Luận án tiến sĩ kỹ thuật nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

TỔNG QUAN

TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU NHẬN -CHITIN

1.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp và phế liệu từ mực sau chế biến Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được đánh bắt với số lượng chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica, Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus

Mực ống Loligo sp (Hình 1.1a) được phân loại [58]:

Ngành động vật thân mềm Mullusca

Hình 1.1 Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp (b)

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Mực ống Loligo sp là một trong những sản phẩm xuất khẩu có giá trị cao của Việt Nam, với sản lượng khai thác khoảng 24.000 tấn/năm Theo VASEP, mặt hàng mực và bạch tuộc của Việt Nam hiện được xuất khẩu sang 25 thị trường, bao gồm cả Nhật Bản, Hoa Kỳ và Châu Âu, với tổng kim ngạch đạt từ 390-460 triệu USD/năm, trong đó mực chiếm 55-65%, ước đạt 165 triệu USD Một khảo sát cho thấy, mỗi tấn mực thành phẩm sản xuất ra sẽ thải 0,45 tấn phế liệu, tỷ lệ này thay đổi tùy thuộc vào loài và kích thước mực nguyên liệu Hầu hết phế liệu này hiện được thu gom và tận dụng để sản xuất các sản phẩm phụ phục vụ cho thức ăn chăn nuôi.

Mai mực chiếm khoảng 0,4-0,5% trọng lượng của mực ống tươi hoặc 10-15% phế liệu nội tạng sau chế biến Theo thống kê từ Công ty Việt Nam Food tại Cà Mau, mỗi tháng công ty thu mua khoảng 130 tấn phế liệu từ chế biến mực ống, ước tính thu được 10-15 tấn mai mực Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này chủ yếu được phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi hoặc xuất khẩu trực tiếp sang Trung Quốc với giá trị thấp.

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp

Quy trình chiết xuất chitin phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, cụ thể là hàm lượng khoáng và protein trong phế liệu Thành phần hóa học của nguyên liệu là yếu tố quyết định trong việc lựa chọn phương pháp tách chiết và chất lượng sản phẩm chitin Bảng 1.1 trình bày kết quả tổng hợp về thành phần hóa học của một số nguồn phế liệu thủy sản phổ biến So sánh cho thấy, vỏ cua có hàm lượng khoáng cao nhất, đạt 56%, nhưng hàm lượng chitin lại thấp nhất, chỉ 12,9% Điều này dẫn đến khó khăn trong việc thu nhận chitin từ vỏ cua do quá trình loại khoáng và hiệu quả thu nhận chitin không cao.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản thông dụng để sản xuất chitin

TLTK Độ ẩm Protein Khoáng Lipid α-Chitin

Phế liệu vỏ đầu tôm

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vannamei) - 26,1 26,6 - 27,3 [158]

Ghẹ chấm (Portunus trituberculatus) 12,9 10,3 57,9 0,3 17,1 Đối với phế liệu vỏ tôm có hàm lượng lipid tương đối cao, ví dụ vỏ tôm

Pandalus borealis chứa khoảng 10,2% lipid, do đó cần chú ý đến quá trình xử lý lipid Thông thường, lipid có thể được loại bỏ trong giai đoạn khử protein trong môi trường kiềm Để thu nhận chitin từ nguyên liệu vỏ tôm, cua và ghẹ, cần thực hiện quá trình khử khoáng và khử protein.

Mai của một loài mực chứa hàm lượng chitin cao (31-42%) so với phế liệu vỏ tôm, cua và ghẹ, trong khi hàm lượng khoáng rất thấp (dưới 2%) và lipid cũng không đáng kể Điều này cho phép quá trình tách chiết chitin chỉ cần tập trung vào việc khử protein mà không cần thực hiện khử khoáng và khử lipid.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Bảng 1.2 Thành phần hóa học trong một số mai mực

Phân tích thành phần khoáng trong mai mực và vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei cho thấy hàm lượng các nguyên tố như Ca, Fe, K, Mg, Na và Zn trong mai mực thấp hơn nhiều so với trong vỏ tôm Cụ thể, hàm lượng Ca trong mai mực là một ví dụ điển hình cho sự chênh lệch này.

Loligo lessoniana là 17,74 ppm trong khi trong vỏ tôm là 4856 pmm, cao gấp 250 lần

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng mai mực không chứa kim loại nặng như thủy ngân (Hg), chì (Pb) và asen (As), điều này cho thấy phế liệu mai mực ống là nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận β-chitin với độ tinh khiết cao.

Bảng 1.3 Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực

Ca Fe K Mg Na Zn

Vỏ tôm thẻ (Penaeus vanamei) 26,6 4856 15,67 2437 - 1594 11,8 [2]

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Chitin trong nguyên liệu thường liên kết với protein, khoáng chất, lipid và các hợp chất khác, với hàm lượng thay đổi tùy theo loại nguyên liệu Quá trình tách chiết chitin đòi hỏi phải loại bỏ các hợp chất phi chitin này Nghiên cứu của Rinaudo (2006) và Lavall (2007) chỉ ra rằng chitin tồn tại dưới dạng phức hợp với các thành phần như protein, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận chitin.

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu [112, 170]

Armenta (2009) và Nikolov (2010) đã phát triển mô hình mô tả chitin, trong đó nguyên liệu được bảo bọc bởi các sợi protein xoắn tạo thành cấu trúc vững chắc bảo vệ sinh vật Nghiên cứu chỉ ra rằng cấu trúc chitin trong lớp biểu bì có tính chất bất đẳng hướng, với các mô khoáng liên kết chặt chẽ với sợi chitin-protein, tạo thành cấu trúc dạng tấm Đặc biệt, lớp vỏ này được vôi hóa bằng muối cacbonat canxi, giúp tăng cường độ cứng và bảo vệ các sinh vật mềm yếu bên trong.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật n

Hình 1.3 Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu [16]

Nghiên cứu của Kristbergsson, Einrsson và Peter năm 2003 chỉ ra rằng chitin trong cấu trúc nguyên liệu có liên kết chặt chẽ với các thành phần khác như protein, cacbonat canxi, lipid, chất màu, khoáng chất và các hợp chất hữu cơ, điều này gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận chitin.

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm [88]

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Mai mực ống là thành phần xương sụn bên trong các loài mực ống bao gồm

Loligo lessonicana, Loligo formosana, Loligo vulgaris, Ommastrephes bartrami, và Illex argentines là nguồn duy nhất hiện nay để thu nhận β-chitin Kết quả từ ảnh quét điện tử (SEM) cho thấy bề mặt mai mực ống nguyên liệu có các lớp chitin và protein phân bố đan xen, tạo nên cấu trúc sụn mềm đặc trưng của mai mực ống.

Hình 1.5 Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống [95]

Hàm lượng khoáng và màu trong mai mực thấp hơn nhiều so với vỏ tôm, cua và ghẹ, cho phép quy trình thu nhận chitin/chitosan từ mai mực loại bỏ hai công đoạn khử khoáng và khử màu Hình 1.6 so sánh các công đoạn thu nhận chitin từ các nguồn khác nhau.

Qui trình sản xuất chitin bao gồm các bước tách protein, khoáng và tẩy màu Ở Việt Nam, công đoạn tẩy màu thường kết hợp với phơi khô dưới ánh nắng mặt trời Sau đó, chitin được deacetyl hóa để thu được chitosan Hiện nay, quy trình này có thể thực hiện bằng ba phương pháp: hóa học, sinh học, hoặc kết hợp cả hai, tùy thuộc vào loại nguyên liệu, công nghệ và yêu cầu chất lượng sản phẩm chitin và chitosan.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Khử protein trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Khử khoáng trong môi trường acid (HCl, HNO 3 , )

Deacetyl trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Khử protein trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Deacetyl trong môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Cắt mạch chitosan (H 2 O 2 , enzyme) Chitosan ứng dụng

Vỏ tôm, cua, ghẹ Mai mực

Hình 1.6 Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

1.1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về thu nhận β-chitin/chitosan

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về thu nhận và ứng dụng chitin và chitosan, phần lớn chỉ tập trung vào việc chiết xuất từ vỏ tôm Chitosan thương mại chủ yếu cũng được sản xuất từ nguồn này Một số ít nghiên cứu đã khai thác chitin và chitosan từ các nguồn khác như cua, ghẹ, nấm và mai mực Đặc biệt, tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện về điều kiện thu nhận chitin và chitosan từ mai mực trước Luận án này.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật mực Các nghiên cứu chính đã được công bố ngoài nước liên quan đến đề tài, bao gồm:

TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN

1.2.1 Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin

Chitin là thành phần chính trong cấu trúc vỏ của động vật chân đốt như tôm, cua, ghẹ, cũng như trong xương của động vật thân mềm như mai mực, và có mặt trong tảo cùng thành vách tế bào của nấm và nấm men Chitin được cấu tạo từ các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (NADG) liên kết với nhau thông qua các liên kết β-1,4-glucozid.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học phân tử chitin

Chitin được phân loại thành ba dạng dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học: dạng α-chitin, có nguồn gốc từ vỏ tôm, vỏ cua và vỏ ghẹ, dạng β-chitin thu nhận từ mai mực, và dạng γ-chitin từ vách tế bào nấm và nấm men Ba dạng chitin này khác nhau về số lượng và sắp xếp các mạch chitin, cũng như kích thước của chúng trong mỗi đơn vị cấu trúc.

α-chitin là loại chitin có các mạch sắp xếp song song ngược chiều nhau, thường được chiết xuất từ vỏ tôm, cua và ghẹ Trong khi đó, β-chitin có các mạch sắp xếp song song cùng chiều, với tính hydrat hóa cao, chủ yếu thu được từ mai mực ống γ-chitin là sự kết hợp của α và β, thường được tìm thấy trong vách tế bào nấm và vi khuẩn Sự khác biệt trong cấu trúc dẫn đến tính chất khác nhau, trong đó α-chitin có độ rắn tinh thể cao nhất, còn β-chitin có độ rắn thấp nhất.

Hình 1.8 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Sự khác biệt trong tính hydrat hóa và độ rắn tinh thể của các dạng chitin ảnh hưởng đến khả năng khử gốc acetyl và cấu trúc mạch tinh thể trong dung môi hòa tan, từ đó quyết định các tính chất chức năng sinh học, đặc biệt là khả năng kháng khuẩn của chúng.

Cấu trúc phân tử và các liên kết chính của hai dạng α-chitin và β-chitin được thể hiện rõ trong Hình 1.9 Chitin có cấu trúc chặt chẽ, điều này khiến nó rất khó hòa tan trong nhiều dung môi khác nhau Trên thực tế, chitin chỉ có thể hòa tan trong một số dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4 và dimethylacetamide (DMAc) có chứa 5% lithium chloride.

Cấu trúc phân tử của α-chitin và β-chitin được mô tả với sự khác biệt rõ rệt giữa hai dạng này Các liên kết hydro nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl và acetamide tạo nên sự tổ chức của chitin ở dạng tấm sắp xếp song song, được liên kết chặt chẽ qua các liên kết hydro giữa các nhóm amin và carbonyl, với khoảng cách khoảng 0,47 nm Đặc biệt, α-chitin có các liên kết hydro giữa các tấm dọc theo trục b của các mạch đơn vị nhờ vào các nhóm hydroxymethyl, điều này không xuất hiện trong β-chitin Sự khác biệt này dẫn đến sự khác nhau về tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học giữa α-chitin và β-chitin, trong đó β-chitin có tính trương nở với nước cao hơn so với α-chitin.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 1.10 Cấu trúc α-chitin và -chitin [134]

Chitin tự nhiên có độ deacetyl từ 8-12% và phân tử lượng trung bình lớn hơn 1 triệu dalton, trong khi chitin chiết xuất từ vi sinh vật có phân tử lượng thấp, chỉ khoảng vài chục ngàn dalton Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc, chitin sẽ bị khử gốc acetyl để tạo thành chitosan Ngược lại, khi đun nóng chitin trong dung dịch HCl đặc, chitin sẽ bị thủy phân thành các phân tử glucosamine với hoạt tính sinh học cao.

Hình 1.11 Phổ XRD của α-chitin và β-chitin [95]

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) cho thấy rằng độ kết tinh của α-chitin từ vỏ ghẹ đạt 85%, cao hơn đáng kể so với độ kết tinh của β-chitin từ mai mực ống, chỉ đạt 72%.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ kết tinh, kích thước tinh thể và mức độ định hướng của các mạch có ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thụ nước và độ tan của polyme Điều này ảnh hưởng đến các ứng dụng tiềm năng của chitin, đặc biệt trong hệ dẫn thuốc và màng chữa lành vết thương, nơi ái lực với nước là rất quan trọng Sự khác biệt giữa α-chitin và β-chitin dẫn đến những khác biệt về tính chất hóa lý của chitosan sau quá trình deacetyl Chitosan từ β-chitin có độ rắn thấp và độ xốp cao, được ứng dụng trong nuôi cấy mô và cố định tế bào Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của β-chitosan cũng vượt trội hơn so với α-chitosan Hơn nữa, việc sản xuất chitosan mạch ngắn từ β-chitin dễ dàng hơn nhờ tính xốp cao, độ rắn thấp và độ trương lớn, giúp tăng cường khả năng kháng nấm và kháng khuẩn.

1.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được tạo ra thông qua quá trình deacetyl hóa, trong đó nhóm acetyl bị tách ra khỏi mạch chitin Do đó, chitosan là một polyme giàu đơn vị Glucosamine, mang nhiều nhóm amin Cấu trúc hóa học của chitosan tương tự như chitin và cellulose, với điểm khác biệt là chitosan có nhóm amin tại cacbon vị trí thứ 2.

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của chitosan

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Khác với chitin, chỉ hòa tan trong một số hệ dung môi hạn chế, chitosan có khả năng tan tốt trong các axit hữu cơ phổ biến như axit formic, axit acetic, axit propionic, axit citric và axit lactic.

Hằng số phân li acid (pKa) của chitosan nằm trong khoảng từ 6,2 đến 6,8, cho phép chitosan hòa tan trong môi trường acid loãng và tạo thành dung dịch keo dương, điều này đặc biệt vì hầu hết các keo polysaccharit tự nhiên đều tích điện âm Chitosan, với điện tích dương, có khả năng bám dính tốt trên các bề mặt có ion tích điện âm, tạo phức với các ion kim loại và tương tác hiệu quả với các polyme tích điện âm Bên cạnh đó, loại dung môi acid cũng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chitosan; nghiên cứu của Beverlya và cộng sự (2008) chỉ ra rằng chitosan trong dung môi acid acetic có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với acid lactic.

Chitosan không hòa tan trong nước, dung dịch kiềm và cồn, như được chỉ ra trong Bảng 1.4, nơi trình bày một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan.

Bảng 1.4 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan [7]

Dung môi Nồng độ thường sử dụng (%)

Chitosan có nhiều đặc tính quan trọng như khả năng hút nước, hấp phụ chất màu, hấp phụ kim loại, và tính kháng khuẩn, kháng nấm, tất cả đều phụ thuộc vào độ deacetyl hóa của nó Độ deacetyl hóa cao giúp chitosan cải thiện khả năng hấp phụ chất màu và tạo phức với kim loại, đồng thời nâng cao hiệu quả kháng khuẩn và kháng nấm.

Luận án tiến sĩ về kỹ thuật deacetyl cho thấy chitosan có độ deacetyl trên 90% có khả năng kháng khuẩn tốt Tuy nhiên, độ hút nước của chitosan giảm khi độ deacetyl tăng Nghiên cứu của Trung (2010) chỉ ra rằng chitosan có độ deacetyl hóa thấp (75%) có khả năng hút nước lên đến 659%, cao hơn nhiều so với chitosan có độ deacetyl hóa cao chỉ đạt 486%.

Bảng 1.5 Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl [144]

Tính chất Chitosan với độ deacetyl khác nhau

Tính thấm nước (%) 659  33 472  35 486  29 Độ tan (%) 99,4  0,1 99,6  0,3 99,5  0,2

GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH

1.3.1 Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ Cà Solanaceae và là một loại quả phổ biến được tiêu thụ rộng rãi Không chỉ có giá trị kinh tế cao, cà chua còn cung cấp nhiều dưỡng chất quan trọng như acid folic, vitamin C, kali và các hợp chất carotenoid, đặc biệt là lycopene, β-carotene, γ-carotene và phytoene, mang lại lợi ích sức khỏe và khả năng kháng oxy hóa.

Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong việc phát triển giống cây chất lượng cao và công nghệ bảo quản sau thu hoạch, nhưng các nước đang phát triển như Lào, Việt Nam và Campuchia vẫn đối mặt với tổn thất nông sản lớn Nguyên nhân chủ yếu bao gồm thu hoạch không đúng thời điểm, kỹ thuật thu hoạch và bảo quản kém, bao gói và hệ thống vận chuyển yếu, cùng với việc thiếu kho bảo quản và kỹ thuật chế biến Đặc biệt, bốn yếu tố quan trọng cần chú ý trong và sau khi thu hoạch cà chua là độ chín, thời gian thu hoạch, phương pháp thu hoạch và xử lý trái tại ruộng Bất kỳ thiếu sót nào trong những yếu tố này đều có thể dẫn đến giảm chất lượng trái và tổn thất nghiêm trọng.

Cà chua được thu hoạch khi đạt độ chín sinh lý, có thể là khi vỏ còn xanh, ngả màu hoặc hoàn toàn chín, tùy thuộc vào mục đích sử dụng và yêu cầu của từng thị trường.

Cà chua được thu hoạch khi còn xanh hoặc ửng đỏ, vì đây là giai đoạn mà trái có thể tiếp tục chín tự nhiên và đạt chất lượng tối ưu Trái non không thể phát triển màu sắc và hương thơm tốt, dễ bị hư hỏng sau thu hoạch Khi thu hoạch, không nên loại bỏ cuống nhỏ, vì đây là nơi trao đổi khí chủ yếu, giúp duy trì độ ẩm và giảm thiểu tổn thất khối lượng Đồng thời, cần tránh các tổn thương vật lý như cắt, lỗ thủng hay trầy xước, vì những tổn thương này không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan mà còn làm tăng tốc độ mất nước và chín, tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập.

Suslow (2005) đã phát triển chỉ số chất lượng tiêu chuẩn để phân loại và tuyển chọn các giống cà chua, tập trung vào sự tương đồng về hình dáng và việc không có khuyết tật hay hư hỏng Mặc dù kích cỡ không phải là yếu tố chính trong việc xác định chất lượng, nhưng nó lại có ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng thương phẩm của cà chua Các chỉ số chất lượng này rất quan trọng trong quá trình đánh giá và lựa chọn giống.

+ Hình dạng: có cùng một kiểu hình dạng (hình tròn, hình cầu, hình cầu dẹt) + Màu sắc tương đồng: từ đỏ cam đến đỏ đậm, vàng nhạt

Da khỏe mạnh thường có bề mặt trơn mịn, không xuất hiện sẹo lớn hay các vết rạn nứt Ngoài ra, da không nên có dấu hiệu rám nắng, vết thương do côn trùng, tổn thương cơ giới hay vết bầm tím.

+ Độ cứng: Chịu được áp lực Không bị biến dạng do chín nẫu

Tiêu thụ sản phẩm là khâu quan trọng cuối cùng trong hoạt động sau thu hoạch, liên kết giữa người sản xuất, người vận chuyển và người tiêu dùng Các hoạt động xử lý sau thu hoạch quyết định chất lượng sản phẩm cuối cùng, đảm bảo cung cấp cho người tiêu dùng những sản phẩm chất lượng tốt nhất Sản phẩm cần có bề ngoài hấp dẫn, tươi mới và không bị khuyết tật Do đó, cần thực hiện các xử lý thích hợp, chú trọng không chỉ vào sản phẩm mà còn vào thao tác của người xử lý.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

1.3.2 Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch

Theo nghiên cứu của Wakil và Monilola (2011), bệnh thối nhũn do vi khuẩn đã gây thiệt hại từ 10-30% tổng sản lượng rau củ quả như carot, cà chua, hành tây và khoai tây sau thu hoạch tại các chợ Nghiên cứu chỉ ra sự đa dạng của các vi khuẩn gây bệnh thối nhũn, với 76 loài thuộc 3 chi: Erwinia, Pseudomonas và Xanthomonas Trong đó, chi Erwinia có tần suất xuất hiện cao nhất, chiếm 64,48%, chủ yếu là các chủng Erwinia carotovora (27,63%), Erwinia herbicola (11,84%), Erwinia chrysanthemi (10,4%), Erwinia artroseptica (9,1%) và Erwinia amylovora (5,3%).

Hình 1.15 Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot)

Bệnh thối nhũn trên rau, củ, quả chủ yếu do vi khuẩn Erwinia spp gây ra, thường phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 25-35°C và trong điều kiện ẩm ướt.

Vi khuẩn trên cà chua xâm nhập qua các tế bào tổn thương, gây ra vết bệnh phát triển nhanh chóng về cả đường kính lẫn chiều sâu Khu vực bị ảnh hưởng trở nên nhũn mềm, chảy nước, và bề mặt vết bệnh đổi màu, có thể xuất hiện nếp nhăn hoặc phồng rộp Ban đầu, tốc độ gây tổn thương chậm, nhưng sau đó tăng nhanh, khiến mô bị phân hủy, tạo ra vết nứt và bề mặt nhầy nhụa, kèm theo mùi hôi hoặc mùi lưu huỳnh đặc trưng Khi tiếp xúc với không khí, vết bệnh có thể chuyển sang màu xám hoặc nâu sẫm.

Để kiểm soát bệnh thối nhũn trên rau củ quả sau thu hoạch, cần áp dụng các biện pháp bảo quản và kiểm soát dịch hại hiệu quả Việc xử lý phải tránh sử dụng thuốc trừ sâu tổng hợp, nhằm hướng tới phát triển nông nghiệp bền vững Theo nghiên cứu của Okonkwo (1995) và Bartz (1981), việc kiểm soát dịch bệnh là rất quan trọng trong quá trình này.

Luận án tiến sĩ về kỹ thuật phần sự phát triển của bệnh cho thấy việc tránh làm tổn thương củ, quả và rễ cây trong quá trình chăm sóc, làm cỏ, thu hoạch, vận chuyển và lưu trữ là rất quan trọng Nghiên cứu của Rahman (1991) đã chỉ ra rằng lưu trữ trong điều kiện khô mát là phương pháp hiệu quả, được nhiều nhà nghiên cứu khuyến nghị, nhằm hạn chế bệnh thối nhũn do vi khuẩn.

Việc sử dụng hóa chất như thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypoclorit 1,2%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride phenol 2% trong 37,51 lít nước có khả năng loại bỏ tác nhân gây bệnh thối nhũn từ bề mặt củ, quả sau thu hoạch Mặc dù kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh sau thu hoạch vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm, một số nghiên cứu ban đầu đã cho thấy kết quả khả quan Các protein và peptide có hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm nhằm tăng cường khả năng phòng thủ của cây, tuy nhiên, công nghệ di truyền này vẫn cao và tốn kém, vượt quá khả năng của nông dân trung bình.

Hiện tại, việc kiểm soát bệnh thối nhũn do vi khuẩn trên rau củ quả sau thu hoạch vẫn chưa có biện pháp hiệu quả, do chúng dễ bị lây nhiễm từ các tác nhân gây bệnh.

1.3.3 Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp gây bệnh thối nhũn

Chi Erwinia spp thuộc họ Enterobacteria là loại vi khuẩn yếm khí tuỳ ý, gây bệnh thối nhũn trên nhiều loại cây trồng và rau, củ, quả sau thu hoạch, bao gồm khoai tây, cà chua, cải bắp, dứa, ớt, cà rốt, hành tây, súp lơ, hướng dương, cây xương rồng và cây thuốc lá.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU

2.1.1 Mai mực ống Loligo sp

Mai mực ống Loligo sp được thu hoạch tại các nhà máy chế biến thủy sản ở tỉnh Kiên Giang, có kích thước chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm Sau khi thu hoạch, mai mực tươi được rửa sạch, đóng bao PA hút chân không và cấp đông ở -4°C cho đến khi được xử lý tại phòng thí nghiệm Trước khi sử dụng, mai mực được rửa sạch và sấy ở 60°C trong 16 giờ, sau đó được xay nhỏ với kích thước 3 - 5 mm để làm mẫu trong quá trình thí nghiệm.

Hình 2.1 Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp

2.1.2 Trái cà chua Lycopersicon esculetum

Cà chua thuộc Bộ: Solaneae; Chi: Lycopersicon; Loài: Lycopersicon esculentum

Trái cà chua được sử dụng trong thí nghiệm có tên khoa học là Lycopersicun esculetun Mill, thuộc giống C95, là giống cà chua lai phổ biến tại Việt Nam nhờ năng suất cao, thời gian sinh trưởng ngắn và khả năng trồng trái vụ Mẫu cà chua này được thu mua tại các chợ đầu mối nông sản ở Bình Dương, Thủ Đức (TpHCM) và Nha Trang, đáp ứng tiêu chuẩn TCVN 4845:2007.

Cà chua là loại trái cây có khả năng chín tiếp tự nhiên sau khi thu hoạch, ngay cả khi vỏ vẫn còn màu xanh hoặc đang chuyển sang đỏ Để đạt được chất lượng tối ưu, trái cà chua thu hoạch cần có kích thước đồng đều, không có khuyết tật và không bị tổn thương vật lý như vết dập, vết cắt, lỗ thủng hay vết trầy xước.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 2.2 Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là loại tinh khiết, bao gồm NaOH, HCl và các hóa chất phục vụ phân tích chỉ tiêu chất lượng, tất cả đều được sản xuất bởi công ty Merck, Đức Các hóa chất này được bảo quản đúng theo yêu cầu của nhà sản xuất ghi trên bao bì.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu trong luận án được thể hiện trong Hình 2.3 Quá trình nghiên cứu nhằm xác định điều kiện thu nhận β-chitin và chitosan từ phế liệu mai mực ống Loligo sp được thực hiện bằng phương pháp hóa học, dựa trên các kết quả nghiên cứu đã công bố của Chandumpai (2004), Jung (2013), và Kurita.

Việc sử dụng dung dịch NaOH với nồng độ thấp trong quá trình khử protein để thu nhận β-chitin và deacetyl hóa nhằm sản xuất chitosan giúp hạn chế tối đa việc cắt mạch chitin Nghiên cứu này có tiềm năng ứng dụng trên quy mô sản xuất lớn, mang lại hiệu quả thiết thực.

Mai mực ống được thu nhận tại nhà máy chế biến thủy sản ở Kiên Giang với kích thước chiều dài từ 12-15cm, rộng 1-1,5cm và độ dày trung bình 0,4-0,5mm Quá trình sơ chế bao gồm rửa sạch và đóng bao để bảo quản, giúp giữ nguyên chất lượng và hình dạng của mai mực ống.

PA hút chân không, vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản lạnh 4C cho đến

Luận án tiến sĩ Kỹ thuật đề cập đến quy trình xử lý mẫu mai mực ống trong nghiên cứu Mẫu được rửa sạch và sấy khô ở 60°C trong 16 giờ cho đến khi độ ẩm dưới 10% Sau khi sấy khô, mai mực ống được xay nhỏ với kích thước 3-5mm Cuối cùng, mẫu được phân tích để xác định các thành phần hóa học cơ bản như protein, khoáng chất, lipid, acid amin và thành phần khoáng.

Rửa sạch, sấy 60°C qua đêm (16 giờ), xay kích thước 3-5 mm.

Khử protein, khử khoáng thu nhận -chitin Đánh giá ảnh hưởng các yếu tố:

Chọn điều kiện thích hợp để thu nhận β-chitin Đánh giá tính chất của sản phẩm -chitin

Deacetyl thu nhận β-chitosan Đánh giá ảnh hưởng các yếu tố:

Chọn điều kiện thích hợp để thu nhận β-chitosan

Hòa tan trong dung dịch acid acetic 1%, chỉnh pH = 5 – 5,5

Phân lập vi khuẩn gây bệnh Erwinia sp.

Thu nhận trái cà chua bệnh thối nhũn Mai mực Loligo sp Đánh giá:

- Thành phần hóa học cơ bản

- Thành phần khoáng, kim loại

1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan ở điều kiện in vitro

2 Đánh giá khả năng kháng bệnh của chitosan ở điều kiện in vivo Đánh giá tính chất của sản phẩm -chitosan

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Dựa trên việc xác định thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp., quá trình xử lý mẫu mai mực bao gồm việc loại bỏ các thành phần phi chitin như protein, khoáng và lipid nhằm thu nhận β-chitin.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Trong quá trình khử protein mẫu mai mực, môi trường NaOH được sử dụng với các yếu tố như nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian khử được khảo sát và đánh giá Mục tiêu chính là giảm hàm lượng protein còn lại dưới 1% và đảm bảo mạch β-chitin thu được ít bị phân cắt nhất trong quá trình xử lý.

Quá trình khử khoáng của mai mực được thực hiện trong môi trường acid HCl, với mục đích loại bỏ các thành phần khoáng và đạt hàm lượng khoáng còn lại dưới 1% đồng thời hạn chế sự phân cắt mạch β-chitin Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này bao gồm nồng độ HCl, nhiệt độ khử và thời gian khử, cần được khảo sát và đánh giá kỹ lưỡng để đạt được kết quả mong muốn.

Sản phẩm -chitin sau khi được xử lý được thu nhận và đánh giá dựa trên các tiêu chí như độ tinh khiết, khối lượng phân tử trung bình (Mw), độ deacetyl (DD), cũng như các đặc điểm cấu trúc thông qua phổ nhiễu xạ tia X (XRD), phổ hồng ngoại (FTIR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Ngoài ra, một số tính chất lý - hóa quan trọng khác cũng được xem xét để đảm bảo chất lượng sản phẩm.

Quá trình deacetyl hóa sản phẩm -chitin được thực hiện trong môi trường NaOH, với các yếu tố như nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian được khảo sát và đánh giá Mục tiêu của quá trình này là đạt được độ deacetyl trên 90% (DD > 90%) và đảm bảo mạch chitosan ít bị phân cắt trong suốt quá trình xử lý.

Đánh giá kháng khuẩn cho thấy việc phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch là cần thiết Các mẫu cà chua bệnh được thu thập từ các chợ đầu mối nông sản, và quá trình phân lập vi khuẩn Erwinia sp được thực hiện theo quy tắc Koch, đồng thời các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn này cũng được mô tả bởi Mân.

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan từ mai mực ống cho thấy sản phẩm này được cắt mạch bằng H2O2 theo phương pháp của Liu (2006) và Huang (2012) Các chitosan thu được có phân tử lượng biến đổi từ 6831 đến 138 kDa Đặc biệt, khả năng kháng khuẩn của các chitosan này đã được đánh giá đối với vi khuẩn Erwinia sp., tác nhân gây bệnh thối nhũn trên cà chua, trong cả điều kiện in vitro và in vivo.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin

2.2.2.1 Thí nghiệm tổng quát, đánh giá ảnh hưởng của 3 yếu tố: nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu

Dựa trên cở sở các kết quả nghiên cứu đã công bố Chandumpai 2004 [36], Jung

Nghiên cứu của Kurita (1993) chỉ ra rằng việc thu nhận β-chitin từ phế liệu mai mực phụ thuộc vào ba yếu tố chính: nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian xử lý Để đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của các yếu tố này đối với nguyên liệu mai mực Loligo sp., sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trong Hình 2.4.

Khử protein ở nhiệt độ 30 o C với tỷ lệ NL/DM (1/10, w/v) NaOH (w/v): 3%; 4%; 5%

Khử protein ở nhiệt độ 60 o C với tỷ lệ NL/DM (1/10, w/v) NaOH (w/v): 3%; 4%; 5%

Khử protein ở nhiệt độ 90 o C với tỷ lệ NL/DM (1/10, w/v) NaOH (w/v): 3%; 4%; 5%

- Hàm lượng protein còn lại

- Hàm lượng khoáng còn lại

Sơ đồ thí nghiệm trong Hình 2.4 thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu.

Mục đích của nghiên cứu là thăm dò và đánh giá mức tác động của ba yếu tố: nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian, đến quá trình khử protein trong mẫu mai mực.

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU

2.3.1 Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản

- Xác định hàm lượng ẩm theo chuẩn AOAC 1990

- Xác định hàm lượng khoáng theo chuẩn AOAC 1990

- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Folch [60]

- Xác định hàm lượng chitin bằng phương pháp Rao và cộng sự [144]

- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret và MicroBiuret (Phụ lục

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng

- Xác định thành phần acid amin: phân tích phương pháp GC với một bộ kit (GC- EZ: FAAST) để phân tích acid amin tự do theo chuẩn AOAC

- Xác định thành phần khoáng: Thành phần khoáng được phân xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử AAS theo chuẩn AOAC (2000)

2.3.3 Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan

- Xác định hàm lượng protein còn lại (hàm lượng protein > 3%): được xác định bằng phương pháp Biuret, nội dung chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1

Hàm lượng protein còn lại trên chitin được xác định bằng phương pháp MicroBiuret, theo nghiên cứu của Aye và Stevens năm 2006, với giá trị protein thấp hơn 3% Thông tin chi tiết về phương pháp này có thể được tìm thấy trong Phụ lục 2.

Độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của chitin được xác định thông qua việc đo độ hấp phụ quang học sau khi thủy phân mẫu bằng H3PO4, theo phương pháp của Hein và cộng sự (2008).

Mạch chitin có phân tử lượng trung bình (Mw) được xác định thông qua độ nhớt nội và tính toán theo công thức Mark–Houwink, như đã được Einbu và cộng sự trình bày vào năm 2007 [57] Thông tin chi tiết có thể được tìm thấy trong Phụ lục 3.

Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) được thực hiện trên máy PANalytical X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia chiếu xạ CuKα với bước sóng λ = 1,54A Quy trình đo được thực hiện ở hiệu điện thế 40kV và cường độ 40mA, với góc quét từ 4 đến 44, bước quét 0,05 và tốc độ quét 1/min, tại nhiệt độ 25C.

- Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR): đo trên máy Nicolet iS10, Thermo Scientific, bước sóng từ 548–4000cm -1

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng dung môi DCl và D2O

- Kính hiển vi điện tử SEM: được chụp trên máy Hitachi S-4800

- Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM: được chụp trên máy H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện thế 100 kv

Độ hòa tan của chitosan được xác định bằng cách đo lường mức độ hòa tan của 1g mẫu trong 100ml dung dịch acid acetic 1%, theo phương pháp được điều chỉnh từ Samar và cộng sự năm 2013 Thông tin chi tiết về quy trình này được trình bày trong Phụ lục 4.

Độ kết tinh của chitin và chitosan được xác định thông qua chỉ số kết tinh (CrI - Crystalline Index), theo phương pháp được mô tả bởi Pareek và cộng sự.

2013 [117] và mức độ kết tinh (χcr - Degree of Crystallinity) theo phương pháp được Chebotok và cộng sự 2007 [40], nội dung cụ thể được trình bày ở Phụ lục 5

2.3.4 Phương pháp cắt mạch chitosan

Sản phẩm chitosan ban đầu (CTS-1) có độ deacetyl DD từ 91-93% và khối lượng phân tử trung bình đạt 6831 kDa Để tối ưu hóa khả năng tương tác với H2O2, chitosan được xử lý trong dung dịch NaOH 0,2% (w/v) ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ với tỷ lệ 1/15 (w/v), giúp cấu trúc mạch chitosan trương nở và tăng cường tiếp xúc với H2O2.

Chitosan đã được xử lý trương nở với nồng độ 10% (v/v) và tỷ lệ 1/10 (w/v) trong khoảng thời gian 3 giờ, 5 giờ và 7 giờ Sau đó, mẫu được điều chỉnh về pH = 10, tiến hành lọc để thu hồi chitosan kết tủa Các mẫu chitosan thu được được sấy ở nhiệt độ 60 °C trong 12 giờ Kết quả cho thấy các sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử khác nhau, được trình bày chi tiết trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Tính chất các chitosan sau cắt mạch

Chitosan Thời gian cắt mạch

C-120: Chitosan thương mại (Sigma-Aldrich) có DD 79-81% và Mw 120 kDa

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

2.3.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn

Phương pháp lựa chọn khuẩn lạc và chủng vi khuẩn bắt đầu bằng việc rửa mẫu cà chua bệnh bằng cồn, sau đó cắt đôi và lấy 1g phần thịt cà chua tại ranh giới bị bệnh cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều Sau 30 phút, pipet 50µl dịch vi khuẩn lên mặt thạch PDA (đĩa petri 90mm) và dùng que cấy trang trên mặt thạch Mẫu được ủ ở nhiệt độ 30°C trong 24-48 giờ để quan sát và lựa chọn các khuẩn lạc phát triển Theo Janse (2005) và Mân (2007), khuẩn lạc Erwinia sp nuôi cấy trên môi trường PDA có màu trắng xám, hình tròn hoặc bầu dục không đều, với bề mặt khuẩn lạc nhầy ướt Quá trình này được lặp lại trên các mẫu bệnh để chọn các khuẩn lạc thuần khiết cho các công đoạn tiếp theo Cuối cùng, tiến hành nhuộm Gram và kiểm tra khả năng di động của các dòng vi khuẩn đã chọn; Erwinia sp có tế bào hình gậy (0,5-1,0 x 1,0-3,0 mm), Gram âm, ưa khí tùy tiện và di động bằng chu mao.

Đánh giá khả năng phân giải pectin trên môi trường CVP (Crystal Violet Pectate) là một phương pháp quan trọng để xác định khả năng phân giải pectin của các chủng vi khuẩn Để thực hiện, chuẩn bị môi trường CVP và sử dụng que cấy để lấy mẫu từ khuẩn lạc cần thử nghiệm, sau đó chấm từ 4 đến 6 điểm trên bề mặt thạch CVP Sau khi ủ ở nhiệt độ 30ºC trong 48 giờ, quan sát sự phát triển của khuẩn lực để đánh giá kết quả Những chủng vi khuẩn có khả năng phân giải pectin sẽ tạo ra các hố trên bề mặt thạch và làm lỏng pectate, đồng thời hình thành lớp pectin tinh khiết trên bề mặt hố trong quá trình phát triển.

Đánh giá khả năng lên men-oxy hóa glucose (Oxidative-Fermentative) được thực hiện bằng cách pha môi trường PG lỏng vào ống nghiệm 15ml và vô trùng, sau đó thêm 2 giọt bromothymol blue đã được lọc qua màng lọc 0,2µm Sau khi cấy vi khuẩn vào ống nghiệm và phủ lớp parafin lên bề mặt môi trường, mẫu được nuôi ở 30C trong 48 giờ Sự thay đổi màu của môi trường sẽ được quan sát để xác định kết quả Theo Janse (2005), thí nghiệm này nhằm loại bỏ các chủng vi khuẩn thuộc chi Xanthomonas spp và Pseudomonas spp., từ đó nhận diện chủng thuộc chi Erwinia.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật sp nghiên cứu khả năng chuyển hóa carbohydrate (glucose) của các vi khuẩn Gram âm trong điều kiện lên men kỵ khí và hiếu khí Trong quá trình lên men kỵ khí, acid pyruvat được chuyển hóa thành nhiều sản phẩm acid khác nhau, tùy thuộc vào loại quá trình lên men Sự gia tăng hàm lượng các acid trong suốt quá trình này làm cho chất chỉ thị bromthymol chuyển từ màu xanh sang màu vàng, cả trong điều kiện có và không có oxy.

Đánh giá khả năng oxy hóa tryptophan thành các hợp chất hữu cơ chứa vòng indol được thực hiện trong môi trường pepton broth vô trùng Sau khi cấy vi khuẩn và ủ ở 30°C trong 48 giờ, kết quả được xác định bằng cách thêm 5 giọt thuốc thử Kovacs’s Ống nghiệm dương tính (+) sẽ xuất hiện lớp màu tím hoặc đỏ, trong khi ống âm tính (-) không tạo màu Kết quả cho thấy loài Ecc không oxy hóa tryptophan thành các hợp chất như Indole, Skatole và indole-acetate, trong khi Echr có khả năng này.

Khả năng nhạy cảm với Erythromycine được đánh giá thông qua việc bổ sung erythromycine vào môi trường PDA đã khử trùng với hàm lượng 15µg/đĩa thạch (20 ml/đĩa) Vi khuẩn được cấy điểm trên bề mặt thạch và theo dõi sự phát triển sau 48 giờ ở nhiệt độ thường Kết quả cho thấy loài Ecc không nhạy cảm với erythromycine, trong khi loài Echr lại nhạy cảm với kháng sinh này.

Phương pháp giải trình tự 16s rARN được áp dụng để xác định các dòng vi khuẩn nghi ngờ là Erwinia sp Sau khi thực hiện các bước thí nghiệm loại trừ, các mẫu vi khuẩn này được gửi đến phòng xét nghiệm Nam Khoa, TpHCM Tại đây, chúng được định danh thông qua phương pháp khuếch đại gen PCR, giải trình tự gen mã hóa 16s rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.

2.3.6 Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora

Mẫu vi khuẩn Erwinia sp sau khi phân lập được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường

PG lỏng sau 24 giờ ở nhiệt độ 30C Mẫu được pha loãng và do OD ở 610 nm đạt giá trị 0,25, với kết quả mày mẫu dịch vi khuẩn đạt 2,1 x 10 3 tế bào/ml [100]

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

2.3.7 Phương pháp gây bệnh nhân tạo

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP

Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.2.1, mai mực Loligo sp được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, sau đó sấy khô ở 60C trong 12 giờ và xay nhuyễn đến kích thước 3-5 mm Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu sau quá trình tiền xử lý được trình bày trong Bảng 3.1, Bảng 3.2 và Bảng 3.3.

3.1.1 Thành phần hóa học cơ bản

Bảng 3.1 trình bày hàm lượng các thành phần chính của nguyên liệu mai mực

Loligo sp bao gồm chitin, protein, lipid và khoáng

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp

Mai mực (Loligo lessoniana và Loligo formosana) 36-37 - - 0,04 [36]

Mai mực (Loligo plei và

Vỏ tôm thẻ chân trắng

 Giá trị trong bảng được tính trung bình từ kết quả 3-5 lần thí nghiệm theo trọng lượng khô tuyệt đối

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Kết quả cho thấy phế liệu mai mực Loligo sp có hàm lượng β-chitin là 35,8%

Hàm lượng β-chitin trong phế liệu mai mực Loligo sp thu được từ các nhà máy chế biến thủy sản ở Kiên Giang cao hơn nhiều so với hàm lượng α-chitin trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (29,4%), vỏ cua Callinectes sapidus (12,9%) và vỏ ghẹ chấm Portunus trituberculatus (17,1%) Kết quả này cũng tương đồng với các nghiên cứu trước đây của Chandumpai (2004), Kiruta (1993) và Lavall (2007), cho thấy hàm lượng β-chitin trong các loài mực Loligo dao động từ 35-42% Do đó, phế liệu từ mai mực Loligo sp là nguồn nguyên liệu lý tưởng để thu nhận β-chitin.

Ngoài ra, kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng khoáng có trong mai mực

Hàm lượng khoáng trong Loligo sp chỉ đạt 1,37%, thấp hơn nhiều so với 26,5% trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei So với các nghiên cứu trước đây, giá trị này tương tự với một số loài mực khác như Loligo lessoniana và Loligo formosana (0,05%), Loligo sanpaulensis (1,9%), Todarodes pacifica (0,8%) và Illex argentines (0,1%).

Việc thu nhận β-chitin từ mai mực có thể được tối ưu hóa bằng cách bỏ qua quá trình khử khoáng, điều này không chỉ giúp tránh sử dụng hóa chất mà còn bảo vệ cấu trúc chitin Nghiên cứu của Jung (2013) và Chandumpai (2004) đã chỉ ra rằng việc không sử dụng acid HCl trong quá trình chiết xuất β-chitin từ mai mực là khả thi Bỏ qua bước khử khoáng còn mang lại lợi ích về thời gian và chi phí sản xuất, đồng thời giảm thiểu chất thải và ô nhiễm môi trường trong quy trình sản xuất quy mô lớn.

Kết quả phân tích thành phần hóa học trong mai mực ống Loligo sp cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với phế liệu vỏ tôm cua ghẹ, với hàm lượng protein cao (57,2%) và khoáng thấp (1,37%) Trong khi đó, phế liệu vỏ tôm, cua, ghẹ chỉ chứa protein từ 15-26% và khoáng từ 26-35% Điều này mở ra khả năng bỏ qua bước khử khoáng và tập trung vào khử protein trong quy trình tách chiết chitin từ mai mực ống Loligo sp.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Việc xác định các khoáng chất trong nguyên liệu là cần thiết để đánh giá bản chất nguyên liệu, lựa chọn tác nhân khử protein và độ tinh khiết sản phẩm Kết quả phân tích thành phần khoáng trong mai mực ống Loligo sp cho thấy hàm lượng Ca, Mg, Fe cao hơn so với nghiên cứu của Chaidumpai (2004) trên loài Loligo formosana và Loligo lessoniana, cũng như Lavall (2007) trên loài Loligo plei và Loligo sanpaulensis Sự khác biệt này có thể do yếu tố loài, môi trường sống, tuổi trưởng thành của mực và thời điểm mùa vụ đánh bắt.

Bảng 3.2 Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm

Ca Fe K Mg Na Zn

Mai mực (Loligo sp.) 254 17,12 29,3 20,8 152,3 206 Kết quả luận án

Mai mực (Loligo lessoniana và Loligo formosana) 17,74 7,73 - 3,30 - - [36]

Mai mực (Loligo plei và

Khi so sánh với nguyên liệu vỏ tôm, mai mực chứa thành phần Ca là rất thấp

(254 ppm) so vỏ đầu tôm thẻ Penaeus vanamei (3254 ppm) hoặc vỏ tôm thể Penaeus vanamei (4856 ppm) [2] Do đó, có thể suy ra hàm lượng thành phần CaCO trong mai

Nghiên cứu về kĩ thuật thu nhận β-chitin từ mai mực Loligo sp cho thấy hàm lượng CaCO3 trong mai mực này thấp hơn so với vỏ tôm Penaeus aztecus (48,9%), tôm Penaeus durarum (42,2%) và vỏ cua (66,5%), điều này cho phép bỏ qua quá trình khử khoáng bằng acid HCl như trong các quy trình thông thường Hơn nữa, không phát hiện các kim loại nặng như Hg, Pb, As trong mai mực Loligo sp., đồng nhất với các nghiên cứu trước đây của Jung (2013), Chaidumpai (2004), Chaussard (2004) và Lavall (2007) Kết quả này khẳng định mai mực là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất β-chitin và chitosan có độ tinh khiết cao, phù hợp cho ứng dụng trong y dược, y sinh và thực phẩm.

Mai mực ống Loligo sp chứa một lượng nhỏ khoáng chất, bao gồm cả CaCO3, và không phát hiện có kim loại nặng.

Quy trình tách chiết chitin từ mai mực mang lại lợi ích kinh tế và hiệu quả hơn, nhờ vào việc rút ngắn thời gian và giảm lượng hóa chất so với việc xử lý vỏ tôm, cua và ghẹ Sản phẩm chitin thu được có độ tinh khiết cao, phù hợp cho việc sản xuất chitosan và ứng dụng trong thực phẩm cũng như y dược.

Thành phần acid amin trong chitin và chitosan từ nguồn tự nhiên, đặc biệt là nguyên liệu thủy sản, đóng vai trò quan trọng trong ứng dụng của chúng Những acid amin này có thể gây dị ứng cho người tiêu dùng, làm giảm độ tan và chất lượng sản phẩm chitin và chitosan Phân tích thành phần acid amin trong nguyên liệu mai mực ống Loligo sp được thể hiện trong Bảng 3.3.

Bảng 3.3 So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp và kết quả tham khảo

Acid amin Kết quả luận án Các kết quả tham khảo

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Theo đó, trong nguyên liệu mai mực Loligo sp các thành phần như Alanine,

Proline, Tyrosine và Histidine là ba axit amin chiếm tỷ lệ lớn nhất trong mai mực Todarodes pacifica, với mức từ 4,39 đến 6,68 g/100g Trong khi đó, các axit amin khác như Leucine, Isoleucine, Serine, Methionine, Glutamic acid và Phenylalanine có tỷ lệ thấp hơn, dao động từ 0,53 đến 2,6 g/100g Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Youn năm 2013 về thành phần axit amin trong mai mực, mặc dù có sự chênh lệch nhỏ giữa các thành phần, có thể do sự khác biệt về đặc điểm giống loài và độ tuổi trưởng thành của mực.

So sánh thành phần acid amin của vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei theo nghiên cứu của Dương (2014) và Trung (2012) cho thấy sự chênh lệch đáng kể về hàm lượng.

Luận án tiến sĩ về kỹ thuật các acid amin cho thấy rằng hầu hết các acid amin như Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Aspartic acid, Lysine, Histidine và Tyrosine trong mai mực ống có hàm lượng cao hơn từ 3-6 lần so với vỏ tôm thẻ Tuy nhiên, một số acid amin như Glutamic và Phenylalanine lại có hàm lượng tương đương nhau Tổng hàm lượng acid amin trong mai mực Loligo sp (49-55g/100g) vượt trội hơn 3-4 lần so với tổng hàm lượng acid amin trong vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (12-14g/100g).

Nguyên mai mực ống chứa hàm lượng acid amin cao hơn so với vỏ tôm thẻ, điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của quá trình khử protein để loại bỏ acid amin trong quy trình tách chiết chitin Việc này giúp thu được chitin và chitosan tinh khiết hơn, mở ra khả năng ứng dụng cho các sản phẩm yêu cầu độ tinh khiết cao của chitin và chitosan.

XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP

CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP

3.2.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp Để có cơ sở tiến hành các khảo sát chi tiết, chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ trong một khoảng rộng ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thu nhận chitin từ mai mực ống Dựa trên kết quả xác định thành phần hóa học có trong nguyên liệu mai mực ống Loligo sp ở mục 3.1 và các nghiên cứu đã công bố trước đây về tách chiết, thu nhận chitin từ mai mực và vỏ tôm (Bảng 1.7) làm cơ sở để xác định điều kiện khử protein có trong mai mực nguyên liệu

Thí nghiệm được thực hiện theo mô tả trong mục 2.2.2.1 và Hình 2.4, với ba lô thí nghiệm ở các mức nhiệt độ 30C, 60C và 90C nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH (3-5%) và thời gian khử đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (NL/DM) được duy trì cố định là 1/10 (w/v) trong tất cả các thí nghiệm Mẫu xử lý sẽ được thu nhận định kỳ, rửa trung tính và kiểm tra hàm lượng protein còn lại, với kết quả trình bày trong Hình 3.1 và Phụ lục 3.1.

Kết quả trình bày ở Hình 3.1 cho thấy quá trình khử protein thực hiện ở nhiệt độ

Quá trình khử ở 30 độ C cho hiệu quả rất thấp, với hàm lượng protein ở tất cả các nồng độ khảo sát vẫn cao hơn 1% sau 72 giờ Quan sát thí nghiệm cho thấy điều này rõ ràng.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật cho thấy sản phẩm chitin thu được bị phân rã và có độ nhớt giảm mạnh sau thời gian

Quá trình khử trong 72 giờ có thể được giải thích bởi sự thấm nước vào tấm mai mực và sự cắt mạch chitin Để đạt hiệu quả khử tối ưu (hàm lượng protein còn lại dưới 1%), cần thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, đồng thời rút ngắn thời gian phản ứng và giảm cắt mạch chitin Tuy nhiên, điều này gây khó khăn cho việc triển khai sản xuất quy mô lớn do thời gian sản xuất kéo dài và mức độ cắt mạch lớn.

Hình 3.1 Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của

3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian)

Quá trình khử ở nhiệt độ 60 o C cho hiệu quả cao hơn và thời gian ngắn hơn so với 30 o C Cụ thể, sau 12 giờ, hàm lượng protein còn lại lần lượt là 1,7%; 1,4% và 1,05% với các dung dịch NaOH nồng độ 3%, 4% và 5% Mặc dù có sự cải thiện, hiệu quả khử vẫn chưa đạt yêu cầu khi hàm lượng protein còn lại vẫn lớn hơn 1% Do đó, để rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả khử, cần tiến hành ở nhiệt độ cao hơn.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Quá trình khử ở nhiệt độ 90 o C cho hiệu quả cao hơn và giảm thời gian so với 60 o C Cụ thể, sau 8 giờ, hàm lượng protein còn lại lần lượt là 1,5%; 0,9% và 0,6% với các dung dịch NaOH nồng độ 3%, 4% và 5% Đặc biệt, nồng độ NaOH 4% đủ để đạt yêu cầu sản phẩm sau 8 giờ khử Ngược lại, với nồng độ 3%, thời gian khử 12 giờ vẫn chỉ đạt hiệu quả 1,3%, chưa đáp ứng yêu cầu với hàm lượng protein nhỏ hơn 1% Do đó, cần nghiên cứu thêm trong khoảng nhiệt độ này để tối ưu hóa thời gian và hiệu quả khử Kết quả thu được tương đồng với các nghiên cứu trước đây của Kiruta (1993) và Gupta (2010).

Để đạt hiệu quả tối ưu trong quá trình khử protein, cần đảm bảo hàm lượng protein còn lại dưới 1% và giảm thời gian khử Việc khảo sát chi tiết về ảnh hưởng của nồng độ NaOH từ 3-5%, nhiệt độ từ 70-90 độ C trong khoảng thời gian 4-14 giờ với tỷ lệ nguyên liệu cố định (1/10, w/v) là cần thiết để áp dụng vào sản xuất quy mô lớn.

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin

Quá trình khử protein trong mai mực bằng NaOH phụ thuộc vào cấu trúc và bản chất của các liên kết chitin-protein Theo nghiên cứu của Brine và cộng sự (1982), các liên kết này được chia thành bốn nhóm: liên kết bazơ Schiff, acetal, amide và liên kết cộng hóa trị, trong đó ba loại đầu tiên chiếm 68-91% tương tác chitin-protein Liên kết cộng hóa trị chỉ chiếm 32-9% và khó bị loại bỏ trong quá trình khử protein Về mặt không gian, các mạch và sợi chitin phân bố trong nền protein, với các sợi chitin được bao bọc bởi protein và tập hợp thành các sợi lớn hơn Cuối cùng, các sợi lớn này hình thành các lớp chitin, cấu thành mai mực như mô tả trong Hình 1.2 và Hình 1.5.

Trong quá trình khử protein, tốc độ khử phụ thuộc vào thời gian phản ứng, nhiệt độ và nồng độ NaOH Các phân tử protein nằm giữa các lớp chitin sẽ được khử trước, tiếp theo là các protein liên kết với chitin.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật các sợi bên trong có sự liên kết và bao bọc chặt chẽ hơn và khó bị khử hơn rất nhiều

Quá trình thủy phân protein ở các lớp sâu bên trong yêu cầu năng lượng hoạt hóa lớn hơn, đồng nghĩa với việc cần nhiệt độ cao hơn, thời gian dài hơn và nồng độ NaOH cao hơn Khi nhiệt độ tăng, động năng của các phần tử OH- tách ra từ NaOH cũng tăng, dẫn đến việc cắt đứt các liên kết giữa chitin và protein trở nên hiệu quả hơn Thời gian phản ứng kéo dài và nồng độ NaOH tăng cường sẽ cải thiện khả năng thủy phân protein.

OH - có khả năng thâm nhập sâu vào cấu trúc chặt chẽ của chitin-protein ở các lớp bên trong, dẫn đến hiệu quả khử protein tăng lên, mặc dù chậm hơn trong giai đoạn đầu và ở nồng độ NaOH thấp Tuy nhiên, sự cắt mạch chitin diễn ra mạnh mẽ hơn nhờ vào sự tương tác mạnh mẽ giữa tác nhân OH - và các phân tử chitin tự do.

Kết quả đánh giá cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và quá trình cắt mạch của β-chitin được thể hiện rõ trong Hình 3.2.

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin

Dựa trên kết quả đánh giá sơ bộ về điều kiện khử protein, năm lô thí nghiệm đã được thực hiện với mai mực Loligo sp ở các nhiệt độ 70, 75, 80, 85 và 90C Quá trình khử protein diễn ra với nồng độ NaOH 4% (w/v) trong 12 giờ, với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 (w/v) Sau khi xử lý, mẫu được rửa trung tính và tiến hành xác định hàm lượng protein còn lại cũng như khối lượng phân tử trung bình (Mw), với kết quả được trình bày trong Hình 3.2a và Phụ lục 3.2.

Khi nhiệt độ tăng từ 70 lên 90 độ C, hiệu quả khử protein tăng nhưng đồng thời cũng làm tăng quá trình cắt mạch chitin Cụ thể, hàm lượng protein còn lại giảm từ 1,65% xuống 0,3%, và khối lượng phân tử trung bình của chitin giảm từ 8550 kDa xuống 5040 kDa Để đạt được mục tiêu hàm lượng protein còn lại dưới 1%, chỉ cần thực hiện quá trình ở nhiệt độ thích hợp.

80 o C Ở nhiệt độ này, hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình của chitin lần lượt là DD = 0,7% và Mw = 8330 kDa

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch β-chitin

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP

TỪ MAI MỰC LOLIGO SP

3.3.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl -chitin

Quá trình deacetyl chitin thành chitosan có thể thực hiện theo hai điều kiện: phản ứng đồng thể khi chitin và tác nhân deacetyl (NaOH, KOH, enzyme) hòa tan trong dung dịch, và phản ứng dị thể khi chitin ở trạng thái rắn hoặc trương nở Nghiên cứu chủ yếu tập trung vào deacetyl trong điều kiện dị thể, với NaOH là tác nhân chính Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình deacetyl bao gồm nồng độ NaOH, dạng hydrat hóa, nhiệt độ phản ứng và nồng độ CH3COONa tạo ra Sử dụng NaOH nồng độ cao và nhiệt độ cao giúp chitin trương nở nhanh, giảm năng lượng hoạt hóa Theo nghiên cứu của Lamarque 2007, năng lượng hoạt hóa của quá trình deacetyl dị thể của β-chitin thay đổi tùy thuộc vào nồng độ NaOH và nhiệt độ, với 50% NaOH là nồng độ tối ưu cho quá trình này.

Sự tạo thành các dạng hydrat NaOH(H2O) n trong dung dịch ảnh hưởng lớn đến hiệu quả deacetyl của chitin trong phản ứng dị thể Ở nhiệt độ 90 o C và nồng độ 50%, số phân tử nước (n) có thể là 1 hoặc 2, tạo ra cấu trúc hydrat có ái lực tốt nhất với chitin, từ đó mang lại hiệu quả deacetyl cao nhất [Lamarque 2007].

Hàm lượng muối NaOCOCH3 tạo ra trong quá trình phản ứng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả deacetyl của chitin Muối này có khả năng ngậm nước, làm tăng nồng độ NaOH trong hệ phản ứng, dẫn đến hiện tượng kết tủa Vì vậy, khi hàm lượng muối NaOCOCH3 tăng cao, hiệu quả deacetyl sẽ giảm sút.

Các cân bằng có thể xảy ra trong quá trình deacetyl giữa chitin, NaOH, nước và NaOCOCH3 như sau [Lamarque 2007]:

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Trong luận án này, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình deacetyl β-chitin từ mai mực, dựa trên các công bố trước đây và tính chất của sản phẩm thu được Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả deacetyl được nghiên cứu bao gồm nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian Cụ thể, deacetyl β-chitin được thực hiện ở ba mức nhiệt độ 30, 60 và 90C trong dung dịch NaOH với nồng độ 40, 50 và 60%, theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/10, w/v) Kết quả khảo sát được trình bày trong Hình 3.8.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, quá trình deacetyl diễn ra nhanh và hiệu quả khi nhiệt độ và nồng độ NaOH tăng Ở nhiệt độ thấp, hiệu quả deacetyl thấp, với 42% và 68% ở 30 và 60 độ C với nồng độ NaOH 40% sau 24 giờ Mặc dù tăng nồng độ NaOH lên 50% và 60% vẫn không đạt được độ deacetyl trên 90%, nhưng khi nhiệt độ tăng, hiệu quả deacetyl cải thiện rõ rệt Cụ thể, ở nhiệt độ 90 độ C, thời gian cần để sản phẩm chitosan có độ deacetyl trên 90% là 12 giờ với NaOH 50% và 6 giờ với NaOH 60%.

Như vậy, để đạt được chitosan có độ deacetyl lớn hơn 90% thì nhiệt độ của quá trình phản ứng phải trên 60 o C

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl b Ảnh hưởng của nồng độ NaOH

Khi tăng nồng độ NaOH, hiệu quả deacetyl của chitosan cũng tăng theo Tuy nhiên, ở các nồng độ NaOH 40%, 50% và 60% khi thực hiện deacetyl tại nhiệt độ 30C và 60C, độ deacetyl của chitosan đều không đạt mục tiêu nghiên cứu trên 90% Đặc biệt, với nồng độ NaOH 50% và 60% khi deacetyl ở nhiệt độ 90C, chỉ sau 18 và 6 giờ, độ deacetyl đạt lần lượt 91% và 95%, đáp ứng mục tiêu nghiên cứu Cần lưu ý rằng với nồng độ NaOH 40%, kết quả không đạt yêu cầu dù ở nhiệt độ nào.

90 o C, sau 18 giờ thì độ deacetyl của chitosan thu được vẫn nhỏ hơn 90%

Như vậy, để đạt được chitosan có độ deacetyl lớn hơn 90% thì nồng độ dung dịch NaOH cần dùng phải trên 40% c Ảnh hưởng của thời gian

Kết quả đánh giá cho thấy rằng trong cùng điều kiện deacetyl (nồng độ NaOH và nhiệt độ giống nhau), việc kéo dài thời gian sẽ làm tăng hiệu quả deacetyl Tuy nhiên, hiệu quả này chỉ thực sự cao khi thực hiện ở nhiệt độ trên 60C Ngược lại, nếu tiến hành quá trình deacetyl ở 30C, việc kéo dài thời gian đến 72 giờ sẽ không mang lại hiệu quả đáng kể.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật nồng độ NaOH 40, 50 và 60% đều không đạt mục tiêu nghiên cứu với hiệu quả deacetyl trên 90%

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các công bố trước đây của Kiruta (1993) và Jung (2013) khi sử dụng NaOH, cũng như Broussignac (1968) với KOH trong quá trình deacetyl hóa chitin để thu nhận chitosan Những phát hiện này khẳng định rằng việc lựa chọn phương pháp và hóa chất thích hợp là rất quan trọng để đạt được sản phẩm chitosan chất lượng cao.

Khi DD > 90%, cần sử dụng dung dịch NaOH hoặc KOH với nồng độ trên 50% và nhiệt độ khử phải đạt trên 90°C Đồng thời, quá trình deacetyl có thể được thực hiện lặp lại từ 2 đến 4 lần để đạt hiệu quả tối ưu.

Các yếu tố khảo sát như nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian có tác động mạnh đến độ deacetyl sau quá trình khử Kết quả so sánh các giá trị trung bình theo chuẩn Duncan (α= 0,005) cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Hình 3.8 chỉ ra rằng nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian tỷ lệ thuận với hiệu quả quá trình deacetyl Để đạt được độ deacetyl lớn hơn 90% cho sản phẩm chitosan và hạn chế cắt mạch, các thông số tối ưu được xác định là nồng độ NaOH từ 45-55%, nhiệt độ deacetyl từ 70-90°C và thời gian khử từ 4-24 giờ, với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch là 1/10 (w/v).

3.3.2 Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

Kết quả đánh giá cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl β-chitin và quá trình cắt mạch của β-chitosan được thể hiện rõ trong Hình 3.9.

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

Nhiệt độ tăng không chỉ làm tăng tốc độ phản ứng deacetyl hóa mà còn dẫn đến sự cắt mạch của sản phẩm chitosan, gây ra chitosan có khối lượng phân tử thấp Do đó, việc lựa chọn nhiệt độ deacetyl hóa phù hợp là rất quan trọng để đạt được sản phẩm chitosan chất lượng cao.

Luận án tiến sĩ này tập trung vào việc nghiên cứu kĩ thuật chitosan với độ deacetyl cao và phân tử chitosan ít bị phân cắt Dựa trên kết quả đánh giá chất lượng chitin và số liệu khảo sát điều kiện deacetyl, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm để đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình deacetyl ở các mức 50°C và 60°C.

Quá trình deacetyl hóa chitosan được thực hiện ở nhiệt độ 70, 80 và 90C, sử dụng nồng độ NaOH 50% trong 12 giờ với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/10 (w/v) Sau khi xử lý, mẫu được rửa trung tính để xác định độ deacetyl (DD) và khối lượng phân tử trung bình (Mw) Kết quả cho thấy khi nhiệt độ tăng từ 50 lên 90C, độ deacetyl của sản phẩm chitosan tăng từ 60,2% lên 90,1%, trong khi khối lượng phân tử trung bình giảm từ 7784 xuống.

Khi áp dụng chuẩn Duncan (α= 0,005) để so sánh các giá trị trung bình độ deacetyl ở các mức nhiệt độ khác nhau, kết quả cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Cụ thể, hiệu quả của quá trình deacetyl tăng lên khi nhiệt độ khử tăng, với sản phẩm chitosan đạt được độ deacetyl (DD) lên tới 87,9% khi khử ở nhiệt độ 80C.

KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN

3.4.1 Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch

Kết quả khảo sát cho thấy, sau khi vận chuyển, lượng cà chua tại các chợ đầu mối thường bị thất thoát từ 10-15% do dập và tổn thương cơ học, dẫn đến quá trình thối nhũn diễn ra nhanh chóng trong 1-3 ngày Nếu không xử lý kịp thời, thối nhũn sẽ lây lan nhanh chóng sang các trái khác, gây thiệt hại lớn Hiện nay, nông dân và thương lái thường loại bỏ ngay các trái cà chua bị dập và có mùi thối để bảo vệ các trái còn lại Qua ba đợt thu thập, đã có 24 mẫu từ chợ đầu mối Thủ Đức và 21 mẫu từ chợ Vĩnh Hải Nha Trang, trong đó 10 mẫu có biểu hiện bệnh thối nhũn đã được chọn để phân lập và xác định đối tượng gây bệnh Theo nghiên cứu của Janse (2005) và Mân (2007), bệnh thối nhũn trên cà chua phát triển nhanh ở nhiệt độ 30-32 độ C.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật mô tả tình trạng nhũn mềm và chảy nước của tế bào do tổn thương, dẫn đến bề mặt vết bệnh sẫm màu, có thể xuất hiện nếp nhăn hoặc phồng rộp Ban đầu, biên độ tổn thương diễn ra chậm nhưng sau đó gia tăng nhanh chóng, khiến các mô trong khu vực bị ảnh hưởng bị phân hủy, chảy nước, và hình thành các vết nứt, tạo ra bề mặt nhầy nhụa với mùi thối đặc trưng Khi tiếp xúc với không khí, vết bệnh có thể chuyển sang màu xám hoặc nâu sẫm.

Bảng 3.13 Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản

Nơi lấy mẫu Đợt lấy mẫu

Thời gian lấy Số lượng mẫu thu nhận

Số lượng mẫu được chọn phân lập

Thủ Đức HCM Đợt 1 Tháng 12/2013 10 2 Đợt 2 Tháng 04/2014 7 2 Đợt 3 Tháng 09/2014 7 1

Nha Trang Đợt 1 Tháng 12/2013 6 2 Đợt 2 Tháng 04/2014 8 1 Đợt 3 Tháng 09/2014 7 2

Hình 3.18 Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản

Từ 6 đợt thu mẫu, đã phân lập và chọn được 10 mẫu cà chua bệnh Các mẫu được xử lý và phân lập trên môi trường PDA ở pH trung tính và nhiệt độ 30C, thu được 37 mẫu khuẩn lạc đặc trưng Các khuẩn lạc này có màu trắng xám đến vàng đục, hình tròn hoặc bầu dục không đều, với bề mặt lồi nhầy ướt Kết quả nhuộm Gram cho thấy trong 37 dòng vi khuẩn, có 20 dòng Gram âm, hình que, hai đầu hơi tròn, kích thước tế bào nằm trong khoảng (0,5-1,0 × 1,0-3,0 μm) và có khả năng di động.

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Các nghiên cứu đã loại trừ hầu hết các tác nhân gây bệnh như nấm và các vi khuẩn Gram dương, bao gồm Bacillus spp., Clotridium spp., và Clavibacter spp Tuy nhiên, vẫn còn một số tác nhân vi khuẩn gây bệnh nghi ngờ thuộc các chi Erwinia spp., Pseudomonas spp., và Xanthomonas spp.

Hình 3.19 (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram

- Kết quả đánh giá các đặc tính sinh hóa, sinh lý của chủng phân lập:

Kết quả đánh giá khả năng lên men-oxy hóa glucose cho thấy 20 dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa glucose thành các acid, làm thay đổi màu sắc của chỉ thị bromothymol từ xanh sang vàng trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí, như được trình bày trong Bảng 3.14 Phép thử sinh hóa này đã loại trừ một số dòng vi khuẩn không đáp ứng yêu cầu.

Xanthomonas spp và Pseudomonas spp đều là vi khuẩn Gram âm có hình dạng tế bào hình gậy và ưa khí Nghiên cứu đã xác định được 11 dòng vi khuẩn thuộc chi Erwinia spp có khả năng chuyển hóa glucose trong cả điều kiện yếm khí và hiếu khí.

Trong nghiên cứu về khả năng phân giải pectin trên môi trường CVP (Crystal Violet Pectate), 11 dòng vi khuẩn đã được đánh giá và kết quả cho thấy 7 trong số đó có khả năng phân giải pectin Các dòng vi khuẩn không có khả năng này bao gồm: Erwinia amylovora, Erwinia tracheiphila, Erwinia rubrifaciens, Erwinia salics, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia nigrifluens, Erwinia stewartii và Erwinia uredovora Theo Janse (2005), chi vi khuẩn Erwinia spp bao gồm 14 loài, trong đó có Erwinia carotovora.

The doctoral thesis focuses on various Erwinia species, including Erwinia quercina, Erwinia salics, Erwinia herbicola, Erwinia rhapontici, Erwinia chrysanthemi, Erwinia cypripedii, Erwinia nigrifluens, Erwinia stewartii, and Erwinia uredovora It highlights that only strains capable of pectin degradation are responsible for causing soft rot disease.

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng oxy hóa tryptophan thành các hợp chất chứa vòng indol của 7 dòng vi khuẩn phân giải pectin đều có khả năng sinh H2S nhưng không sinh indol Theo thông tin từ Janse (2005), các dòng vi khuẩn thuộc chi Erwinia sp đã được loại trừ, bao gồm Erwinia mallotivora và Erwinia quercina, do không có khả năng sinh H2S.

Khả năng nhạy cảm với erythromycine đã được đánh giá, trong đó 6 trên 7 dòng vi khuẩn được chọn không nhạy cảm với erythromycine Kết quả này dẫn đến việc loại trừ chủng Erwinia rhapontici, vì chủng này nhạy cảm với erythromycine.

Kết quả đánh giá các đặc tính sinh hóa và sinh lý của các dòng vi khuẩn phân lập cho thấy có 6 dòng vi khuẩn đáp ứng đầy đủ các yêu cầu và đang nằm trong diện nghi ngờ.

Kết quả giải trình tự gen 16s rARN của 6 chủng vi khuẩn cho thấy, chủng EC24-NT có độ đồng nhất lên đến 97% khi so sánh với trình tự gen của chủng CP002038 Dickeya dadantii 3937 trong ngân hàng gen NCBI, thông qua chương trình BLAST SEARCH.

Kết quả phân lập xác định chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch là Dickeya dadantii 3937 hay Erwinia carotovora Dòng vi khuẩn này đã được chụp qua kính hiển vi điện tử SEM, cho thấy hình dạng que với hai đầu hơi tròn, kích thước tế bào vi khuẩn nằm trong khoảng (0,5-1,0×1,0-3,0μm) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu và mô tả của Janse (2005) và Mân (2007).

Hình 3.20 Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Hình 3.21 Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora

Kết quả đánh giá độc lực của chủng Erwinia carotovora trên trái cà chua được thực hiện theo quy tắc Koch, trong đó bệnh nhân tạo được gây ra trên trái cà chua nhằm xác định mức độ gây hại của vi khuẩn này.

Koch đã được mô tả ở phần 2.3.7 Kết quả đánh giá khả năng gây bệnh trên trái cà chua của Erwinia carotovora được trình bày trong Hình 3.22 và Hình 3.23

Thời gian 24 giờ 48 giờ 72 giờ

Hình 3.22 Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua

Luận án tiến sĩ Kĩ thuật

Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian hình thành vết bệnh trên trái cà chua là 24 giờ, với tỷ lệ nhiễm bệnh đạt 100% Bệnh phát triển nhanh chóng, từ khi bắt đầu cho đến khi trái thối nhũn hoàn toàn mất 72 giờ, và vết bệnh ổn định trong khoảng thời gian này Độc lực của Erwinia carotovora cho thấy trong 24 giờ đầu, vết bệnh phát triển chậm, nhưng sau đó tăng nhanh và hoàn toàn phá hủy ký chủ sau 72 giờ Vi khuẩn gây bệnh tấn công mạnh mẽ bên trong, nhanh hơn so với vết bệnh bên ngoài.

Hình 3.23 Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua