Realtime PCR Với giá trị chỉ số κ là 0,3 cho thấy mức độ phù hợp giữa kết quả chẩn đoán lâm sàng và phát hiện phân tử thấp Vì vậy, cần tiến hành song song với kết quả một số thông số lâm sàng khác, từ đó đưa ra các chẩn đoán chính xác hoặc loại trừ cho bệnh nhân, để có liệu pháp điều trị thích hợp điều trị Tính chất biểu hiện cao của miRNA-141 ở mẫu bệnh so với mẫu lành cho thấy làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với chỉ số OR = 11,0 và RR = 5,5 Giá trị OR = 11,0 cho thấy tỉ lệ biểu hiện cao miRNA-141 cao gấp 22 lần so với mẫu lành Đối với giá trị RR = 5,5 cho thấy nguy cơ miRNA-141 biểu hiện cao ở bệnh nhân UTVH cao gấp 5,5 lần so với nhóm người lành, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,01

3.5.2 Mức biểu hiện của miRNA-141

Qua xử lý số liệu bằng thống kê đã thể hiện sự biểu hiện của U6 không thay đổi nhiều trong hầu hết mẫu bệnh khi so với các mẫu lành Theo giá trị trung bình chu kì ngưỡng (mean ∆Ct), U6 biểu hiện trong mẫu bệnh (30,55) không có khác biệt nhiều so với giá trị trung bình của mẫu lành (30,73) chỉ cách nhau khoảng 0,6-1,3 giá trị trung bình chu kỳ ngưỡng, với độ tin cậy 95% khoảng: -1,557 đến 2,341 (control normalized ratio ranging)

Hình 3.11 Giá trị trung bình chu kì ngưỡng của miRNA-141 (A) và mức biểu hiện của miRNA-141 (B) trong mẫu lành và bệnh

Chú thích: Các chấm tròn thể hiện giá trị chu kì ngưỡng

Qua xử lý số liệu bằng thống kê đã thể hiện mức biểu hiện của miRNA-141 tăng trong hầu hết mẫu bệnh khi so với các mẫu lành (Hình 3.11.A) Theo giá trị trung bình chu kì ngưỡng (mean ∆Ct), trung bình chu kì ngưỡng của miR-141 trong mẫu bệnh thấp hơn so với giá trị trung bình của mẫu lành, với độ tin cậy 95% ở khoảng: 1,908 đến 12,55 (control normalized ratio ranging) Như kỳ vọng ban đầu, các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê (p = 0,0116) Sự khác biệt trong mẫu bệnh không có sự tương quan đối nghịch về số liệu (khả năng sai số trong thống kê) khi so với mẫu lành (R 2 = 0,4) Kết quả sẽ được biểu diễn bằng giá trị Mean ± SEM trong nghiệm thức trên, p = 0,0116 bằng Student’s t test

Mức biểu hiện của miRNA-141 được tính toán dựa trên chỉ số 2 -ΔΔCt thể hiện trên hình 3.11B Theo đó, mức biểu hiện của miRNA-141 tăng gấp 9,38 lần khi so

82 sánh với mẫu lành (2 -ΔΔCt = 9,38), giá trị p = 0,003 Kết quả sẽ được biểu diễn thông qua giá trị Mean ± SEM trong nghiệm thức trên, với p < 0,05 bằng Student’s t test

Kết luận chung: miRNA-141 biểu hiện cao trong các mẫu ung thư điều này hoàn toàn đúng với giả thuyết Hơn nữa, đây là công trình thực nghiệm đầu tiên về sự biểu hiện miRNA-141 trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam.

Kết hợp tính chất biểu hiện của miR-141 và gene RPMS1

Từ 20 mẫu UTVH và 20 mẫu dịch phết lành tính, em kết hợp phân tích tính chất biểu hiện của miRNA-141 và sự xuất hiện gene RPMS1 Kết quả được trình bày tại bảng sau:

Bảng 3.9 Bảng tần số xuất hiện của miRNA-141 và RPMS1 trên mẫu bệnh

Mẫu miR-141 RPMS1 Mẫu miR-141 RPMS1

Chú thích: “+” mẫu dương tính, “-” mẫu âm tính

Cùng với đó, miRNA-141 có tần số xuất hiện là 2/20 mẫu lành, không có sự xuất hiện nào của gene RPMS1 trên mẫu lành Từ đó, sự xuất hiện của gene RPMS1 và miRNA-141 được thống kê dưới dạng và được trình bày ở bảng 3.10 Giá trị p-value giữa các nhóm được tính bằng phương pháp chi bình phương (Chi-square tests) Giá trị p-value ≤ 0,05 thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm được so sánh

Bảng 3.10 Bảng kết hợp giữa tần số xuất hiện miRNA-141 và RPMS1

Nhìn chung ở mẫu bệnh, tần số xuất hiện của miR-141 trong các mẫu xuất hiện gene RPMS1 và không xuất hiện gene RPMS1 lần lượt là 45,0% (9/25 mẫu), 15%

(3/20 mẫu ) Ngược lại ở mẫu lành, tần số xuất hiện của miRNA-141 và RPMS1 là rất thấp Kết quả cho thấy giá trị p-value ở hai nhóm mẫu bệnh và mẫu lành lần lượt là

Kết quả thống kê cho thấy 0,0319 và 0,0003 đều nhỏ hơn 0,05, chứng tỏ có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tần suất xuất hiện của miRNA-141 giữa nhóm có biểu hiện gen RPMS1 và nhóm không biểu hiện gen RPMS1 Điều này cho thấy sự biểu hiện của miRNA-141 có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện của gen RPMS1.

4.1 Kết quả khảo sát in silico

Kết quả khảo sát in silico cho thấy có căn cứ vững chắc để nghiên cứu biểu hiện của miRNA-141 trong phát hiện sớm ung thư vòm họng bằng phương pháp Realtime PCR Kết quả phân tích tổng hợp cho thấy miRNA-141 biểu hiện cao ở bệnh phẩm (chiếm 61,94%) so với mẫu lành (chiếm 32,26%), làm tăng nguy cơ ung thư vòm họng (OR = 3,51; RR = 1,93) theo mô hình phân tích ngẫu nhiên.

= 1,404 – 2,658 mô hình phân tích ngẫu nhiên)

Thu nhận mẫu: các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu nhận từ các bệnh nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng, Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mẫu gồm 20 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE) Đồng thời, 20 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả nhuộm HE

Trên tổng số 20 mẫu bệnh và 20 mẫu lành, tần số biểu hiện của miRNA-141 là 55% ở mẫu bệnh và ở mẫu lành là 10% Phân tích bằng giá trị 2 -ΔΔCt cho thấy, mức biểu hiện của miRNA-141 tăng gấp 10,38 lần khi so sánh với mẫu lành (2 -ΔΔCt = 9,38)

Qua quá trình nghiên cứu, một số kiến nghị như sau được đưa ra để hoàn thành công trình nghiên cứu tốt hơn:

 Mở rộng cỡ mẫu thí nghiệm dựa trên quy trình thực nghiệm và các cặp mồi thừa kế đã được tối ưu hóa Kiểm tra trên nhiều loại mẫu khác nhau để hoàn thiện quy trình phân tích sự biểu hiện của miRNA-141

 Khảo sát các yếu tố về lâm sàng (bao gồm: độ tuổi, giai đoạn bệnh,…) nhằm phân tích mối quan hệ giữa miR-141 với các yếu tố