Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật hóa học: Tổng hợp nano canxi hydroxyapatite từ phế phẩm xương cá chẽm biến tính ZnO và đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu

TỔNG QUAN

Cấu tạo hóa học và cấu trúc tinh thể

Trong tự nhiên, apatite là tên chung của một nhóm khoáng chất, có công thức tổng quát Ca5X(PO4)3 Trong đó X có thể là một trong số các gốc OH  , Cl  , F  hoặc

Br  Canxi hydroxyapatite là một dạng apatite chứa nhóm OH  có công thức

Ca5(PO4)3OH [3] Còn khi thể hiện HA ở dạng tinh thể công thức HA thường được viết là Ca10(PO4)6(OH)2, do HA tồn tại với hai phân tử liên kết với nhau Công thức cấu tạo của HA được thể hiện ở hình 1.1

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của phân tử HA Phân tử HA có cấu trúc mạch thẳng, gồm ba vòng canxi photphat Ca3(PO4)2 liên kết với nhau bằng cầu nối canxi, hai nhóm OH nằm ở hai đầu mạch và liên kết trực tiếp với nguyên tử P

HA thường được tìm thấy ở hai dạng tinh thể, là dạng lục phương (hexagonal) và dạng đơn tà (monoclinic) [4] HA dạng đơn tà chủ yếu được sinh ra khi nung dạng lục phương ở 850 o C trong không khí sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng Còn dạng lục phương thường được tạo thành trong quá trình điều chế ở nhiệt độ từ 25 o C đến

100 o C Giản đồ nhiễu xạ tia X của hai dạng này giống nhau hoàn toàn về số lượng và vị trí của các vạch nhiễu xạ (hình 1.2), chúng chỉ khác nhau về cường độ của đỉnh đặc trưng, dạng đơn tà cho các đỉnh có cường độ yếu hơn dạng lục phương khoảng 1% [5]

5 Hình 2.2: Kết quả XRD của hai dạng tinh thể lục phương (a) và đơn tà (b) Trong thực tế, dạng lục phương xuất hiện nhiều hơn, đây cũng là cấu trúc thường gặp trong xương và răng của người Cấu trúc ô mạng tinh thể lục phương bao gồm các ion Ca 2+ ,PO4 3, và OH  được sắp xếp trong các ô đơn vị như hình 1.3

Hình 2.3: Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể lục phương

Hình 1.3 cho thấy, có 6 ion Ca 2+ của HA nằm trọn vẹn trong một ô mạng đơn vị trong tổng số 14 ion Ca 2+ , còn lại 8 ion nằm trên hai mặt đáy và được dùng chung với các ô đơn vị kế bên Trong 10 nhóm PO4 3, có hai nhóm nằm trong ô đơn vị và 8 nhóm nằm trên hai mặt đáy nhưng chỉ có sáu nhóm thuộc về ô đơn vị, 6 nhóm này

6 gồm 2 nhóm ở bên trong ô đơn vị và tám nhóm chia đều nằm trên 2 mặt đáy Tương tự chỉ có 2 trong số tám nhóm OH- trong hình là thuộc về ô đơn vị Trong ô đơn vị, số lượng các ion có thể không đúng với công thức phân tử của HA Điều này được giải thích do có sự lặp lại của các ô đơn vị trong hệ đối xứng ba chiều Như vậy cách giải thích trên cho thấy, trong một phân tử HA bao gồm 10 ion Ca 2+ , 6 nhóm PO4 3 và hai nhóm OH - , một lần nữa khẳng định công thức hóa học lý tưởng của HA là

Ca10(PO4)6(OH)2 Cấu trúc mạng tinh thể lục phương của HA có các thông số mạng như sau: a = b = 0,9423 nm, c = 0,6875 nm, α = β = 90 o , γ = 120 o

Tính chất vật lý

HA thường có màu trắng hoặc trắng ngà, ngoài ra khi hình thành ngoài tự nhiên,

HA cũng có thể có các màu khác như xanh, vàng, nâu… Tùy thuộc vào điều kiện hình thành và phương pháp tổng hợp, điều kiện tổng hợp mà tinh thể HA tồn tại ở dạng hình cầu, hình kim hoặc hình trụ Sau khi đã xác định được trạng thái pha của

HA bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, có thể sử dụng các phương pháp phân tích như kính hiển vi điện tử quét (SEM) hoặc kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để nhận biết các hình dạng tồn tại của tinh thể HA minh họa ở hình 1.4 HA có một số tính chất vật lý đặc trưng như được trình bày ở bảng 1.1

Hình 2.4: Các dạng tồn tại của HA

7 Bảng 2.1: Tính chất vật lý của HA

STT Tính chất vật lý Giá trị

1 Khối lượng phân tử 1004,62 g/mol

6 Độ cứng theo thang Mod 5

7 Tính bền nhiệt Bền với nhiệt độ < 850 o C

Tính chất hóa học

Do trong phân tử chứa nhóm OH  nên HA có thể phản ứng với axit tạo thành các muối của canxi và nước:

Ca PO OH  2HCl3Ca PO  CaCl  2H O

HA tương đối bền nhiệt, bị phân hủy chậm trong khoảng nhiệt độ từ 800 o C đến

1200 o C tạo thành oxy-hydroxyapatite theo phản ứng:

Ca PO OH Ca PO OH O  xH O (0 ≤ x ≤ 1) Ở nhiệt độ lớn hơn 1200 o C, HA bị phân hủy thành β–Ca3(PO4)2 (β–TCP) và

Ca PO OH  2 – Ca PO  Ca P O  2H O

Tính chất sinh học

8 Thành phần hóa học của xương người bao gồm: 10% nước, 20% chất hữu cơ và khoảng 70% là hợp chất vô cơ, cụ thể là khoáng apatite Trong đó tỉ lệ nguyên tố Ca/P trong thành phần khoáng vô cơ này gần giống với tỉ lệ Ca/P trong HA Do có cùng bản chất và thành phần hóa học với xương, nên HA tự nhiên hay nhân tạo đều là những vật liệu có tính tương thích sinh học cao

Khi ở dạng màng và xốp HA có đặc tính giống như xương tự nhiên, các lỗ xốp liên thông với nhau làm cho các mô sợi, mạch máu dễ dàng xâm nhập, neo đậu và cố định Ngoài ra, HA còn được chứng minh là có thể thúc đẩy sự phát triển của xương mới thông qua cơ chế dẫn xương mà không gây ra độc tính cục bộ hoặc toàn thân [6] Khi cấy ghép vật liệu gốm chứa HA vào cơ thể, một lớp mô mới được hình thành trên bề mặt của nó và góp phần vào sự liên kết của các mô cấy vào xương, dẫn đến sự định hình vượt trội của mô cấy đến các mô xung quanh [7, 8] Hơn nữa, một số nghiên cứu còn cho thấy HA có thể được khai thác như một hợp chất mô hình để nghiên cứu quá trình khoáng hóa sinh học trong cơ thể [9] Ở dạng bột mịn kích thước nano, HA là dạng canxi photphat dễ dàng được cơ thể hấp thụ nhất với tỉ lệ mol Ca/P là 1,67 tương đồng với thành phần vô cơ trong xương và răng Hợp chất HA có đặc điểm tương đối bền với dịch men tiêu hóa, khi ở kích thước nano có thể được cơ thể hấp thu rất nhanh qua niêm mạc lưỡi và thực quản Do đó còn được sử dụng như một hợp chất bổ sung canxi cho cơ thể.

Ứng dụng phổ biến của vật liệu HA

2.1.5.1 Ứng dụng làm vật liệu y sinh

Do tính chất của HA tương tự với xương và răng của người, nên HA được coi là một loại vật liệu thích hợp để khắc phục, sửa chữa các khiếm khuyết của mô cứng trong cơ thể từ 40 năm trước (Hench, 1991) Trong thực hành lâm sàng, gốm sứ sinh học HA thường được ứng dụng để chế tạo các chi tiết lấp đầy khiếm khuyết: trám răng, cấy ghép các xương nhỏ, không phải chịu tải (xương tai giữa) hoặc làm lớp phủ sinh học trên vật liệu cấy ghép kim loại để cấy ghép phục hình các khớp, xương có chức năng chịu lực lớn Thực tế cho thấy vật liệu HA có khả năng thích nghi tốt với

9 môi trường dịch tế bào, thúc đẩy hình thành xương mới, tạo liên kết với các mô xương bị tổn thương

Ngoài ra, HA còn có khả năng lưu trữ điện tích trên bề mặt có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng của nguyên bào sợi, đẩy nhanh quá trình hình thành của lớp biểu bì và sự di chuyển của tế bào sừng vào lớp biểu bì nên được nghiên cứu để điều trị các tổn thương trên bề mặt da

2.1.5.2 Ứng dụng làm chất dẫn truyền thuốc

Ngoài khả năng tương thích sinh học, không độc với dịch tế bào, độ ổn định khi lưu trữ cao, HA còn có tính chất đặc biệt là thay đổi tính tan theo pH nên đây là lựa chọn khả quan cho việc ứng dụng làm chất dẫn truyền thuốc Khi pH giảm từ pH kiềm xuống axit, tốc độ phân hủy của HA tăng lên rõ rệt, lúc này tốc độ giải phóng các phân tử thuốc khỏi bề mặt HA cũng tăng lên Theo nghiên cứu y sinh cho thấy, pH trong các tế bào bình thường xấp xỉ 7,4, tuy nhiên lân cận các khối u sẽ có pH thấp hơn (pH ≈ 5) chính là pH kích thích HA phân hủy

Qua quá trình nghiên cứu, đã có nhiều phương pháp để khống chế, điều chỉnh kích thước, hình thái, cấu trúc xốp của vật liệu HA, đây cũng là lợi thế để các nhà khoa học nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của HA trong việc dẫn truyền thuốc 2.1.5.3 Ứng dụng trong thực phẩm bổ sung chất dinh dưỡng

Cơ thể cần được bổ sung canxi liên tục và đầy đủ để phát triển xương, khớp và điều hòa quá trình nội tiết Canxi có trong thức ăn thường nằm ở dạng hợp chất hòa tan nên khả năng hấp thụ của cơ thể không cao và thường phải dùng kết hợp với vitamin D nhằm tăng cường việc hấp thụ và chuyển hóa canxi thành HA để phát triển xương HA ở dạng bột mịn, kích thước nano được cơ thể người hấp thụ nhanh qua niêm mạc lưỡi và thực quản, do vậy nó ít chịu ảnh hưởng của dung dịch axit có trong dạ dày Vì những đặc tính này, HA kích thước nano được dùng làm thuốc bổ sung canxi với hiệu quả cao

2.1.5.4 Ứng dụng trong kỹ thuật y sinh

Trong hai thập kỷ gần đây, kỹ thuật xét nghiệm bệnh phẩm ngày càng đóng vai trò quan trọng, bổ trợ hiệu quả cho quá trình đánh giá và điều trị của bác sĩ Và ngày nay, HA cũng được ứng dụng trong lĩnh vực này

HA được sử dụng như một chất hấp thụ và làm sạch trong sắc ký, để phân tách riêng biệt protein, axit nucleic và kháng thể do có khả năng hấp thụ cao, tính chọn lọc cao, ổn định trong môi trường phân tách, gần như trơ và không có tác dụng phụ với các thành phần của bệnh phẩm Thêm nữa khi sử dụng vật liệu này có thể tái tạo và sử dụng được trong thời gian dài.

Các phương pháp tổng hợp HA

Hiện nay, việc nghiên cứu để tổng hợp vật liệu HA đã có những thành tựu đáng kể, đi từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau: tổng hợp hóa học từ các hóa chất đơn lẻ, tổng hợp sinh học từ các nguyên liệu như vỏ sò, xương bò, xương cá bằng nhiều phương pháp khác nhau Dưới đây là một số phương pháp phổ biến thường được ứng dụng trong thực tế

Phương pháp cơ học [10] thường được sử dụng để điều chế chất rắn đa tinh thể,

HA được sinh ra bằng phản ứng giữa hai pha rắn, phản ứng được thể hiện ở một trong các phản ứng dưới đây:

4CaCO3 + 6CaHPO4.2H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 + 4H2CO3

2Ca3(PO4)3 + Ca4P2O9 + H2O → Ca10(PO4)6(OH)2

3Ca3(PO4)3 + CaO + H2O → Ca10(PO4)6(OH)2

2Ca3(PO4)3 + Ca(OH)2 → Ca10(PO4)6(OH)2

Phương pháp này xảy ra trong một hệ thống gồm có nhiều bi nghiền và má nghiền, đòi hỏi có lực ma sát lớn lên cấu tử của hai pha rắn Lực này phải đủ mạnh để tạo ra sự khuếch tán nội, dẫn đến xảy ra phản ứng giữa hai pha rắn để tạo ra pha thứ ba Phương pháp này dễ thực hiện, dễ điều khiển quá trình Nhược điểm là cần có thời gian phản ứng dài, sản phẩm dễ lẫn tạp chất là sản phẩm trung gian, sản phẩm phụ hoặc mảnh vụn sinh ra do sự mài mòn của hệ thống máy nghiền [11]

2.1.6.2 Phương pháp kết tủa hóa học

Phương pháp kết tủa hóa học thường được sử dụng trong công nghiệp do cách thực thực hiện khá đơn giản và có thể điều chỉnh được kích thước hạt HA theo mong muốn [12, 13] Phương pháp này thường đi từ các nguyên liệu là hóa chất có sẵn,

11 hoặc dạng dễ tan, dễ tạo huyền phù trong nước

Quá trình phản ứng sẽ trải qua hai giai đoạn, giai đoạn hòa tan và phân li của chất phản ứng, giai đoạn kết hợp của các ion để tạo thành HA có kích thước nano Hai giai đoạn này xảy ra rất nhanh và gần như đồng thời, nên thời gian phản ứng được rút ngắn Ngoài ra, thông qua các thông số nhiệt độ, thời gian, pH, dung môi,… để kiểm soát sự lớn lên của tinh thể sản phẩm nhằm điều chỉnh kích thước của hạt sản phẩm mong muốn

Nhược điểm của phương pháp này là sản phẩm có thể lẫn một số chất không mong muốn như Ca3(PO4)2, CaHPO4,…

Hệ phân tán là môi trường liên tục, trong đó các tiểu phân (các hạt) có kích thước nhỏ được phân tán đồng đều trong môi trường đó Tập hợp các tiểu phân này gọi là pha phân tán, môi trường chứa pha phân tán gọi là môi trường phân tán Khi môi trường phân tán là lỏng và pha phân tán là rắn thì tùy kích thước hạt mà ta thu được hệ huyền phù hoặc hệ keo

Sol là dạng huyền phù chứa các tiểu phân có đường kính khoảng 1 – 100 nm phân tán trong môi trường lỏng, trong đó chuyển động Brown giúp các hạt lơ lửng Gel là trạng thái mà chất lỏng và rắn phân tán vào nhau trong đó vẫn còn giữ dung môi trong hệ chất rắn dưới dạng keo hoặc plymer Có thể chuyển Sol thành Gel bằng cách tách dung môi Khi dung môi bị tách ra, các hạt keo hoặc chất cao phân tử xích lại gần nhau hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng liên kết lại với nhau, lúc này độ nhớt của dung dịch tăng nhanh và toàn khối dung dịch sẽ chuyển thành gel Một cách khác để tạo gel đó là khuấy mạnh dung dịch Khi thời gian và cường độ khuấy đủ lớn sẽ làm tăng tần số va chạm giữa các hạt và tạo điều kiện cho chúng liên kết với nhau Để tăng hiệu suất, thường sẽ kết hợp hai phương pháp nêu trên HA tổng hợp theo phương pháp sol-gel thường đi từ nguyên liệu là Ca(NO3)2, (NH4)2HPO4 và các chất tạo gel như (C2H5O)3P(O), CH3O(CH2)2(OH) theo một tỉ lệ nhất định được khuấy đều trong nước ở nhiệt độ khoảng 6070 o C, trong thời gian 34 giờ, sẽ tạo thành gel Sấy gel ở nhiệt độ 120 o C trong thời gian 24 giờ và nung ở nhiệt độ khoảng 800 o C sẽ thu được HA có kích thước nano [14]

12 Phương pháp sol-gel có thể cho sản phẩm có độ đồng nhất cao, dễ dàng chế tạo vật liệu ở dạng màng mỏng, sợi hoặc hạt có chất lượng tốt

Phương pháp thủy nhiệt [15] chủ yếu để tổng hợp HA dạng xốp và gốm xốp, thường đi từ sản phẩm có tính chất sinh học như xương bò, xương cá, vỏ sò, vỏ trứng… Sản phẩm HA thu được theo phương pháp này thường vẫn giữ nguyên hình thái và cấu trúc xốp như ban đầu Với thành phần và cấu trúc xốp sinh học này, vật liệu sẽ có khả năng tương thích sinh học với cơ thể người cao hơn so với HA gốm xốp tổng hợp bằng các phương pháp khác

Trong các vật liệu sinh học phổ biến như vỏ sò, xương cá, thường chứa một lượng lớn CaCO3 cao hơn trong xương người, do đó tỉ lệ Ca/P cũng cao hơn Phản ứng thủy nhiệt được sử dụng để biến đổi lượng CaCO3 này thành HA trong dung dịch có chứa gốc PO4 3- ở điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao [16]

10CaCO3 + 6(NH4)2HPO4 + 2H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 + 6(NH4)2CO3 + 4H2CO3

Phương pháp này cho sản phẩm có độ tinh khiết cao, sản phẩm thu được là sản phẩm đơn pha, nhưng thiết bị và điều kiện thực hiện có phần phức tạp hơn các phương pháp khác

GIỚI THIỆU VỀ KẼM OXIT

Kẽm oxit là hợp chất của kẽm và oxy Về tính chất vật lý: tinh thể ZnO có khối lượng riêng p ~ 5,606 g/cm 3 , nhiệt độ nóng chảy cao (~1975 o C) và sôi ở nhiệt độ khoảng 2360 o C, gần như không tan trong nước (0,16 mg/100 mL tại 30 °C), không mùi Ở điều kiện thường có dạng bột màu trắng, khi nung trên 300°C, sẽ chuyển sang màu vàng và quay trở lại màu trắng khi làm lạnh về nhiệt độ thường

Tinh thể ZnO tồn tại dưới 03 dạng chủ yếu: wurtzite lục giác, zincblende khối, và các rocksalt khối hiếm gặp Trong đó cấu trúc wurtzite lục giác được cho là ổn định nhất ở điều kiện thường nên cũng là dạng tồn tại phổ biến nhất Cấu trúc wurtzite lục giác của ZnO dựa trên liên kết đồng hóa trị của một nguyên tử với bốn nguyên tử lân cận Hằng số mạng a, c dao động trong khoảng khoảng 0,32495–0,32860 nm và 0,52069–0,5214 nm

13 Hình 2.5: Cấu trúc tinh thể của kẽm oxit

Trong các lĩnh vực công nghiệp cũng như trong đời sống, oxit kẽm có rất nhiều ứng dụng Trong ngành công nghiệp sản xuất cao su, oxit kẽm cùng với axit stearic được sử dụng trong lưu hóa cao su và được dùng để làm phụ gia bảo vệ cao su khỏi nấm và ánh sáng UV Trong ngành công nghiệp bê tông, oxit kẽm được bổ sung vào sản phẩm để cải thiện thời gian xử lý và tăng sức đề kháng của bê tông chống lại nước hay được sử dụng để làm lớp phủ chống ăn mòn kim loại Ngoài ra, oxit kẽm còn được thêm vào làm phụ gia kháng khuẩn trong công nghiệp sản xuất vải sợi, túi ni lông, hộp giấy tiện lợi, đầu lọc thuốc lá…

Trong lĩnh vực y tế, kẽm oxit được dùng để sản xuất calamin (dùng để dưỡng da và điều trị trong nha khoa) Ngoài ra, kẽm oxit còn được dùng để sản xuất thuốc mỡ khử trùng, kem bôi, kem chống nắng với ưu điểm nổi bật là không gây hại da, không gây mụn Không những vậy, kẽm oxit còn được dùng trong phấn trẻ em để chống ban khi trẻ em mang tã, dùng trong dầu gội trị gàu, trị nấm da đầu,…

Trong lĩnh vực thực phẩm, oxit kẽm được thêm vào rất nhiều sản phẩm, bao gồm cả ngũ cốc ăn sáng, nó được coi như là một nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể.

Tính chất sinh học và khả năng kháng khuẩn của ZnO

Trong nhóm nguyên tố vi lượng cần cho cơ thể, kẽm là nguyên tố thứ hai, chỉ đứng sau sắt, và 85% kẽm trong cơ thể tập trung ở xương và cơ Theo các chuyên gia dinh dưỡng, đối với cơ thể người trưởng thành cần bổ sung khoảng 15 mg kẽm/ngày

14 để hoạt động bình thường Nếu chế độ ăn uống không đáp ứng được nhu cầu, có thể dẫn đến nhiều vấn đề về sức khỏe, bao gồm phản ứng miễn dịch thay đổi, vết thương chậm lành, thay đổi biểu bì da và rối loạn cảm xúc Lý do là bởi vì kẽm đóng một vai trò quan trọng trong việc phục hồi và kích thích giám sát miễn dịch Những điều này cho thấy kẽm là nguyên tố “thân thiện” với cơ thể người

Qua một số nghiên cứu, cho thấy kẽm oxit có khả năng kháng khuẩn thông qua bốn cơ chế như sau:

Cơ chế 1: Hấp thụ tĩnh điện lên bề mặt vi khuẩn làm vi khuẩn mất cân bằng điện ZnO có thể hấp thụ lên màng tế bào của vi khuẩn nhờ lực hút tĩnh điện giữa ZnO (điện tích dương) và màng tế bào vi khuẩn (điện tích âm) Khi ZnO hấp thụ lên màng tế bào của vi khuẩn sẽ làm thay đổi điện tích dẫn đến thay đổi cấu trúc và hình dạng của tế bào vi khuẩn, giúp tiêu diệt vi khuẩn [17, 18]

Cơ chế 2: Xâm nhập vào tế bào vi khuẩn gây rối loạn hoặc ức chế quá trình trao đổi chất Hạt ZnO ở kích thước nano có diện tích bề mặt riêng và năng lượng bề mặt lớn, nên dễ dàng hấp thụ lên vi khuẩn và sau khi hấp thụ lên màng tế bào, chúng sẽ tấn công vào bên trong tế bào vi khuẩn, gây rối loạn và ức chế quá trình trao đổi chất của tế bào vi khuẩn với môi trường, giúp ngăn cản quá trình phát triển của tế bào vi khuẩn [18]

Cơ chế 3: Tạo ion Zn 2+ đi vào tế bào chất của vi khuẩn và phá hủy các nhóm chức năng: amino -NH2, hydroxy –OH Một lượng nhỏ ZnO hòa tan và phân li sẽ tạo ra ion Zn 2+ , Zn 2+ dễ dàng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn bằng hình thức trao đổi ion, sau khi vào tế bào chất sẽ xen giữa các cấu trúc axit amin, axit nucleic làm rối loạn hoạt động tế bào của vi khuẩn làm vi khuẩn giảm sức sống và chết dần [18]

Cơ chế 4: Tạo ra những phân tử ROS (Reactive Oxygen Spcecies) chứa nguyên tố oxi (OH, O2…) có hoạt tính mạnh [18] Một vài ROS điển hình minh họa ở hình 1.6

Do có tồn tại electron chưa bão hòa nên ROS có hoạt tính hóa học mạnh, thời gian tồn tại ngắn, sau khi sinh ra sẽ nhanh chóng phản ứng với các chất khác để lập nên trạng thái bền hơn, nên ROS dễ dàng phản ứng với hợp chất hữu cơ: AND, ARN, axit amin của vi khuẩn dẫn đến phá hủy màng sinh chất, và vật chất di truyền của vi

15 khuẩn Mặt khác các phản ứng oxi hóa khử này có tính dây chuyển, sản phẩm của phản ứng trước là chất tham gia của phản ứng sau, làm cấu trúc và chức năng tế bào vi khuẩn nhanh chóng bị phá hủy Đây được xem là cơ chế chính của quá trình kháng khuẩn mà ZnO sinh ra (cơ chế được minh họa hình 1.7) Ngoài ra, ROS còn được cơ thể sản sinh ra dưới các tác động xấu của môi trường như tia cực tím, khói thuốc, căng thẳng và sẽ tấn công cả tế bào của cơ thể Do đó việc bổ sung lượng ZnO vào cơ thể cần có sự xem xét và cân nhắc của bác sĩ chuyên môn

Hình 2.6: Những cấu trúc ROS điển hình

Hình 2.7: Mô phỏng cơ chế kháng khuẩn của ZnO

Về cơ chế hình thành ROS: trong tế bào sinh vật, có một đơn vị chức năng gọi là ti thể: là nơi diễn ra các phản ứng oxi hóa khử dạng chuỗi để sinh ra năng lượng giúp tế bào thực hiện chức năng Trong ti thể tồn tại một lượng lớn các phân tử ROS

16 Kẽm oxit sẽ can thiệp vào hoạt động của ti thể, làm rò rỉ một phần hoặc toàn bộ các ROS ra tế bào chất và phá hủy các thành phần cấu trúc của tế bào bằng phản ứng oxi hóa khử

Giới thiệu về ZnO@HA

Việc kết hợp ZnO và HA là một trong những giải pháp để tăng tính kháng khuẩn và độ bền cơ học cho vật liệu HA khi ứng dụng trong lĩnh vực y sinh Sự có mặt của ZnO trong vật liệu cấy ghép sẽ thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào mới, giúp cho quá trình khôi phục và hoàn thiện cấu trúc diễn ra nhanh hơn Thêm vào đó, sự kết hợp ZnO và HA sẽ làm thay đổi một số thông số cấu trúc của vật liệu, như: tham số mạng, tính chất vật lý và sinh học Vật liệu ZnO@HA sẽ có tính chất cơ học vượt trội hơn HA, tăng cường được các phản ứng sinh học để kháng khuẩn và chống nấm Mặt khác, ZnO cũng sẽ góp phần kiểm soát tốc độ phân hủy sinh học của HA Một số nghiên cứu về quá trình khoáng hóa khi cấy ghép vật liệu ZnO@HA đã được báo cáo và chứng minh là có khả năng thúc đẩy sự hình thành mô liên kết xung quanh các mô cấy và làm giảm các phản ứng viêm [19] Đồng thời khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của ZnO@HA đã được nghiên cứu và cho kết quả là cải thiện được hiệu suất chống lại vi khuẩn khoang miệng.

Khả năng kháng khuẩn của ZnO@HA

Vi khuẩn là sinh vật đơn bào, có cấu trúc đơn giản, có khả năng thích nghi với nhiều kiểu môi trường khác nhau Những sinh vật này có ảnh hưởng rất lớn đến môi trường sống và sức khỏe của con người

Tế bào vi khuẩn khác với tế bào thực vật và động vật Vi khuẩn là đơn vật nhân sơ, cấu tử di truyền tồn tại ngay trong tế bào chất chứ không có cấu trúc màng bao quanh Một tế bào vi khuẩn bao gồm: thành tế bào, vỏ nhầy, màng tế bào, tế bào chất, ribosome, thế nhân, tiêu mao và nhung mao Trong đó thành tế bào (được cấu tạo bởi lớp peptidoglycan) có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn

Khi kết hợp ZnO vào HA, các hạt nano ZnO có kích thước nhỏ có thể đi qua

17 thành tế bào hoặc phá vỡ thành tế bào bằng cách phá vỡ lớp protein màng và lipit, do đó làm hỏng tế bào vi khuẩn [20] Đồng thời sự giải phóng ion Zn 2+ gây ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn Năm 2017, Ananth A và Dharaneedharan [21] đã chứng minh sự giải phóng Zn 2+ là một trong những cơ chế chính của ZnO trong thí nghiệm kháng vi khuẩn E.coli, S.iniae, S.parauberis và E.tarda

Hình 2.8: Cơ chế kháng khuẩn của ZnO@HA Hơn nữa, khi kết hợp ZnO vào HA, nhờ sự tương thích sinh học tốt của HA sẽ giúp cho các tinh thể ZnO tồn tại tốt hơn trong môi trường dịch bào, qua đó tăng cường khả năng tạo ra ROS, giúp cho hoạt tính kháng khuẩn của ZnO@HA cao hơn [20].

Một số phương pháp tổng hợp ZnO@HA

Phướng pháp tẩm: Tẩm là phương pháp ngâm trực tiếp vật liệu nền làm chất mang vào dung dịch của hợp chất cần tẩm, các nguyên tử/phân tử sẽ phân bố ngẫu nhiên trên bề mặt và bên trong khối vật liệu [22] Phương pháp này có đặc điểm là đơn giản, dễ thực hiện, nhưng khó kiểm soát sự phát triển của kích thước hạt nên sản phẩm thu được không đồng nhất

Phương pháp sol-gel: đây là phương pháp được sử dụng để tạo ra các sản phẩm có kích thước nano có độ đồng nhất tương đối cao, nhưng quy trình thực hiện tương đối phức tạp cần theo dõi và điều chỉnh liên tục [23]

18 Phương pháp vi sóng: Phương pháp này sử dụng năng lượng của vi sóng để gia tăng quá trình chuyển động, va chạm và xen lẫn vào nhau của các hạt vật chất Phương pháp này cho hiệu suất cao, sản phẩm thu được đồng đều nổi trội hơn so với các phương pháp khác Trong khuôn khổ luận văn này, để tổng hợp vật liệu HA biến tính ZnO có kích thước đồng đều cũng như tiết kiệm chi phí năng lượng cho quá trình tổng hợp, phương pháp tổng hợp có sự hỗ trợ vi sóng sẽ được áp dụng ỨNG DỤNG VI SÓNG TRONG CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Vi sóng (tên gọi khác là sóng vi ba) là một dạng bức xạ điện từ có bước sóng từ khoảng 1 m đến 1 mm với tần số giao động từ 300 MHz đến 300 GHz Dải sóng này lần đầu được phát minh bởi hai nhà khoa học Randall và Boot vào năm 1940 với mục đích ứng dụng trong kỹ thuật rada [24] Từ đó đến nay kỹ thuật vi sóng đã phát triển mạnh mẽ về cả mặt thiết bị tạo vi sóng và ứng dụng của nó, nhiều kiểu thiết bị vi sóng ra đời phục vụ cho các mục đích khác nhau: sấy và tiệt trùng thực phẩm, dược phẩm; tổng hợp vật liệu nano, tổng hợp hữu cơ, hỗ trợ trong công nghệ thiêu kết vật liệu…[25]

Hình 2.9: Cấu tạo bóng đèn cao tần ((Magnetron)

Vi sóng được sinh ra từ bóng đèn cao tần (Magnetron) có cấu tạo như hình ở trên Một bóng đèn cao tần gồm có catot và anot được đặt trong môi trường chân không và từ trường, trong đó anot có cấu tạo đặc biệt bao gồm các mặt cong như các mặt trong của hình trụ Khi áp một điện áp cao áp lên đến 5000 V giữa anot và catot, phần lõi catot sẽ rất nhanh chóng nóng lên, nhiệt độ cao làm các eletron bứt ra va đập

19 vào thành anot Các tương tác của electron với bề mặt anot trong từ trường sẽ tạo ra các dao động có tần số cao lên đến 2,5 GHz được dẫn truyền và phát vào khoang phản ứng tại bộ phận microwave radiation

Tính chất quan trọng giúp vi sóng được ứng dụng rộng rãi đó là tần số dao động của vi sóng vừa phải, không quá lớn để phá hủy các liên kết hóa học, nhưng đủ để gây ra chuyển động lớn cho cấu tử phân cực có trong môi trường vi sóng và làm vật chất đó nóng lên Xét hệ vật chất có cẩu tử phân cực (ví dụ là H2O) khi ở trong môi trường vi sóng, sẽ có hiện tượng xảy ra như hình 1.10

Khi sóng điện từ đổi pha, phân tử nước sẽ quay, sao cho nguyên tử hydro hướng theo chiều của điện trường Trong một giây, sóng điện từ đổi pha lên đến gần 2,5 tỉ lần nên phân tử nước cũng sẽ dao động số lần tương đương Việc dao động nhanh và liên tục làm chúng cọ xát, va đập vào nhau tạo ra nhiệt để làm nóng cả khối vật chất

Hình 2.10: Sơ đồ dao động của phân tử H2O trong môi trường vi sóng

Hiện nay, với nhu cầu tăng tốc độ phản ứng và giảm thời gian phản ứng trong công nghiệp hóa học, cùng với xúc tác, vi sóng trở thành hướng nghiên cứu khả quan, và đã có nhiều thành tựu trong thực tế [26] Vi sóng có khả năng đẩy nhanh tốc độ

20 phản ứng, tăng năng suất của quá trình, giảm sản phẩm phụ và tăng độ tinh khiết cho sản phẩm qua đó tăng cao hiệu quả của cả quá trình công nghệ…[27]

Nguyên lý tác động của vi sóng lên hệ phản ứng là thông qua việc cung cấp năng lượng Để một phản ứng xảy ra thì năng lượng của trạng thái trung gian phải cao hơn năng lượng hoạt hóa của phản ứng, vi sóng không có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa mà là làm hệ phản ứng nóng lên, cung cấp năng lượng để hệ vượt qua ngưỡng năng lượng hoạt hóa Mặt khác, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng theo phương trình dưới [28]: k= A ∗ e

Ví dụ, với một phản ứng bậc 1, có phương trình tốc độ phản ứng là: v= k[A], thì chỉ cần tăng nhiệt độ lên 17 o C, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên 10 lần, tăng nhiệt độ lên 35 oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 100 lần Mà vi sóng có khả năng tăng nhiệt độ cho hệ gần như lập tức, do đó, rất hiệu quả trong việc rút ngắn thời gian phản ứng Thêm nữa, khi sử dụng vi sóng để gia nhiệt, người ta nhận thấy rằng hỗn hợp nóng lên gần như đồng nhất (sự phân bố nhiệt hẹp hơn các phương pháp gia nhiệt thông thường) nên sản phẩm được tạo thành gần như đồng đều ở mọi vị trí, do đó đặc biệt thích hợp cho các phản ứng cần khống chế kích thước hạt sản phẩm [27] Đến nay, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra vi sóng cho hiệu quả vượt trội so với các phương pháp thông thường Nhóm tác giả [29] đã thành công ứng dụng vi sóng để tổng hợp siêu nhanh thuốc nano diopside ứng dụng trong y sinh Hwang và cộng sự [30] đã có báo cáo kết quả tổng hợp các hạt nano sắt/carbon (M@CNPs, M,

Co, Ni) gần như tinh khiết bằng cách sử dụng vi sóng để cung cấp năng lượng dẫn đến phân hủy nhiệt hợp chất cơ kim Năm 2019, Kalenga Pierre Mubiayi và cộng sự [31] đã ứng dụng phương pháp vi sóng để tổng hợp vật liệu CIGSe QD (Copper indium gallium selenide quantum dots) có đủ đặc điểm, tiêu chuẩn để chế tạo pin mặt trời Từ nguyên liệu Xeri (III) nitrat hexahydrat và natri hydroxit, nhóm tác giả [32] cũng đã tổng hợp thành công vật liệu ceria (CeO2) bằng phương pháp thủy nhiệt có sự hỗ trợ của vi sóng, thời gian phản ứng rút ngắn chỉ còn 10 phút và giảm được nhiệt

21 độ của giai đoạn thiêu kết từ 1500 o C xuống còn 1200 o C mà vẫn giữa được các đặc tính kỹ thuật cần thiết Đến nay, công nghệ tổng hợp vật liệu tồng hợp bằng vi sóng đã được nghiên cứu ứng dụng trong tổng hợp ZnO và đã có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng các yếu tố như thời gian vi sóng [33-35] và công suất vi sóng [36-38] đến tính chất của vật liệu như kích thước hạt, hình thái tinh thể cũng như tính chất quang và hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu nano ZnO Tùy mỗi tiền chất sử dụng hay môi trường phân tán khác nhau sẽ ứng với điều kiện tổng hợp phù hợp Do vậy, với mỗi vật liệu nghiên cứu cần khảo sát đánh giá lựa chọn điều kiện tổng hợp vi sóng phù hợp nhằm tiết kiệm chi phí tổng hợp đồng thời tạo ra được sản phẩm đáng ứng yêu cầu chỉ tiêu sản phẩm Điển hình là vật liệu HA từ xương cá chẽm biến tính ZnO chưa được nghiên cứu, do vậy khi áp dụng công nghệ vi sóng trong tổng hợp vật liệu này, khảo sát và xác định điều kiện vi sóng (thời gian và công suất vi sóng) là cần thiết

Với những tính năng nổi bật về khả năng rút ngắn thời gian phản ứng và tăng độ tinh khiết cho sản phẩm như trên, vi sóng được kỳ vọng là phương pháp phù hợp cho nghiên cứu về vật liệu y sinh trên nền HA từ xương cá chẽm biến tính ZnO với độ tinh khiết cao trong khuôn khổ đề tài này

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LIỆU

Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp nhiễu xạ tia X được được dùng để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu, có thể xác định nhanh, chính xác các pha tinh thể, định lượng pha tinh thể và kích thước hạt với độ tin cậy cao

Nguyên lý chung của phương pháp nhiễu xạ tia X: Chiếu tia X vào tinh thể, khi đó các nguyên tử bị kích thích và trở thành các tâm phát sóng thứ cấp Các sóng thứ cấp này (tia X, điện tử, nơron) triệt tiêu nhau theo một phương và tăng cường nhau theo một số phương tạo nên hình ảnh giao thoa Hình ảnh này phụ thuộc vào cấu trúc tinh thể Từ việc phân tích hình ảnh đó, ta có thể biết được cách sắp xếp các nguyên tử trong ô mạng Qua đó xác định được cấu trúc mạng tinh thể, các pha cấu trúc trong vật liệu…

22 Phương trình nhiễu xạ Bragg: Hiện tượng nhiễu xạ tia X được giải thích dựa trên phương trình nhiễu xạ Bragg Theo đó, ta coi mạng tinh thể là tập hợp các mặt phẳng song song cách nhau một khoảng d Khi chiếu tia X vào bề mặt, do tia X có khả năng đâm xuyên mạnh nên không chỉ những nguyên tử bề mặt mà cả những nguyên tử bên trong cũng tham gia vào quá trình tán xạ [39]

Hình 2.1: Hình ảnh mô tả nhiễu xạ tia X trên bề mặt vật liệu Điều kiện có cực đại giao thoa (phương trình Vulf–Bragg) [40]:

Trong đó, n là bậc phản xạ (số nguyên dương), λ là bước sóng của tia tới, d là khoảng cách giữa hai mặt phẳng song song, θ là góc giữa chùm tia X Đây là phương trình cơ sở để nghiên cứu cấu trúc mạng tinh thể Trên giản đồ căn cứ vào giá trị cực đại của 2θ có thể tính được d theo phương trình trên Bằng phương pháp này chất cần nghiên cứu sẽ được xác định cấu trúc mạng tinh thể Ngoài việc xác định cấu trúc mạng tinh thể, phương pháp XRD còn cho phép xác định kích thước trung bình của tinh thể theo phương trình Scherrer [41]:

Với D là kích thước tinh thể trung bình (nm), θ là góc nhiễu xạ, β là độ rộng vạch nhiễu xạ đặc trưng (radian) lấy giá trị bằng nửa cường độ cực đại, λ = 1,5406 Å là bước sóng của tia tới, k là hằng số Scherrer phụ thuộc vào hình dạng tinh thể và chỉ số Miller của vạch nhiễu xạ (lấy k = 0,9)

Thực nghiệm: Các mẫu vật liệu được đo thành phần pha trên thiết bị đo XRD D2-PHARSER (hãng Brucker) tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ nano – Trung tâm Nghiên cứu Triển khai – Khu Công nghiệp cao với các thông số bước quét của 2θ 23 0,03 o , bức xạ CuKα Mẫu được nghiền thành dạng bột mịn, tạo bề mặt phẳng có bề dày khoảng 100 Å, sau đó tiến hành đo Phần mềm phân tích nhiễu xạ ASTM được sử dụng để xác định các pha có trong mẫu thử, đo ở nhiệt độ phòng Các mẫu vật liệu

HA thu được sẽ được đo XRD để xác định pha tinh thể cũng như sự ảnh hưởng của nhiệt độ ủ, thời gian ủ, nhiệt độ nung, thời gian nung và tỷ lệ rắn lỏng ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp vật liệu HA Các mẫu ZnO@HA sẽ được phân tích XRD để xem xét độ đơn pha và kích thước của tinh thể khi được tổng hợp ở các khoảng thời gian và công suất vi sóng khác nhau.

Phương pháp quang phổ huỳnh quang XRF

Phương pháp quang phổ huỳnh quang tia X – là kỹ thuật quang phổ được ứng dụng chủ yếu trong các mẫu chất rắn, trong đó sự phát xạ tia X thứ cấp được sinh ra bởi sự kích thích các điện tử của mẫu bằng nguồn phát tia X XRF có khả năng xác định gần như tất cả các nguyên tố trong bảng tuần hoàn hóa học, thông thường giữa natri và uranium (bao gồm cả các nguyên tố âm điện chẳng hạn như clo, photpho, lưu huỳnh) tới giới hạn phát hiện trong phạm vi 1–10 mg/kg [42]

Nguyên lý chung của phương pháp XRF: Ở chế độ cơ bản, nguyên tử được cấu tạo bởi nhân và các lớp electron (điện tử) xung quanh (K, L, M, N)

Hình 2.2: Sơ đồ cơ chế của phương pháp quang phổ huỳnh quang tia X Khi bắn tia X mang năng lượng lớn vào mẫu – nguyên tử: Mức năng lượng này lớn hơn nhiều so với năng lượng liên kết các lớp electron cấu tạo nên nguyên tử, xảy

24 ra hiện tượng các lớp điện tử bao quanh nhân K, M bị bắn ra Do bị trống nên các electron lớp kế tiếp nhảy lại để lấp các lỗ trống mà electron bị đẩy ra ngoài Sự chuyển dịch các electron này sẽ phát ra năng lượng– phát sáng gọi là hiện tượng huỳnh quang Mỗi một nguyên tố khi phát xạ sẽ có một phổ khác nhau, đặc trưng cho hàm lượng của nguyên tố trong mẫu Từ đó sẽ định tính và định lượng được nguyên tố có trong mẫu phân tích

Trong nghiên cứu này, thành phần nguyên tố của các mẫu được đo trên máy dòng S2 Puma, hãng BRUKER sử dụng Ag anode, max voltage 50 kV, max power

50 W tại Trường Đại học Công nghiệp Thực Phẩm TP.HCM.

Phương pháp phổ hồng ngoài FT-IR

Để xác định cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu thường dùng phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) Trên phổ dựa vào các tần số đặc trưng của các nhóm chức trong phân tử mà có thể xác định sự có mặt của các nhóm chức đó có trong mẫu Phổ hồng ngoại chính là phổ dao động – quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay của các nhóm chức đều bị kích thích Phổ dao động – quay của phân tử được phát sinh do sự chuyển dịch giữa các mức năng lượng dao động và quay Dạng năng lượng được sinh ra khi chuyển dịch giữa các mức này ở dạng lượng tử hóa, nghĩa là chỉ có thể biến thiên một cách gián đoạn Hiệu số năng lượng được tính theo công thức Bohr [43]: ΔE = h ν (2.3)

Trong đó: ΔE là biến thiên năng lượng, h là hằng số Planck và ν là tần số dao động

Hình 2.3: Sơ đồ nguyên lý của phương pháp phổ hồng ngoại FT–IR

25 Bằng phương pháp FT-IR, vật liệu HA được phân tích để xác định sự có mặt của các nhóm chức đặc trưng bao gồm hai nhóm chức chính là OH – và PO4 3– Ngoài ra trong mẫu còn có thể có các nhóm chức khác như CO3 2–, HPO4 2– (nếu mẫu thu được không đơn pha tinh thể)

Trong nghiên cứu này, phổ FT-IR của các mẫu được đo trên máy hiệu BRUKER tại Viện Công nghệ Hóa học Tốc độ quét 1 lần/giây, số lần quét 30 lần.

Phương pháp tán sắc năng lượng tia X (EDS)

Kỹ thuật phân tích EDS hay EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) được sử dụng để xác định thành phần của mẫu chất rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ mẫu vật rắn do tương tác với các bức xạ (chùm điện tử có năng lượng cao trong các kính hiển vi điện tử)

Kỹ thuật EDS chủ yếu được thực hiện trong các kính hiển vi điện tử, ở đó, ảnh vi cấu trúc vật rắn được ghi lại thông qua việc sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao tương tác với vật rắn Khi chùm điện tử có năng lượng lớn được chiếu vào vật rắn, nó sẽ đâm xuyên sâu vào nguyên tử vật rắn và tương tác với các lớp điện tử bên trong của nguyên tử Tương tác này dẫn đến việc tạo ra các tia X có bước sóng đặc trưng tỉ lệ với nguyên tử số (Z) của nguyên tử theo định luật Mosley f = ν = ( )(Z − 1) = (2,48 ∗ 10 Hz)(Z − 1) (2.4)

Có nghĩa là, tần số tia X phát ra là đặc trưng với nguyên tử của mỗi chất có mặt trong chất rắn Việc ghi nhận phổ tia X phát ra từ vật rắn sẽ cho thông tin về các nguyên tố hóa học có mặt trong mẫu đồng thời cho các thông tin về tỉ phần các nguyên tố này Trong nghiên cứu này, EDS mapping và phổ EDX được phân tích trên thiết bị JEOL JST-IT 200 tại Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM.

Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM)

Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử quét là dùng chùm tia điện tử quét lên bề mặt mẫu và thu lại chùm tia phản xạ [44] Qua việc xử lý chùm tia phản xạ này, có thể thu được những thông tin về hình ảnh bề mặt mẫu để tạo ảnh của mẫu nghiên cứu Phương pháp hiển vi điện tử quét cho phép quan sát mẫu với độ phóng

26 đại rất lớn, từ hàng nghìn đến chục nghìn lần

Hình 2.4: Sơ đồ nguyên lý của phương pháp hiển vi điện tử quét

Chùm điện tử được tạo ra từ catot qua hai tụ quang sẽ được hội tụ lên mẫu nghiên cứu Chùm điện tử đập vào mẫu phát ra các điện tử phản xạ thứ cấp Mỗi điện tử phát xạ này qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành tín hiệu sáng, chúng được khuếch đại dựa vào mạng lưới điều khiển tạo độ sáng trên màn hình.

Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng chùm điện tử xuyên qua mẫu cần nghiên cứu [45] Vì thế, các mẫu đưa vào cần phải đủ mỏng để chùm điện tử xuyên qua Chiều dày tối đa của mẫu là 500 nm, và đạt chất lượng tốt khi mẫu mỏng dưới

27 Hình 2.5: Sơ đồ nguyên lý của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua Chùm tia điện tử được tạo ra từ hai súng phóng điện tử sẽ được hội tụ lên mẫu nghiên cứu Khi chùm tia điện tử đập vào mẫu sẽ phát ra các chùm tia điện tử phản xạ và điện tử truyền qua Chùm tia điện tử truyền qua này được đi qua điện thế gia tốc vào phần thu và biến đổi thành một tín hiệu sáng, tín hiệu này được khuếch đại rồi được đưa vào mạng lưới điều khiển để tạo ra độ sáng trên màn ảnh Mỗi điểm trên mẫu cho một điểm tương ứng trên màn ảnh, độ sáng tối phụ thuộc vào lượng điện tử phát ra tới bộ thu

Thấu kính điện tử được đặt bên trong hệ đo là bộ phận giúp phóng đại của phương pháp TEM Thấu kính này có khả năng thay đổi được tiêu cự Khi tia điện tử có bước sóng cỡ 0,4 nm chiếu lên mẫu ở hiệu điện thế khoảng 100 kV, ảnh thu được cho biết chi tiết hình thái học của mẫu theo độ tương phản tán xạ và tương phản nhiễu xạ và qua đó có thể xác định được kích thước hạt một cách chính xác

Trong nghiên cứu này, các mẫu hạt nano được phân tích ảnh TEM chụp trên thiết bị TEM JEM 1400 tại Viện Khoa học Vật liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phương pháp hấp phụ N 2

Phương pháp này dựa trên việc xác định lượng khí cần thiết để bao phủ bề mặt của một lớp đơn phân tử Lượng khí này được xác định từ đường cong hấp phụ đẳng nhiệt của nitơ ở nhiệt độ của nitơ lỏng (77,4 K) theo Brunauer, Emmett và Teller (BET) từ đó N2 bị hấp phụ bằng hấp phụ vật lý trên bề mặt chất hấp phụ Lượng N2 hấp phụ ở một áp suất cho trước được xác định bằng phép đo thể tích hoặc khối lượng Để loại bỏ chất nhiễm bẩn bề mặt chất hấp phụ, mẫu được hút chân không và được gia nhiệt trong điều kiện thích hợp trước khi phép đo được thực hiện [43]

Phương trình BET có dạng:

Trong đó: p là áp suất hơi bão hòa, V là thể tích khí hấp phụ ở áp suất p, V là thể tích khí bị hấp phụ ở lớp thứ I (đơn phân tử), C là thừa số năng lượng

28 Ngoài ra, biết V ta có thể tính được bề mặt hấp phụ S theo biểu thức:

Trong đó: N là số Avogadro, Wm là bề mặt chiếm bởi một phân tử chất bị hấp phụ ở lớp đơn phân tử, V0 là thể tích 1 mol khí ở điều kiện chuẩn (22400 cm 3 /mol)

Trong nghiên cứu này, các mẫu được đo trên thiết bị BET NOVA 2200 E (số liệu được xử lý bằng phần mềm Quantan Chrome) tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Diện tích bề mặt riêng được tính từ phần tuyến tính trong phương trình BET, đường phân bố kích thước mao quản được xác định từ nhánh khử hấp phụ với việc sử dụng công thức BJH.

Xác định chỉ tiêu vi sinh

2.5.8.1 Giới thiệu Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn là phép thử nghiệm bắt buộc cho các vật liệu ứng dụng y sinh, dược phẩm từ nguyên liệu đến thành phẩm không được tiệt trùng trong quá trình sản xuất Mục đích của việc đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn nhằm xác định giới hạn tối đa của số lượng vi khuẩn hiếu khí, vi nấm có trong 1 gam (hay 1 ml) chế phẩm thử

2.5.8.2 Chủng vi khuẩn được lựa chọn để đánh giá mức độ nhiễm khuẩn của vật liệu Để đánh giá vật liệu HA và HA biến tính ZnO tổng hợp được có đáp ứng các chỉ tiêu về vi sinh hay không, chọn thử nghiệm vật liệu trên 3 chủng vi khuẩn là Salmonella, Escherichia coli (E.coli) và Coliform Các loại vi khuẩn được chọn khá đặc trưng vì chúng gây ra các bệnh quen thuộc như vi khuẩn Salmonella gây ra bệnh thương hàn, các bệnh nhiễm trùng ở ống tiêu hóa; vi khuẩn E.coli thường làm ngộ độc thức ăn, gây bệnh về đường ruột; còn vi khuẩn Coliform có thể gây ra các rối loạn tạo nên chứng tiêu chảy gây mất nước, rối loạn máu, suy thận hay thậm chí là tử vong Các chủng vi khuẩn này được chọn để đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn theo quy định chỉ điểm vệ sinh đối với vật liệu được ứng dụng làm vật liệu y sinh

Bước 1: Chuẩn bị môi trường:

- TBX (Tryptone Bile X-Glucuronide) Agar : Đối với vi khuẩn E.coli

- VBRG (Violet red bile glicose agar) Agar: Đới với vi khuẩn Coliform

- SS (Samonella shigella agar) Agar: Đối với vi khuẩn Samonella

- Mẫu được pha với nước cất vô trùng tỉ lệ 5 mg/ml

- Tiến hành pha loãng mẫu theo nồng độ 10 -1 , 10 –2 mg/ml

Bước 3: Tiến hành đo mẫu:

- Dùng micropipet hút 1 ml mẫu đã pha loãng cho vào đĩa Petri vô trùng

- Cho vào 3 đĩa Petri, mỗi đĩa 15 ml môi trường, được giữ ấm 45–47 o C tương ứng với từng loại vi khuẩn

- Lắc đều đĩa Petri mẫu với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại

- Cho vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37 o C/24 giờ

 Đĩa đối chứng: Gồm 2 đĩa:

- Một đĩa môi trường tương ứng

- Một đĩa môi trường tương ứng được bổ sung vi khuẩn

- Đếm số khuẩn lạc điển hình của từng loại vi khuẩn trên môi trường đặc trưng

- Cần đếm các khuẩn lạc điển hình trên ít nhất mỗi đĩa chứa ít nhất 15 CFU vi khuẩn điển hình

Trong đó: N: Số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn) vi khuẩn trong 1 gam hay 1 ml mẫu;

∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn; n1: Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ nhất; di: Hệ số pha loãng thứ I; và v: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa petri.

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu HA biến tính ZnO (ZnO@HA)

Mẫu HA biến tính ZnO được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp

30 nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minial Inhibitory concentration) là nồng độ ức chế tối thiểu, là nồng độ thấp nhất của một kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24 giờ Đây là thông số chủ yếu được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với các chủng vi khuẩn

Chuẩn bị các mẫu kháng khuẩn với nồng độ khác nhau: Mẫu kháng khuẩn được thử nghiệm ở nồng độ tăng dần, thường là pha loãng gấp đôi (ví dụ N, N/2, N/4, N/8,… với N = 20 mg/ml)

Chuẩn bị các đĩa thạch kháng khuẩn: Cân thạch, đun sôi cho tan hết, sau đó hấp thạch ở 121 o C/15 phút Đối với một số chủng vi khuẩn đòi hỏi môi trường dinh dưỡng cao (như chủng S.pneumoniae) cần phải cho thêm 5 – 10 % máu vào môi trường thạch Hấp cách thuỷ thạch ở 80 o C/20 phút, lắc đều trong suốt thời gian hấp cách thuỷ Để thạch nguội khoảng 40 – 50 o C, sau đó dùng ống đong cho thạch vào bình nón đã đựng sẵn các mẫu kháng khuẩn theo các nồng độ khác nhau, lắc kỹ và đổ vào hộp lồng Sau khi thạch nguội cất bảo quản trong tủ lạnh 4 – 8 o C

2.5.9.2 Chủng vi khuẩn được chọn để đánh giá

Trong đề tài luận văn này, lựa chọn năm chủng vi khuẩn để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu, bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella và Bacillus cereus để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu ZnO@HA

 Escherichia coli (vi khuẩn Gram âm): sống trong đường tiêu hoá của người và động vật Nó là nguyên nhân gây ra các bệnh về tiêu hoá như: tiêu chảy, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiểu hay viêm màng não

 Staphylococcus aureus (vi khuẩn Gram dương): Staphylococcus aureus hay còn gọi là vi khuẩn tụ cầu, là một trong những tác nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng ở người và các bệnh viêm khớp Chúng cư trú chủ yếu ở da và màng nhầy Tuy nhiên, khi xâm nhập vào máu, khớp, phổi hay tim, có thể dẫn đến tình trạng nhiễm trùng nghiêm trọng, gây nguy hiểm cho tính mạng

 Pseudomonas aeruginosa (vi khuẩn Gram âm): Pseudomonas aeruginosa hay còn gọi là trực khuẩn mủ xanh Là một loại vi khuẩn nguy hiểm, gây ra nhiều

31 loại nhiễm trùng khác nhau cho con người như: nhiễm trùng đường ruột, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi Khi tấn công vào các vết thương, vết mổ chúng có thể gây ra tình trạng nhiễm trùng huyết nặng

 Salmonella (vi khuẩn Gram âm): là một loại vi trùng có thể gây chứng bệnh ở đường tiêu hoá của người và động vật Tuy hiếm xảy ra nhưng tác hại của vi khuẩn Salmonella có thể truyền từ ruột sang máu và đến những nơi khác trong cơ thể

Bacillus cereus (vi khuẩn Gram dương): là một loại vi khuẩn sản sinh độc tố và là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất, còn được gọi là “hội chứng cơm chiên”

THỰC NGHIỆM

Nguyên liệu

Xương cá chẽm sau khi đã được xử lý enzyme: xương cá chẽm tách ra từ quá trình phi lê, lấy thịt cá để đóng hộp, được xử lý tiếp với enzyme nhằm mục đích tách tuyệt đối phần thịt cá, nội tạng còn sót lại, đây là một bước để tận thu protein của cá Xương cá chẽm sau giai đoạn này được sấy khô và nghiền mịn thành bột (kích thước sau nghiền nhỏ hơn 0,25 mm)

Kết quả phân tích thành phần canxi và photpho có trong nguyên liệu: canxi chiếm 71,7 % và photpho chiếm 23,5 %.

Hóa chất

- Axit H3PO4 1% được pha từ dung dịch gốc H3PO4 85% (nhà sản xuất Merck)

- Dung dịch NH4OH 5% được pha từ dung dịch gốc NH4OH 25%

- Kẽm nitrat Zn(NO3)2 (nhà sản xuất Merck)

Dụng cụ, thiết bị sử dụng

Quá trình thực hiện đề tài có sử dụng các dụng cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm như: cốc thủy tinh, buret, pipet, cá từ, bình nước cất, giấy cân, đũa thủy tinh, thìa lấy mẫu…

Các thiết bị sử dụng gồm có:

33 Cân điện tử có độ chính xác  10 –3 gam Máy khuấy từ Lò vi sóng: Sharp R-

Máy li tâm: Jouan Tủ sấy: memmert Lò nung khí trơ

Thiết bị phản ứng Máy đo pH: toledo

QUY TRÌNH TỔNG HỢP HA

Sơ đồ quy trình tổng hợp HA

34 Hình 3.1: Sơ đồ quy trình tổng hợp HA m gam Xương cá chẽm (d < 0,25 mm) m = 1,00 gam

Gạn lay ran Khuay từ

50 ml H 2 O T = nhiệt độ phòng t = 0,5 giờ

NH 4 OH 5 % duy trı̀ pH

T = nhiệt độ phòng t = 2 giờ

Tỷ lệ ran/lỏng

T = nhiệt độ phòng t = 15 phút/lan, toc độ 4000 vòng/hút

Diễn giải quy trình

Cân chính xác m gam xương cá chẽm đã được xử lý (làm sạch, sấy khô, nghiền mịn d < 0,25 mm) bằng cân kỹ thuật, cho vào cốc thủy tinh 250 ml, thêm vào 50 ml nước cất rồi khuấy ở nhiệt độ phòng với tốc độ khuấy 300 vòng/phút trong thời gian

30 phút bằng máy khuấy từ

Sau khi khuấy với nước cất trong 30 phút, thêm từ từ từng giọt đến hết 14 ml dung dịch H3PO4 loãng có nồng độ xác định vào cốc phản ứng đồng thời dùng

NH4OH pha loãng 5% để duy trì pH = 10 ± 0,2 trong suốt quá trình phản ứng, kiểm tra pH liên tục bằng thiết bị máy đo pH mettler toledo HA được tổng hợp bằng phản ứng hóa học giữa CaO (trong xương cá chẽm) và H3PO4 nồng độ pha loãng nhất định

Tỷ lệ mol Ca/P được duy trì ổn định là 1,67 Trong giai đoạn phản ứng này, hỗn hợp vẫn được khuấy từ và giữ ở nhiệt độ phòng Thời gian phản ứng là 2 giờ tính từ khi nhỏ giọt H3PO4 cuối cùng Khối lượng xương cá và nồng độ H3PO4 sẽ có thay đổi khi khảo sát sự ảnh hưởng của yếu tổ tỉ lệ rắn/lỏng đến khả năng phản ứng (thông số này sẽ được khảo sát sau cùng)

Hình 3.2: Quá trình bổ sung H3PO4 và duy trì phản ứng

36 Kết thúc phản ứng cho hỗn hợp vào thiết bị phản ứng thủy nhiệt áp suất cao, và ủ nhiệt trong tủ sấy để đảm bảo ổn định cấu trúc của sản phẩm HA Thời gian và nhiệt độ ủ được thay đổi để khảo sát sự ảnh hưởng của hai yếu tố này

Hình 3.3: Thiết bị ủ nhiệt áp suất cao Sau khi ủ nhiệt, sử dụng máy li tâm để tách phần rắn và lỏng trong sản phẩm ủ được Điều kiện vận hành máy li tâm: 5.000 vòng/phút, 15 phút/lần li tâm Tiếp tục rửa phần rắn trong ống li tâm bằng nước cất và li tâm, tách bỏ phần nước, cho đến khi phần nước sau rửa bỏ đi có pH bằng 7 thì dừng lại Lần rửa cuối sử dụng cồn thay cho nước cất để sản phẩm sau đó có thể sấy khô nhanh hơn

Tiếp theo, mang phần rắn thu được sau li tâm sấy bằng tủ sấy ở nhiệt độ 80 o C trong 12 giờ Mang mẫu sau sấy đi nung bằng lò nung nhiệt độ cao để loại bỏ các thành phần hữu cơ còn sót lại trong sản phẩm Nhiệt độ nung và thời gian nung được thay đổi theo nhiều giá trị để khảo sát và lựa chọn giá trị tối ưu của quá trình

Hình 3.4: Mẫu HA trước nung (a) và sau khi nung (b)

37 Sau khi quá trình nung kết thúc, để nguội sản phẩm HA, sau đó nghiền nhỏ và bảo quản trong các bình kín khác nhau với các mẫu khảo sát ở các điểu kiện khác nhau Với một thông số được khảo sát ở các điều kiện khác nhau, lấy mẫu phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) để đánh giá thành phần pha và lựa chọn giá trị điều kiện phụ hợp với tiêu chí kích thước tinh thể HA nhỏ nhất và không lẫn thành phần pha tạp khác Khi khảo sát thông số sau, sử dụng giá trị phù hợp đã xác định trước đó để thực hiện quy trình tổng hợp.

Khảo sát nhiệt độ của giai đoạn ủ nhiệt

Bảng 3.1: Các giá trị nhiệt độ ủ nhiệt được khảo sát

Lượng dung dịch H3PO4 1 % (ml) 14

Thực hiện ủ nhiệt ở 4 nhiệt độ khác nhau: 80, 100, 120 và 140 o C Sản phẩm thu được từ quy trình tổng hợp trên tiến hành phân tích nhiễu xạ tia X Dựa vào kết quả phân tích XRD, đánh giá thành phần pha và độ tinh khiết của các sản phẩm thu được và từ đó chọn ra nhiệt độ ủ nhiệt tốt nhất để tiến hành khảo sát yếu tố thời gian ủ nhiệt.

Khảo sát thời gian của giai đoạn ủ nhiệt

Bảng 3.2: Các giá trị thời gian của giai đoạn ủ nhiệt được khảo sát

38 Lượng dung dịch H3PO4 1 % (ml) 14

Nhiệt độ ủ nhiệt ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.3

Sau khi xác định được nhiệt độ phù hợp, tiến hành lặp lại quy trình tổng hợp 05 mẫu HA ở 05 khoảng thời gian ủ nhiệt khác nhau Sản phẩm thu được từ quá trình tổng hợp trên cũng được đem đi phân tích nhiễu xạ tia X Từ kết quả quả phân tích XRD thu được sẽ đánh giá được thành phần pha và độ tinh khiết của sản phẩm HA để chọn ra thời gian ủ nhiệt tối ưu cho quy trình tổng hợp HA.

Khảo sát nhiệt độ của giai đoạn nung

Bảng 3.3: Các giá trị nhiệt độ của giai đoạn nung được khảo sát

Nhiệt độ ủ nhiệt ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.3

Thời gian ủ nhiệt (giờ) Giá trị xác định từ phần 2.2.4

Nhiệt độ nung sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của việc loại bỏ các tạp chất hữu cơ còn sót lại trong sản phẩm Thực hiện nung 05 mẫu ở 05 mức nhiệt độ khác nhau, đánh giá thành phần pha và độ tinh khiết của các sản phẩm thu được bằng phương pháp nhiễu xạ tia X để lựa chọn nhiệt độ nung phù hợp nhất.

Khảo sát thời gian của giai đoạn nung

Bảng 3.4: Các giá trị thời gian của giai đoạn nung được khảo sát

Lượng dung dịch H3PO4 1 % (ml) 14

Nhiệt độ ủ nhiệt ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.3

Thời gian ủ nhiệt (giờ) Giá trị xác định từ phần 2.2.4

Nhiệt độ nung ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.5

Tương tự như khảo sát các thông số ở trên, thực hiện quy trình ở 5 mức thời gian nung khác nhau Đánh giá sản phẩm thu được thông qua thành phần pha và độ tinh khiết của các sản phẩm thu được bằng phương pháp nhiễu xạ tia X để lựa chọn giá trị thời gian nung phù hợp nhất cho quy trình.

Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ rắn lỏng đến hiệu quả của quá trình

Bảng 3.5: Các tỉ lệ rắn lỏng được khảo sát

Nồng độ dung dịch H3PO4 (%) 0,5 1 2 3 4

Lượng dung dịch H3PO4 (ml) 14

Nhiệt độ ủ nhiệt ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.3

Thời gian ủ nhiệt (giờ) Giá trị xác định từ phần 2.2.4

Nhiệt độ nung ( o C) Giá trị xác định từ phần 2.2.5

Thời gian nung (giờ) Giá trị xác định từ phần 2.2.6

40 Bằng cách thay đổi nồng độ dung dịch axit photphoric và khối lượng xương cá sử dụng để thay đổi tỉ lệ rắn/lỏng của phản ứng Khảo sát tại năm tỉ lệ như bảng trên, thu được năm mẫu sản phẩm HA Mang sản phẩm HA thu được phân tích XRD để đưa ra tỷ lệ rắn/lỏng tối ưu cho quy trình tổng hợp

QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ ZnO@HA

Sơ đồ quy trình điều chế ZnO@HA

41 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình điều chế ZnO@HA

T = nhiệt độ phòng Rửa

50 ml H 2 O T = nhiệt độ phòng t = 0,5 giờ

NH 4 OH 5 % duy trı̀ pH = 11

T = nhiệt độ phòng t = 2 giờ

H 2 O t = 15 phút/lan, toc độ 4000 vòng/phút

Diễn giãi quy trình

Cân chính xác 0,367 gam muối Zn(NO3)2.6H2O cho vào cốc thủy tinh 250 ml Tiếp tục cho vào cốc có chứa sẵn muối kẽm nitrat 50 ml nước cất và khuấy đều trên máy khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút trong 30 phút Cân 1,9 g HA, cho vào cốc thủy tinh ở trên để tiến hành phản ứng, đồng thời sử dụng NH4OH 5% để điều chỉnh pH = 11 trong suốt thời gian phản ứng Duy trì phản ứng trong 2 giờ trên máy khuấy từ, ở nhiệt độ phòng Sau thời gian phản ứng, đưa hỗn hợp sau khi phản ứng vào bình cầu một cổ có gắn sinh hàn để chiếu vi sóng trong lò vi sóng Ở đây ta sẽ khảo sát ảnh hưởng của thời gian vi sóng và công suất vi sóng đến sản phẩm thu được Thiết bị vi sóng (Sharp R-201VN-W) có công suất vi sóng cực đại là 800 W có thể điều chỉnh ở bốn mức công suất khác nhau: Medium Low, Medium, Medium High, High, tương đương với bốn mức tốc độ gia nhiệt từ chậm đến nhanh Quy trình thực nghiệm sẽ tiến hành khảo sát các khoảng thời gian khác nhau tại mức công suất Medium, sau đó lựa chọn giá trị thời gian vi sóng thích hợp Tại giá trị thời gian vi sóng này, khảo sát kết quả mẫu vi sóng ở cả bốn mức công suất để chọn ra công suất thích hợp, chi tiết các giá trị của thông số thời gian, công suất sẽ khảo sát được trình bày ở phần 2.3.3

Sau khi chiếu vi sóng, phần rắn sẽ được tách riêng bằng thiết bị ly tâm tốc độ

5000 vòng/phút, thời gian mỗi lần ly tâm là 15 phút Tách bỏ phần lỏng, dùng nước cất để rửa phần rắn Lặp lại quy trình, rửa  ly tâm  bỏ lỏng đến khi pH của phần nước bỏ đạt 7 Lần rửa cuối sử dụng cồn thay cho nước cất để rút ngắn thời gian sấy khô phần mẫu rắn thu được

Phần rắn thu được sau li tâm được mang sấy khô ở nhiệt độ 80 o C trong vòng

Khảo sát thời gian vi sóng

43 Bảng 3.6: Các mốc thời gian vi sóng được khảo sát

Công suất vi sóng Mức trung bình (Medium)

Thời gian vi sóng (phút) 15 30 45 60

Thực hiện điều chế bốn mẫu 2 gam ZnO@HA có chứa 5% ZnO tại bốn khoảng thời gian vi sóng khác nhau Sản phẩm sau khi vi sóng sẽ được đánh giá bằng phương pháp XRD và EDS để đánh giá kích thước tinh thể và khả năng phân bố của ZnO trên

HA và lựa chọn thời gian vi sóng phù hợp nhất.

Khảo sát công suất vi sóng

Bảng 3.7: Các công suất vi sóng được khảo sát

Công suất vi sóng Medium-

Thời gian vi sóng (phút) Giá trị xác định từ phần 2.3.3

Sau khi lựa chọn được thời gian vi sóng phù hợp, tiếp tục thay đổi công suất vi sóng ở bốn mức độ khác nhau: ML, M, MH, H Sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD), tán sắc tia X (EDS) và khả năng kháng khuẩn đối với năm chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudonomas aeruginosa, Salmonella, Bacillus cereus để đánh giá sản phẩm thu được và rút ra công suất vi sóng phù hợp nhất

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ nhiệt

Thực hiện tổng hợp 04 mẫu HA trong cùng điều kiện thời gian ủ nhiệt 24 giờ, nhiệt độ nung 550 o C và nung trong 2 giờ với 04 giá trị nhiệt độ ủ khác nhau: 80, 100,

120 và 140 o C Giản đồ XRD của các mẫu HA được tổng hợp trong cùng điều kiện thời gian ủ nhiệt 24 giờ, nhiệt độ nung là 550 o C và nung trong 2 giờ với thời gian ủ nhiệt khảo sát lần lượt là 80, 100, 120và 140 o C như dưới

Hình 4.1: Phổ XRD của các mẫu HA được tổng hợp ở nhiệt độ ủ (Th) khác nhau (th = 24 giờ, Tc = 550 o C và tc = 2 giờ); a) Th = 80 o C; b) Th = 100 o C; c) Th = 120 o C; d) Th = 140 o C Khi so sánh với phổ chuẩn của HA (JCPDS card No: 9–0432), kết quả phân tích cho thấy các đỉnh đặc trưng của HA đều xuất hiện và tỉ lệ cường độ các đỉnh tương đối giống với phổ chuẩn, không có sự xuất hiện của các pha khác, chứng tỏ sản phẩm HA tương đối đơn pha Các đỉnh đặc trưng của HA có cường độ cao trong mẫu tổng hợp xuất hiện ở các vị trí 2θ = 25,75 o , 31,41 o , 31,95 o , 32,49 o và 49,09 o hoàn toàn

45 phù hợp với phổ chuẩn Trong đó, đỉnh có cường độ nhiễu xạ mạnh nhất tại 2θ 31,41 o Độ rộng và cường độ các đỉnh đặc trưng tại từng nhiệt độ khảo sát tương đối như nhau So sánh phổ XRD giữa các mẫu được tổng hợp ở nhiệt độ ủ 120 o C và 140 oC, các mẫu tổng hợp ở nhiệt độ 80 o C và 100 o C có các đỉnh đặc trưng cho HA có cường độ không cao bằng và chưa tách biệt rõ ràng

Bảng 4.1: Kích thước tinh thể (d) của các mẫu HA được tổng hợp ở nhiệt độ ủ

(Th) khác nhau (th = 24 giờ, Tc = 550 o C và tc = 2 giờ)

Dựa vào kết quả tính toán kích thước tinh thể HA tính theo công thức Scherrer [41, 46] (bảng 3.1) ta thấy tất cả các mẫu được tổng hợp ở các nhiệt độ ủ đều thu được tinh thể HA có kích thước nano và khi tăng nhiệt độ ủ thì kích thước tinh thể giảm Hai mẫu HA tổng hợp ở nhiệt độ ủ 120 o C và 140 o C kích thước tinh thể tương đương nhau (bằng 35,5 nm) Xét tiêu chí về mặt kinh tế, để tiết kiệm chi phí năng lượng cho quá trình tổng hợp, nhiệt độ ủ 120 o C được lựa chọn để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng các yếu tố thời gian ủ nhiệt, nhiệt độ nung và thời gian nung đến độ tinh khiết của sản phẩm HA.

Ảnh hưởng của thời gian ủ nhiệt

Sau khi chọn được nhiệt độ ủ nhiệt thích hợp (120 o C), ta tiếp tục tổng hợp các mẫu HA với thời gian ủ nhiệt khác nhau (6, 7, 8, 16 và 24 giờ) và được nung trong cùng điều kiện nhiệt độ 550 o C trong 2 giờ Kết quả phân tích XRD của các mẫu HA được thể hiện ở hình 3.2 Khi so sánh với phổ chuẩn của HA (JCPDS card No: 9–0432) kết quả cho thấy, ở các mẫu HA hầu hết các đỉnh đặc trưng của HA tại 2θ 25,75 o , 31,41 o , 31,95 o , 32,49 o và 49,09 o đều xuất hiện, tỷ lệ cường độ các đỉnh tương đối giống với phổ chuẩn, không xuất hiện đỉnh của các pha khác Trong số các phổ XRD của các mẫu, mẫu tổng hợp với thời gian ủ nhiệt 6 giờ có cường độ đỉnh không

46 cao và sắc nét bằng các mẫu còn lại, điều này chứng tỏ mẫu này có cường độ kết tinh kém hơn Kết hợp với việc so sánh kích thước tinh thể ở bảng 3.2, ta thấy mẫu tổng hợp với thời gian ủ 6 và 7 giờ có kích thước tinh thể nhỏ và xấp xỉ nhau Từ những nhận định trên, thời gian ủ phù hợp là 7 giờ Vậy, điều kiện ủ nhiệt phù hợp tổng hợp

HA là nhiệt độ 120 o C và thới gian 7 giờ

Hình 4.2: Phổ XRD của các mẫu HA được tổng hợp với thời gian ủ (th) khác nhau (Th = 120 o C, Tc = 550 o C và tc = 2 giờ); a) th = 6 giờ; b) th = 7 giờ; c) th = 8 giờ; d) th = 16 giờ; e) th = 24 giờ

Bảng 4.2: Kích thước tinh thể (d) của các mẫu HA được tổng hợp với thời gian ủ (th) khác nhau (Th = 120 o C, Tc = 550 o C và tc = 2 giờ)

Thời gian ủ nhiệt (giờ) 6 7 8 16 24 d (nm) 28,5 28,8 31,3 32,2 35,5

Ảnh hưởng của nhiệt độ nung

Quá trình nung ở nhiệt độ cao giúp loại bỏ hoàn toàn phần hữu cơ liên kết chặt chẽ trong xương cá để thu nhận HA Do đó, nhiệt độ nung có ảnh hưởng rất lớn đến hình dạng, kích thước cũng như độ đơn pha của sản phẩm HA tạo thành

Hình 4.3: Phổ XRD của các mẫu HA tổng hợp được khi nung ở nhiệt độ khác nhau (Th = 120 o C, th = 7 giờ, tc = 2 giờ); a) Tc = 550 o C; b) Tc = 650 o C; c) Tc = 750 o C; d) Tc = 800 o C; e) Tc = 850 o C Sau khi chọn được nhiệt độ ủ nhiệt và thời gian ủ nhiệt thích hợp, tiến hành tổng hợp các mẫu HA trong cùng điều kiện ủ nhiệt là 120 o C, 7 giờ rồi tiến hành khảo sát nung mẫu HA ở nhiệt độ khác nhau trong vùng nhiệt độ 550 – 850 o C với cùng thời gian nung 2 giờ Kết quả các phổ XRD (hình 3.3) cho thấy khi so sánh với phổ chuẩn của HA (JCPDS card No: 9–0432), các mẫu HA đều xuất hiện các đỉnh đặc trưng của

HA, điều này chứng tỏ có sự hình thành HA trong các mẫu tổng hợp Tuy nhiên, từ

550 o C đến 750 o C các đỉnh tại vị trí 2θ = 31,41 o và 31,95 o chưa tách biệt rõ ràng chứng tỏ HA tạo thành vẫn có độ tinh khiết chưa cao Đối với mẫu nung ở nhiệt độ

800 o C, các đỉnh đặc trưng của HA đều xuất hiện hoàn toàn trùng khớp với phổ chuẩn, tách biệt nhau rõ rệt và không có sự xuất hiện của các pha lạ khác chứng tỏ HA sản phẩm tương đối đơn pha và thể hiện được độ tinh khiết cao của sản phẩm thu được Khi nung ở nhiệt độ cao hơn (850 o C), ngoài sự xuất hiện của các đỉnh giống như phổ

HA chuẩn, trong phổ XRD của mẫu HA nung ở nhiệt độ này còn có sự xuất hiện thêm các đỉnh của pha khác Các đỉnh này là sự xuất hiện của pha β–TCP Ca3(PO4)2 có trong mẫu, hiện diện ở các góc 2θ phù hợp với mô tả của pha canxi này trong các tài liệu trước đây [47] Thêm vào đó, phổ XRD mẫu nung ở 850 o C còn có sự hiện diện của các đỉnh đặc trưng cho thành phần pha CaO ở 2θ = 37,43 o , 37,72 o , 53,18 o và 64,18 o [48] các đỉnh này lại có sự trùng lắp với các đỉnh của β–TCP Như vậy có thể đã có sự chuyển đổi một phần từ HA sang β–TCP và CaO khi nung mẫu theo phương trình dưới [49]:

Ca10(PO4)6(OH)2  3Ca3(PO4)2 + CaO + H2O (1)

Mặt khác, bảng 3.16 cũng cho thấy khi nung ở nhiệt độ 850 o C kích thước tinh thể của HA lớn hơn nhiều so với mẫu nung ở nhiệt độ 800 o C, điều này có thể do nhiệt độ nung cao đã xảy ra hiện tượng thiêu kết các tinh thể HA Các kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Boutinguiza [50] khi tổng hợp HA từ phế phẩm xương cá kiếm và xương cá ngừ và khảo sát nung ở các nhiệt độ 600 và 950 o C; hay gần đây nhất là nghiên cứu của các tác giả khi nghiên cứu một số đặc tính của HA có nguồn gốc từ xương cá ngừ vằn [49] khi được nung ở các nhiệt độ 600, 900và 1200 oC Từ kết quả thu được ở trên, nhiệt độ nung phù hợp cho mẫu HA được chọn là 800 oC

Bảng 4.3: Kích thước tinh thể (d) của các mẫu HA tổng hợp được khi nung ở nhiệt độ khác nhau (Th = 120 o C, th = 7 giờ, tc = 2 giờ)

Ảnh hưởng của thời gian nung

Thời gian nung cũng ảnh hưởng đến độ kết tinh cũng như sự thiêu kết của sản phẩm HA Từ kết quả phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ nung được trình bày ở trên, ảnh hưởng của thời gian nung mẫu HA khác nhau (0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ và 2 giờ) ở cùng nhiệt độ nung 800 o C cũng đã được tiến hành khảo sát

Hình 4.4: Phổ XRD của các mẫu HA tổng hợp được khi nung với thời gian nung khác nhau (Th = 120 o C, th = 7 giờ, Tc = 800 o C); a) tc = 0,25 giờ; b) tc = 0,5 giờ; c) tc = 1 giờ; d) tc = 1,5 giờ; e) tc = 2 giờ

Kết quả phân tích phổ XRD của các mẫu HA thu được khi nung ở 800 o C với thời gian khác nhau được trình bày ở hình 3.4 Tất cả các đỉnh đặc trưng đều xuất hiện phù hợp với phổ chuẩn của HA (JCPDS card No: 9–0432) Các đỉnh thu được đều sắc nhọn và cường độ tương đương nhau so với mẫu chuẩn chứng tỏ HA có độ kết tinh cao Ngoài ra không có sự xuất hiện của các đỉnh lạ so với mẫu chuẩn chứng tỏ HA thu được đơn pha và có độ tinh khiết cao Mẫu nung trong thời gian nung 15 phút (0,25 giờ) các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng cho HA không sắc nét, điều này cho biết có thể các tạp chất hữu cơ còn sót trên mẫu chưa được loại sạch hoàn toàn do thời gian nung ngắn Kết hợp với so sánh kích thước tinh thể trong các khoảng thời gian

50 khác nhau (bảng 3.4) chứng tỏ thời gian nung đạt độ kết tinh cao và ít tốn năng lượng nên chọn là 0,5 giờ

Bảng 4.4: Kích thước tinh thể (d) của các mẫu HA tổng hợp được khi nung với thời gian nung khác nhau (Th = 120 o C, th = 7 giờ, Tc = 800 o C)

Thời gian nung (giờ) 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0 d (nm) 31,15 32,9 35,5 36,0 36,1

Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng

Sau khi khảo sát các yếu tố nhiệt độ và thời gian ủ nhiệt cũng như trong quá trình nung mẫu, ta tiến hành thực hiện các thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng của tỷ lệ rắn/lỏng đến quá trình hình thành vật liệu HA

Hình 4.5: Phổ XRD của các mẫu HA tổng hợp với tỷ lệ rắn/lỏng khác nhau trong cùng điều kiện ủ và điều kiện nung phù hợp (Th = 120 o C, th = 7 giờ,

Tc = 800 o C, tc = 0,5 giờ); a) 0,5g/50mL; b) 1g/50mL; c) 2g/50mL; d) 3g/50mL; e) 4g/50mL

51 Hình 3.5 thể hiện kết quả phân tích XRD của 4 mẫu HA được tổng hợp theo tỷ lệ rắn/lỏng khi tăng đồng thời khối lượng xương cá và nồng độ dung dịch H3PO4 để vẫn đảm bảo tỷ lệ mol Ca/P theo lý thuyết là 1,67 So với phổ chuẩn của HA (JCPDS 09–0432) ở cả 5 mẫu khảo sát, các đỉnh đặc trưng đều xuất hiện chứng tỏ có sự hình thành HA Tuy nhiên, với mẫu với tỷ lệ rắn/lỏng cao hơn 2g/50mL có cường độ các đỉnh tương đối yếu và các đỉnh có phần tù hơn so với mẫu chuẩn Ngoài ra còn có sự xuất hiện thêm đỉnh của pha khác (2θ = 31,3 o ), đây là sự xuất hiện của pha β–TCP

Ca3(PO4)2 trong mẫu [47] Trong khi đó mẫu tỷ lệ rắn lỏng 0,5g/50mL và 1g/50mL cho kết quả phổ nhiễu xạ tia X hoàn toàn gần giống nhau và phù hợp với phổ chuẩn Điều này chứng tỏ khi tổng hợp HA với 2 tỷ lệ này thì thu được vật liệu HA có độ tinh khiết cao Để lợi về mặt kinh tế chọn tỷ lệ rắn lỏng 1g/50mL là phù hợp

Từ kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc vật liệu HA, quy trình tổng hợp HA từ xương cá chẽm phù hợp nhất đã được đề xuất với các thông số được trình bày ở bảng 3.5

Bảng 4.5: Các thông số cho quy trình tổng hợp HA từ xương cá chẽm

Tỷ lệ rắn lỏng, g/mL 1/50

Nồng độ dung dịch H3PO4, % 1

52 Hình 4.6: Quy trình tổng hợp HA từ xương cá chẽm đề xuất

(*) Giá trị T = 25 o C biểu diễn cho điều kiện thực hiện là ở nhiệt độ phòng

53 Quy trình tổng hợp HA từ xương cá chẽm được trình bày ở hình 3.6, cụ thể như sau: Cân 1,00 gam xương cá chẽm đã được sấy khô và nghiền mịn (d < 0,25 mm) cho vào becher 250 ml, thêm vào 50 ml nước cất rồi khuấy ở nhiệt độ phòng với tốc độ khuấy 300 vòng/phút trong thời gian 30 phút Tiếp theo, thêm từ từ từng giọt dung dịch H3PO4 (14 mL) nồng độ 1% vào hỗn hợp, đồng thời dùng dung dịch NH4OH pha loãng 5 % để duy trì pH = 10 trong suốt quá trình phản ứng Sau khi nhỏ hết dung dịch H3PO4, hỗn hợp vẫn được tiếp tục khuấy, và giữ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ Kết thúc phản ứng đem hỗn hợp ủ nhiệt ở nhiệt độ 120 o C trong thời gian 7 giờ để đảm bảo ổn định cấu trúc của sản phẩm HA Sau khi ủ nhiệt, gạn lấy phần rắn đem rửa bằng nước cất và ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, thời gian mỗi lần ly tâm là

15 phút Tiến hành rửa và ly tâm nhiều lần cho đến khi pH dung dịch sau lọc đạt giá trị 70,2 Tiếp theo, rửa và ly tâm lần cuối cùng thực hiện với ethanol 95% Sau ly tâm, mẫu rắn được đem sấy khô ở nhiệt độ 80 o C trong thời gian 12 giờ Mẫu sau sấy được đem nung ở nhiệt độ 800 o C trong 30 phút để loại bỏ các thành phần hữu cơ còn liên kết chặt chẽ trong xương cá để thu nhận được sản phẩm HA tinh khiết Theo quy trình này hiệu suất tổng hợp HA từ xương cá chẽm đạt được 56% (so với khối lượng bột xương ban đầu đưa vào)

CÁC TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA HA THU ĐƯỢC TỪ XƯƠNG CÁ CHẼM

Thành phần pha của vật liệu HA

Phổ nhiễu xạ tia X của vật liệu HA tổng hợp từ xương cá chẽm tại nhiệt độ ủ

120 o C trong 7 giờ và nung ở 800 o C trong 0,5 giờ được trình bày ở hình 3.7 Tất cả các đỉnh đặc trưng của HA đều xuất hiện Trên giản đồ XRD chỉ thấy sự xuất hiện của những đỉnh đặc trưng của HA, không thấy sự có mặt của các pha lạ chứng tỏ sản phẩm thu được là đơn pha Trong đó, đỉnh có cường độ mạnh nhất tại vị trí 2θ 31,41 o , và các đỉnh khác có cường độ tương đối mạnh ở các vị trí 25,75 o ; 31,95 o ; 32,49 o ; 49,09 o ;… Các đỉnh đặc trưng tách biệt khá rõ nét, đỉnh sắc nhọn, cường độ các đỉnh khá cao nên sản phẩm HA thu được có kích thước nano và độ tinh khiết cao Theo công thức Scherrer [41, 46], kích thước tinh thể trung bình HA đạt được 32,9

Hình 4.7: Phổ XRD của mẫu HA thu được từ xương cá chẽm theo quy trình

Thành phần nguyên tố của vật liệu HA

Thành phần và hàm lượng các nguyên tố của nguyên liệu xương sau thủy phân protein được sấy khô và mẫu HA tổng hợp ở điều kiệt tốt nhất được thể hiện ở bảng 3.6 Thành phần chính trong xương cá chẽm nguyên liệu chứa Ca (71,7 %) và P (23,5

%), ngoài ra còn có chứa các nguyên tố khác nhưng với hàm lượng không đáng kể Kết quả phân tích XRF mẫu nguyên liệu xương cá chẽm sau quá trình thủy phân protein và sấy khô thu được tỷ lệ mol Ca/P là 2,36 vượt xa so với tỷ lệ cho phép của vật liệu HA (Ca/P trong khoảng 1,6–1,8) Trong quá trình tổng hợp, lượng H3PO4 được tính toán thêm vào để đưa tỷ lệ mol Ca/P xấp xỉ 1,67 Kết quả cho thấy vật liệu

HA sau khi tổng hợp được phân tích lại thành phần nguyên tố thì tỷ lệ Ca/P bằng 1,61 hoàn toàn phù hợp với tỷ lệ mong đợi Bên cạnh đó, tỷ lệ này tương đối gần với tỷ lệ mol Ca/P (1,67) trong thành vô cơ của xương và răng, theo nhận định của tác giả [45], với tỉ lệ mol Ca/P đã thu được, vật liệu HA đã tổng hợp sẽ có tính tương thích sinh

55 học cao Khi so sánh với cùng loại vật liệu là HA, kết quả cho thấy tỷ lệ Ca/P thu được khá tốt so với các nhóm nghiên cứu trước đây (chi tiết như ở bảng 3.7)

Bảng 4.6: Hàm lượng các nguyên tố của mẫu xương cá chẽm nguyên liệu và sản phẩm HA

Hàm lượng (%) Nguyên liệu xương cá chẽm HA

Bảng 4.7: So sánh tỷ lệ mol Ca/P trong sản phẩm HA thu được từ xương cá chẽm và các sản phẩm HA ở các nghiên cứu khác

Nhóm nghiên cứu Nguyên liệu Tỷ lệ Ca/P

Boutinguiza [50] Xương cá ngừ và cá kiếm 1,87

N.Mustafa [52] Xương cá rô phi 1,69 Đề tài này Xương cá chẽm 1,61

Các nhóm chức và liên kết đặc trưng của vật liệu HA

Hình 4.8: Phổ FT–IR của mẫu HA thu được từ xương cá chẽm

Quan sát phổ FT-IR (hình 3.8), ta thấy xuất hiện các dải phổ đặc trưng cho nhóm chức của HA, điều này củng cố thêm nhận định về việc đã tổng hợp thành công sản phẩm HA từ xương cá chẽm (nhận định từ kết quả XRD) Các dải phổ hiển thị đặc trưng cho nhóm PO4 3– gồm ba vùng chính Vùng đầu tiên thể hiện các đỉnh với các số sóng ở vị trí 1093,81 cm –1 , 1041,91 cm –1 tượng trưng cho co giãn v3 và tại vị trí 962,95 cm –1 tượng trưng cho co giãn v1 Vùng thứ hai của nhóm PO4 3– thể hiện dao động uốn v4 với các đỉnh ở 603,02 cm –1 và 569,39 cm –1 Vùng thứ ba được quan sát thấy ở các đỉnh hấp thụ yếu 473,40 cm –1 tương ứng với chế độ uốn v2 Đối với nhóm chức OH – , dao động giãn được thể hiện tại bước sóng 3572,24 cm –1 và 632,91 cm –1

Sự hiện diện của vật chất hữu cơ (C–H) được phát hiện dưới dạng các đỉnh cường độ rất yếu ở bước sóng 2925,43 cm –1

Ngoài các đỉnh hấp thụ chính đặc trưng cho các nhóm chức của HA trong phổ hồng ngoại của các mẫu còn xuất hiện các đỉnh hấp thu của nhóm chức CO3 2– tại các vị trí từ 1463,78 cm –1 , 1414,11 cm –1 và 2002,37 cm –1 Sự hình thành ion CO3 2– có thể là do sự hấp thu CO2 trong không khí trong quá trình thực hiện thí nghiệm, nó liên quan đến môi trường kiềm trong dung dịch khi duy trì phản ứng tại pH = 10.

Hình thái bề mặt của của vật liệu HA

Hình 4.9: Ảnh SEM (a) và TEM (b) của mẫu HA thu được từ xương cá chẽm Để khảo sát hình thái của bề mặt vật liệu, phương pháp phân tích qua kính hiển vi điện tử quét và phương pháp phân tích qua kính hiển vi điện tử truyền qua được sử dụng để đánh giá vật liệu tổng hợp được trong điều kiện tốt nhất Kết quả được trình bày ở hình 3.9 Ảnh SEM của vật liệu HA thể hiện ở hình 3.9a cho thấy có sự hiện diện của các hạt nano tương đối đồng đều, một số tinh thể kết tập lại với nhau thành

58 cụm Nhìn chung các hạt tương đối đồng đều có kích thước nằm trong khoảng 30 –

60 nm Hình dạng, cấu trúc và kích thước mẫu HA được phân tích sâu bằng TEM thể hiện ở hình 3.9b Các hạt tồn tại với kích thước tương đối đồng đều nhau trong khoảng 3040 nm.Kích thước hạt quan sát được từ ảnh SEM và TEM khá phù hợp với kích thước trung bình tính theo công thức Scherrer Khi so sánh với các nhóm nghiên cứu khác cùng tổng hợp vật liệu HA, kích thước vật liệu HA tổng hợp được từ xương cá chẽm tốt hơn hẳn so với các nghiên cứu được thực hiện trước đây (thể hiện ở bảng 3.8)

Bảng 4.8: So sánh kích thước tinh thể HA từ xương cá chẽm với các mẫu HA của các nghiên cứu khác

Nguyên liệu Kích thước (nm)

Xương cá chẽm (HA, đề tài này) 43–60

Diện tích bề mặt riêng, đường kính lỗ xốp và kích thước lỗ xốp (BET) của vật liệu HA

Diện tích bề mặt vật liệu HA được xác định bằng phân tích BET đường hấp phụ và giải hấp khí N2 được thể hiện ở hình 3.10a Kích thước lỗ xốp trong khoảng từ meso đến microporous (đường kính trong khoảng 0 – 500 Å) được xác định bằng phân tích BJH (hình 3.10b) nhằm nâng cao độ phân giải trong khoảng micropore Kích thước lỗ xốp phân bố trong phạm vi 15 – 50 Å với đường kính của lỗ xốp là 24

Å Mẫu vật liệu HA tổng hợp được có diện tích bề mặt riêng là 21,6 m 2 g –1 và tổng thể tích lỗ xốp là 0,029 cm 3 g –1

59 Hình 4.10: Đường hấp phụ và giải hấp đẳng nhiệt khí N2 (a) và đường phân bố kích thước lỗ xốp được xác định bằng phân tích BJH (b) của vật liệu HA

Từ những kết quả trên cho thấy vật liệu HA tổng hợp được từ xương cá chẽm (HA) với nhiệt độ ủ nhiệt 120 o C trong thời gian 7 giờ và nung 800 o C trong 0,5 giờ cho kết quả khá tốt, diện tích bề mặt riêng lớn, hạt đạt kích thước nano và độ tinh khiết cao.

Các chỉ tiêu vi sinh của vật liệu HA

Bảng 4.9: Hình ảnh đánh giá một số chỉ tiêu vi sinh Salmonella, E coli và

Chỉ tiêu Samonella E.coli Coliform

Môi trường không có bổ sung vi khuẩn

Môi trường có bổ sung vi khuẩn

Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu vi sinh Salmonella, E coli và Coliform của mẫu HA tổng hợp được từ xương cá chẽm thể hiện ở bảng 3.9 Khi so sánh mẫu HA

61 pha loãng 10 lần với các mẫu đối chứng môi trường có bổ sung vi khuẩn và mẫu đối chứng môi trường không có bổ sung vi khuẩn nhận thấy rằng sau thời gian nuôi cấy mẫu HA đã được pha loãng giống với mẫu đối chứng môi trường không có bổ sung vi khuẩn Điều này chứng tỏ rằng mẫu HA tổng hợp từ xương cá chẽm theo phương pháp thực hiện trong đề tài này không bị nhiễm khuẩn, phù hợp trong việc ứng dụng làm vật liệu y sinh.

Ảnh hưởng của thời gian vi sóng

Ở phần này, 4 mẫu ZnO@HA với cùng thành phần 5%ZnO mang trên HA (được tổng hợp ở điều kiện tốt nhất với các tính chất nêu ở phần 3.2) được tiến hành tổng hợp ở cùng công suất vi sóng Medium (M) và thành phần ZnO không đổi 5% ở 4 khoảng thời gian vi sóng khác nhau: 15, 30, 45 và 60 phút Các mẫu được ký hiệu lần lượt là: ZnHA-M-15, ZnHA-M-30, ZnHA-M-45 và ZnHA-M-60 Thành phần pha của các mẫu vật liệu sau khi tổng hợp được đánh giá thông qua kết quả nhiễu xạ tia

Hình 4.11: Phổ XRD của các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở các thời gian vi sóng khác nhau (công suất: Medium, %kl ZnO: 5%)

62 Phổ XRD của các mẫu HA biến tính ZnO được điều chế với thời gian khác nhau (hình 3.11) xuất hiện các đỉnh tại các đỉnh nhiễu xạ 2 bằng 25,9, 28,1, 31,7, 32,2, 32,9, 34,0, 35,5, 38,9, 39,8, 42,3, 46,7, 48,1, 49,5, 50,5, 51,2, 52,1, 53,1 Các đỉnh này xuất hiện tương đối rõ và đặc trưng của HA (JCPDS 009-0432) Kết quả này cho thấy việc biến tính ZnO không làm thay đổi thành phần pha của HA (hình dạng và cường độ các đỉnh đặc trưng cho HA không có sự thay đổi so với HA thuần, hình 3.7)

Ngoài ra, các phổ XRD của các mẫu mẫu HA biến tính ZnO còn xuất hiện các đỉnh nhiễu xạ tại 2 bằng 31,8, 34,4, 36,3, 47,5 và 56,6, đặc trưng cho thành phần pha của ZnO (JCPDS 36-1451) Các đỉnh đặc trưng cho ZnO xuất hiện với cường độ thấp hơn so với các đỉnh đặc trưng cho thành phần HA, điều này chứng tỏ với thành phần chiếm lượng thấp (5 %kl), ZnO đã phân tán tốt trên bề mặt HA Nhìn chung giữa các mẫu HA biến tính ZnO tổng hợp bằng phương pháp vi sóng với thời gian khác nhau hình dạng phổ không có sự khác biệt lớn, điều này chứng tỏ thời gian vi sóng ảnh hưởng không lớn đến thành phần pha của các mẫu Để lựa chọn thời gian vi sóng phù hợp, tiêu chí kích thước các tinh thể ZnO và HA thu được cũng như sự phân bố chất biến tính ZnO trên bề mặt HA được xem xét đánh giá Hình ảnh thể hiện sự phân bố các nguyên tố, thành phần Zn (hay ZnO quy đổi) trên bề mặt HA và kích thước trung bình của các tinh thể ZnO và HA của các mẫu HA được trình bày ở hình 3.12 và bảng 3.10

Quan sát hình 3.12, ta thấy bề mặt mẫu ZnHA-M-30 (tổng hợp với thời gian vi sóng 30 phút) có bề mặt với các hạt trên bề mặt nhỏ hơn và bề mặt tương đối xốp hơn so với các mẫu tổng hợp ở thời gian 15 phút, 45 phút và 60 phút Thời gian vi sóng tăng từ 15 phút đến 30 phút sản phẩm thu được có bề mặt xốp hơn, có thể các hạt ZnO hình thành trên bề mặt có kích thước nhỏ hơn, cụ thể giảm từ 25,2 xuống còn 20,9 nm (như đã trình bày ở bảng 3.10) Điều này cũng nhận thấy ở công trình Shingange [34] và các cộng sự, khi nghiên cứu tổng hợp ZnO thuần (không mang trên chất mang) bằng phương pháp vi sóng với thời gian vi sóng khác nhau Tuy nhiên, khi thời gian vi sóng kéo dài 45 và 60 phút, bề mặt vật liệu trở nên thô hơn, điều này có thể được lý giải, thời gian vi sóng dài các hạt ZnO hình thành ổn định

63 cấu trúc và tương tác liên kết chặt chẽ với nhau hoặc với vật liệu HA dẫn đến bề mặt nhẵn và ít xốp hơn [33] Kết quả tính toán kích thước tinh thể ZnO ở bảng 3.10 cho thấy điều này, khi tăng thời gian vi sóng lên 45 phút và 60 phút, kích thước tinh thể trung bình của ZnO tăng tương ứng là 37,3 và 41,8 nm Quan sát hình 3.12, ta cũng có thể thấy các vùng tập trung nguyên tố Zn của 2 mẫu này cũng có kích thước lớn hơn a) ZnHA-M-15 b) ZnHA-M-30 c) ZnHA-M-45 d) ZnHA-M-60

Hình 4.12: EDS mapping thể hiện sự phân bố của các nguyên tố của các mẫu

ZnO@HA được tổng hợp ở các thời gian vi sóng khác nhau

(công suất: Medium, %kl ZnO: 5%)

Từ kết quả kích thước tinh thể ZnO và HA cũng như thành phần Zn trình bày ở bảng 3.10 nhận thấy, mẫu vật liệu HA biến tính ZnO tổng hợp với thời gian vi sóng

30 phút (ZnHA-M-30) có kích thước tinh thể ZnO và HA nhỏ nhất, mặt khác thành phần Zn xác định được đúng bằng giá trị tính toán lý thuyết là 4 %kl, tương đương với thành phần ZnO là 5% Trong khi các mẫu khác đạt được có sự chên lệch quá lớn

64 so với giá trị tính toán lý thuyết (độ chênh lệch >10%) Kết quả này cho thấy với thời gian vi sóng 30 phút, chất biến tính ZnO phân tán tốt trên HA, đồng thời các tinh thể ZnO và HA có kích thước trung bình là nhỏ nhất Từ những kết quả này, có thể xác định được thời gian vi sóng 30 phút là phù hợp

Bảng 4.10: Kích thước tinh thể của HA (dHA),ZnO (dZnO) và thành phần Zn (Zn) có trong các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở các thời gian vi sóng khác nhau (công suất: Medium, %kl ZnO: 5%, tương đương %kl Zn: 4,01%)

Mẫu ZnHA-M-15 ZnHA-M-30 ZnHA-M-45 ZnHA-M-60 dHA, nm 40,9 35,3 41,7 36,1 dZnO, nm 25,2 20,9 37,3 41,8

Ảnh hưởng của công suất vi sóng

Từ kết quả thời gian vi sóng 30 phút phù hợp ở trên, ở phần này 4 mẫu ZnO@HA với cùng thành phần 5%ZnO mang trên HA được tiến hành tổng hợp với

4 mức công vi sóng khác nhau High, Medium-High, Medium và Medium-Low trong cùng thời gian vi sóng 30 phút Các mẫu được ký hiệu lần lượt là: ZnHA-H-30, ZnHA-MH-30, ZnHA-M-30 và ZnHA-ML-30 Thành phần pha của các mẫu vật liệu sau khi tổng hợp được đánh giá thông qua kết quả nhiễu xạ tia X (hình 3.12)

65 Hình 4.13: Phổ XRD của các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở các mức công suất vi sóng khác nhau (thời gian vi sóng 30 phút; %ZnO = 5%)

Tương tự phổ XRD của các mẫu HA biến tính ZnO được điều chế với thời gian khác nhau (hình 3.12), phổ XRD của các mẫu HA biến tính ZnO tổng hợp ở các mức công suất vi sóng khác nhau cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng của HA tại các đỉnh nhiễu xạ 2 bằng 25,9, 28,1, 31,7, 32,2, 32,9, 34,0, 35,5, 38,9, 39,8, 42,3, 46,7, 48,1, 49,5, 50,5, 51,2, 52,1, 53,1 (JCPDS 009-0432) và các đỉnh đặc trưng của ZnO (JCPDS 36-1451)tại các đỉnh nhiễu xạ 2 bằng 31,8, 34,4, 36,3, 47,5 và 56,6 Nhìn chung, các đỉnh đặc trưng cho thành phần HA xuất hiện rõ, trong khi các đỉnh đặc trưng cho thành phần ZnO xuất hiện yếu, điều này được lý giải do trong mẫu HA biến tính ZnO, thành phần ZnO chỉ chiếm 5%, còn lại là HA Mặt khác do thành phần chiếm lượng thấp, ZnO phân tán tốt trên bề mặt của HA nên các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng cho thành phần ZnO xuất hiện yếu và yếu nhất đối với mẫu tổng hợp ở mức vi sóng Medium Để đánh giá lựa chọn công suất vi sóng phù hợp, tiêu chí kích thước các tinh thể ZnO và HA thu được cũng như sự phân bố chất biến tính

66 ZnO trên bề mặt HA được xem xét Hình ảnh thể hiện sự phân bố các nguyên tố, thành phần Zn (hay ZnO quy đổi) trên bề mặt HA và kích thước trung bình của các tinh thể ZnO và HA của các mẫu ZnO@HA được trình bày ở hình 3.14 và bảng 3.11 a) ZnHA-H-30 b) ZnHA-MH-30 c) ZnHA-M-30 d)ZnHA-ML-30

Hình 4.14: EDS mapping thể hiện sự phân bố các nguyên tố của các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở các công suất vi sóng khác nhau (thời gian vi sóng: 30 phút,

%kl ZnO: 5% ); a) ZnHA-H, b) ZnHA-MH, c) ZnHA-M và d) ZnHA-ML Hình 3.14 cho thấy, mẫu HA biến tính ZnO tổng hợp ở công suất vi sóng cao (ZnHA-H-30) có bề mặt nhẵn hơn so với 3 mẫu còn lại, điều này cũng dễ dàng lý giải vì mức năng lượng cao các tinh thể ZnO hình thành tương tác và liên kết với nhau tạo nên bề mặt nhẵn [36] Mặc dù có sự khác biệt nhau về kích thước tinh thể HA và ZnO (như trình bày ở bảng 3.11) nhưng thành phần Zn xác định được trên các mẫu chênh lệch nhau không quá cao, điều này có nghĩa là Zn phân bố khá đồng đều ở các mẫu Để chọn công suất vi sóng phù hợp, kết hợp thêm tiêu chí mức độ kháng khuẩn

67 của các vật liệu Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các vật liệu HA biến tính ZnO tổng hợp ở các mức công suất vi sóng khác nhau thể hiện ở bảng 3.12 Bảng 4.11: Kích thước tinh thể của HA (dHA), ZnO (dZnO) và thành phần Zn (Zn) có trong các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở công suất vi sóng khác nhau

(thời gian vi sóng: 30 phút, %kl ZnO: 5% )

Mẫu ZnHA-H-30 ZnHA-MH-30 ZnHA-M-30 ZnHA-ML-30 dHA (nm) 41,7 44,7 35,3 39,3 dZnO (nm) 31,9 41,4 20,9 37,3

Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu HA biến tính cùng hàm lượng chất biến tính 5%ZnO được tổng hợp bằng phương pháp vi sóng với công suất vi sóng khác nhau trong cùng khoảng thời gian 30 phút (ở hình 3.12) cho thấy, hai mẫu tổng hợp ở hai công suất vi sóng High và Medium-Low (ZnHA-H-30 và ZnHA-ML-30) có nồng độ ức chế tối thiểu lớn hơn, điều này có nghĩa hai mẫu này có hoạt tính kháng khuẩn yếu hơn so với hai mẫu tổng hợp ở hai công suất còn lại (ZnHA-MH-30 và ZnHA-M-30) Mặc dù kích thước các tinh thể trung bình (xác định từ kết quả XRD) cũng như hàm lượng pha ZnO (xác định bằng phổ tán xạ tia X) của các mẫu lệch nhau không nhiều, điều này có thể lý giải như sau: quan sát bề mặt vật liệu cho thấy hai mẫu được tổng hợp ở hai công suất Medium-High và Medium (ZnHA-MH-30 và ZnHA-M-30) có bề mặt tương đối đồng đều và xốp hơn so với hai mẫu ZnHA-H-30 và ZnHA-ML-30, vật liệu xốp hơn làm cho sự tiếp xúc của các loại vi khuẩn với bề mặt vật liệu tốt hơn dẫn đến khả năng kháng khuẩn của vật liệu tốt hơn

Bảng 4.12: Nồng độ ức chế tối thiểu của các mẫu ZnO@HA được tổng hợp ở công suất vi sóng khác nhau (thời gian vi sóng: 30 phút, %kl ZnO: 5% ) đối với các loại vi khuẩn khác nhau

E coli S aureus P aeruginosa Salmonella B.cereus

Chú thích: N = 20 mg/ml +: vi khuẩn mọc; : vi khuẩn không mọc

So sánh hoạt tính kháng khuẩn của 2 mẫu ZnHA-MH-30 và ZnHA-M-30 nhận thấy cả 2 mẫu thể hiện hoạt tính kháng khuẩn gần như nhau đối với các loại vi khuẩn, chỉ khác biệt đối với vi khuẩn B cereus, hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu ZnHA-MH-30 tốt hơn so với vật liệu ZnHA-M-30 (5 mg/ml so với 10 mg/ml) Tuy nhiên,

69 trong nghiên cứu này nhằm mục đích chế tạo vật liệu HA biến tính ZnO hướng đến ứng dụng trong lĩnh vực y sinh, cụ thể là trong cấy ghép xương nhân tạo Tiêu chí kháng khuẩn S aureus của vật liệu được quan tâm đánh giá hàng đầu vì vi khuẩn này là nguyên nhân gây ra viêm khớp và đau nhức xương Đối với khả năng kháng vi khuẩn S aureus, cả hai mẫu ZnHA-MH-30 và ZnHA-M-30 thể hiện hoạt tính như nhau Xét về chi phí năng lượng cho quá trình tổng hợp, tiến hành thực hiện ở công suất vi sóng Medium-High sẽ tiêu tốn chi phí cao hơn so với mức công suất vi sóng Medium Từ những kết quả đạt được cũng như phân tích về chi phí tổng hợp, mức công suất vi sóng Medium được chọn là mức phù hợp để chế tạo vật liệu HA biến tính ZnO

Từ những kết quả kết quả trên, quy trình tổng hợp HA biến tính ZnO đề xuất được trình bày ở hình 3.15, cụ thể như sau: Cân 0,367 g muối Zn(NO3)2.6H2O cho vào cốc thủy tinh Tiếp tục cho 50 ml nước cất vào và khuấy đều trên máy khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút trong thời gian 30 phút Cân 1,9 g HA, cho vào cốc thủy tinh ở trên để tiến hành phản ứng, đồng thời sử dụng NH4OH 5% để điều chỉnh pH 11 trong suốt thời gian phản ứng Duy trì phản ứng trong 2 giờ trên máy khuấy từ, ở nhiệt độ phòng Sau thời gian phản ứng, đưa hỗn hợp sau khi phản ứng vào bình cầu một cổ đặt vào lò vi sóng, lắp sinh hàn và lắp bơm nước lạnh vào sinh hàn và tiến hành chiếu vi sóng trong thời gian 30 phút ở mức công suất Medium Sau khi vi sóng, mẫu được làm nguội đến nhiệt độ phòng và được đem đi ly tâm và rửa Ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút, thời gian mỗi lần ly tâm là 15 phút Tách bỏ phần lỏng, dùng nước cất để rửa phần rắn Lặp lại quy trình, rửa  ly tâm  bỏ lỏng đến khi phần nước bỏ có pH = 7 Lần rửa cuối sử dụng cồn thay cho nước cất để rút ngắn thời gian sấy khô phần mẫu rắn thu được Phần rắn thu được sau ly tâm được mang sấy khô ở nhiệt độ 80 o C trong vòng 12 giờ Sau khi sấy, sản phẩm thu được là vật liệu HA biến tính ZnO

(*) Giá trị T = 25 o C biểu diễn cho điều kiện thực hiện là ở nhiệt độ phòng (*) Giá trị T = 25 o C biểu diễn cho điều kiện thực hiện là ở nhiệt độ phòng

70 (*) Giá trị T = 25 o C biểu diễn cho điều kiện thực hiện là ở nhiệt độ phòng

Hình 4.15: Quy trình tổng hợp HA biến tính ZnO đề xuất

NH 4 OH 5 % duy trı̀ pH = 11

Thành phần pha trong vật liệu HA biến tính ZnO

Hình 4.16: Phổ XRD của mẫu 5%ZnO@HA được tổng hợp ở điều kiện tốt nhất Hình 3.16 thể hiện phổ nhiễu xạ tia X của các mẫu HA biến tính ZnO được tổng hợp ở điều kiện tốt nhất So sánh với phổ chuẩn JCPDS No.09- 0432 của HA, ta thấy mẫu HA biến tính 5%ZnO có các peak trùng với các đỉnh đặc trưng của HA ở các góc 2θ như 26 o ; 31,5 o ; 39,7 o ; 46,5 o ; 49,5 o ;…Tương ứng với các mặt phẳng miller (002); (211); (310); (222); (213) [53], với cường độ đỉnh cao nhất ở 2θ = 31,5 o Đồng thời, phổ XRD cũng xuất hiện các đỉnh đặc trưng của ZnO (JCPDS 36-1451) và đỉnh xuất hiện rõ nhất là đỉnh tại tại vị trí 2θ = 36,3 o , tương ứng với mặt phẳng miller (101) Tuy nhiên, các đỉnh đặc trưng ZnO xuất hiện với cường độ yếu, điều này có thể do hàm lượng ZnO thấp phân tán tốt trong mẫu hoặc các tinh thể ZnO hình thành trong mạng tinh thể HA có kích thước nhỏ, các tinh thể ZnO tập trung chủ yếu ở bên trong, xen kẽ giữa các tinh thể HA, do đó đỉnh của nó xuất hiện không được rõ nét trên phổ Từ kết quả XRD ở hình 3.15, theo công thức Scherrer, kích thước tinh thể trung bình của HA và ZnO trong mẫu HA biến tính ZnO được điều chế theo quy trình tốt nhất được xác định lần lượt là 35,3 nm và 20,9 nm, hai thành phần này có sự tương đồng về kích thước.

Thành phần nguyên tố trong vật liệu HA biến tính ZnO

Hình 4.17: Ảnh EDS mapping thể hiện sự phân bố các nguyên tố (a), phổ tán xạ tia X (b) của thành phần các nguyên tố có trong vật liệu HA biến tính ZnO Ảnh EDS mapping thể hiện sự phân bố các nguyên tố có trong mẫu HA biến tính ZnO (hình 3.17a) thể hiện các nguyên tố phân bố tương đối đồng đều trên bề

73 mặt, chỉ một số ít vị trí tập trung các nguyên tố Zn (màu đỏ) Phổ tán xạ tia X (hình 3.17b) thể hiện cường độ của các đỉnh đặc trưng cho các nguyên tố O, P, Ca và Zn có trong mẫu và một vài đỉnh đặc trưng cho nguyên tố C (C của nền keo dán phủ mẫu và H không xác định bằng phép đo EDX) Thành phần các nguyên tố cũng đã được xác định, thành phần khối lượng của các nguyên tố O, P, Ca và Zn được xác định lần lượt là 45,62%, 17,89%, 32,49% và 4,00% (bảng đính kèm trong hình 3.17) Thành phần này cũng gần xấp xỉ thành phần các nguyên tố tính toán theo lý thuyết Thành phần nguyên tố Zn là 4%kl, tương đương 5 %kl ZnO (đúng theo hàm lượng đưa vào ban đầu theo tính toán lý thuyết) Kết quả này minh chứng cho sự phân bố khá đồng đều của chất biến tính ZnO trên vật liệu HA.

Các nhóm chức và liên kết đặc trưng của vật liệu HA biến tính ZnO 73

Hình 4.18: Phổ FT-IR của HA biến tính ZnO

Phổ hồng ngoại FT-IR của mẫu HA biến tính ZnO được tổng hợp bằng phương pháp vi sóng ở điều kiện tốt nhất (hình 3.18) cho thấy có sự xuất hiện dao động của các nhóm đặc trưng cho HA như PO , OH lần lượt tại các vị trí: PO ở 1043 cm 1 ,

472 cm 1 , 1092 cm 1 và 570–602 cm 1 [54, 55] tương tự như phổ FT-IR của HA thuần (hình 3.8) ; vạch dao động của OH xuất hiện ở vị trí 632 cm 1 , 3570 cm 1 và 3445

74 cm 1 [56] Chứng tỏ các nhóm chức đặc trưng của HA khi biến tính ZnO không có sự thay đổi [57] Ở dải hấp thu 429–435 cm 1 , phổ FT-IR của các mẫu ZnO@HA có xuất hiện các dao động đặc trưng của ZnO [56] Các dao động này xuất hiện rõ nét và không thấy xuất hiện dao động của các pha tạp khác Kết quả này cũng đã phần nào khẳng định cho sự thành công của phương pháp tổng hợp ZnO mang trên HA bằng phương pháp vi sóng, sản phẩm thu được có độ kết tinh cao và thuần pha của ZnO và HA, mặt khác việc biến tính ZnO không làm thay đổi trạng thái pha của HA so với ban đầu.

Hình thái bề mặt của vật liệu HA biến tính ZnO

Hình thái bề mặt của vật liệu HA biến tính ZnO được đánh giá thông qua ảnh chụp bề mặt vật liệu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) trình bày ở hình 3.19 Dựa vào ảnh SEM (hình 3.19a) ta thấy các hạt với kích thước đường kính nhỏ (dao động từ 30 đến 60 nm) liên kết với nhau tạo nên bề mặt vật liệu tương đối đồng đều, điều này cũng dễ dàng lý giải trên bề mặt vật liệu HA biến tính ZnO các hạt tinh thể HA và ZnO có kích thước khá tương đồng (như đã trình bày ở phần kết quả XRD) Ảnh TEM của mẫu ZnO@HA (hình 3.19b) cho thấy kích thước hạt trung bình của mẫu HA biến tính ZnO ước tính khoảng 50 nm So với mẫu HA thuần (hình 3.9b), sau khi biến tính ZnO, kích thước hạt trung bình của mẫu gần như không đổi

So với ảnh SEM và TEM của HA thuần (hình 3.9), bề mặt vật liệu HA biến tính ZnO không có sự khác biệt lớn Điều này có thể được lý giải do thành phần chất biến tính ZnO thấp, mặt khác ZnO phân tán đều vào bề mặt bên trong của vật liệu HA (minh chứng ở kết quả EDS mapping) và kích thước tinh thể ZnO tương đồng so với

HA như đã trình bày ở trên Từ kết quả này, có thể khẳng định, bằng phương pháp tổng hợp vi sóng thời gian ngắn (30 phút) và công suất vi sóng không cao, việc biến tính ZnO vào HA không làm giảm kích thước trung bình của tinh thể HA

75 a) b) Hình 4.19: Ảnh SEM (a) và TEM (b) của mẫu ZnO@HA.

Diện tích bề mặt riêng, đường kính lỗ xốp và kích thước lỗ xốp của vật liệu HA biến tính ZnO

Tương tự vật liệu HA, diện tích bề mặt vật liệu HA biến tính ZnO cũng được xác định bằng phân tích BET đường hấp phụ và giải hấp khí N2 được thể hiện ở hình 3.20a Kích thước lỗ xốp trong khoảng từ meso đến microporous (đường kính trong khoảng 0 – 500 Å) được xác định bằng phân tích BJH (hình 3.20b) Đường hấp phụ

- giải hấp đẳng nhiệt N2 ở hình 3.20a cho thấy mẫu ZnO@HA tổng hợp được thuộc nhóm vật liệu loại II, đặc trưng cho vật liệu có cấu trúc không xốp [58] Kích thước

76 lỗ xốp phân bố trong phạm vi 13 – 60 Å với đường kính của lỗ xốp trung bình là 24,2

Å Mẫu vật liệu ZnO@HA tổng hợp được có diện tích bề mặt riêng là 18,6 m 2 g –1 và tổng thể tích lỗ xốp là 0,023 cm 3 g –1 So với vật liệu HA thuần, vật liệu HA biến tính ZnO có đường kính lỗ xốp trung bình thay đổi không đáng kể, nhưng diện tích bề mặt riêng và thể tích lỗ xốp thấp hơn (HA thuần có diện tích bề mặt riêng là 21,6 m 2 g –1 và tổng thể tích lỗ xốp là 0,029 cm 3 g –1 ) Điều này chứng tỏ chất biến tính ZnO hình thành đã điền vào một phần cấu trúc của HA

Hình 4.20: Đường hấp phụ và giải hấp đẳng nhiệt khí N2 (a) và đường phân bố kích thước lỗ xốp được xác định bằng phân tích BJH (b) của vật liệu ZnO@HA

Các chỉ tiêu vi sinh vủa vật liệu HA biến tính ZnO

Bảng 4.13: Hình ảnh đánh giá các chỉ tiêu vi sinh của HA biến tính ZnO

Chỉ tiêu nhiễm khuẩn Samonella E coli Coliform

Môi trường không có bổ sung vi khuẩn

Môi trường có bổ sung vi khuẩn

Bảng 3.12 trình bày kết quả đánh giá chỉ tiêu vi sinh của mẫu HA biến tính ZnO được tổng hợp ở điều kiện tốt nhất thông qua đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn đối với ba loại vi khuẩn: E.coli, Samonella và Coliform, với nồng độ ZnO@HA đối chiếu là

10 -2 và 10 -1 mg/ml Qua kết quả bảng 3.12 ta thấy, so với các mẫu đối chứng (môi trường thạch vô khuẩn và môi trường thạch cấy khuẩn), trên các đĩa thạch chứa các mẫu HA biến tính ZnO nồng độ 10 -2 và 10 -1 mg/ml không xuất hiện khuẩn lạc của các vi khuẩn E.coli, Samonella và Coliform, tương tự như các đĩa thạch vô khuẩn Kết quả này chứng tỏ vật liệu HA biến tính ZnO tổng hợp đạt các chỉ tiêu vi sinh, có thể định hướng ứng dụng làm vật liệu y sinh.

Khả năng kháng khuẩn vật liệu HA biến tính ZnO

Hình 4.21: Hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu HA biến tính ZnO (E- E coli, Sta - S aureus, P -P aeruginosa, Sal - Salmonella và B - B.cereus)

Kết quả kháng khuẩn ở hình 3.21 và bảng 3.14 cho thấy vật liệu HA biến tính ZnO có khả năng kháng khuẩn đối với cả 5 loại vi khuẩn gồm: 02 vi khuẩn Gram (+)

S aureus, B cereus và 03 vi khuẩn Gram () (E coli, P.aeruginosa, Salmonella), chứng tỏ việc biến tính ZnO vào HA đem lại kết quả khả quan trong ứng dụng làm vật liệu kháng khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu đối với các vi khuẩn P.aeruginosa, Salmonella và B.cereus là 10 mg/ml, cao hơn so với nồng độ ức chế tối thiểu cuả vật

79 liệu đối với vi khuẩn E coli và S aureus (2,5 mg/ml) Sự khác nhau trong hoạt tính kháng khuẩn của vật liệu HA biến tính ZnO đối với các loại vi khuẩn có thể do thành tế bào của các vi khuẩn khác nhau và khả năng tương tác giữa vật liệu với vi khuẩn là khác nhau [59]

Bảng 4.14: Nồng độ ức chế tối thiểu của vật liệu HA biến tính ZnO đối với 5 loại vi khuẩn khác nhau

Loại vi khuẩn Nồng độ ức chế (mg/ml)

Như đã đề cập, S aureus là loại là vi khuẩn tụ cầu, là một trong những tác nhân chính gây ra các bệnh nhiễm trùng ở người và các bệnh viêm khớp Chúng cư trú chủ yếu ở da và màng nhầy Khi đã xâm nhập vào máu, khớp, phổi hay tim, chúng có thể dẫn đến tình trạng nhiễm trùng nghiêm trọng, gây nguy hiểm cho tính mạng Đối với loại vi khuẩn này, nồng độ ức chế tối thiểu của vật liệu HA biến tính ZnO thấp, chỉ 2,5 mg/ml, mặc dù hàm lượng ZnO biến tính trong vật liệu chỉ 5%kl Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng vật liệu HA biến tính ZnO làm vật liệu y sinh, điển hình trong cấy ghép xương nhân tạo trong tương lai

Từ kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của vật liệu HA biến tính ZnO tổng hợp được trong đề tài này và vật liệu nano ZnO của các nhóm nghiên cứu khác đối với hai loại vi khuẩn E.coli và S.aureus (bảng 3.15), ta thấy mặc dù tỷ lệ ZnO biến tính vào HA chỉ có 5% khối lượng nhưng kết quả kháng khuẩn của nó lại rất khả quan khi nồng độ MIC của E coli và S aureus đều là 2,5 mg/ml So với vật liệu nano ZnO, nồng độ này thấp hơn đối với vi khuẩn E coli và cao hơn đối với vi khuẩn S aureus

Sự chênh lệch này không quá lớn Từ những kết quả trên, có thể kết luận rằng, sản

80 phẩm HA biến tính 5%ZnO tổng hợp được bằng phương pháp vi sóng có kích thước nano có hoạt tính kháng khuẩn cao có khả năng ứng dụng làm vật liệu kháng khuẩn và cả vật liệu y sinh

Bảng 4.15: So sánh nồng độ ức chế tối thiểu đối với hai chủng vi khuẩn E coli và S.aureus của vật liệu HA biến tính ZnO với vật liệu nano ZnO ở một số công trình đã công bố

Mẫu Vi khuẩn MIC (mg/ml) Tài liệu tham khảo

E.coli 2,5 Tổng hợp ở đề tài