Nghiên cứu chế tạo và đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá cây và gai leo

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN VÕ THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VẬT LIỆU NANO BẠC TỔNG HỢP TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY CÀ GAI LEO So

Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu quy trình tổng hợp AgNPs từ dịch chiết lá cây cà gai leo

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu AgNPs tổng hợp từ dịch chiết lá cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour.)

3 nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung thêm quy trình mới trong phương pháp tổng hợp vật liệu nano và cung cấp thêm dẫn chứng khoa học về vai trò kháng khuẩn của AgNPs

- Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thực hiện nghiên cứu quy trình tổng hợp AgNPs từ dịch chiết lá cây cà gai leo Đây là phương pháp tổng hợp xanh vật liệu nano với chi phí thấp, thân thiện và không gây độc hại cho môi trường Đề tài sẽ có giá trị lớn trong ngành khoa học vật liệu và y sinh Ứng dụng tạo ra các sản phẩm hạn chế tình trạng kháng thuốc ở các loài vi sinh vật

- Chương 1 Tổng quan tài liệu

- Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận

- Kết luận và kiến nghị

5 Những đóng góp mới của đề tài

Tính mới hấp dẫn trong nghiên cứu này là tổng hợp AgNPs từ dịch chiết lá cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour.) trồng tại Việt Nam Nghiên cứu trên đối trượng này chưa được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về nano bạc

Theo định nghĩa của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), Nano bạc (AgNPs) là dạng vật chất kim loại bạc ở kích thước nano với đường kính nằm trong khoảng từ 1 – 100nm Do kích thước nhỏ như vậy nên diện tích bề mặt tiếp xúc của AgNPs lớn hơn rất nhiều so với nguyên tử bạc thông thường Chỉ với một hàm lượng nhỏ trong dung dịch ở nồng độ phần triệu (ppm), AgNPs cũng thể hiện hoạt tính một cách hiệu quả

AgNPs là một dạng hạt tồn tại của kim loại bạc Các hạt này có kích thước nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được AgNPs có tỉ lệ diện tích bề mặt lớn hơn hàng triệu lần so với kim loại bạc Vì vậy, tính chất đặc hiệu của bạc được tăng lên đáng kể AgNPs có kích thước phổ biển nằm trong khoảng từ 10 – 100nm 3

AgNPs tồn tại dưới dạng dung dịch Các sản phẩm AgNPs thường được gọi với tên gọi khác là keo bạc Điều này khiến nhiều người lầm tưởng dung dịch AgNPs có độ nhớt như dạng keo Thực tế, dung dịch AgNPs sẽ có độ nhớt tương đương với nước nếu quan sát bằng mắt thường Màu của dung dịch là màu của AgNPs Trong khi các dung dịch chất thông thường luôn cố định chỉ thay đổi độ đậm – nhạt màu tùy theo nồng độ thì dung dịch AgNPs thay đổi màu sắc từ vàng tới đỏ sẫm phụ thuộc nồng độ AgNPs Dung dịch có màu vàng nhạt với nồng độ 50pp, chuyển sang màu đỏ với nồng độ 500pp và có thể chuyển sang xanh đen khi đạt nồng độ 5000pp Tính chất đặc biệt này chỉ riêng AgNPs mới có Do đó, các dung dịch AgNPs trong suốt được quảng cáo trên thị trường thường không chứa các hạt nano hoặc nồng độ rất thấp AgNPs không tồn tại ở thể rắn nên các loại bột bán trên thị trường đều không hề chứa hạt nano 3

AgNP có cấu trúc 3 phần gồm lõi bạc, lớp điện tích trên bề mặt hạt và chất bảo vệ Lớp điện tích cùng với chất bảo vệ giúp cấu trúc nano bền hơn đồng thời tạo ra những đặc điểm mà chỉ ở bạc với kích thước nano mới có được

Hình 1.1 Cấu trúc hạt nano bạc

Phần lõi gồm các nguyên tử bạc sắp xếp dạng tinh thể khối với số lượng tùy thuộc vào kích thước và hình dáng hạt AgNPs Ví dụ 1 hạt AgNPs hình cầu, kích thước hạt là 20nm có thể chứa đến 125.000 hạt nguyên tử bạc Như vậy chỉ với một kích thước nhỏ cỡ nano mà tập trung được một lượng lớn hoạt chất cho thấy chỉ cần ở nồng độ thấp các hạt AgNPs thể hiện được hoạt tính của mình

Bề mặt hạt AgNPs là các nguyên tử bạc và ion bạc Ag + xen kẽ nhau Tại đó liên tục diễn ra quá trình cân bằng động chuyển đổi giữa các nguyên tử

Ag và ion Ag + Khi gặp các bề mặt có tính oxi hóa như bề mặt virus, vi khuẩn thì ion Ag + sẽ được tạo ra liên tục từ hạt AgNPs cho hiệu quả tiêu diệt virus, vi khuẩn và nấm cao

Lớp vỏ hạt AgNPs được bao quanh là các phân tử bảo vệ giúp ổn định bề mặt hạt, giữ hạt AgNPs ở kích thước quy định tránh sa lắng và kết tụ Ngoài ra, một số loại hạt AgNPs đặc biệt có lớp vỏ bảo vệ có hoạt tính sinh học giúp điều biến tính chất của hạt nano Ví dụ TSN – phức hợp của hạt AgNPs có chứa lớp vỏ là Tannic acid có ái lực mạnh với các loại virus do đó tăng khả năng bám dính của khối AgNPs vào virus, tạo điều kiện giải phóng nhiều ion

Ag + và tiêu diệt virus.

Hình 1.2 Thành phần cấu tạo hạt AgNPs 1.2 Các phương pháp điều chế nano bạc

Vật liệu nano bạc có thể được điều chế bằng hai phương thức cơ bản:

Phương pháp từ trên xuống (top – down) là phương pháp tạo các hạt nano từ vật liệu khối ban đầu Vật liệu khối được chia thành các hạt nhỏ bằng cách giảm kích thước bằng các kỹ thuật vật lý và hóa học khác nhau Các phương pháp từ trên xuống ít được sử dụng, vì AgNPs chế tạo bằng phương pháp này thường có kích thước hạt lớn và không đồng đều

Phương pháp từ dưới lên (bottom-up) là phương pháp tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau Đối với hạt AgNPs, người ta thường điều chế bằng phương pháp này Nguyên tắc là khử ion Ag thành Ag Các ion này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các hạt nano này được bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan Cách tiếp cận này bao gồm các phương pháp sản xuất hóa học và sinh học

1.2.1.1 Kỹ thuật ăn mòn bằng tia laser

Bào chế AgNPs bằng phương pháp vật lý RF plasma Kỹ thuật này sử dụng tia laser với bước sóng ngắn để cắt bỏ kim loại trong dung dịch mà không có thuốc thử hóa học Phương pháp này cho phép thu được hạt AgNPs tinh khiết Nồng độ và hình thái của các hạt nano bị ảnh hưởng bởi số lượng chùm tia laser Hạt nano thu được thường có kích thước khoảng 10nm

Ngoài ra, có thể sử dụng sóng điện từ năng lượng cao như tia gamma, tia tử ngoại để khử ion kim loại Dưới tác dụng của các tác nhân này, các chất phụ gia trong dung môi được biến đối để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại 1, 3

1.2.1.2 Kỹ thuật hóa lý tạo AgNPs tinh khiết

Cấu trúc luận văn

- Chương 1 Tổng quan tài liệu

- Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận

- Kết luận và kiến nghị

Những đóng góp mới của đề tài

Tính mới hấp dẫn trong nghiên cứu này là tổng hợp AgNPs từ dịch chiết lá cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour.) trồng tại Việt Nam Nghiên cứu trên đối trượng này chưa được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

Giới thiệu về nano bạc

Theo định nghĩa của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), Nano bạc (AgNPs) là dạng vật chất kim loại bạc ở kích thước nano với đường kính nằm trong khoảng từ 1 – 100nm Do kích thước nhỏ như vậy nên diện tích bề mặt tiếp xúc của AgNPs lớn hơn rất nhiều so với nguyên tử bạc thông thường Chỉ với một hàm lượng nhỏ trong dung dịch ở nồng độ phần triệu (ppm), AgNPs cũng thể hiện hoạt tính một cách hiệu quả

AgNPs là một dạng hạt tồn tại của kim loại bạc Các hạt này có kích thước nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy được AgNPs có tỉ lệ diện tích bề mặt lớn hơn hàng triệu lần so với kim loại bạc Vì vậy, tính chất đặc hiệu của bạc được tăng lên đáng kể AgNPs có kích thước phổ biển nằm trong khoảng từ 10 – 100nm 3

AgNPs tồn tại dưới dạng dung dịch Các sản phẩm AgNPs thường được gọi với tên gọi khác là keo bạc Điều này khiến nhiều người lầm tưởng dung dịch AgNPs có độ nhớt như dạng keo Thực tế, dung dịch AgNPs sẽ có độ nhớt tương đương với nước nếu quan sát bằng mắt thường Màu của dung dịch là màu của AgNPs Trong khi các dung dịch chất thông thường luôn cố định chỉ thay đổi độ đậm – nhạt màu tùy theo nồng độ thì dung dịch AgNPs thay đổi màu sắc từ vàng tới đỏ sẫm phụ thuộc nồng độ AgNPs Dung dịch có màu vàng nhạt với nồng độ 50pp, chuyển sang màu đỏ với nồng độ 500pp và có thể chuyển sang xanh đen khi đạt nồng độ 5000pp Tính chất đặc biệt này chỉ riêng AgNPs mới có Do đó, các dung dịch AgNPs trong suốt được quảng cáo trên thị trường thường không chứa các hạt nano hoặc nồng độ rất thấp AgNPs không tồn tại ở thể rắn nên các loại bột bán trên thị trường đều không hề chứa hạt nano 3

AgNP có cấu trúc 3 phần gồm lõi bạc, lớp điện tích trên bề mặt hạt và chất bảo vệ Lớp điện tích cùng với chất bảo vệ giúp cấu trúc nano bền hơn đồng thời tạo ra những đặc điểm mà chỉ ở bạc với kích thước nano mới có được

Hình 1.1 Cấu trúc hạt nano bạc

Phần lõi gồm các nguyên tử bạc sắp xếp dạng tinh thể khối với số lượng tùy thuộc vào kích thước và hình dáng hạt AgNPs Ví dụ 1 hạt AgNPs hình cầu, kích thước hạt là 20nm có thể chứa đến 125.000 hạt nguyên tử bạc Như vậy chỉ với một kích thước nhỏ cỡ nano mà tập trung được một lượng lớn hoạt chất cho thấy chỉ cần ở nồng độ thấp các hạt AgNPs thể hiện được hoạt tính của mình

Bề mặt hạt AgNPs là các nguyên tử bạc và ion bạc Ag + xen kẽ nhau Tại đó liên tục diễn ra quá trình cân bằng động chuyển đổi giữa các nguyên tử

Ag và ion Ag + Khi gặp các bề mặt có tính oxi hóa như bề mặt virus, vi khuẩn thì ion Ag + sẽ được tạo ra liên tục từ hạt AgNPs cho hiệu quả tiêu diệt virus, vi khuẩn và nấm cao

Lớp vỏ hạt AgNPs được bao quanh là các phân tử bảo vệ giúp ổn định bề mặt hạt, giữ hạt AgNPs ở kích thước quy định tránh sa lắng và kết tụ Ngoài ra, một số loại hạt AgNPs đặc biệt có lớp vỏ bảo vệ có hoạt tính sinh học giúp điều biến tính chất của hạt nano Ví dụ TSN – phức hợp của hạt AgNPs có chứa lớp vỏ là Tannic acid có ái lực mạnh với các loại virus do đó tăng khả năng bám dính của khối AgNPs vào virus, tạo điều kiện giải phóng nhiều ion

Ag + và tiêu diệt virus.

Các phương pháp điều chế nano bạc

Vật liệu nano bạc có thể được điều chế bằng hai phương thức cơ bản:

Phương pháp từ trên xuống (top – down) là phương pháp tạo các hạt nano từ vật liệu khối ban đầu Vật liệu khối được chia thành các hạt nhỏ bằng cách giảm kích thước bằng các kỹ thuật vật lý và hóa học khác nhau Các phương pháp từ trên xuống ít được sử dụng, vì AgNPs chế tạo bằng phương pháp này thường có kích thước hạt lớn và không đồng đều

Phương pháp từ dưới lên (bottom-up) là phương pháp tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau Đối với hạt AgNPs, người ta thường điều chế bằng phương pháp này Nguyên tắc là khử ion Ag thành Ag Các ion này sau đó liên kết với nhau tạo thành hạt nano và các hạt nano này được bọc bởi các chất ổn định như PVP, PVE, chitosan Cách tiếp cận này bao gồm các phương pháp sản xuất hóa học và sinh học

1.2.1.1 Kỹ thuật ăn mòn bằng tia laser

Bào chế AgNPs bằng phương pháp vật lý RF plasma Kỹ thuật này sử dụng tia laser với bước sóng ngắn để cắt bỏ kim loại trong dung dịch mà không có thuốc thử hóa học Phương pháp này cho phép thu được hạt AgNPs tinh khiết Nồng độ và hình thái của các hạt nano bị ảnh hưởng bởi số lượng chùm tia laser Hạt nano thu được thường có kích thước khoảng 10nm

Ngoài ra, có thể sử dụng sóng điện từ năng lượng cao như tia gamma, tia tử ngoại để khử ion kim loại Dưới tác dụng của các tác nhân này, các chất phụ gia trong dung môi được biến đối để sinh ra các gốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại 1, 3

1.2.1.2 Kỹ thuật hóa lý tạo AgNPs tinh khiết

Theo các nghiên cứu gần đây, phương pháp điện phân kết hợp siêu âm có thể dùng để sản xuất ra hạt AgNPs tinh khiết mà không cần sử dụng chất hoạt động bề mặt hoặc chất ổn định Bình thường phương pháp điện phân chỉ tạo ra lớp màng kim loại trên bề mặt điện cực Nhờ có siêu âm, các hạt sẽ rời điện cực và đi vào trong dung môi nước

1.2.1.3 Kỹ thuật Plasma điện hóa

Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một dây bạc làm điện cực, nhúng trong dung môi nước Trong quá trình phóng điện, lớp bề mặt của dây bạc bị ăn mòn và được khử ngay bởi plasma tạo ra các hạt AgNPs Ngoài ra, plasma còn giải phóng các electron tích điện âm khiến các hạt AgNPs đẩy nhau, tránh kết tụ Phương pháp này có thể khử triệt để các ion bạc nên dung dịch AgNPs ổn định lâu dài và an toàn Các hạt AgNPs tạo ra có kích thước từ 20 – 30 nm 1

Hình 1.3 Bào chế AgNPs bằng phương pháp vật lý RF plasma

1.2.2 Phương pháp hóa học Để tổng hợp AgNPs bằng phương pháp hóa học cần sử dụng muối bạc, chất khử và chất ổn định để kiểm soát sự hình thành các hạt nano Muối bạc nitrat được sử dụng để tạo ra hạt nano do chi phí thấp và ổn định hóa học hơn các muối khác Các chất khử được sử dụng là borohydrid, citrat, ascorbate và khí hydro Trong đó borohydrid là một chất khử mạnh có thể tạo ra hạt có kích thước nhỏ với tốc độ khử nhanh Đồng thời nó có vai trò như chất ổn định để tránh kết tụ trong quá trình phân hủy

* Phương pháp khử hóa học: Nguyên tắc của phương pháp này là chuyển electron lên ion Ag + để đưa ion về nguyên tử Ag 0 Các nguyên tử

Ag 0 này kết dính với nhau tạo ra hạt Ag có kích thước lớn hơn Theo phương pháp này, các chất sử dụng gồm nguyên liệu đầu vào chứa ion Ag + như

Ag2SO4, AgNO3 hay AgClO4, và chất khử như muối citrate, borohydride, ascorbic acid, glucose, formaldehyde, ethylene glycol hay dung dịch chiết từ cây

Phương trình khử Ag + bằng các chất khử NaBH4 , ascorbic acid và citrate có thể được viết gọn như sau:

Sự hình thành hạt nano Ag diễn ra theo trình tự từ ion Ag + đến nguyên tử Ag 0 và kết dính lại tạo ra hạt Ag có kích thước vài nm

Ngoài ra để các hạt nano phân tán tốt trong môi trường, người ta có thể sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt tĩnh điện trái dấu sẽ đẩy nhau, tránh kết tụ Mặt khác có thể sử dụng các chất hoạt động bề mặt để bọc các hạt nano Kích thước hạt AgNPs tạo ra nhờ phương pháp này nằm trong khoảng từ 10nm -100nm 1,3

1.2.3 Phương pháp sinh học (tổng hợp xanh hạt nano)

Trong các nghiên cứu gần đây, người ta đã chứng minh rằng vi sinh vật và thực vật có thể được sử dụng để tổng hợp các hạt nano theo cách vừa thân thiện với môi trường vừa an toàn khi sử dụng Vi khuẩn và thực vật có khả năng hấp thụ và lưu trữ các ion kim loại vô cơ từ môi trường Do đặc tính hấp dẫn của chúng, nhiều sinh vật sống là nhà máy sinh học hiệu quả, giảm thiểu ô nhiễm đồng thời thu hồi kim loại từ chất thải công nghiệp Khả năng một sinh vật sống sử dụng các quá trình trao đổi chất để biến đổi các ion kim loại vô cơ thành các hạt nano kim loại đã mở ra cánh cửa cho một lĩnh vực nghiên cứu tương đối mới và chủ yếu chưa được khai thác rộng rãi 14 Kể từ khi phát hiện ra khả năng tương tác, loại bỏ và thu thập các nguyên tố kim loại từ môi trường xung quanh của vi khuẩn, một số ứng dụng công nghệ sinh học, chẳng hạn như xử lý sinh học và lọc sinh học đã được phát triển 15 Chúng có thể tương tác với môi trường nhờ màng lưỡng tính dựa trên lớp lipid kép, cho phép diễn ra nhiều quá trình oxy hóa-khử khác nhau và thúc đẩy các biến đổi sinh hóa 16 Các vi sinh vật phát triển trong những môi trường cụ thể cũng có thể đẩy nhanh quá trình oxy hóa và khử liên kết trong quá trình hình thành hạt nano 17 Tuy nhiên, cơ chế oxy hóa - khử vẫn chưa được con người biết đến Vẫn cần nhiều nghiên cứu để hiểu đầy đủ và giải thích sự khác biệt về kích thước và hình dạng hạt nano giữa các kim loại khác nhau khi chúng được tạo ra bởi cùng một vi sinh vật Ngay cả khi nói đến việc sử dụng thực vật để tạo ra các hạt nano, điều này vẫn đúng Có một số lợi ích khi sử dụng thực vật thay vì các hệ thống sinh học thân thiện với môi trường khác như vi khuẩn và nấm, chẳng hạn như loại bỏ các phương pháp chuẩn bị và phân lập tốn kém và tốn thời gian Ngược lại, việc sử dụng thực vật hoặc chiết xuất từ thực vật để tạo ra hạt nano thường được coi là an toàn và hiệu quả hơn so với việc sử dụng các hệ thống sinh học khác để sản xuất hạt nano Một ưu điểm khác của quá trình sinh tổng hợp từ thực vật so với các cách khác là đây là một quá trình đơn giản và có thể dễ dàng mở rộng quy mô để sản xuất hạt nano ở quy mô lớn Đây là một lợi thế đáng kể so với các lựa chọn thay thế khác

Tổng hợp từ dịch chiết thực vật: ưu điểm chính của việc sử dụng dịch chiết từ thực vật để tổng hợp các hạt AgNPs là dễ dàng có sẵn, an toàn với môi trường và trong nhiều trường hợp có sẵn các chất chuyển hóa có thể hỗ trợ trong việc khử các ion bạc, và nhanh hơn so với vi khuẩn trong quá trình tổng hợp 5,7 Cơ chế chính của quá trình này là sự khử các ion bởi các hoạt chất từ thực vật Các hoạt chất thực vật chính tham gia là terpenoid, flavon, xeton, andehit, amit và axit cacboxylic Flavon, axit hữu cơ và quinon là các hoạt chất thực vật hòa tan trong nước có vai trò khử các ion Mặc dù ở từng loại cây khác nhau có sự tham gia của các hoạt chất khác nhau nhưng cơ chế chính tham gia là các quá trình khử ion Các phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ thực hiện, thân thiện với môi trường do không sử dụng các chất độc hại Tổng hợp các hạt AgNPs bằng cách sử dụng chiết xuất thực vật như vỏ tươi của cây búp Ấn Độ (Pongamia pinnata), 18 chiết xuất quả đu đủ (Carica papaya), 19 vỏ thân cây

Boswellia ovalifoliolata (là một loài thực vật có hoa trong họ Burseraceae), 20 lá cây mắt nai (Alternanthera dentata), cây nam nghiến (Boerhaavia diffusa),

Ficus carica loài thực vật có hoa trong họ Hoa môi, cây sả (Cymbopogan citratus), cây Tài tượng Ấn (Acalypha indica) và cách cỏ cây (Premna herbacea), 40-46 chiết xuất hạt của Cây hồ trăn Đại Tây Dương (Pistacia atlantica), Trachyspermum ammi (loài thực vật có hoa trong họ Hoa tán),

Thảo bạc gân (Argyreia nervosa) và cây Phá cố chỉ (Psoralea corylifolia), 21-24 chiết xuất quả lựu (Punica granatum) và nho (Vitis vinifera) 25,26 Vì vậy các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp tổng hợp sinh học Phương pháp sinh tổng hợp ra các hạt AgNPs có độ phân bố khá đồng đều và có khả năng sản xuất ra với qui mô lớn do các hạt được ổn định ngay trong quy trình tổng hợp 27, 28

Hoạt tính kháng khuẩn của AgNPs

Tình trạng đa kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh đối với thuốc kháng sinh đã trở thành trở ngại lớn cho việc chẩn đoán và quản lý thành công các bệnh truyền nhiễm Những tiến bộ gần đây trong các loại thuốc dựa trên công nghệ nano đã mở ra những chân trời mới để chống lại tình trạng đa kháng thuốc ở vi sinh vật Đặc biệt, việc sử dụng hạt nano bạc (AgNPs) làm chất kháng khuẩn mạnh đã nhận được nhiều sự quan tâm Các thông số hóa lý quan trọng nhất ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của AgNPs bao gồm kích thước, hình dạng, điện tích bề mặt, nồng độ và trạng thái keo AgNPs thể hiện tiềm năng kháng khuẩn của chúng thông qua các cơ chế nhiều mặt Người ta nhận thấy rằng việc giảm kích thước của AgNP sẽ tăng cường tính ổn định và khả năng tương thích sinh học của chúng 29 Do đó, cần phải thiết kế các hạt nano có kích thước, hình dạng phù hợp với các đặc tính bề mặt mong muốn để sử dụng trong nhiều can thiệp lâm sàng và điều trị khác nhau

Sự bám dính của AgNPs vào tế bào vi sinh vật, thâm nhập vào bên trong tế bào, ROS và tạo gốc tự do cũng như điều chế các đường dẫn truyền tín hiệu của vi sinh vật đã được công nhận là phương thức hoạt động kháng khuẩn nổi bật nhất Mặt khác, việc tiếp xúc với tế bào người của AgNPs gây ra độc tính tế bào, nhiễm độc gen và phản ứng viêm trong tế bào người theo cách phụ thuộc vào loại tế bào Điều này đã làm dấy lên mối lo ngại về việc sử dụng AgNPs trong trị liệu và phân phối thuốc Dựa trên nghiên cứu được thực hiện cho đến nay, AgNP có thể được thiết kế để tăng hiệu quả, tính ổn định, tính đặc hiệu, an toàn sinh học và khả năng tương thích sinh học của chúng

Hình dạng của hạt nano là một trong những tính chất ảnh hưởng đến các tính chất hóa lý khác của hạt nano 30 AgNP tương tác với vi khuẩn, nấm và virus theo cách phụ thuộc vào hình dạng 31 Hình ảnh TEM lọc năng lượng đã cho thấy những thay đổi trong màng tế bào của vi khuẩn E coli gram âm khi xử lý với các AgNP có hình dạng khác nhau, cả trong môi trường thạch lỏng và bán rắn 32 So với AgNP hình cầu hoặc hình que, AgNP hình tam giác cắt cụt cho thấy tác dụng kháng khuẩn được tăng cường 32,33 Tuy nhiên, các AgNP có cùng diện tích bề mặt, hình dạng khác nhau cho thấy hoạt tính diệt khuẩn khác nhau, điều này có thể là do sự thay đổi về diện tích bề mặt hiệu quả và các mặt hoạt động của AgNP Các chất hóa học bề mặt khác nhau, chẳng hạn như carbon xốp, poly (N-vinyl-2-pyrrolidone) (PVP) và albumin huyết thanh bò (BSA) cũng có thể ảnh hưởng đến sự tương tác của AgNP với vi rút, chẳng hạn như virus HIV-1 và gây ra sự ức chế của chúng 34 Vì cả BSA và PVP đều được bao bọc hoàn toàn và được bao bọc trực tiếp trên bề mặt hạt nano nên về cơ bản không có diện tích bề mặt lộ ra cho tương tác AgNP-virus Ngược lại, các hạt nano bạc cacbon xốp, có diện tích bề mặt tiếp xúc để virus bám vào, có độc tính tế bào cao hơn và gây ra sự ức chế tương đối cao hơn AgNPs với hóa học bề mặt BSA và PVP 34 Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Hoàng và công sự năm 2023, đã cho thấy việc chế tạo vật liệu nano bạc sử dụng vi sóng 1,5 phút hoặc 3 phút đã mang lại cho chúng hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn so với 5 phút 35 Cùng với kết quả phân tích TEM và tia X cho thấy khi xử lý vi sóng 1,5 phút trong dung dịch vẫn còn nhiều tinh thể AgNO3 Do đó, hoạt tính kháng khuẩn đo được phải do cả AgNO 3 và AgNPs Tuy nhiên, khi thời gian vi sóng tăng lên 3 phút, các tinh thể AgNO3 biến mất và hình thành các AgNPs với nhiều hình dạng khác nhau, đặc tính diệt khuẩn của chúng được tăng cường nhờ sự có mặt của (111) và (200) khía cạnh Các dây nano bạc (AgNW) được tạo ra sau 5 phút vi sóng không cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cao Có thể là do hình dạng của chúng cản trở khả năng liên kết với màng, và do đó khả năng thâm nhập của chúng Nhiều cơ chế có thể đã được đề xuất để giải thích hoạt động kháng khuẩn của bạc Các hạt nano bạc có thể tích tụ trong các lỗ trên thành tế bào và gây biến tính màng tế bào dẫn đến chết tế bào Chúng cũng có khả năng xuyên qua thành tế bào vi khuẩn và sau đó làm thay đổi cấu trúc của màng tế bào Các AgNP có cùng diện tích bề mặt nhưng hình dạng khác nhau cho thấy hoạt tính diệt khuẩn khác nhau, có thể do sự khác biệt về diện tích bề mặt hiệu quả và các khía cạnh hoạt động của AgNP Tuy nhiên, hiện tại có rất ít thông tin về hình dạng của các hạt nano ảnh hưởng như thế nào đến hoạt động sinh học của AgNP.

Giới thiệu về cây Cà gai leo

Cà gai leo hay còn được gọi là cà gai dây, cà vạnh, cà lù, cà bò và có tên khoa học là Solanum procumbens Lour thuộc họ Solanaceae Loài cây này thường được trồng rộng rãi ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt Nam Cà gai leo thuộc loài cây leo nhỏ, chia nhiều cành, có chiều dài trung bình từ 60 -

100 cm Lá cây cà gai leo có màu xanh, mọc so le, hình trứng hoặc thuôn dài, dưới gốc lá hình lưỡi rìu hay hơi tròn, mặt dưới lá hình sao có nhiều lông mềm, màu trắng nhưng không bị nhám, mặt trên của lá có gai Cây cà gai leo ra hoa từ tháng 4 đến tháng 9 và có quả vào tháng 9 đến tháng 12 Cây cà gai leo cho quả mọng, bóng, màu đỏ, hình cầu đường kính của quả dao động từ 7

- 9 mm Hạt màu vàng nhạt, dạng thận hình đĩa, kích thước 3 x 2 mm Đối với loại cà gai leo có nhiều gai thì sẽ có cành xòe rộng 36

Cà gai leo là loài cây được xem là cây thuốc nam có vị hơi the, tính ấm, có tác dụng giải độc gan Cà gai leo là một vị thuốc nam quý được Y Học Cổ Truyền ghi nhận về tác dụng ổn định tế bào gan, tăng cường chức năng của gan Cà gai leo còn có chứa một số thành phất chất hóa học quan trọng như: Flavonoid, saponin, sterol, acid amin, alkaloid Đồng thời, phần lá và rễ cà có nhiều dược tính hỗ trợ cho sức khỏe con người như: Solamnia A, Solamnia

B, glycoalkaloid, cholesterol, 3beta-Hydroxy-5alpha-pregnan-20-one, dihydro lanosterol 36 Vì vậy, cà gai leo có rất nhiều công dụng trong chữa bệnh Các nhà nghiên cứu đã khám phá rộng rãi tầm quan trọng về mặt y học của loài thực vật này, nhưng nó vẫn chưa được khám phá về khả năng sử dụng nó trong việc ổn định và giảm tác động đến môi trường của các phương pháp

“hóa học xanh” Nó có một số đặc tính chữa bệnh với hoạt tính chống khối u và kháng khuẩn, cũng như hàm lượng polyphenol và flavonoid cao hơn, đóng vai trò quan trọng trong việc khử muối kim loại trong các hạt nano ổn định.

Ứng dụng của nano bạc

Ứng dụng của bạc đã được biết đến từ thời xưa khi người ta dùng bình bằng bạc đựng nước hay dùng đồng xu bằng kim loại bạc để kháng khuẩn 37

Từ thế kỷ thứ XVII, con người cũng dùng kim loại Bạc cho nhiều ứng dụng khác nhau trong chữa bệnh Từ 1980 đến 2010, thế giới có khoảng 7500 bằng phát minh, sáng chế liên quan đến AgNPs 38 Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của AgNPs là rất lớn Nghiên cứu năm 2011 cho thấy có khoảng trên 300 sản phẩm tiêu dùng sử dụng AgNPs Trong số các ứng dụng của AgNPs thì chủ yếu là đến từ khả năng kháng khuẩn của AgNPs, sau đó là đặc tính quang học cho cảm biến và số khác ứng dụng tính xúc tác Bạc với kích thước vài micrometre (5 - 10 àm) được ứng dụng rộng rói trong cỏc thiết bị điện tử nhờ tính dẫn điện cao

1.5.1 Ứng dụng làm vật liệu kháng khuẩn Ứng dụng này dùng bạc dưới dạng hạt nano hay dung dịch ion Ag+ Hạt nano được trộn vào trong vật liệu polymer, ceramic để lọc nước, hay tráng lên bề mặt thiết bị y tế, 5, 47, 48 giấy, 47 sơn kháng khuẩn 49 hay dụng cụ gia dụng như máy giặt, thiết bị điều ẩm, lọc khí, máy điều hòa, quần áo sử dụng trong môi trường y tế, bít tất, miếng lót giày chống mùi hôi AgNPs cũng được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, dệt may Dạng ion Ag+được sử dụng để tẩm thiết bị lọc nước trên nền đất sét để kháng khuẩn

Tính kháng khuẩn của bạc còn có tác dụng quan trọng trong chữa bệnh vì hiện nay vấn đề kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn ngày càng trầm trọng 39,40 Các tổ chức quốc tế đang kêu gọi các nhà khoa học tìm kiếm giải pháp để hạn chế, thay thế một số loại thuốc kháng sinh hiện nay 36 Các nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của bạc với thuốc kháng sinh như gentamicin, ofloxacin và ampicilin làm tăng khả năng diệt khuẩn lên hai lần so với trường hợp chỉ sử dụng thuốc kháng sinh Điều này cho thấy bạc có tác dụng tích cực trong ứng dụng kháng khuẩn gây bệnh Ngoài ra, AgNPs còn được khảo sát cho các ứng dụng kháng nấm, kháng virus, chống sưng tấy, chống ung thư và hạn chế sự phát triển mất cân bằng của mô (anti-angiogenic) 36

1.5.2 Ứng dụng trong các lĩnh vực y tế

+ Khả năng kháng virus: hạt nano bạc đã được chứng minh là có tác dụng chống virus HIV-1 ở nồng độ không gây độc tế bào Các hạt nano bạc được điều chế sinh học đã ức chế khả năng tồn tại của virus herpes simplex (HSV) loại 1, loại 2 và virus para cúm ở người loại 3 dựa trên kích thước và điện thế zeta Việc xử lý các tế bào vero với nồng độ không gây độc tế bào của các hạt nano bạc đã ức chế đáng kể bởi sự sao chép của Virus paste des petits (PPRV), cơ chế nhân lên của virus là do sự tương tác của các hạt nano bạc với lõi virion

+ Tiềm năng trong điều trị ung thư: AgNPs có tiềm năng chống ung thư vì nó ngăn cản chuỗi hô hấp của ty thể, tăng tốc độ tổng hợp các loại oxy phản ứng (ROS), tổng hợp ATP và cuối cùng dẫn đến tổn thương DNA và chết tế bào ung thư

+ Do có nhiều đặt tính ưu việt và là công nghệ sạch, AgNPs đã và đang được nhiều nước phát triển ứng dụng sâu rộng trong lĩnh vực y tế Sau đây là một số ứng dụng của trong lĩnh vực y tế:

- Vệ sinh, diệt sạch khuẩn và khử mùi bệnh viện, thiết bị dụng cụ phẩu thuật…

- Rửa tay phòng ngừa dịch bệnh

- Xử lí mùi hôi rác thải, nước thải và ngăn chặng bệnh lây lan

- Nguyên liệu làm dung dịch rửa phụ khoa, kem trị bệnh ngoài da, băng trị bỏng…

1.5.3 Ứng dụng trong nông nghiệp

Phòng và trị bệnh do nấm, khuẩn và virus gây ra (thay thế hoàn thoàn thuốc bảo vệ thực vật hóa học dùng để phòng trị bệnh trên cây trồng) Sử dụng AgNPs thường xuyên định kỳ theo các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây giúp cây trồng ngăn ngừa chủ động từ xa dịch bệnh, giảm chi phí, tăng giá trị nông sản Phòng và đặc trị bệnh do các vi sinh vật đơn bào gây ra trên tôm, cá, ba ba, ếch 3

1.5.4 Ứng dụng trong công nghiệp

Bạc ở kích thước nano là vật liệu có các tính chất quang học, khả năng dẫn điện và dẫn nhiệt cao Ngoài ra, bạc là một trong những kim loại có độ cứng và khả năng chống mài mòn cao nhất Vì vậy, AgNPs có thể được tích hợp vào các sản phẩm đa dạng từ các loại pin quang điện, các sản phẩm điện tử, các chi tiết cần độ dẫn nhiệt cao, tới các sản phẩm cảm biến sinh học và hóa học Sự có mặt của AgNPs giúp cho các sản phẩm này có độ dẫn diện, dẫn nhiệt cao, ổn định và có độ bền cao Hiện nay, các nhà sản xuất đã sản xuất các hàng tiêu dùng sử dụng tính chất kháng khuẩn của các hạt AgNPs như tủ lạnh, điều hòa và máy giặt Ngoài ra các loại đồ chơi, quần áo, hộp đựng thực phẩm, chất tẩy quần áo cũng đã sử dụng AgNPs Ứng dụng sản xuất sợi nhân tạo dùng dệt vải, khăn quần áo có chức năng kháng khuẩn, chống hôi AgNPs được phủ lên bề mặt mà được đưa vào trong sản phẩm qua qui trình nóng chảy dùng sản xuất tấm ra trải giường, khăn lau chén, bát, thảm trải nền nhà, túi bọc tấm đệm giường, quần áo cũng như các sản phẩm vệ sinh khác như quần áo cho bệnh viện, quần áo bảo vệ, khẩu trang 4

1.5.5 Ứng dụng trong xử lý môi trường

Kích thước hạt AgNPs có khả năng diệt khuẩn cao và thể hiện vai trò diệt khuẩn cực mạnh trong môi trường nước Trong quá trình di chuyển và phân tán ở môi trường nước, hạt AgNPs vừa khử mùi và tiêu diệt mầm bệnh

Vì vậy AgNPs ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong xử lý nguồn nước ô nhiễm chứa hàm lượng vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là trong quá trình xử lý làm sạch nước ở các ao hồ thủy sản, tiêu diệt các vi sinh vật gây hại.

Tình hình nghiên cứu chế tạo nano bạc bằng phương pháp sinh học từ thực vật trên thế giới và Việt Nam

từ thực vật trên thế giới và Việt Nam

Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp các hoạt nano bạc từ thực vật Để tổng hợp AgNP, các bộ phận của thực vật như lá, quả, thân, rễ, hạt và hoa được sử dụng do số lượng và tính sẵn có dồi dào của chúng, đồng thời thành phần sinh hóa của chúng thường được coi là không độc hại đối với con người hoặc các chất không phải mục tiêu khác sinh vật vì chúng được biết đến với khả năng sản xuất các chất hóa học thực vật có lợi Một số loại cây như Acacia nilotica, Ocimum sanctum, Coleus thơm, Lantana camara và Moringa oleifera đã được sử dụng để sinh tổng hợp AgNP AgNP có nguồn gốc từ thực vật được đặc trưng bởi các kỹ thuật khác nhau 41 Thực vật có sẵn rộng rãi như là nguồn cung cấp nhiều chất chuyển hóa phong phú đóng vai trò là tác nhân sinh học để khử các ion Ag+ 42 Các phân tử sinh học từ một số loài thực vật cũng có thể được sử dụng để phủ AgNP nhằm giảm nhu cầu về thuốc thử hóa học và các chất độc hại hoặc các phương pháp tinh chế khác 43 Eucalyptus globulus, Azadirachta indica, 44 Cissus quadrangularis, 45 hoa Lantana camara, 46 lá Rubus illecebrosus, 47 vỏ

Nephelium lappaceum, 48 Ricinus communis, 49 Calotropis gigantea và các loại khác loài được sử dụng trong quá trình tổng hợp xanh của AgNP 50 Các chất khử và ổn định trong thực vật giúp hình thành các AgNP tương thích sinh học Các hợp chất thứ cấp có sẵn bao gồm terpenoid, flavonoid, phenol, alkaloid, protein và carbohydrate trong chức năng chiết xuất như chất khử 51-

54 Kumar và cộng sự (2013) tổng hợp hạt AgNPs bằng chiết xuất lá Premna

Hercea và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nó chống lại vi khuẩn gây bệnh lỵ 55 Gnanajobitha và cộng sự năm 2013 tổng hợp và mô tả đặc tính của các hạt AgNPs qua trung gian trái cây bằng cách sử dụng chiết xuất từ quả lựu và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 56 Rout và cộng sự tổng hợp xanh các hạt nano bạc sử dụng chiết xuất lá Centella asiatica L kháng lại mầm bệnh ở người 57 Jebakumar và Sethuraman năm 2013 cho thấy sự giảm xúc tác điện của Benzyl clorua bằng các hạt nano bạc tổng hợp màu xanh lá cây bằng cách sử dụng chiết xuất vỏ của Acacia Nilotica hay Reddy và cộng sự năm 2014 đánh giá tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và gây độc tế bào của các hạt nano bạc tổng hợp màu xanh lá cây của Piper Longum Fruit… 58,59

Các loài thực vật khác nhau và các phần tương ứng của chúng cũng đã được khai thác cho mục đích tương tự Sự tổng hợp nhanh màu xanh lá cây của các hạt nano bạc hình cầu với kích thước 50–100 nm đã được quan sát bằng cách sử dụng chiết xuất nước Alternanthera dentate Quá trình khử ion bạc thành hạt nano bạc bằng chiết xuất này được hoàn thành trong vòng 10 phút Các hạt nano bạc ngoại bào tổng hợp bằng chiết xuất lá nước giúp xác nhận quy trình nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm so với các phương pháp hóa học và vi sinh vật Các hạt nano bạc này thể hiện hoạt động kháng khuẩn chống lại Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia và Enterococcus faecal 60 Acorus calamus cũng được sử dụng để tổng hợp các hạt nano bạc để đánh giá tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn cũng như chống ung thư của nó 61 Chiết xuất thực vật Boerhaavia diffusa được sử dụng làm chất khử để tổng hợp các hạt nano bạc màu xanh lá cây Phân tích XRD và TEM cho thấy kích thước hạt trung bình là 25 nm của các hạt nano bạc có cấu trúc lập phương đặt tâm vào mặt với dạng hình cầu Những hạt nano này đã được thử nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn chống lại ba mầm bệnh vi khuẩn ở cá, đó là Pseudomonas fluorescens, Aeromonas hydrophila và

Flavobacter Branchiophilum và cho thấy độ nhạy cao nhất đối với F Branchiophilum so với hai loại vi khuẩn khác 62

Tại Việt nam, nghiên cứu tổng hợp nano bạc từ thực vật còn chưa phát triển, một số ít nhóm nghiên cứu trong các trường Đại học, các Viện nghiên cứu mới bắt đầu tập trung vào hướng đi này trong những năm gần đây Có thể kể đến là nghiên cứu của nhóm tác giải Cao Văn Dư năm 2021, nghiên cứu tổng hợp nano bạc trong môi trường dịch chiết các dược liệu giàu polyphenol: dịch chiết nước lá Trứng cá, dịch chiết lá Trầu không Kết quả UV-Vis cho đỉnh hấp thu cực đại nằm trong khoảng 400 ÷ 440 nm, hình thái kích thước qua TEM cho thấy các hạt nano tổng hợp trong dịch chiết lá Trầu không và dịch chiết lá Trứng cá chủ yếu ở dạng tựa cầu với kích thước phân bố lần lượt là 20 ± 3 và 11 ± 5 nm; 63 hay tác giả Trần Nguyễn Minh Ân (Khoa Công Nghệ Hóa học, Đại học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh), tổng hợp xanh Nano bạc từ AgNO 3 và dịch chiết lá diếp cá và cho thầy AgNPs có khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis và Bacillus pumilus 64 AgNPs nồng độ 1mM cho thấy có khả năng kháng khuẩn Staphylococcus epidermidis cao Nhóm tác giả Nguyễn Thị Thanh Hải năm 2019, tổng hợp vật liệu nano bạc và đánh giá khả năng kháng nấm pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa….

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quy Nhơn

Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp AgNPs từ dịch chiết lá cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour.)

2.3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu AgNPs tổng hợp từ dịch chiết lá cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour.).

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất Đầu tiên, lá cà gai leo được rửa nhẹ bằng nước cất Sử dụng 100 g lá đã rửa sạch và 1000 ml nước cất, đun dưới bếp từ ở nhiệt độ 80 0 C; Trong quá trình đun, sử dụng dụng cụ tán nhuyễn lá cà gai leo, tạo điều kiện cho quá trình lọc được nhanh hơn Sau thời gian đun 90 phút đồng thời tán nhỏ lá Loại bỏ các lá lớn hơn bằng rây Hỗn hợp còn lại này được lọc tiếp bằng giấy lọc Whatmann hoặc máy hút chân không Dịch chiết từ lá cà gai leo sau đó sử dụng cho quá trình tổng hợp AgNPs

Các lượng khác nhau của AgNO 3 10mM được trộn với 100 ml dịch chiết từ lá cà gai leo trong bình Erlenmeyer 250 ml để đạt nồng độ cuối cùng là 1 mM; 3 mM; 5 mM; 10 mM và 15 mM và được xác nhận bằng sự thay đổi màu sắc của nó Ảnh hưởng của các thông số khác nhau như thời gian tiếp xúc, nồng độ của AgNO3 và nồng độ dịch chiết lá cây cà gai leo sẽ được nghiên cứu Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng cách ghi lại phổ UV–Vis bằng cách sử dụng hỗn hợp phản ứng được thu thập đều đặn

Chất đối chứng (dịch chiết từ lá cà gai leo khi không có AgNO 3 đang chạy cùng với thí nghiệm trong cùng điều kiện) Tất cả các giải pháp được bảo quản trong bóng tối để loại bỏ bất kỳ sự đảo ngược quang hóa nào trong quá trình thí nghiệm

2.4.3 Phương pháp xác định đặc tính AgNPs

- Phổ UV–Vis của các hỗn hợp phản ứng được ghi lại bằng máy quang phổ UV-1800 (Shimadzu, Tokyo, Nhật Bản) ở bước sóng từ 350 nm tới 700 nm

- Hình thái bề mặt và kích thước của AgNPs được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kính hiển vi quét SEM là một loại kính hiển vi điện tử, có thể tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao của bề mặt mẫu bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét qua bề mặt của mẫu Sự tạo ảnh của vật mẫu được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tự tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu

- Sự hình thành AgNPs được đo bằng nhiễu xạ tia X (XRD) sử dụng máy đo tia X (Bruker D2 máy đo nhiễu xạ được trang bị nguồn bức xạ Cu Kα) Nghiên cứu nhiễu xạ tia X (XRD) được thực hiện bằng cách sử dụng AgNPs dạng bột được thu thập bằng siêu ly tâm, sau đó sấy khô trong lò chân không trong 24 giờ

- Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR): AgNPs tổng hợp được sẽ được đo bằng máy quang phổ FTIR Phổ hồng ngoại thu được bằng cách sử dụng Nicolet iS5 (Thermo Fisher Khoa học) được trang bị máy quang phổ ID7-ATR với tinh thể kim cương có góc tới cố định 45° Các mẫu được phân tích ba lần bằng phổ hấp thụ trong vùng từ 4.000 đến 400 cm −1 , với 32 lần quét ở độ phân giải 4 cm −1 bằng phần mềm OMNIC của Thermo Fisher Scientific Chúng được chọn làm thông số tiêu chuẩn mà phần lớn máy quang phổ hồng ngoại có thể chạy

2.4.4 Phương pháp khuếch tán giếng thạch xác định khả năng kháng khuẩn của AgNPs

Các nghiên cứu sinh học đã được thực hiện để xác định hoạt tính diệt khuẩn của AgNPs tổng hợp

Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán đĩa chống lại các vi sinh vật gây bệnh E coli Các chủng vi sinh vật thuần khiết được nuôi cấy trên môi trường thạch Luria Bertani

Khoan lỗ thạch được sử dụng tạo ra các giếng có đường kính 6 mm Sau đú, 20 àL nano bạc được thờm vào từng giếng bằng micropipette Sau 24 giờ ủ ở 35 o C, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách xác định vùng ức chế vi sinh vật (ZOI) theo công thức:

Trong đó: D: đường kính vùng ức chế (mm), d: đường kính giếng thạch (mm)

2.4.5 Phương pháp xử lý các số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng TB ± SD (TB: giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm, SD: sai số chuẩn) Xử lý số liệu bằng phần mềm

GRAPHPAD PRISM (test thống kê Anova) để so sánh sự khác biệt giữa các thí nghiệm Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Tổng hợp AgNPs và phân tích phổ UV–Vis

Dung dịch AgNO3 được thêm vào dịch chiết lá cà gai leo và phản ứng khử được ghi lại bằng sự thay đổi màu sắc từ màu nâu đỏ đến màu nâu sẫm ổn định sau thời gian vi sóng 2 phút, cho thấy sự khử của nước Ag + với dịch lọc nuôi cấy và là bằng chứng sơ bộ cho sự phát triển của hạt nano bạc và đối chứng không có hợp chất bạc trong cùng điều kiện đã được tìm thấy không đổi màu (Hình 3.1)

Sự tổng hợp của AgNPs được ghi lại bằng máy quang phổ UV-Vis Đặc tính của AgNPs đã tiết lộ điều đó, như trong Hình 3.2 Phổ UV-Vis do phản ứng khử của ion bạc biểu hiện AgNPs đa phân tán, có đỉnh hấp thụ ở bước sóng 465 nm Sự thay đổi màu màu vàng trong hiệu suất hấp thụ của AgNPs có thể là do đặc tính tập hợp của nó và sự định vị của các electron dẫn Do đó, từ kết quả có thể thấy rằng các phân tử sinh học của dịch chiết lá cà gai leo có liên quan đến quá trình khử, giới hạn và ổn định các AgNPs tổng hợp được Quá trình khử và hình thành AgNPs có thể được quy cho đến các chất phytochemical đặc biệt là flavonoid, hợp chất phenolic pound, saponin, sterol, acid amin, alkaloid… và các chất chống oxy hóa khác 36 có mặt trong dịch chiết lá cà gai leo, nó không chỉ đóng vai trò là chất ổn định mà còn hỗ trợ quá trình chuyển đổi Ag + thành bạc nguyên tố Các chất phytochemical là những chất nhặt gốc tự do, do đó có khả năng khử dạng ion thành dạng kim loại và ngăn chặn một cách hiệu quả sự phát triển của tinh thể thành hình dạng và kích thước hình cầu xác định được gọi là nano 65-67 Trong quá trình khử và hình thành bạc nguyên tố, sự thay đổi quan sát được có màu từ không màu đến vàng nhạt và cuối cùng là màu nâu sẫm ổn định có thể được coi là do sự kích thích của cộng hưởng plasmon liên kết với bề mặt, xuất hiện dưới dạng các cực đại biểu thị sự kết hợp dao động của một electron tự do và sự dẫn truyền của chúng được bắt đầu và tăng tốc dưới tác dụng của trường điện từ liên quan đến quá trình oxy hóa của polyphenol cũng góp phần làm thay đổi màu sắc

Dịch chiết 1mM AgNO 3 3mM AgNO 3 cà gai leo

5mM AgNO3 10mM AgNO3 15mM AgNO3

Hình 3.1 Sinh tổng hợp AgNP bằng cách sử dụng dịch chiết lá cà gai leo trong nước Quan sát trực quan sự thay đổi màu sắc ở các nồng độ AgNO 3 khác nhau (2 phút) trong quá trình khử dung dịch AgNO 3 (10 mM) dịch chiết lá cà gai leo

Hình 3.2 Quang phổ UV-Vis của AgNPs đƣợc sinh tổng hợp ở các nồng độ AgNO 3 khác nhau cho thấy đỉnh cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR)

3.2 Phân tích thành phần và cấu trúc của AgNPs thông qua kết quả FTIR XRD ảnh SEM của AgNPs

3.2.1 Phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

Nhiều báo cáo đã công bố đã chứng minh rằng các chất hóa học thực vật có trong chiết xuất thực vật đóng một vai trò quan trọng trong sự ổn định của hạt NP thông qua việc ngăn chặn sự phát triển của tinh thể thành dạng hình cầu có kích thước xác định với yêu cầu tối thiểu đối với quá trình xử lý tiếp theo 68-70 Phép đo FTIR của dịch chiết lá cà gai leo và AgNPs được thực hiện để xác định sự tương tác có thể có giữa các chất hóa học thực vật (bao gồm các chất chuyển hóa thứ cấp, protein, v.v.) có trong dịch chiết và nguyên tố bạc bị khử Phổ FTIR của dịch chiết lá cà gai leo được mô tả trong (Hình 3.3)

Phổ FTIR của hỗn hợp gồm dịch chiết và các AgNPs tổng hợp cho thấy có các dao động đặc trưng cho các nhóm chức khác nhau được quan sát như Hình 3.3a Các tín hiệu IR ở vị trí 3253 và 3411 cm -1 được cho là dao động hóa trị của liên kết N-H (của nhóm min bậc 1); O-H (của các hợp chất có hoạt tính sinh học như saponin, polysacarit, phenylpropenoid, glyceride, …) Các tín hiệu dao động ở ở vị trí 1643 cm -1 được cho là dao động hóa trị của liên kết C=O của nhóm aldehyde; carboxylic) hoặc có thể có liên quan đến dao động kéo giãn của nhóm amide bậc 1 71,72 Tín hiệu IR ở 723 cm -1 được cho là dao động của liên kết O-C=O (của các dạng acid carboxylic, acid amine) Trên phổ IR còn xuất hiện dải tín hiệu dao động trong khoảng 435 – 549 cm -1 (Hình 3.3b) được tạo ra do sự tương tác tương đối giữa protein và nano Ag 72 Như vậy, cùng với kết quả thu được từ giản đồ XRD (xem Hình 3.3) có thể khẳng định rằng nano Ag đã được tổng hợp thành công và tồn tại dạng dung dịch keo với chất ổn định là các hợp chất protein

Một báo cáo trước đó cũng đề xuất rằng với sự có mặt của nhóm hoạt động –OH, hợp chất này có thể giải phóng một proton, chuyển thành dạng anion, được ổn định hơn nữa nhờ các cấu trúc cộng hưởng Do đó, do hiệu ứng cảm ứng và sự sắp xếp các cấu trúc cộng hưởng liên tục của các ion, các hợp chất như axit caffeic giải phóng đồng thời hai electron Do đó, có thể axit chlorogen, axit caffeic, quercetin hoặc axit rosmarinic của dịch chiết nước có thể đóng vai trò là chất khử và bị oxy hóa bởi AgNO3, dẫn đến sự hình thành AgNPs 73

Hình 3.3 Biểu đồ FTIR của AgNPs bằng dịch dịch chiết lá cà gai leo

3.2.2 Nhiễu xạ tia X (XRD) và xác định hình dạng, kích thước AgNPs thông qua ảnh chụp SEM

XRD được coi là một trong những công cụ quan trọng nhất để nghiên cứu tất cả các loại tinh thể vật liệu Độ kết tinh của AgNPs sinh tổng hợp từ dịch chiết lá cà gai leo đã được XRD nghiên cứu trong phạm vi hai giá trị theta là 20-70 (Hình 3.4) Các đỉnh nhiễu xạ rõ ràng tương tự như cấu trúc lập phương tâm mặt của bạc đã được quan sát thấy trong phân tích XRD Các đỉnh cực mạnh được quan sát thấy ở 38,04°, 44,22°, 27,21°, 64,39° và 32,11° tương ứng với độ phản xạ Bragg 111, 200, 210, 220 và 122 (tiêu chuẩn thẻ JCPDS 00-04-0783) Việc mở rộng các đỉnh Bragg cho thấy sự tổng hợp thành công của hạt AgNPs Gần đây, phổ XRD của quá trình tổng hợp AgNPs xanh qua dịch chiết xuất hạt Chia (Salvia hispanica L.) cho thấy các đỉnh cực đại ở hai giá trị theta là 38,04°, 46,17°, 64,39° và 77,7° đối với (111), (200),

Hình thái bề mặt của AgNPs được tổng hợp từ dịch chiết lá cà gai leo được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Phân tích SEM cho thấy cấu trúc hình thái của cấu trúc nano AgNPs tổng hợp với cấu trúc liên kết bề mặt không đồng đều Quan sát SEM cho thấy rõ ràng phạm vi kích thước từ 3 đến 100 nm có dạng hình cầu và hình bầu dục cho thấy sự tập hợp của các AgNPs (Hình 3.5) Tuy nhiên, từ hình ảnh SEM cho thấy khi tăng nồng độ AgNO 3 là tăng độ kết tụ các hạt nano, độ phân tán kém Việc mở rộng các đáy của các đỉnh nhiễu xạ Bragg cho thấy việc chế tạo thành công các AgNPs nhỏ có kích thước như đã báo cáo trước đây 74

Hình 3.4 Phổ XRD hiển thị nhóm chức năng liên quan trong AgNPs

Hình 3.5 Ảnh SEM thể hiện hình dạng và kích thước của AgNPs (A) 1 mM AgNO 3 ; (B) 3 mM AgNO 3 ; (C) 5 mM AgNO 3 ,(D) 10 mM

3.2.3 Quy trình tổng hợp nano bạc từ dịch chiết lá cà gai leo

Từ những kết quả phân tích về đặc tính cuả hạt AgNPs được tổng hợp từ dịch chiết cà gai leo bằng dung môi nước, chúng tôi đưa ra quy trình như sau:

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp nano bạc

Hiệu suất kháng khuẩn của AgNPs

Nhiễm khuẩn và kháng kháng sinh thông thường của vi khuẩn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới và điều này có tác động to lớn đến sức khỏe cộng đồng và nền kinh tế y tế 75 Hầu hết các loài vi khuẩn gây bệnh có xu hướng tập hợp, kết dính, nhân lên và hình thành mạng lưới không gian 3 chiều (3D) trên bề mặt sinh học Lớp 3D phức tạp này được gọi là màng sinh học 76 Các thành phần ngoại bào của màng sinh học: polysacarit, axit nucleic, protein và lipid, tương tác với nhau và gắn vào các tế bào vi khuẩn 27 Các thành phần ngoại bào này thực hiện nhiều chức năng như bám dính, bảo vệ, cung cấp chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa, đồng thời tạo ra khả năng chống lại môi trường xung quanh bất lợi và các chất chống nhiễm khuẩn 77 Màng sinh học là lá chắn đặc biệt hiệu quả chống lại thuốc kháng sinh, làm chậm quá trình xâm nhập của chúng, kích thích sự phân hủy enzyme của chúng và tạo cơ hội cho các tế bào vi khuẩn được bảo vệ phát triển khả năng kháng thuốc thông qua thay đổi gen 28 Các thành phần màng sinh học đã được công nhận là mục tiêu tuyệt vời cho liệu pháp kháng khuẩn, 28,77,78 vì sự phá vỡ màng sinh học sẽ khiến tế bào vi khuẩn dễ bị tổn thương hơn đối với kháng sinh và hệ thống miễn dịch Để khắc phục hạn chế của phương pháp điều trị bằng kháng sinh với mục tiêu là màng sinh học, các liệu pháp kháng khuẩn mới đang được phát triển Chúng bao gồm phát triển các phân tử nhỏ, chất điều hòa miễn dịch, chất chống độc lực, kháng thể, vaccine và hạt nano kim loại 79, 80 Kim loại đã được biết đến với đặc tính kháng khuẩn trong suốt lịch sử loài người

Từ thời cổ đại, muối bạc, bạc kim loại và hợp chất bạc đã được sử dụng thành công để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật 81 Những tiến bộ trong công nghệ nano đã cho phép tổng hợp các AgNPs, do tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích lớn của chúng, thể hiện các đặc tính kháng khuẩn vượt trội chống lại một loạt mầm bệnh vi khuẩn 82 Cho đến nay, nhiều báo cáo đã được công bố cho thấy tác dụng của AgNPs đối với tế bào vi khuẩn cũng như màng sinh học của vi khuẩn đa kháng thuốc 83, 84

Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn AgNPs tổng hợp từ dịch chiết lá cà gai leo cho thấy AgNPs đã ức chế sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Dịch chiết cà gai leo và AgNPs có khả năng kháng khuẩn E coli, AgNPs 1, 3 và 5 mM kháng khuẩn hiệu quả hơn AgNPs 10 mM và 15 mM sau 24 giờ ủ ở nhiệt độ 37°C (Hình 3.7) Như vậy kết quả này đã cho thấy tổng hợp AgNPs bằng dịch chiết lá cà gai leo cho thấy hiệu quả kháng khuẩn chống lại Escherichia coli, phù hợp với kỳ vọng của chúng tôi là tìm ra phương pháp tạo ra kích thước nhỏ và AgNPs ổn định có hoạt tính kháng khuẩn

Hình 3.7 Xét nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chống lại Escherichia coli bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 1 mM (1), 3 mM (2), 5 mM (3),

10 mM (4), 15 mM (5) AgNPs (được tổng hợp từ dịch lọc nuôi cấy không có dịch chiết cà gai leo); MT (6): dịch chiết lá cà gai leo; AgNO3 (7)

Một số nghiên cứu đã chứng mình rằng AgNPs mang lại một số lợi thế cho các ứng dụng màng kháng sinh, chẳng hạn như tỷ lệ diện tích bề mặt trên thể tích cao, tính chất trơ, các đặc tính vật lý có thể điều chỉnh được như hình dạng và kích thước, khả năng tương thích sinh học và các đặc tính kháng khuẩn hoặc diệt khuẩn đã được chứng minh ở nồng độ rất thấp 85 Hoạt động kháng khuẩn đến trực tiếp từ AgNPs, cũng như từ các ion bạc (Ag + ) được hình thành từ sự hòa tan của chúng Cả ion Ag + và AgNPs đều có thể tương tác với nhiều thành phần của tế bào vi khuẩn và các thành phần màng sinh học Thông qua những tương tác này, chúng can thiệp vào quá trình trao đổi chất của vi khuẩn 86 Tác dụng kháng khuẩn tổng thể của AgNPs đến từ sự kết hợp của quá trình phá hủy thành tế bào, làm mất ổn định cấu trúc protein, khử hoạt tính protein màng, khử hoạt tính enzyme, ức chế chuỗi vận chuyển điện tử, làm hỏng axit nucleic và stress oxy hóa được tạo ra thông qua quá trình tạo ra gốc tự do oxy hóa (ROS) 87 Do đó, AgNPs đã trở thành một lựa chọn đầy hứa hẹn cho liệu pháp kháng khuẩn 88 Nghiên cứu của Li et al 2010, cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và cơ chế hoạt động của hạt nano bạc trên Escherichia coli ATCC 8739 bằng cách phân tích sự phát triển, tính thấm và hình thái của tế bào vi khuẩn sau khi điều trị bằng hạt nano bạc Kết quả thí nghiệm cho thấy hạt nano bạc 10 àg/ml cú thể ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của 10(7) CFU/ml tế bào E coli trong môi trường Mueller-Hinton lỏng Họ cho rằng hạt nano bạc đã tác động dẫn đến sự rò rỉ đường khử và protein, đồng thời khiến dehydrogenase của chuỗi hô hấp rơi vào trạng thái không hoạt động, và hạt nano bạc có thể phá hủy tính thấm của màng vi khuẩn Khi các tế bào của E coli tiếp xỳc với AgNP 50 àg/ml, người ta quan sỏt thấy nhiều vết rỗ và khoảng trống trong tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua và kính hiển vi điện tử quét, và màng tế bào bị phân mảnh, cho thấy tế bào vi khuẩn đó bị tổn thương nghiờm trọng Sau khi tiếp xỳc với AgNP 10 àg/ml, các túi màng bị hòa tan và phân tán, đồng thời các thành phần màng của chúng trở nên vô tổ chức và phân tán khỏi sự sắp xếp chặt chẽ và có trật tự ban đầu dựa trên quan sát TEM Tóm lại, các kết quả tổng hợp cho thấy AgNP có thể làm hỏng cấu trúc màng tế bào vi khuẩn và làm suy giảm hoạt động của một số enzyme màng, khiến vi khuẩn E coli cuối cùng bị chết 89

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1.1 Qua quá trình nghiên cứu chế tạo vật liệu nano bạc từ dịch chiết lá cây cà gai leo (solanum procumbens Lour.) và thực hiện các phương pháp đánh giá đặc tính của hạt nano bạc (AgNPs) tổng hợp được bằng các kỹ thuật : phân tích phổ UV - vis, phân tích kết quả FTIR, XRD, phân tích ảnh SEM, chúng tôi đã tổng kết được quy trình tổng hợp nano bạc từ dịch chiết cà gai leo được thực hiện theo sơ đồ :

1.2 Nano bạc tổng hợp từ dịch chiết cà gai leo phối trộn với AgNO3 ở nồng độ 1 mM, 3 mM và 5 mM cho hiệu quả kháng vi khuẩn E coli cao hơn nồng độ 10 mM và 15 mM.

Kiến nghị

2.1 Không ngừng nghiên cứu, chế tạo vật liệu nano bạc tổng hợp bằng phương pháp xanh với các nồng độ AgNO3 khác nhau và thời gian ủ, thể tích dung dịch thích hợp để có kết luận chính xác hơn, nhằm tìm ra công thức tối ưu nhất để tổng hợp vật liệu nano bạc từ lá cây cà gai leo

2.2 Tiếp tục đánh giá khả năng kháng khuẩn của vật liệu nano bạc tổng hợp từ lá cây cà gai leo (solanum procumbens Lour.) trên các đối tượng vi sinh vật khác nhau để đưa ra nhiều bằng chứng với độ tin cậy cao về vai trò của nano bạc trong việc tiêu diệt các loại vi khuẩn từ đó mở ra triển vọng ứng dụng trong y học

2.3 Với sự đa dạng của các loài thực vật trên thế giới, từ đó mở rộng hướng nghiên cứu, chế tạo các hạt nano bạc sử dụng các đối tượng sinh học khác có khả năng cung cấp các nguồn vật liệu mới ổn định, không độc hại, tiết kiệm chi phí, thân thiện với môi trường và được tổng hợp bằng phương pháp hóa học xanh

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 S Fakhari, M Jamzad, H K Fard Green synthesis of zinc oxide nanoparticles: a comparison, Green Chemistry Letters and Reviews, 2019,

2 S Ahmed, M Ahmad, B L Swami, S Ikram A review on plants extract mediated synthesis of silver nanoparticles for antimicrobial applications:

A green expertise, Journal of Advanced Research, 2016, 7(1), 17-28

3 G Chen, I Roy, C Yang, P N Prasad Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy, Chemical Reviews,

4 B Pelaz, C Alexiou, R A Alvarez-Puebla, F Alves, A M Andrews, S Ashraf Diverse Applications of Nanomedicine, ACS Nano, 2017, 11(3),

5 M Rai, A P Ingle, S Birla, A Yadav, C A D Santos Strategic role of selected noble metal nanoparticles in medicine, Critical Reviews in Microbiology, 2015, 1-24

6 X F Zhang, F H Huang, G L Zhang, D P Bai, D F Massimo, Y F Huang Novel biomolecule lycopene-reduced graphene oxide-silver nanoparticle enhances apoptotic potential of trichostatin A in human ovarian cancer cells (SKOV3), International Journal of Nanomedicine,

7 X F Zhang, Z G Liu, W Shen, S Gurunathan Silver Nanoparticles: Synthesis, Characterization, Properties, Applications, and Therapeutic

Approaches, International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(9),

8 M Govarthanan, M Cho, J H Park, J S Jang, Y J Yi, S Kamala- Kannan Cottonseed Oilcake Extract Mediated Green Synthesis of Silver Nanoparticles and Its Antibacterial and Cytotoxic Activity, Journal of Nanomaterials, 2016, 2016, 1-6

9 M Govarthanan, Y S Seo, K J Lee, I B Jung, H J Ju, J S Kim Low- cost and eco-friendly synthesis of silver nanoparticles using coconut (Cocos nucifera) oil cake extract and its antibacterial activity, Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 2016, 44(8),1878-82

10 K J Lee, S H Park, M Govarthanan, P H Hwang, Y S Seo, M Cho Synthesis of silver nanoparticles using cow milk and their antifungal activity against phytopathogens, Materials Letters, 2013, 105, 128-31

11 M J Firdhouse, P Lalitha Apoptotic efficacy of biogenic silver nanoparticles on human breast cancer MCF-7 cell lines, Progress in Biomaterials, 2015, 4(2-4), 113-21

12 B Ramalingam, T Parandhaman, S K Das Antibacterial Effects of Biosynthesized Silver Nanoparticles on Surface Ultrastructure and Nanomechanical Properties of Gram-Negative Bacteria viz Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, ACS Applied Materials & Interfaces,

13 D M Rudakiya, K Pawar Bactericidal potential of silver nanoparticles synthesized using cell-free extract of Comamonas acidovorans: in vitro and in silico approaches, 3 Biotech, 2017, 7(2)

14 S Baker, B P Harini, D Rakshith, S Satish Marine Microbes: Invisible Nanofactories., J Pharm Res 2013, 6, 383–388

15 S I Vicas., S Cavalu, V Laslo, M Tocai, T O Costea, L Moldovan Growth, Photosynthetic Pigments, Phenolic, Glucosinolates Content and Antioxidant Capacity of Broccoli Sprouts in Response to Nanoselenium Particles Supply Not Bot Horti Agrobo, 2019, 47, 1

16 S Cavalu, L Fritea, M Brocks, K Barbaro, G Murvai, T O Costea Novel Hybrid Composites Based on PVA/SeTiO2 Nanoparticles and Natural Hydroxyapatite for Orthopedic Applications: Correlations between Structural, Morphological and Biocompatibility Properties,

17 M F Lengke, B Ravel, M E Fleet, G Wanger, R A Gordon, G Southam Mechanisms of Gold Bioaccumulation by Filamentous Cyanobacteria from Gold(III)−Chloride Complex Environ Sci Technol,

18 S Rajeshkumar Synthesis of silver nanoparticles using Fresh bark of Pongamia pinnata and its antibacterial action against gram positive and gram negative pathogen Resource, Efficient Technologies, 2016, 2 (2016), 30–35

19 D Jain, H K Daima, S Kachhwaha, S L Kothari Synthesis of plant- mediated silver nanoparticles using papaya fruit extract and evaluation of their anti-microbial activities, Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2009, 4, 557–563

20 K B Narayanan, H H Park, N Sakthivel Extracellular synthesis of mycogenic silver nanoparticles by Cylindrocladiumfloridanum and its homogeneous catalytic degradation of 4-nitrophenol SpectrochimicaActa Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2013, 116 (2013),

21 B Sadeghi, A Rostami, S S Momeni Facile green synthesis of silver nanoparticles using seed aqueous extract of Pistacia atlantica and its antibacterial activity Spectrochim Part A, Mol Biomol Spectrosc, 2015,

22 K Vijayaraghavan, S Nalini, N U Prakash, D Madhankumar One step green synthesis of silvernano/microparticles using extracts of Trachyspermum ammi and Papaver somniferum Colloid Surf B Biointerfaces, 2012, 94, 114–117

23 R Thombre, F Parekh, N Patil Green synthesis of silver nanoparticles using seed extract of Argyreia nervosa, Int J Pharm Biol Sci 2014, 5(1),

24 D Sunita, D Tambhale, V Parag, A Adhyapak Facile green synthesis of silver nanoparticles using Psoralea corylifolia Seed extract and their in- vitro antimicrobial activities, Int J Pharm Biol Sci, 2014, 5(1), 457–67

25 G Gnanajobitha, S Rajeshkumar, C Kannan, G Annadurai Preparation and characterization of fruit-mediated silver nanoparticles using pomegranate extract and assessment of its antimicrobial activity Journal of Environmental nanotechnology, 2012, 2(1), 04-10

26 G Gnanajobitha, K Paulkumar, M Vanaja, S Rajeshkumar, C Malarkodi, G Annadurai, C Kannan Fruit mediated Synthesis of Silver Nanoparticles using Vitis vinifera and Evaluation of their Antimicrobial Efficacy, Journal of Nanostructures in Chemistry, 2013, 3(67), 1-6

27 Y Jiang, M Geng, L Bai Targeting biofilms therapy: Current research strategies and development hurdles, Microorganisms, 2020, 8, 1222

28 S Fulaz, S Vitale, L Quinn, E Casey Nanoparticle-biofilm interactions: The role of the EPS matrix, Trends Microbiol, 2019, 27, 915–926

29 S H Kim, H S Lee, D S Ryu, S J Choi, D S Lee Antibacterial Activity of Silver-Nanoparticles against Staphylococcus aureus and Escherichia coli, Korean J Microbiol Biotechnol, 2011, 39, 1

30 C Burda, X Chen, R Narayanan, M A El-Sayed Chemistry and properties of nanocrystals of different shapes, Chem Rev, 2005, 105,

31 M A Raza, Z Kanwal, A Rauf, A N Sabri, S Riaz, S Naseem Size- and shape-dependent antibacterial studies of silver nanoparticles synthesized by wet chemical routes, Nanomaterials, 2016, 6, 74

32 S Pal, Y K Tak, J M Song Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the gram-negative bacterium Escherichia coli, Appl Environ Microbiol.,

33 S Chen, D L Carroll Synthesis and characterization of truncated triangular silver nanoplates Nano Lett, 2002, 2, 1003–1007

34 J L Elechiguerra, J L Burt, J R Morones, A Camacho-Bragado, X Gao, H H Lara Interaction of silver nanoparticles with HIV-1, J Nanobiotechnol, 2005, 3, 6

35 N H Hoang, V N Nguyen, T T Nguyen, T M D Nguyen Impact of microwave synthesis time on the shape of silver nanostructures and their antibacterial activity, Journal of Metals, Materials and Minerals, 2023,

36 Tổ chức HELVETAS Việt Nam Cà gai leo - Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hái, sơ chế và bảo quản theo tiêu chuẩn GACP-WHO, Trung tâm Phát triển Kinh tế Nông thôn (CRED), 2020

37 D Kumarasamyraja, N S Jeganathan Green synthesis of silver nanoparticles using aqueous extract of acalypha indica and its antimicrobial activity, Int J Pharm Biol Sci, 2013, 4(3), 469–76

38 S Kumar, R M Daimary, M Swargiary, A Brahma, S Kumar, M Singh Biosynthesis of silver nanoparticles using Premna herbacea leaf extract and evaluation of its antimicrobial activity against bacteria causing dysentery, Int J Pharm Biol Sci, 2013, 4(4), 378–84

39 D Sunita, D Tambhale, V Parag, A Adhyapak Facile green synthesis of silver nanoparticles using Psoralea corylifolia Seed extract and their in- vitro antimicrobial activities, Int J Pharm Biol Sci, 2014, 5(1), 457–67

40 G Gnanajobitha, K Paulkumar, M Vanaja, S Rajeshkumar, C Malarkodi, G Annadurai, C Kannan Fruit mediated Synthesis of Silver Nanoparticles using Vitis vinifera and Evaluation of their Antimicrobial Efficacy, Journal of Nanostructures in Chemistry, 2013, 3(67), 1-6

41 B Ahmed, A Hashmi, M.S Khan, J Musarrat ROS Mediated Destruction of Cell Membrane, Growth and Biofilms of Human Bacterial Pathogens by Stable Metallic AgNPs Functionalized from Bell Pepper Extract and Quercetin, Adv Powder Technol, 2018, 29, 1601–1616

42 S Sumathi, A Thomas Eco-Friendly and Antibacterial Finishes of Organic Fabrics Using Herbal Composite Microencapsules, Int J Pharma Bio Sci., 2017, 8, 310–321

43 S Joseph, B Mathew Microwave Assisted Biosynthesis of Silver Nanoparticles Using the Rhizome Extract of Alpinia Galanga and Evaluation of Their Catalytic and Antimicrobial Activities, J Nanopart,

44 S Ahmed, Saifullah, M Ahmad, B.L Swami, S Ikram Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Azadirachta Indica Aqueous Leaf Extract

45 V Dhand, L Soumya, S Bharadwaj, S Chakra, D Bhatt, B Sreedhar Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Coffea Arabica Seed Extract and Its Antibacterial Activity, Mater Sci Eng C., 2016, 58, 36–

46 I Fatimah, N Indriani Silver Nanoparticles Synthesized Using Lantana Camara Flower Extract by Reflux, Microwave and Ultrasound Methods,

47 B Kumar, K Smita, L Cumbal, A Debut Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Andean Blackberry Fruit Extract, Saudi J Biol Sci.,

48 B Kumar, K Smita, L Cumbal, Y Angulo Fabrication of Silver Nanoplates Using Nephelium Lappaceum (Rambutan) Peel: A Sustainable Approach, J Mol Liq, 2015, 211, 476–480

49 S Ojha, A Sett, U Bora Green Synthesis of Silver Nanoparticles by Ricinus Communis Var Carmencita Leaf Extract and Its Antibacterial Study, Adv Nat Sci Nanosci Nanotechnol, 2017, 8, 35009

50 P.S Joshi, G Ramesh, J.E Packiyam, S.K Jayanna Green Synthesis and Evaluation of Silver Nanoparticles Using Leaf Extract from Calotropis Gigantean, Int J Curr Biotechnol, 2007, 5, 1–5

51 B Ahmed, A Syed, K Ali, A.M Elgorban, A Khan, J Lee, H.A AL- Shwaiman Synthesis of Gallotannin Capped Iron Oxide Nanoparticles and Their Broad Spectrum Biological Applications, RSC Adv, 2021, 11,

52 K Ali K., Q Saquib, B Ahmed, M.A Siddiqui, J Ahmad, M Al-Shaeri, A.A Al-Khedhairy, J Musarrat Bio-Functionalized CuO Nanoparticles Induced Apoptotic Activities in Human Breast Carcinoma Cells and Toxicity against Aspergillus Flavus: An in Vitro Approach, Process Biochem, 2020, 91, 387–397

53 B Ahmed, B Solanki, A Zaidi, M.S Khan, J Musarrat Bacterial Toxicity of Biomimetic Green Zinc Oxide Nanoantibiotic: Insights into ZnONP Uptake and Nanocolloid-Bacteria Interface, Toxicol Res, 2019, 8, 246–261

54 K Ali, B Ahmed, M.S Khan, J Musarrat Differential Surface Contact Killing of Pristine and Low EPS Pseudomonas Aeruginosa with Aloe Vera Capped Hematite (α-Fe2O3) Nanoparticles, J Photochem Photobiol B Biol, 2018, 188, 146–158

55 S Kumar, R.M Daimary, M Swargiary, A Brahma, S Kumar, M Singh Biosynthesis of silver nanoparticles using Premna herbacea leaf extract and evaluation of its antimicrobial activity against bacteria causing dysentery, Int J Pharm Biol Sci, 2013, 4(4), 378–384

56 G Gnanajobitha, K Paulkumar, M Vanaja, S Rajeshkumar, C Malarkodi, G Annadurai, C Kannan Fruit-mediated synthesis of silver nanoparticles using Vitis vinifera and evaluation of their antimicrobial efficacy, Journal of Nanostructure in Chemistry, 2013, 3, 67

57 A Rout, P.K Jena, U.K Parida, B.K Bindhani Green synthesis of silver nanoparticles using leaves extract of Centella asiatica L For studies against human pathogens, Int J Pharm Biol Sci., 2013, 4(4), 661–674

58 T.N Jebakumar Immanuel Edison, M.G Sethuraman Electrocatalytic Reduction of Benzyl Chloride by Green Synthesized Silver Nanoparticles Using Pod Extract of Acacia Nilotica, ACS Sustain Chem Eng, 2013, 1,

59 N.J Reddy, D.N Vali, M Rani, S.S Rani Evaluation of Antioxidant, Antibacterial and Cytotoxic Effects of Green Synthesized Silver Nanoparticles by Piper Longum Fruit, Mater Sci Eng C, 2014, 34, 115–

60 D.A Kumar, V Palanichamy, S.M Roopan Green synthesis of silver nanoparticles using Alternanthera dentata leaf extract at room temperature and their antimicrobial activity Spectrochim Acta Part A, Mol Biomol Spectrosc, 2014, 127, 168–171

61 J.R Nakkala, R Mata, A Kumar Gupta, S Rani Sadras Biological activities of green silver nanoparticles synthesized with Acorous calamus rhizome extract, Eur J Med Chem, 2014, 85, 784–794

62 J.R Nakkala, R Mata, A.K Gupta, S.R Sadras Green synthesis and characterization of silver nanoparticles using Boerhaavia diffusa plant extract and their antibacterial activity, Indus Crop Prod, 2014, 52, 562–

63 Hoàng Đức Thuận, Ngô Văn Cường, Lê Thị Thu Hồng, Trần Thạch Thảo, Nguyễn Thị Như Quỳnh, Cao Văn Dư Tổng hợp xanh nano bạc từ dịch chiết dược liệu (trầu không, trứng cá), Tạp chí Khoa học Lạc Hồng, 2021,

64 Trần Nguyễn Minh Ân Tổng hợp xanh Nano bạc từ AgNO3 và dịch chiết lá diếp cá, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2016, 2(3), 188-192

65 B Kumar, K Smita, L Cumbal, A Debut Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) shell biomass for synthesis of silver nano catalyst, J Saudi Chem Soc, 2014, 21, 293–298

66 R.R Arvizo, S Bhattacharyya, R.A Kudgus, K Giri, R Bhattacharya, P Mukherjee Intrinsic therapeutic applications of noble metal nanoparticles: past, present and future, Chem Soc Rev, 2012, 4, 2943–2970

67 M.N Nadagouda, R.S Varma Green synthesis of silver and palladium nanoparticles at room temperature using coffee and tea extract Green Chem, 2008, 10, 859–862

68 M Haroon, A Zaidi, B Ahmed, A Rizvi, M.S.M.S Khan, J Musarrat Effective Inhibition of Phytopathogenic Microbes by Eco-Friendly Leaf Extract Mediated Silver Nanoparticles (AgNPs), Indian J Microbiol.,

69 A Parveen, S Rao Effect of Nanosilver on Seed Germination and Seedling Growth in Pennisetum Glaucum, J Clust Sci, 2015, 26, 693–

70 B Jasim, R Thomas, J Mathew, E.K Radhakrishnan Plant Growth and Diosgenin Enhancement Effect of Silver Nanoparticles in Fenugreek (Trigonella Foenum-Graecum L.), Saudi Pharm J., 2017, 25, 443–447

71 K.Y Ravi, N B Singh, A Singh, V Yadav, K M Niharika, S Khare Bio-based synthesis of nano silver using Tridax procumbens leaf extract and its impacts on germination and metabolic activity of Solanum lycopersicum L., J Plant Biochem Biotechnol, 2020, 10.1007

72 B.M Al-Ansari, N Alkubaisi, K Gopinath, V Karthika, A Arumugam,

M Govindarajan Facile and Cost-Effective Ag Nanoparticles Fabricated by Lilium lancifolium Leaf Extract: Antibacterial and Antibiofilm Potential, Journal of Cluster Science, 2019, 30, 1081–1089

73 N Joshi, A.A Pathak, R.R Anupam, N.N Jain, J Singh, C P Upadhyaya A Rapid and Efficient Biosynthesis of Metallic Nanoparticles UsingAqueous Extract of Chia (Salvia hispanica L.) Seeds,

74 T Elavazhagan, K.D Arunachalam Memecylon edule leaf extract mediated green synthesis of silver and gold nanoparticles, Int J Nanomed,

75 D Lebeaux, J M Ghigo, C Beloin Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics, Microbiol Mol Biol Rev, 2014, 78, 510–

76 R Roy, M Tiwari, G Donelli, V Tiwari Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biofilm agents and their mechanisms of action, Virulence, 2018, 9, 522–554

77 S J Kassinger, M L van Hoek Biofilm architecture: An emerging synthetic biology target, Synth Syst Biotechnol, 2020, 5, 1–10

78 H C Flemming Biofilms: An emergent form of bacterial life Nat Rev Microbiol, 2016, 14, 563–575

79 H Koo, R N Allan, R P Howlin, P Stoodley, L Hall-Stoodley Targeting microbial biofilms: Current and prospective therapeutic strategies, Nat Rev Microbiol, 2017, 15, 740–755

80 U Theuretzbacher, K Outterson, A Engel, A Karlen The global preclinical antibacterial pipeline, Nat Rev Microbiol, 2020, 18, 275–285

81 S H Lee, B H Jun Silver nanoparticles: Synthesis and application for nanomedicine, Int J Mol Sci, 2019, 20, 865

82 M A D S Ramos Nanotechnology-based drug delivery systems for control of microbial biofilms: A review, Int J Nanomed, 2018, 13, 1179–

83 P Mathur, S Jha, S Ramteke, N K Jain Pharmaceutical aspects of silver nanoparticles, Artif Cells Nanomed Biotechnol, 2018, 46, 115–126

84 A Y Grun Effects of low dose silver nanoparticle treatment on the structure and community composition of bacterial freshwater biofilms,

85 X F Zhang, Z G Liu, W Shen, S Gurunathan Silver nanoparticles: Synthesis, characterization, properties, applications, and therapeutic approaches Int J Mol Sci, 2016, 17, 1534.