Tìm hiểu biến đổi gen RPMS1 trong ung thư vòm họng: Nghiên cứu bằng microrna 141
MỤC LỤC
HỌNG TẠI VIỆT NAM
Các phần mềm và trang web được sử dụng
Phần mềm trực tuyến BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trên trang web NCBI: các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI. IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer). Phần mềm Annhyb phiên bản 4.946: là phần mềm dùng để thực hiện các thao tác xử lí trên các trình tự nucleotide, bao gồm các tính năng như đọc trình tự, chú thích trình tự, tìm kiếm, sắp xếp trình tự oligonucleotide,….
Mẫu thí nghiệm
Dịch vụ Genbank: tìm kiếm các thông tin như trình tự nucleotide và protein, taxonomy, genome, mapping, cấu trúc protein, thông tin vùng domain và bài báo đã công bố trên Pubmed. MEGA (phiên bản 6.0 Kumar, 1993): phần mềm miễn phí dùng để xây dựng cây phát sinh loài theo các phương pháp Maximum Parsimony, Maximum Likelihood, Neighbor-Joining. Tất cả các mẫu nghiên cứu (bao gồm các mẫu sinh thiết UTVH và mẫu dịch phết lành tính) đều kế thừa bộ mẫu nghiên cứu được sự đồng ý cho phép từ Hội Đồng Y Đức Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh: 516/BVCR-HDDD, và sự đồng ý của bệnh nhân tham gia nghiên cứu.
Dụng cụ - thiết bị - hóa chất
26 mẫu gồm 20 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE). Trong trường hợp kết quả nhuộm HE cho kết quả nghi ngờ sẽ được đề nghị thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch để phát hiện kháng nguyên Ki67 trong nhân tế bào. Bộ mẫu này được bảo quản trong dung dịch PBS, ở nhiệt độ thấp và chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành các phương pháp thực nghiệm sau này.
Tiêu chuẩn chọn lọc, loại bỏ công bố khoa học phục vụ cho khảo sát in silico
Tiến hành tính tần số trung bình có trọng số nhằm loại bỏ các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả thống kê. Tiến hành thống kê phân loại tần số xuất hiện các biến thể theo phương pháp, loại mẫu. Tính toán tần số trung bình có trọng số nhằm đưa ra phương pháp và loại mẫu thích hợp nhất.
Phương pháp đánh giá mồi
Sau khi thu nhận tần xuất của các biến thể trên gene RPMS1 (trình bày như bảng 2.1).
Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/ Chloroform Bước 1: Ly giải tế bào
Dùng kẹp vô trùng kẹp que tăm bông, giũ nhẹ để mẫu rớt ra khỏi que tăm hoặc vortex nhẹ.
Khuếch đại trình tự mong muốn và giải trình tự các mẫu đại diện
Xem xét băng kích thước sỏng rừ, kớch thước cú đỳng với kết quả đó khảo sỏt. Sau đú, sản phẩm khuếch đại được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa. Kết quả sau khi giải trình tự được tiến hành so sánh với ngân hàng dữ liệu GenBank.
Hiệu chỉnh trình tự
33 đồng về chiều dài, không có sự sai khác giữa các nucleotide với trình tự đang hiệu chỉnh thì trình tự này sẽ được chấp nhận là đã hiệu chỉnh xong. Trường hợp trình tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên Genbank của NCBI thì tiến hành xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này. Cũn nếu peak khụng rừ ràng khụng thể nhận ra là nucleotide nào thỡ phải giải quyết như sau: lên NCBI thu nhận các trình tự có độ tương đồng trên 90% so với trình tự đang hiệu chỉnh, sắp gióng cột với nhau và kiểm tra sự xuất hiện tại nucleotide này là nucleotide nào rồi xác định nucleotide cần thay thế ở vị trí.
Phân tích tần số phát hiện gene RPMS1 và biến thể trên gene RPMS1
Khi nháy chuột vào các vị trí biến thể xuất hiện, phần mềm sẽ hiển thị vị trí cụ thể của từng nucleotide trên trình tự. Tiến hành thu nhận vị trí của biến thể này trên trình tự EBV hoang dại, trình tự mạch mồi xuôi và ngược của kết quả giải trình tự. Bằng cách này, ta có thể dễ dàng nhận biết được vị trí của biến thể trên từng trình tự.
Kết quả khảo sát in silico tính đa hình gene RPMS1
Đồng thời, biến thể này cũng được khẳng định là dạng đặc thù liên quan đến sự phân bố địa lý (dịch tễ UTVH), tập trung chủ yếu tại khu vực miền Bắc Trung Quốc. Dựa trên bảng thống kê các phương pháp nghiên cứu tính đa hình trên hai gene mục tiêu cho thấy: Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng phương pháp Nested-PCR (chiếm 100%). Do đó, việc sử dụng mẫu lành (dịch phết) vẫn được xem như mẫu chứng cho các nghiên cứu ca – chứng trong nghiên cứu bệnh ung thư nói chung và UTVH nói riêng [11, 98-100].
Khảo sát ảnh hưởng của các biến thể trên gene RPMS1
Như vậy, Nested-PCR có tính nhạy cao (Sensitivity) so với phương pháp PCR thông thường và có thể khuếch đại trình tự gene mục tiêu trên một lượng mẫu rất ít. Liên kết disulfide đóng vai trò chính trong việc ổn định protein, quá trình gấp cuộn protein và do đó nó có vài trò quan trọng trong các nghiên cứu liên quan đến tính. RPMS1-A được dự đoán được khả năng mất liên kết disulfite, dẫn đến khó khăn trong việc xác định cấu trúc và chức năng protein RPMS1, do đó, biến thể RPMS1-A khác so với các biến thể còn lại.
Kết quả khảo sát mồi
Chú thích: L là giá trị chiều dài của mồi (bp); Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi (oC), Tm nằm trong khoảng 55-65oC; %GC là giá trị về phần trăm số lượng base G và C có trong mồi; (1) mức năng lượng liên kết tự do (∆G) cho khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc; (2) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc self-dimer; (3) là mức năng lượng liên kết tự do cho khả năng hình thành cấu trúc heterodimer; (4) Kích thước sản phẩm (bp). Kết quả phân tích tính đa hình gene RPMS1 được thực hiện dựa trên việc so sánh trình tự gene RPMS1 ở các mẫu thí nghiệm với trình tự gene RPMS1 (EBV hoang dại) thu nhận từ ngân hàng gene với mã số truy cập là NC_007605. Với mục đích tiến hành khảo sát sự phân bố dịch tễ chủng EBV thu nhận trong nghiên cứu này, trình tự các kiểu hình đại diện cho các biến thể được tiến hành phân tích quan hệ di truyền dựa trên việc xây dựng cây phả hệ phân tử.
KẾT LUẬN
Bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu, kết quả cho thấy tần số phát hiện các gene RPMS1 trong các mẫu sinh thiết khối u vòm họng là 100%; không có sự hiện diện của các gene này trên các mẫu lành. 58 Nhóm nghiên cứu đã ghi nhận, thừa kế và tiến hành đánh giá về thông số vật lí cũng như độ đặc hiệu của các cặp mồi được sử dụng trong các công trình nghiên cứu về tính đa hình của các gene mục tiêu, thu nhận các cặp mồi phù hợp sử dụng trong thực nghiệm phân tích trình tự gene RPMS1. Dựa trên kết quả phân tích phả hệ di truyền, EBV xâm nhiễm trên cộng đồng người Việt Nam có quan hệ/ nguồn gốc từ khu vực Châu Á như: Trung Quốc, Nhật Bản và HongKong.
ĐỀ NGHỊ
Xây dựng thành công quy trình PCR phát hiện các biến thể của gene RPMS1 trên bệnh nhân UTVH người Việt Nam. Trong đó, biến thể C155384T là hai biến thể mới trên gene RPMS1 được ghi nhận trên người bệnh UTVH Việt Nam.
VềM HỌNG TẠI VIỆT NAM
Khai thác cơ sở dữ liệu
(Nếu hỗn hợp dung dịch lớn hơn 700 μl, tiếp tục cho phần dung dịch còn lại vào Filter Cartridge, ly tâm khoảng 15 giây với 10.000 vòng/phút cho hỗn hợp qua màng lọc, sau đó đưa phần dung dịch qua màng lọc qua một eppendorf mới). Thêm 100 μl dung dịch Elution Solution hoặc nước nuclease-free (95oC) và bộ lọc và đóng nắp. Thu nhận cột lọc Filter Cartridge và lưu trữ ở -20oC hoặc thấp hơn. Chuyển đổi trình tự mRNA thành cDNA bằng bộ chuyển đổi Bước 1: Chuẩn bị Mastermix được ủ lạnh. Bước 2: Lắc đều dung dịch, sau đó ly tâm dung dịch trong 5 giây. Thành phần phản ứng phản ứng RT-PCR. 5x TransAmp Buffer 4 àl. 65 DNase/RNase free-water m àl. Bước 4: Trộn đều bằng pipet. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR. Bước 5: Chạy chu trình nhiệt. Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu cDNA. Nguyên tắc: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260 nm. ml DNA sợi đôi). Phân tích thống kê được tiến hành theo mô hình phân tích tổng ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta - analysis) cho một tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) nhằm đánh giá tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất biểu hiện của miRNA-141) và nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng.
Kết quả khai thác dữ liệu khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-
Tính tương quan giữa tính chất biểu hiện của miRNA-141 với ung thư vòm họng được tính toán thông qua giá trị tỷ suất chênh (Odd Ratios: OR) và nguy cơ mắc bệnh (Relative risk: RR). Điều đáng lưu ý là các công trình nghiên cứu về tính chất biểu hiện của miR- 141, cụ thể là các nghiên cứu dạng mẫu bệnh – ca chứng, vẫn còn khá hạn chế và chỉ tập trung ở chủng tộc Châu Á được thực hiện bởi nhà khoa học, nhà nghiên cứu ở Trung Quốc. Do đó, kết quả nghiên cứu này sẽ là nghiên cứu đầu tiên, cụ thể nghiên cứu trên ca bệnh – chứng và là cơ sở khoa học – đề tài đầu tiên cho những nghiên cứu mở rộng và sâu hơn sau này.
PANTHER DAVID
Kết hợp tính chất biểu hiện của miR-141 và gene RPMS1
Giá trị p-value giữa các nhóm được tính bằng phương pháp chi bình phương (Chi-square tests). Điều này cho thấy rằng có sự khác biệt có ý nghĩa về tần số xuất hiện của miRNA-141 ở nhóm xuất hiện gene RPMS1 và nhóm không xuất hiện. Hay nói cách khác, điều này chứng tỏ sự biểu hiện của miRNA-141 có mối liên hệ chặt chẽ với sự xuất hiện gene RPMS1.